3 期莫金凤, 等 : 乌鳢源舒伯特气单胞菌生物学特性及其药物敏感性分析仪器设备 ATB 细菌半自动鉴定仪 ( 法国 Biomerieux 公司 ), 麦氏比浊仪 ( 法国 Biomerieux 公司 ) 人工感染实验在室内 1 m 1 m.5 m 水泥池进行, 具充氧和控温设备

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茜鳗温
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1 第 4 卷第 3 期水产学报 Vol. 4, No 年 3 月 JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA Mar., 216 文章编号 : 1 615(216) DOI: /jfc 乌鳢源舒伯特气单胞菌生物学特性及其药物敏感性分析莫金凤 1, 姜兰 2 1 *, 吴灶和 (1. 仲恺农业工程学院广州市水产病害与水禽养殖重点实验室, 广东广州 51225; 2. 中国水产科学研究院珠江水产研究所, 广东广州 5138) 摘要 : 为了解乌鳢源舒伯特气单胞菌 WL4 菌株的生理生化生长特性致病因子等生物学特征, 以及其对多种药物的敏感性, 使用细菌生化鉴定仪检测菌株的生理生化特性, 比较不同温度盐度及 ph 条件下菌株的生长特征 ; 通过人工回归感染分析菌株的致病性, 测定相关的毒力因子并采用 PCR 方法扩增毒力基因 ; 采用微量二倍稀释法测试菌株对 2 种抗菌药物的最小抑菌浓度结果发现, 与模式菌株 (ATCC43) 相比, 两菌株的大部分生理生化特性相同,16S rrna 基因比对, 相似度达 99. 9%;WL4 菌株的最适生长温度为 3 C, 最适生长盐度为 5, 最适生长 ph 为 ;29 C 时, 腹腔注射感染乌鳢苗种的半数致死浓度 (LC 5 ) 为 CFU/mL; 该菌株具有溶血性蛋白酶活性和脂肪酶活性 ;WL4 菌株对磺胺类及酰胺醇类等 8 种药物具有耐药性, 而对多西环素新霉素氨苄西林等 12 种药物敏感研究表明,WL4 菌株的生物学特征与其引起的乌鳢内脏类结节病的发生情况相吻合, 致病菌的药物敏感性与药物使用情况存在相关性关键词 : 舒伯特气单胞菌 ; 生长特性 ; 毒力因子 ; 药物敏感性中图分类号 : S 941 文献标志码 : A 舒伯特气单胞菌归属温和气单胞菌复合群 [1] 舒伯特气单胞菌广泛存在于淡水海水土壤鱼类和脊椎动物中, 可引起人类皮肤和软组织感染 [2] [3] 坏死性筋膜炎败血症等, 亦可引起养殖鱼类的内脏类结节病 [4], 是一种人鱼共患条件性致病菌目前对水产养殖中舒伯特气单胞菌的研究主要集中在病原菌的分离鉴定 [49] 及快速检测方法等方面, 有关水产源舒伯特气单胞菌的生长特性致病因子等方面的研究还较少舒伯特气单胞菌 WL4 菌株是刘春等 [] 211 年在广东省中山地区养殖场分离的一株可引起乌鳢类结节病的病原菌, 本实验对该菌株的生理生化特征生长特性毒力因子等生物学特性及药物敏感性进行分析比较, 以期为舒伯特气单胞菌引起的乌鳢类结节病的有效防治提供科学依据 1 材料与方法 1.1 实验材料实验菌株 WL4 菌株为分离自乌鳢的舒伯特气单胞菌, 由中国水产科学研究院珠江水产研究所鱼病室分离保存 [] ;ATCC43 ( 舒伯特气单胞菌模式菌株 ), 购自美国标准生物品收藏中心 (ATCC) 实验鱼乌鳢, 体质量规格分别为 (25±5) g 和 (12±2) g, 购自广东省佛山市顺德乌鳢养殖场, 在实验室水族箱暂养 2 d 以上, 采用镜检方法确定无寄生虫感染后用于攻毒试验试剂 ID32GN 生化检测试剂条购自法国 Biomerieux 公司 ;Bacterial DNA Kit 试剂盒购自美国 OMEGA 公司 ; 大豆酪蛋白琼脂 (TSA) 培养基 LB 肉汤培养基 5% 绵羊血平板等购自广东环凯微生物科技有限公司收稿日期 :21612 修回日期 : 资助项目 : 广州市科技计划 (2132); 广东省科技计划 (211B231) 通信作者 : 吴灶和, wuzaohe@163. com

2 3 期莫金凤, 等 : 乌鳢源舒伯特气单胞菌生物学特性及其药物敏感性分析仪器设备 ATB 细菌半自动鉴定仪 ( 法国 Biomerieux 公司 ), 麦氏比浊仪 ( 法国 Biomerieux 公司 ) 人工感染实验在室内 1 m 1 m.5 m 水泥池进行, 具充氧和控温设备 1.3 生理生化特性和 16 S rrna 序列分析生理生化特性测定将菌株分别接种于 TSA 培养基,3 C 静置培养 24 h, 采用 ID32GN 生化试剂条, 用 ATB 细菌半自动鉴定仪进行测定 16 S rrna 基因序列采用 Bacterial DNA Kit 试剂盒提取细菌的基因组 DNA, 放置在 4 C 冰箱中备用 16 S rrna 的扩增引物参照文献 [1] 合成 ; 反应条件为 95 C 预变性 5 min,95 C 3 s,55 C 退火 3 s,2 C 延伸 6 s, 完成 3 个循环后于 2 C 延伸 1 min;pcr 产物经琼脂糖凝胶电泳检测后委托广州艾基生物技术有限公司测序, 测序结果上传至 NCBI 的 Blast 检索系统进行基因序列分析 1.4 生长特性生长曲线 [11] 参考韩文瑜等的方法, 取 3 C 条件下在 LB 肉汤中 (16±5) r/min 振荡培养 8 h 的 WL4 新鲜菌液, 用麦氏比浊仪将菌液浓度调整至 CFU/mL 作为种子菌液, 移取 2 ml 种子菌液接种于 18 ml 无菌肉汤培养基的 25 ml 三角烧瓶中, 设 3 个平行, 置 3 C 培养箱中 (16±5) r/min 振荡培养, 每间隔.5~2 h, 分别取 5 ml 培养液, 测定 OD 6 值以时间为横坐标,OD 6 值为纵坐标绘制 WL4 菌株的生长曲线温度对生长的影响取在 LB 肉汤中 (3 C) 振荡 (16±5)r/min 培养 6 h 的 WL4 菌液, 接种于 LB 肉汤培养基上, 用麦氏比浊仪将细菌浓度调整至 3 1 CFU/mL, 分装于无菌玻璃管中, 将初液分装于无菌玻璃管中, 每管 5 ml, 共 1 管, 每个温度设 1 管平行, 分别于和 5 C 恒温培养箱中静置培养,4 h 后用麦氏比浊仪测定培养的菌液浓度 ph 值对生长的影响将 WL4 菌株分别接种于 ph 值为的 LB 培养基中, 调整菌液浓度为 3. 1 CFU/mL, 分装于无菌玻璃管中, 每个 ph 值设 1 管平行,3 C 恒温培养箱中静置培养,4 h 后用麦氏比浊仪测定培养的菌液浓度同时于静置培养前后, 分别将细菌培养初液分别点种在 TSA 平板上, 于 3 C 静置培养 24 h, 观察细菌存活情况盐度对生长的影响将 WL4 菌株分别接种于盐度为的 LB 培养基中, 分别调整菌液浓度为 3. 1 CFU/mL, 分装于无菌玻璃管中, 每管 5 ml, 每个盐度设 1 管平行,3 C 恒温培养箱中静置培养,4 h 后用麦氏比浊仪测定培养的菌液浓度同时于静置培养前后, 将细菌培养初液分别点种在 TSA 平板上, 于 3 C 静置培养 24 h, 观察细菌存活情况 1.5 菌株的毒力特性菌株对乌鳢的致病性取纯化培养的细菌菌株, 接种于 LB 肉汤培养基,3 C 振荡 (16±5) r/min 培养 8h, 用.65% 无菌生理盐水将菌液稀释成和 CFU/mL 4 个菌液浓度, 腹腔注射感染健康乌鳢 (25±5) g,.2 ml/ 尾, 每组 1 尾, 对照组注射等量的.65% 无菌生理盐水实验期间水温 (29±1) C, 每天观察实验鱼的症状及记录死亡情况, 连续观察 d, 使用 SPSS16. for Windows 软件辅助计算细菌的半数致死浓度 (LC 5 ) 温度对 WL4 菌株致病性的影响取纯化培养的菌株, 接种于 LB 肉汤,3 C 振荡 (16±5) r/min 培养 8h, 用.65% 无菌生理盐水将菌液稀释成 CFU/mL, 腹腔注射感染健康乌鳢 (12±2) g,.2 ml/ 尾, 分为两组, 每组 5 尾分别控制实验水温为 (29±1) C 和 (23±1) C, 每天观察实验鱼的症状及记录死亡情况, 连续记录 d, 计算不同水温下实验鱼的感染死亡率 1.6 细菌的致病因子溶血性蛋白酶活性与脂肪酶活性测定溶血性参考血平板法 [12], 将菌株接种在 5% 绵羊血平板上,3 C 静置培养 24 h, 出现溶血圈则判断为具有溶血性蛋白酶活性参考脱脂奶平板法 [13], 将菌株接种在含 1% 脱脂奶的 TSA 培养基平板上,3 C 静置培养 24 h, 若菌落周围出现清晰透明的溶蛋白圈, 则判断为具有蛋白酶活性脂肪酶活性参考文献 [14] 的方法, 将菌株接

3 486 水产学报 4 卷种在含 1% 吐温 8 的 TSA 培养基平板上,3 C 静置培养 24 h, 若菌落周围有白色沉淀带出现, 则判断为具有脂肪酶活性毒力基因检测采用 Bacterial DNA Kit 试剂盒提取细菌的基因组 DNA, 放置在 4 C 冰箱中备用根据文献 [6] 合成溶血素 (haemolysin, hly) 弹性蛋白酶 (elastase, ela) 和脂肪酶 (lipase, lip) 基因的扩增引物 ( 表 1) 反应条件为 94 C 预变性 5 min, 94 C 3 s,55 C 退火 3 s,2 C 延伸 1.5 min, 完成 3 个循环后于 2 C 延伸 1 min hly ela lip 1. 药物敏感性试验选取大类 2 种广谱抗菌药物, 其中包括磺胺类 4 种 [ 磺胺间甲氧嘧啶 (SMM) 磺胺二甲嘧啶 / 甲氧苄啶 (S2/TMP) 磺胺嘧啶 / 甲氧苄啶 (SD/TMP) 磺胺甲唑 / 甲氧苄啶 (SXT)] 四环素类 2 种 [ 四环素 (TE) 多西环素 (DO)] 喹诺酮类 4 种 [ 萘啶酸 (NA) 诺氟沙星 (NOR) 恩诺沙星 (ENR) 环丙沙星 (CIP)] 氨基糖苷类 4 种 [ 新霉素 (N) 庆大霉素 (CN) 阿米卡星 (AK) 链霉素 (S)] β 内酰胺类 2 种 [ 氨苄西林 (AMP) 头孢噻肟 (CTX)] 酰胺醇类 3 种 [ 甲砜霉素 (THI) 氟苯尼考 (FFC) 氯霉素 (C)] 呋喃类 1 种 [ 呋喃妥因 (F)] 采用微量二倍稀释法测定药物对 WL4 菌株的最小抑菌浓度 (MIC), 参照美国国家临床实验室标准化委员会 (Clinical and Laboratory Standards [1516] Institute,CLSI) 标准判断菌株的药物敏感性表 1 舒伯特气单胞菌溶血素弹性蛋白酶和目的基因 target gene 脂肪酶基因引物信息 Tab. 1 The primers of haemolysin gene, elastase gene and lipase gene PCR 引物序列 (5'3') primer sequence (5'3') F:ACTTCTCATACACCCTGGAA R:CTTGAACTCGTAGGGGTAGGAG F:ACACGGTCAAGGAGATCAACGG R:GCTGGTGTTGGCCAGCAGCAGGTAG F: ATCTTCTCCGAATGGTTCGG R: GCTGCCAGGACTGGGTCTTG 2 结果 2.1 菌株的生理生化特性 WL4 与 ATCC43 菌株的大部分主要生理生化特性相同, 如甘露醇水杨素蔗糖等都为阴性 ; 仅柠檬酸盐戊酸盐葵酸盐组氨酸和丙氨酸的生化反应不同 ( 表 2) PCR 扩增 WL 4 和 ATCC43 菌株的 16 SrRNA 基因, 获得长度约 15 bp 的片段, 测序后通过序列比对, 两菌株的相似度达 99.9% 结合生理生化特性及 16 SrRNA 序列分析结果, 证实 WL4 菌株确为舒伯特气单胞菌 [1] 2.2 菌株的生长特征 WL4 菌株的生长曲线 3 C 时 WL4 菌株生长良好,~1 h 是菌株的迟缓期,1~5 h 是菌株的对数生长期 ( 图 1) 温度对 WL4 菌株生长的影响 WL4 菌株在 5 C~5 C 的温度范围内, 均可生长, 最适的生长温度是 3 C( 图 2) ph 值对 WL4 菌株生长的影响增菌培养前各 ph 值的细菌初液在 TSA 平板上均可培养出相似的单一菌落, 增菌培养 4 h 后除 ph 值为 4 和 11 的培养物在 TSA 平板上没有细菌菌落生长外, 其余的都培养出相似的单一菌落 WL4 菌株在 ph5~1 的范围内均可生长, 最适生长 ph 值为 ( 图 3), 而 ph 值为 4 和 11 时会导致细菌死亡盐度对 WL4 菌株生长的影响增菌培养前各盐度的细菌初液在 TSA 平板上均可培养出相似的单一菌落, 增菌培养 4 h 后盐度为 ~3 的培养物在 TSA 平板上都培养出相似的单一菌落, 而盐度为 35~6 的培养物在 TSA 平板上培养的菌落随盐度升高而稀疏, 特别是盐度为 6 时只能观察到细小的三两个单菌落, 说明 WL4 菌株在 ~3 的盐度范围内能够生长, 最适生长盐度为 5, 盐度高于 35 时对该菌株的生长有抑制作用 ( 图 4) 2.3 菌株对乌鳢的致病性实验水温为 (29±1) C 时, 攻毒 1 d, 感染了 WL4 菌的乌鳢就开始死亡, 腹部表面出现红肿现象, 第一二天死亡的乌鳢内脏白点不明显, 较小且模糊, 第三天后死亡的乌鳢内脏 ( 肝脾肾等 ) 出现明显的白点 ; 从肝脏白点中分离出优势菌株, 经鉴定是舒伯特气单胞菌, 再次人工感染也出现类似的症状通过 SPSS

4 3 期莫金凤, 等 : 乌鳢源舒伯特气单胞菌生物学特性及其药物敏感性分析 48 表 2 舒伯特气单胞菌 ATCC43 株和 WL4 株的生理生化特性 Tab. 2 Biochemical and physiological characteristics of A. schubertii ATCC43 strain and WL4 strain 生化项目 biochemical item 结果 ( 阳性 +/ 阴性 ) positive(+)/negative() result 生化项目结果 ( 阳性 +/ 阴性 ) positive(+)/negative() result ATCC43 WL4 biochemical item ATCC43 WL4 L 阿拉伯糖 Larabinose 水杨素 salicine 乙酸盐 sodium acetate 丝氨酸同化 Lserine 丙二酸盐 sodium malonate 丙酸盐同化 acidepropionique 蔗糖 Dsaccharose L 鼠李糖 Lrhamnose D 山梨醇 Dsorbitol 脯氨酸 Lproline 衣康酸盐同化 acideitaconique 2 酮基葡萄糖 potassium 2cétogluconate 辛二酸盐同化 acide subérique 5 酮基葡糖酸盐 potassium 5cétogluconate 3 羟基丁酸盐 acide 3hydroxybutyrique DL 乳酸盐同化 acidelactique D 蜜二糖 Dmelibiose D 葡萄糖 Dglucose + + D 核糖 Dribose + + 糖原 glycogène + + N 乙酰葡萄糖胺 Nacétylglucosamine 4 羟基苯甲酸盐同 acide 4hydroxybenzoïque 3 羟基苯甲酸盐同 acide 3hydroxybenzoïque 柠檬酸盐利用 trisodium citrate 肌醇 inositol 组氨酸同化 Lhistidine + L 岩藻糖 Lfucose 戊酸盐同化 acidecalérique + D 甘露醇 Dmannitol 葵酸盐 acidecaprique + D 麦芽糖 Dmaltose + + 丙氨酸同化 Lalanine + 氧化酶 oxidase + + 溶血 hemolysis + + 没有死亡, 实验结束后解剖, 内脏也没有出现明显的病变症状 ( 表 4) 2.4 致病因子图 1 3 C 时舒伯特气单胞菌 WL4 菌株的生长曲线 Fig. 1 Growth curve of A. schubertii WL4 strain at 3 C 16. for Windows 软件辅助计算 WL4 菌株的 LC 5, 结果为 CFU/mL( 表 3) 而感染了 ATCC43 菌的乌鳢没有死亡, 实验结束后解剖, 内脏也没有出现相关的病变症状使用 CFU/mL 浓度的 WL4 菌液腹腔注射感染健康乌鳢, 水温在 (29±1) C 时, 乌鳢的死亡率达 66%, 而水温为 (23±1) C 时, 感染的乌鳢舒伯特气单胞菌溶血性蛋白酶活性及脂肪酶活性结果 WL4 和 ATCC43 菌株在 5% 绵羊血平板上 3 C 静置培养 24 h 后, 菌落周围均出现了溶血圈 ( 图 5a); 在 1% 脱脂奶 TSA 平板上 3 C 培养 24 h 后, 菌落周围均出现清晰透明的圈 ( 图 5 b); 在 1% 吐温 8TSA 培养基中 3 C 培养 24 h 后, 菌落周围均出现白色沉淀带 ( 图 5c); 表明两株菌株均具有溶血性蛋白酶活性和脂肪酶活性舒伯特气单胞菌溶血素弹性蛋白酶及脂肪酶基因的扩增通过 PCR 扩增, 在 ATCC43 菌株上获得 39 bp 片段的 hly 基因, 与 GenBank 上登录的嗜水气单胞菌 (Sb)hemolysin 基因的同源性达 92%( 图 6); 从 WL4 菌株和 ATCC43 菌株上分别获得 515 和 499 bp 片段的 ela 基因, 分别与 GenBank

5 488 水图2 学报 4 卷温度对舒伯特气单胞菌WL4菌株生长的影响 Effect of temperature on the growth of A. schubertii WL4 strain Fig. 2 图3 3 C时pH值对舒伯特气单胞菌WL4菌株生长的影响 Effect of ph on the growth of A. schubertii WL4 strain at 3 C Fig. 3 图4 Fig. 4 产 3 C时盐度对舒伯特气单胞菌WL4菌株生长的影响 Effect of salinity on the growth of A. schubertii WL4 strain at 3 C 上登录的舒伯特气单胞菌(ZS2125)elastase基磺胺甲唑复方磺胺二甲嘧啶和复方磺胺嘧啶) 因的同源性达99%和GenBank上登录的舒伯特气酰胺醇类(氟苯尼考甲砜霉素氯霉素)及链霉单胞菌 (ATCC43 )elastase基因的同源性达素这8种药物具有耐药性对喹诺酮类(萘啶酸 99%(图) 而在ATCC43 菌株及WL4菌株上诺氟沙星恩诺沙星环丙沙星) 氨基糖苷类均未扩增到脂肪酶基因 (新霉素庆大霉素阿米卡星) 四环素类(多西 2.5 药物敏感性 WL4菌株对磺胺类(磺胺间甲氧嘧啶复方环素四环素) β内酰胺类(氨苄西林头孢噻肟 )及呋喃妥因等 12种药物敏感而 ATCC43 菌株除了对氨苄西林具有耐药性外对其余

6 3期 489 莫金凤等乌鳢源舒伯特气单胞菌生物学特性及其药物敏感性分析表3 Tab. 3 菌株名称 strain 29 C时舒伯特气单胞菌WL4菌株和ATCC43 菌株对乌鳢的人工感染结果 Artificial infection results of A. schubertii WL4 strain and ATCC43 strain at 29 C 菌液浓度/(CFU/mL) concentration 数量/尾 number 累计死亡数/尾 accumulative death number 死亡率% mortality LC5/ (CFU/mL) d 2d 3d 4d 5d 6d d (对照 control) 1 ATCC (对照 control) 1 WL 表4 Tab. 4 无 none 不同温度下舒伯特气单胞菌WL4菌株对乌鳢的人工感染结果 Artificial infection results of A. schubertii WL4 strain at different temperature 感染温度/ C infection temperature 菌液浓度/(CFU/mL) concentration 数量/尾 number 29± ± 图5 累计死亡数/尾 accumulative death number 死亡率/% mortality 1d 2d 3d 4d 5d 6d d 舒伯特气单胞菌WL4和ATCC43 菌株毒力因子表型结果 (a)溶血性 (b)蛋白酶活性 (c)脂肪酶活性 Fig. 5 Phenotypic determination of virulence factors of A. schubertii WL4 strain and ATCC43 strain (a) hemolytic; (b) positive for protease; (c) positive for lipase 19种药物都敏感(表5) 3 讨论鳖类 [4, 1819] 而正常情况淡水养殖水环境的pH值大多在6.5~8.5 还未见有海水动物受舒伯特气单胞菌感染发病的报道这与高盐度能抑制舒伯 WL4菌株的生长特性测试结果显示菌株特气单胞菌生长的实验结果相吻合人工感染的最适生长温度为3 C 最适生长盐度为5 最实验结果显示感染病原菌后的乌鳢在适生长pH值为到目前为止舒伯特气单胞菌 (29±1) C的条件下时会发病死亡而在引起水产动物患病的报道均为淡水养殖鱼类和 (23±1) C的条件下未发病死亡细菌性病原引发

49 水产学报 4 卷图 6 舒伯特气单胞菌 hly 基因 PCR 结果 1. DNA Marker;2. ATCC43;3. WL4;4. 阴性对照 Fig. 6 PCR amplification of haemolysin gene of A. schubertii WL4 and ATCC43 strains 1. DNA Marker; 2. ATCC43; 3. WL4; 4.

7 49 水产学报 4 卷图 6 舒伯特气单胞菌 hly 基因 PCR 结果 1. DNA Marker;2. ATCC43;3. WL4;4. 阴性对照 Fig. 6 PCR amplification of haemolysin gene of A. schubertii WL4 and ATCC43 strains 1. DNA Marker; 2. ATCC43; 3. WL4; 4. negative control 1. DNA Marker; 2.ATCC 43; 3.WL4;4. 阴性对照图 ela 基因 PCR 结果 Fig. PCR amplification of elastase gene of A. schubertii WL4 and ATCC43 strains 1. DNA Marker; 2. ATCC43; 3. WL4; 4. negative control 的水生动物疾病的暴发流行特征, 与菌株的生长特性关系密切, 高温养殖季节应提前预防舒伯特气单胞菌感染引起乌鳢类结节病的发生 ; 运输和投放乌鳢苗种时, 可考虑用偏酸性或碱性消毒剂浸泡消毒, 抑制病原菌的生长 ; 同时可适当提高养殖水体 ph 值以防控病害的暴发药物敏感性实验结果显示,ATCC43 菌株除对氨苄西林耐药外, 对其余 19 种药物均敏感 ; 而 WL4 菌株对磺胺类 (SMM SXT SM2/TMP SD/TMP) 及酰胺醇类 (FFC THI C) 等药物均产生了耐药性, 这可能与这些药物在 [2] 水产养殖中使用普遍且时间较长有关李爱华也认为, 多数情况下细菌对某种药物产生抗性只发生在该药物引入使用之后, 耐药菌株比例随药物使用的增加而增加同时,WL4 菌株对新霉素多西环素恩诺沙星诺氟沙星等水产准许使用的药物仍具有较强的敏感性 ; 在水产养殖高温季节可使用新霉素多西环素恩诺沙星诺氟沙星等对舒伯特气单胞菌引起的乌鳢类结节病进行防控此外, 绝大多数的气单胞菌对氨苄西林均具有固有的耐药性, 常在培养基中添加氨苄西林用于筛选培养气单胞菌 ; 但 WL4 菌株却对其敏感, 氨苄西林对 WL 4 菌株作用的特性及新药开发与利用的可行性均有待进一步深入研究和探讨本研究涉及的 WL4 菌株是刘春等 [] 211 年在广东省中山地区养殖场分离到的一株引起乌鳢患类结节病的病原菌, 对乌鳢具有致病性 ; 而舒伯特气单胞菌模式菌株 ATCC43 来源于人的前额脓肿 [21], 对小鼠有致死性 [22] 溶血素弹性蛋白酶和脂肪酶是气单胞菌重要的毒力因子气单胞菌溶血素是一种成孔毒素, 作用于细胞膜, 造成结构和功能的紊乱, 使大量细胞内的成分泄露, 导致细胞死亡, 与致病性有密切关系 [2325] 弹性蛋白酶是胞外蛋白酶的一种, [26] 以降解不溶性弹性蛋白为特征, 刘永杰等证明了弹性蛋白酶是嗜水气单胞菌的一种重要毒力因子脂肪酶被认为与微生物营养代谢有关, 是一种细菌的毒力因子, 抵抗白细胞 [2] 虽然, WL4 和 ATCC43 菌株都具有溶血性蛋白酶活性和脂肪酶活性, 但本试验只扩增到 WL4 菌株的 ela 基因, 而 ATCC43 菌株扩增出了 hly 和 ela 基因 WL4 菌株没能扩增到 hly 基因, 可能该菌株的溶血素由其他基因编码或者由多基因编码 ; 也可能该菌株的溶血性不是由溶血素主 [28] 导, 比如气溶素也具有溶血性,Kannan 等就曾从粪便样本中分离到具有气溶素的舒伯特气单 [29] 胞菌 ;Yutaka 等从虾样品分离的舒伯特气单胞 [3] 菌扩增到气溶素基因 ; 程方俊在国内首次成功克隆了感染淡水鱼类的温和气单胞菌的脂肪酶基因 ; 但舒伯特气单胞菌脂肪酶基因还未见有成功克隆的报道不同来源舒伯特气单胞菌的致病性存在差异, 或许与菌株的毒力基因存在差异有关, 目前关于舒伯特气单胞菌致病因子的相关报道较少, 致病因子表型与基因型间的联系及致病因子与致病性间的关系都值得进一

8 3 期莫金凤, 等 : 乌鳢源舒伯特气单胞菌生物学特性及其药物敏感性分析 491 药物名称 drug 磺胺间甲氧嘧啶 SMM 磺胺甲噁唑 / 甲氧苄啶 SXT/TMP 磺胺二甲嘧啶 / 甲氧苄啶 SM2/TMP 表 5 舒伯特气单胞菌 WL4 菌株 MIC 及药物敏感性结果 Tab. 5 MIC results and susceptibility of A. schubertii WL4 strain 药物敏感性折点 /(mg/l) breakpoint MIC 结果 /(mg/l) 及药物敏感性 MIC results and susceptibility 敏感 (S) 耐药 (R) sensibility resistance ATCC43 WL S >512 R 2/38 4/6 9.5/.5 S >6/4 R 2.5/.5 S >2/4 R 磺胺嘧啶 / 甲氧苄啶 SD/TMP 2.5/.5 S >2/4 R 多西环素 DO S.5 S 四环素 TE S.5 S 萘啶酸 NA S 8 S 环丙沙星 CIP S.5 S 诺氟沙星 NOR S 1 S 恩诺沙星 ENR S.5 S 新霉素 N S 1 S 庆大霉素 CN S.25 S 阿米卡星 AK S.5 S 链霉素 S 4 32 R 氨苄西林 AMP R 4 S 头孢噻肟 CTX S.12 S 氯霉素 C S 64 R 氟苯尼考 FFC S 32 R 甲砜霉素 THI 2 S >32 R 呋喃妥因 F S 4 S 注 :. 磺胺二甲嘧啶 / 甲氧苄啶磺胺嘧啶 / 甲氧苄啶链霉素和甲砜霉素在 CLSI 中没有相关的耐药判定标准 Notes:. no interpretive criteria provided for sulphamethazine/trimethoprim, sulfadiazine/trimethoprim, streptomycin and thiamphenicl in CLSI 步研究编委推荐 : 聂品 ( 中国科学院水生生物研究所, 研究员 ) 何建国 ( 中山大学生命科学学院, 教授 ) 参考文献 : [ 1 ] 胡静仪, 王金良. 气单胞菌属分类与鉴定方法 [J]. 国外医学临床生物化学与检验学分册, 24, 25(5): Hu J Y, Wang J L. Classification and identification methods of Aeronmonas[J]. Foreign Medical (section of Clinical Biochemistry and Laboratory Medicine), 24, 25(5): 48 49(in Chinese). [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] Chao C M, Lai C C, Tang H J, et al. Skin and softtissue infections caused by Aeromonas species [J]. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 213, 4(32): Kao T L, Kao M L. A fatal case of necrotizing Aeromonas schubertii fasciitis afer penetrating injury [J]. American Journal of Emergency Medicine, 212, 3: 258. e e5. Liu J Y, Li A H. First case of Aeromonas schubertii infection in the freshwater cultured snakehead fish, Ophiocephalus argus(cantor), in China [J]. Journal of Fish Diseases, 212, 35: 罗霞, 邓国成, 廖国礼, 等. 斑鳢内脏白点病病原的分

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11 494 水产学报 4 卷 Biological characteristics and drug susceptibility of Aeromonas schubertii WL4 isolated from snakehead MO Jinfeng 1, JIANG Lan 2, WU Zaohe 1 * (1. Key Laboratory of Aquatic Disease & Waterfowl Breeding of Guangzhou, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 51225, China; 2. Key Laboratory of Fishery Drug Development, Ministry of Agriculture, Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 5138, China) Abstract: Aeromonas schubertii had caused snakehead disease with white spots in internal organs, which resulted in economic losses in snakehead industry. In this study, A. schubertii strain WL4 which was isolated from the snakehead (Channa maculate C. argus ) was analyzed in relation with its physiology and biochemistry characteristics, its growth characteristics and virulence factors, and its susceptibility was tested against 2 antibiotics. Its physiology and biochemistry characteristics were tested by using bacterial biochemical identification instrument and its growth situation was analyzed at different temperatures, salinities and ph values. In comparison with the type strain, A. schubertii ATCC43, A. schubertii WL4 strain was almost same as the type strain in major physiological and biological characteristics. Moreover, 16S rrna gene of A. schubertii WL4 strain is 99. 9% similar to that in A. schubertii ATCC43. The results of growth characteristics showed that the WL4 strain's optimum growth temperature was 3 C, optimal salinity was 5 and optimum ph was. In addition, the WL4 strain exhibited virulence to snakeheads (25±5)g in experimental challenges with LC 5 being CFU/mL. The WL4 strain was positive for hemolytic activity, and elastase and lipase activity by phenotypic determination. Susceptibility tests, which detected the minimum inhibition concentration (MIC) of 2 antibacterial agents by trace double dilution method, showed that the strain WL4 was resistant to sulfonamides and amide alcohols, and susceptible to enrofloxacin, norfloxacin, doxycycline, neomycin, ampicillin and so on. In conclusion, biological characteristics of the WL4 strain were consistent with the occurrence of the disease with white spots in snakeheads' internal organs which were caused by A. schubertii. In addition, the results of antibacterial susceptibility tests may have an applied value in the control of A. schubertii infection agents in aquaculture. Key words: Aeromonas schubertii; growth characteristics; virulence factors; drug susceptibility Corresponding author: WU Zaohe. wuzaohe@163. com Funding projects: Science and Technology Plan of Guangzhou (2132); Science and Technology Plan of Guangdong province(211b231).

2月5期aa

2月5期aa 中国农学通报 212,28():2-27 Chinese Agricultural cience Bulletin 血清 11 型鸭疫里默氏菌的分离鉴定 1,2 2, 2, 2, 2, 2, 2, 杨晓辉, 程龙飞, 陈红梅, 施少华, 傅光华, 万春和, 黄瑜 ( 1 福建省农业科学院畜牧兽医研究所, 福州

3 期莫金凤, 等 : 乌鳢源舒伯特气单胞菌生物学特性及其药物敏感性分析 仪器设备 ATB 细菌半自动鉴定仪 ( 法国 Biomerieux 公司 ), 麦氏比浊仪 ( 法国 Biomerieux 公司 ) 人工感染实验在室内 1 m 1 m.5 m 水泥池 进行, 具充氧和控温设备

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