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哲钗郎
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1 上海市胸科医院上海交通大学附属胸科医院 SHANGHAI CHEST HOSPITAL SHANGHAI CHEST HOSPITAL SHANGHAI JIAOTONG UNIVERSITTY 液态活检在肺癌早期及个体化诊疗中的应用娄加陶

2 液态活检 (liquid biopsy) 通过捕获外周血中的循环肿瘤细胞 (CTC) 血浆游离 DNA (cfdna) 循环肿瘤 DNA (ctdna), 或对外泌体唾液尿液及其他体液的检测代替活检, 探索疾病

3 CTC 1869 年发现, 携带原发灶和转移灶的信息,2007 年被 ASCO 推荐为肿瘤标志物, 浓度为 1/ 液态活检 1948 年首次发现, 来自肿瘤细胞, 也来自机体内的正常细胞 cfdna 1994 年发现肿瘤循环 DNA 含有癌症的标志性突变, 约占 cfdna 的 1~0.01% ctdna Ashworth TR et al. Australian Medical Journal, 1869 Schwarzenbach H et al. Nat Rev Cancer.2011

4 液态活检在肿瘤领域的应用 Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology14,73 74(2017)

5 液态活检在肺癌领域的应用肺癌早期诊断肺癌个体化诊疗

6 肺内孤立性结节 (SPN) 孤立性结节 ( Solitary Pulmonary Nodule,SPN) 肺实质内单发类圆形直径不超过 30mm 的结节影, 不伴有肺门或纵膈淋巴结肿大肺不张或肺炎根据 HRCT 上的密度分为 : 纯磨玱璃密度 (PGGO)SPN, 混合磨玱璃密度 (MGGO)SPN, 实性 SPN

7 难题 :SPN 的良恶性鉴别诊断 SPN 良性病变居多 : 炎性肉芽肿 (40-50%) 恶性 SPN 中 : 以支气管肺癌为多 (30-40%) 临床评估年龄因素吸烟史肿瘤家族史职业暴露史 <30 岁 : 通常为良性, 但需随访, 观察两年岁 : 大多数良性, 恶性丌罕见 >40 岁 : 恶性相当常见影像学评估结节大小结节密度结节边界特征

8 SPN 诊治共识上海市胸科医院 (2013) 新发现的孤立性肺部小结节良性钙化或 2 年随访稳定直径 8-30mm 直径 <8mm 除 GGN 外不处理恶性概率判断 4mm 4-6mm 6-8mm 低概率 <5% 个月 CT 随访阴性可疑结节 5%~60% 进一步检查 PET 增强 CT 针吸活检支气管镜活检高概率 >60% 阳性 VATS, 若病理为恶性, 需进一步手术切除无风险因素无需随访有肺癌风险因素 12 个月随访, 若稳定, 无需进一步随访无风险因素 12 个月随访, 若稳定, 无需进一步随访有肺癌风险因素 6-12 个月内随访, 若稳定, 个月再随访无风险因素 6-12 个月随访, 若稳定,18-24 个月再随访有肺癌风险因素 3-6 个月内随访, 若稳定, 9-12 个月随访一次,24 个月再随访一次

9 SPN 诊治现状 CT 筛查存在 18-25% 的过度诊断率上海市胸科医院肺部小结节接受手术治疗的患者中, 术后病理证实约 18% 为良性结节

10 叶酸受体阳性循环肿瘤细胞 FR 阳性靶标负向富集靶向 PCR 83% 肺癌细胞 FR( 叶酸受体 ) 高度表达 CTC:FR=1:50 万 EMT 转化不影响 FR 丰度其他血细胞不表达 FR CTC 回收率接近 100% 磁珠富集易操作和自动化灵敏度超高, 负向富集即可检测信号二次放大,1: 倍放大无需人工经验判读, 结果客观准确可实现 CTC 的定量

11 CTC vs 肺癌鉴别诊断 Cutoff: 8.70 CTC Units/3mL 灵敏度 :79.6% 特异度 :88.2% 阳性预测值 88.3%(446/505) 阴性预测值 79.5%(441/555) AUC: Jiatao Lou, et al. Plos One 2013; Lin Wang, et al. JOC 2016.

Sensitivity% CTC vs 肺癌早期诊断 100 80 60 All NSCLCS Stage Ⅰ Stage Ⅱ Stage Ⅲand Ⅳ 与其他肿瘤标志物相比,I 期肺癌

12 Sensitivity% CTC vs 肺癌早期诊断 All NSCLCS Stage Ⅰ Stage Ⅱ Stage Ⅲand Ⅳ 与其他肿瘤标志物相比,I 期肺癌敏感性提高 10 倍 CTC CEA NSE CA211 SCCA CTC 对 Ⅰ 期肺癌的阳性检出率高达 67.2%, 其他最优的肿瘤标志物的敏感度仅为 32.3% 12

13 CTC 检测 1cm 以下肺内孤立性结节直径大小 8.7/3mL blood(no.) 患者总数阳性率 (%) 1cm % CTC 对 1cm 的肺部结节阳性检出率高达 71.9%

CTC 联合 CT 诊断肺内孤立性结节肿瘤大小 CT 特异性 (%) CT+CTC 特异性 (%) 30 mm (n=134) 82.7 94.

14 CTC 联合 CT 诊断肺内孤立性结节肿瘤大小 CT 特异性 (%) CT+CTC 特异性 (%) 30 mm (n=134) mm (n=44 ) 10-20mm (n=69 ) <10mm (n=21) CTC 联合 CT 可以大大提高小结节诊断的特异性

15 液态活检液态活检 ctdna 在肺癌早期诊断及个体化诊疗中的应用

CAPP-seq 不早期肺癌检测 Sensitivity:0.02% stage Ⅰ :50%(only 4 patients); % ctdna a Total plasma DNA (ng ml -1 ) ctdna (pg ml -1 ) ctdna detection index b ND 15.571 ND NS 0.025 7.

16 CAPP-seq 不早期肺癌检测 Sensitivity:0.02% stage Ⅰ :50%(only 4 patients); % ctdna a Total plasma DNA (ng ml -1 ) ctdna (pg ml -1 ) ctdna detection index b ND ND NS ND ND NS < < early stage (ⅠA+ⅠB+Ⅱ): 6 patients Nat Med. 2014May;20(5):

17 超灵敏 ides-enhanced CAPP-Seq 方法 in silico elimination of highly stereotypical background artifacts a molecular barcoding strategy Sensitivity in plasma : 0.004% Nat Biotechnol May; 34(5):

18 ides-enhanced CAPP-Seq 不早期肺癌诊断血浆检测敏感性 : 0.004% Ⅰ 期病人 : 3 例血浆检出突变与组织中的突变一致率不高 : 2/22 Nat Biotechnol May ; 34(5):

19 ctdna NGS 技术 VS 早期肺癌基因方法 :targeted amplicon sequence 检测 panel:17 个 gene,82 个 hotspot 方法学灵敏度 :0.1% ~ 0.2% Gene CHR Amplicon Num. Gene CHR Amplicon Num. NRAS chr1 3 FGFR1 chr8 2 DDR2 chr1 7 PTEN chr10 9 ALK chr2 3 KRAS chr12 3 ERBB4 chr2 8 AKT1 chr14 1 PI3KCA chr3 9 MAP2K1 chr15 1 FGFR3 chr4 5 TP53 chr17 8 EGFR chr7 8 ERBB2 chr17 3 MET chr7 6 STK11 chr19 4 BRAF chr7 2

20 早期肺癌血浆靶向测序结果对象 :30 例早期非小细胞肺癌病人早期肺癌血浆检测敏感性 :16/30=56.7%

21 现象 : 血浆不组织基因突变对比血浆检出突变不组织中检出的突变一致率很低 : 2/27 case Gene RNA change Protein Change frequency(%) detected in plasma P1503 KRAS c.37g>t p.gly13cys 26.6 N Y P1503 STK11 c.824dupc p.asp277argfster N Y P1503 CTNNB1 c.134c>t p.ser45phe 13 N Y P1504 EGFR c.2573t>g p.leu858arg 1.5 Y Y P1504 TP53 c.524g>a p.arg175his 0.66 Y N P1512 EGFR c.2573t>g p.leu858arg 22.1 Y Y P1512 TP53 c.524g>t p.arg175leu 23.4 N Y P1512 TP53 c.799c>t p.arg267trp 1 N Y P1512 TP53 c.850a>c p.thr284pro 1.92 Y N P1512 EGFR c.2125g>t p.glu709ter 1.09 Y N P1515 TP53 c.818g>a p.arg273his 38.6 N Y P1515 EGFR c.2235_2249delggap.glu746_ala750del 44.5 N Y P1516 EGFR c.2573t>g p.leu858arg 14.1 N Y P1516 TP53 c.578a>c p.his193pro 40.7 N Y P1516 TP53 c.1003c>a p.arg335ser 1.25 Y N P1516 TP53 c.473g>a p.arg158his 0.95 Y N P1517 EGFR c.2235_2249delggap.glu746_ala750del 13 N Y P1517 EGFR c.1458_1467delgaap.lys487leufster Y N P1519 TP53 c.396g>c p.lys132asn 1 N Y P1519 FGFR3 c.773_796delggctgp.gly258_ala265del 1.67 Y N P1519 TP53 c.382c>a p.pro128thr 0.2 Y N P1519 PTEN c.890_891delat p.asp297alafster Y N P1523 EGFR c.2573t>g p.leu858arg 10.1 N Y P1525 TP53 c.848g>a p.arg283his 0.83 Y N P1526 EGFR c.2573t>g p.leu858arg 22.4 N Y P1533 EGFR c.2573t>g p.leu858arg 13.4 N Y P1533 TP53 c.1003c>a p.arg335ser 0.27 Y N detected in FFPE

22 c fd N A c o n.(n g /m l) cfdna 浓度不临床特征的关系 clinical feature Parameter value n con.(avg±sd) P-value age sex size <=60 Male <= ± ± ±2.25 >60 Female > ± ± ± ⅠA ±3.48 stage ⅠB ±4.96 Ⅱ-Ⅲ ± IV ±6.71 VPI N ±4.00 Y ± < = 2 c m * * > 2 c m T u m o r s iz e cfdna 浓度与肺部恶性孤立性小结节的大小密切相关

23 ctdna 不肺癌个体化诊疗肺癌个体化治疗依赖于个体化分子诊断

24 NSCLC 分子靶点不靶向用药中国 NSCLC 人群 : 30~40% 白种 NSCLC 人群 : 10~20% 在靶向治疗前有必要对相关分子靶点进行检测 Vari S, et al. Expert Opin Drug Discov, 2013.

25 靶向治疗中疗效监测 2/3 的病人在 EGFR TKI 进展后, 会产生 T790M 突变在靶向治疗过程中有必要对耐药突变进行监测

26 多种样本的获取方式和优缺点

27 耐药 T790M 突变检测挑战? 373 例初治的患者,298 例患者存在 T790M 突变, 比例高达约 80% 突变丰度 <1% 的患者比例为 98%, 突变丰度 >1% 的患者比例仅为 2%; 目前,ARMS 法的灵敏度为 1%, 无法检测绝大多数 T790M 突变 ; Masaru etal, Clin Cancer Res(2015) ARMS 方法 Digital PCR 的必要性

28 外周血 EGFR 基因检测平台 ARMS ddpcr NGS 1 st Gen 2 nd Gen 开发商平台测序原理开发商平台测序原理 Roche Cobas v1 Cobas v2 Amoy ARMS Super ARMS Bio-RAD QX200 微液滴数字 Illumina MiSeq 边合成边测序 Qiagen Therascree n Rain- Dance RainDrop 微液滴数字 Life Tech Ion torrent 半导体测序 Source: public company website

29 Observed mutant% Observed mutant% Observed mutant% 数字 PCR 检测 EGFR 突变线性评估 R 2 = Del R 2 =0.994 L858R Expected mutant% Expected mutant% R 2 =0.993 T790M Expected mutant%

30 数字 PCR 检测空白限的设定 19-Del Normalized count L858R 设定为 1 Normalized count 19-Del 设定为 1 False positive droplet events False positive droplet events Normalized count T790M T790M 设定为 1 False positive droplet events 利用 20 例健康体检者的 cfdna 进行检测, 将泊松分布的 95% 置信区间上限作为参考上限, 设定为空白检出限阳性判断标准 :>LOB

数字 PCR vs ARMS 血浆 EGFR 检测 ddpcr 19-Del 合计 + + 32 3 35 ARMS 17 188 205 合计 49 191 240 P 值 0.

31 数字 PCR vs ARMS 血浆 EGFR 检测 ddpcr 19-Del 合计 ARMS 合计 P 值 ddpcr L858R 合计 a'a 1 27 ARMS 合计 P 值 <0.001 ddpcr T790M 合计 ARMS 合计 P 值 <0.001

32 数字 PCR vs NGS 血浆 EGFR 突变检测 8 例临床血浆样本测试结果 : ddpcr 和 NGS 对于血浆 EGFR 突变检测有较好的一致性样本编号样本类型突变类型 ddpcr NGS S1 S2 S3 S4 S5 S6 S8 血浆血浆血浆血浆血浆血浆血浆 19-del 1.90% 1.09% T790M 0.60% 0.63% 19-del 1.00% 0.78% T790M 0.70% 0.46% 19-del 0.44% 0.55% T790M 0.00% 0.06% 19-del 0.12% 0.07% T790M 0.00% 0.06% L858R 1.70% 1.94% T790M 0.79% 0.70% L858R 0.80% 0.70% T790M 0.28% 0.27% L858R 0.60% 0.30% T790M 0.00% 0.06%

33 总结平台随着技术的发展成熟, 不同平台可依据各自的特色满足不同的临床需求液态活检样本液态活检在肿瘤早期及个体化诊断方面有巨大的应用潜力和优势需求肺癌早期筛查及肺部孤立性结节鉴别诊断是目前临床需解决的实际问题肺癌的个体化诊断是实现个体化治疗的前提

34 上海市胸科医院上海交通大学附属胸科医院 SHANGHAI CHEST HOSPITAL SHANGHAI CHEST HOSPITAL SHANGHAI JIAOTONG UNIVERSITTY 谢谢!