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谦元
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1 J South Med Univ, 2014, 34(6): doi /j.issn 临床研究 ICSI 中不同来源精子对卵母细胞受精胚胎质量及发育潜能的影响谢多, 邱卓琳, 罗琛, 褚庆军, 全松南方医科大学南方医院生殖医学中心, 广东广州摘要 : 目的研究卵胞浆内单精子注射技术 (ICSI) 中不同来源精子对卵母细胞受精胚胎质量及发育潜能的影响方法回顾性分析我中心因单纯男性因素行 ICSI 助孕治疗的 197 例患者的临床资料, 按不同精子来源分为射精组 (n=102) ESA 组 (n=68) TESA 组 (n=27)3 组, 其中将射精组又分为严重少弱畸精子症组 (n=67) 和隐匿精子症组 (n=35) 比较 4 组间受精率优质胚胎率新鲜胚胎移植周期的着床率及妊娠率, 以及低质胚胎继续培养的优质囊胚形成率结果少弱畸精子射精组隐匿精子射精组 ESA 组 TESA 组的正常受精率分别为 64.8% 62.1% 75.6 % 61.6%, 其中 ESA 组明显高于其它 3 组 (<0.05),4 组的优质胚胎率新鲜胚胎移植周期的着床率及妊娠率无明显差异 (>0.05) 4 组间低质胚胎继续培养的优质囊胚形成率也无显著差异 (>0.05) 结论 ESA 来源的精子 ICSI 中正常受精率较高, 但在 ICSI 中不同来源精子对胚胎质量及发育潜能无显著影响关键词 : 卵胞浆内单精子注射技术 ; 精子来源 ; 胚胎质量 ; 胚胎发育潜能 Effect of spermatozoa from different sources on normal fertilization of oocytes and embryo quality and development in intracytoplasmic sperm injection cycles XIE Duo, QIU Zhuolin, LUO Chen, CHU Qingjun, QUAN Song Center of Reproductive Medicine, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou , China Abstract: Objective To evaluate the impact of spermatozoa from different sources on normal fertilization of oocytes, embryo quality and embryo developmental potential in intracytoplasmic sperm injection (ICSI) cycles. Methods A retrospective analysis was conducted among 197 patients undergoing ICSI cycles in our center. The patients were classified into 3 groups according to the sources of semen, namely ejaculated spermatozoa group (n=102), percutaneous epididymal sperm aspiration (ESA) group (n=68), and testicular sperm aspiration (TESA) group (n=27). The ejaculated spermatozoa group was further classified into oligoasthenoteratozoospermia (n=67) and cryptozoospermia (n=35) subgroups. The normal fertilization, high-quality embryo, implantation and clinical pregnancy rates were compared among the groups; the rate of high-quality blastocyst formation in in-vitro culture of non-top quality embryos was also observed. Results The patients with ESA showed significantly higher normal fertilization rate (75.6% ) than those in oligoasthenoteratozoospermia (64.8% ), cryptozoospermia (62.1%), and TESA (61.6%) groups (<0.05). No significant differences were found in the high-quality embryo, implantation, and clinical pregnancy rates among the groups (>0.05). The rate of high-quality blastocyst formation in the in-vitro culture of non-top quality embryos was also comparable among the groups (>0.05). Conclusion Although spermatozoa obtained with by ESA is associated with a higher normal fertilization rate, the sources of spermatozoa do not significantly affect the embryonic quality and developmental potential in ICSI cycles. Key words: intracytoplasmic sperm injection;sources of spermatozoa; embryo quality; blastocyst; developmental potential, embryo 卵胞浆内单精子注射技术 (Intracytoplasmic sperm injection ICSI) 可以在显微镜下选择单个精子直接注射至卵胞浆内使卵母细胞受精, 该技术可避免因精子功能异常所致的受精失败, 成为治疗男性不育的里程碑用于 ICSI 的精子可通过射精和手术取精方式获取, 然而既往关于不同来源的精子对于 ICSI 结局影响的文献报 [1-2] 道多存有争议因此, 本研究选择因单纯男性因素而行 ICSI 的患者作为研究对象, 旨在阐明 ICSI 中不同来收稿日期 : 基金项目 : 卫生行业科研专项基金 ( ) 作者简介 : 谢多, 在读博士研究生, xie.duo18@gmail.com 通信作者 : 全松, 教授, 博士生导师, quansong2008@gmail.com 源精子对卵母细胞受精胚胎质量及发育潜能的影响 1 资料与方法 1.1 研究对象选择 2012 年 4 月 ~2013 年 10 月在南方医科大学南方医院生殖中心行 ICSI 治疗的原发性不育症患者 197 例作为研究对象, 纳入标准为 :(1) 单纯男方因素 ( 严重少弱畸精症隐匿无精子症梗阻性无精症等 ), 染色体核型分析正常 ;(2) 女方为原发性不孕, 月经周期规律 (27~ 34 d), 基础激素水平在正常范围 ( 月经第 3 天血 FSH< 10 U/L), 排除子宫内膜异位症子宫肌瘤等因素 ;(3) 均为第 1 次促性腺激素释放激素激动剂 (GnRH-a) 长方案

2 858 J South Med Univ, 2014, 34(6): 控制性卵巢刺激 (COS) 周期 1.2 研究对象分组 197 例研究对象按照不同精子来源分为射精组经皮附睾穿刺抽吸精子组 (ESA) 和经皮睾丸穿刺抽吸精子组 (TESA)3 组, 其中射精组又分为隐匿精子症组和少弱畸精子症组具体分组如下 :A1 组为严重少弱畸精子症射精组 (n=67);a2 组为隐匿精子症组 (n=35);b 组为 ESA 组 (n=68), 包括梗阻性无精子症患者 (OA);C 组为 TESA 组 (n=27), 包括 OA 患者非梗阻性无精症 (NOA) 患者上述分组所用的诊断标准采用 WHO 第 5 [3] 版的标准 1.3 控制性卵巢刺激方案常规采用黄体中期 GnRH-a 长方案进行 COS 周期, 降调 14 d 时, 测定激素水平子宫内膜厚度和窦状卵泡直径, 确定达到降调标准后 ( 内膜厚度 5 mm E 2 50 pg/ml LH 5 U/L FSH<5 U/L 窦状卵泡直径均 <8 mm), 应用 150~300 U 促性腺激素 (Gn) 启动 COS 周期, 并根据 B 超监测的卵泡情况和血清 LH E 2 水平调整 Gn 用量, 当 3 个主导卵泡直径达到 18 mm 时, 肌注 [4] hcg 4000~ U,36 h 后 B 超引导下取卵 1.4 精子获取和处理射精组患者取精前禁欲 3~7 d, 取卵日当天采取手淫法取精 ;ESA 组和 TESA 组按中心常规方法进行取 [4] [5] 精, 对获取的精子进行按文献方法相应处理 1.5 受精卵裂胚胎质量观察按常规方法行 ICSI 后 16~18 h 观察有无原核形成, 以双原核 (2N) 为正常受精分别于受精后 41~43 h,61~ 69 h 察看胚胎卵裂情况, 并计录卵裂球数目根据卵裂球大小均匀与否及核碎片量的多少进行胚胎质量评级, 优质胚胎定义为胚胎培养 3 天后细胞数为 7~8 个, 核碎片评级为 Ⅰ~Ⅱ 级的胚胎以上胚胎质量标准参考 [6] eter 卵裂期胚胎评分系统 1.6 低质胚胎的囊胚培养对胚胎移植后剩余的未达到优质胚胎标准的 4 细胞 Ⅱ 级以上的低质胚胎进行囊胚培养, 观察其囊胚形成 [7] 率, 并按照 Gamder 囊胚分级法对囊胚进行评分第 5~6 天观察, 囊胚评级 3 级以上, 内细胞团 (ICM) 和滋养外胚层细胞 (TE) 评分为 A 级或 B 级定义为优质囊胚 1.7 胚胎移植和妊娠新鲜周期胚胎移植均为第 3 天胚胎, 移植后 12 d 检测血 hcg 水平以确定是否怀孕, 移植后 30 d 超声检查, 见宫腔内有孕囊和心管搏动诊断为临床妊娠 1.8 统计学分析用 SSS19.0 统计软件进行数据处理, 计量资料用均数 ± 标准差, 采用单向方差分析 ; 各组受精率优质胚胎率着床率妊娠率和低质胚胎培养的囊胚形成率的比较采用 R C 表卡方检验,<0.05 为差异有统计学意义 ; 组内两两比较按照 Bonferroni 法校正检验水平为结果 2.1 患者基础临床资料比较 4 组患者在基础临床资料方面, 如女方年龄男方年龄不孕年限, 以及女方的基础 FSH E 2 值以及基础窦状卵泡数比较均无统计学差异 (>0.05, 表 1) 2.2 COS 周期中一般资料比较表 1 4 组间患者基础临床资料比较 Tab.1 Comparison of the clinical characteristics of the patients in the groups Infertile Female age (year) Male age (year) duration (year) Basal FSH (IU/L) Basal E2 (pg/ml) Basal antral follicle count (n) A1 (n=67) A2 (n=35) B (n=68) C (n=27) 30.28± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± A1: Ejaculated sperm group with oligoasthenoteratozoospermia; A2: Ejaculated sperm group with cryptozoospermia; B: ESA group; C: TESA group. 4 组患者 COS 期中 Gn 使用剂量 hcg 日 E 2 水平取卵个数均无差异 (>0.05), 但 4 组间正常受精率存在差异,B 组明显高于其它 3 组 (<0.05), 即 ESA 组的正常受精率较高正常受精 (2N) 的卵裂率及优质胚胎形成率 4 组间无统计学差异 (>0.05, 表 2) 2.3 低质胚胎囊胚培养情况比较对正常受精的 D 3 低质胚胎进行囊胚培养, 结果显示 4 组间囊胚形成率优质囊胚形成率均无统计学差异 (>0.05), 说明不同来源精子对低质胚胎的体外发育潜能的影响无差异具体结果见表新鲜周期胚胎移植情况比较各组间行新鲜周期移植的胚胎个数移植的胚胎质量以及移植日内膜厚度均无显著差异 (>0.05),4 组间胚胎着床率和临床妊娠率也无显著差异 (>0.05), 提示不同来源精子对优质胚胎的体内发育潜能的影响无差异具体结果见表 4

3 J South Med Univ, 2014, 34(6): 表 2 4 组间受精率卵裂率及优质胚胎形成率比较 Tab.2 Comparison of the rates of normal fertilization, cleavage, and high-quality embryos among the 4 groups Dosage of Gn (iu) E2 value on hcg day (pg/ml) No.of retrieved oocytes Normal f ertilization rate (%) 2N cleavage rate (%) High-quality embryo rate (%) A1 (n=67) ± ± ± (426/657) 97.7 (416/426) 45.5 (194/426) A2 (n=35) ± ± ± (198/319) 96.5 (191/198) 44.4 (88/198) B (n=68) ± ± ± * (599/792) 96.5 (578/599) 43.9 (263/599) C (n=27) ± ± ± (173/287) < (168/173) (71/173) *<0.05. 表 3 4 组间低质胚胎行囊胚培养的形成率优质囊胚形成率比较 Tab.3 Comparison of the rates of blastulation and high-quality blastocysts in in-vitro culture of non-top quality embryos among the 4 groups No.of non-top quality embroy Blastulation rate (%) High-quality blastocysts rate (%) A (125/210) 44.3 (93/210) A (49/90) 46.7 (42/90) B (157/287) 40.4 (116/287) C (52/104) 41.3 (43/104) 表 4 4 组间新鲜胚胎移植着床率和临床妊娠率的比较 Tab.4 Comparison of implantation rate and clinical pregnant rate in fresh embryo-transfer of four groups No.of embryo transferred cycles No.of transferred embroys No.of transferred High-quality embroys Endometrial thickness (mm) Implantation rate (%) Clinical pregnancy rate (%) A ± ± ± (37/113) 54.7 (29/53) A ± ± ± (24/55) 64.3 (18/28) B ± ± ± (44/102) 63.3 (31/49) C ± ± ± (20/40) 70.0 (14/20) 讨论 ICSI 用于治疗男性因素所致的不育症获得成功 20 余年, 业已证实该技术利用射出精子附睾精子和睾丸精子均可使成熟卵母细胞正常受精形成优质胚胎并获得临床妊娠和分娩, 这是否意味着在 ICSI 中不同来源的精子对卵母细胞正常受精胚胎质量和胚胎发育潜能没有影响呢? 现有的文献报道存在相悖的观点 [1-2, 8-9], 值得进一步研究众所周知, 卵母细胞的体外受精率与精子的质量密切相关, 不同来源的精子在形态质量及成熟度等方面存在差异 [10], 而通过 ICSI 可利用数量和质量达不到体外受精标准的不同来源精子使成熟卵母细胞受精, 尽管有些文献报道在 ICSI 中使用不同来源精子可获得相似的受精率 [1, 11], 但本研究结果显示 ESA 组的正常受精率明显高于 TESA 组 (75.6% vs 61.6%,<0.05), 与上述文 [2] 献报道不同 Hameed 等的研究也发现睾丸来源的精子行 ICSI 后正常受精率低于附睾来源精子, 并认为这样的结果与精子的成熟度密切相关睾丸精子生成后需要在附睾中进一步成熟, 其中包括精子质膜的通透性改变精子核的成熟以及顶体外膜抗原分布的改变, 最终才能使精子获得运动能力及受精能力而睾丸抽吸的成熟精子比例较低 [12], 使用这样的精子会直接影响卵子的激活, 从而影响正常受精, 与本研究结果一致值得注意的是本研究结果显示 ESA 组的正常受精率显著高于严重少弱畸精子症射精组 (75.6% vs 64.8%,< 0.05) 和隐匿性精子症射精组 (75.6% vs 62.1%,< 0.05), 因为射精组中严重少弱畸精子症和隐匿性精子症多是由于睾丸生精功能低下或障碍导致精子数目过少精子畸形率过高, 而在本研究中 ESA 组仅包括 OA 的患者, 一般这类患者的生精功能正常, 但随着精子发生缺陷的程度加重 ( 如严重少弱畸精子症 ), 正常受精率 [13] [14] 会明显下降 Strassburger 等认为极低的精子数目

4 860 J South Med Univ, 2014, 34(6): ( 如隐匿性无精子症 ) 会对 ICSI 的结局产生负面的影响, 而且精子密度低会导致精子染色体异常的出现几率增 [15] 高而影响精子质量正常受精后的卵裂率和优质胚胎率是反映胚胎质量的重要指标, 本研究发现不同来源精子所致卵母细胞 [1, 11] 正常受精后卵裂率无显著差异, 此与文献报道一致受精卵 mrna 的转录从 4~8 细胞阶段开始, 这也标志着父方基因开始表达, 如果精子本身存在缺陷, 就会影响父方基因的表达, 从而会导致胚胎在 5~8 细胞阶段的发 [16] 育缓滞通常受精后 72 h 胚胎应处于 6~8 细胞期或早期致密化, 故受精后第 3 天细胞数为 7~8 个的 Ⅰ Ⅱ 级胚胎被认为是优质胚胎, 具有良好的发育潜能 [8] Amirjannati 等的研究发现睾丸来源的 A 级胚胎 (6~8 细胞, 卵裂球对称, 无碎片 ) 个数明显少于射精来源, 他们认为这可能与精子的成熟度及精子表观遗传学对胚胎质量的影响有关, 但多数的研究结果显示射出精子与睾丸 [9, 17] 精子行 ICSI 后的胚胎质量无明显差异在我们的研究中也观察到 ICSI 中使用不同来源精子获得的胚胎, 其优质胚胎率无显著差异 (>0.05), 提示不同来源的精子一旦使成熟卵母细胞正常受精后并不影响胚胎的质量囊胚形成率是评估胚胎在体外发育潜能的指标之一, 成熟卵母细胞在体外正常受精形成胚胎后, 需要经历形态变化和基因调控等多种变化才能发育至囊胚期, 不少胚胎在发育到囊胚前便停止发育有研究表明 D 3 天卵裂球数目与囊胚形成率成正比, 卵裂球数为 6~8 个的胚胎相比小于 6 个的胚胎, 具备更好的发育潜, 同时碎片评级 Ⅰ~Ⅱ 级的 D 3 胚胎的囊胚形成率显著高于 Ⅲ~ [18-20] Ⅳ 级的胚胎, 由此可以看出优质胚胎更容易发育到囊胚期, 形成优质囊胚, 但也有部分低质胚胎在体外培养环境中可发育至囊胚期目前关于不同来源精子 ICSI 后低质胚胎发育潜能的研究报道颇为匮乏, [21] Balaban 等曾报道 NOA 患者 TESA 来源的精子受精后胚胎的囊胚形成率明显低于严重少弱畸精子症患者射精来源及 OA 患者 ESA/TESA 来源的精子, 但该研究是将全部胚胎都进行了囊胚培养本研究特别对比了不同来源精子行 ICSI 后低质胚胎囊胚培养的情况, 对受精 D 3 未达到优质胚胎标准的 4 细胞 Ⅱ 级以上的低质胚胎进行囊胚培养, 经对比各组间的囊胚形成率及优质囊胚形成率均无统计学差异 (>0.05), 故本研究结果说明精子的来源并不影响低质胚胎的体外发育潜能, 同时胚胎形态学评分不能完全揭示胚胎的体外发育潜能胚胎的着床率和临床妊娠率可以反映移植胚胎在 [22-23] 体内的发育潜能,Nicopoullos 等与 Naru 等的研究报道认为精子的来源对于 ICSI 的着床率妊娠率并无影响本研究显示各组间的胚胎着床率妊娠率均无差异 [24] (>0.05), 与上述文献报道一致而郭海彬等的研究发现重度少弱畸精子症患者射出精子进行 ICSI 治疗后胚胎着床率临床妊娠率低于梗阻性无精子症行 ESA/ TESA 的患者, 他们分析这与其研究中各组间女方年龄存在差异有关已有大量文献证实, 女性年龄与胚胎种 [25] 植率临床妊娠率呈负相关, 而本研究选择单纯男性因素行 ICSI 的患者作为研究对象, 排除了女方因素的干扰, 且各组间移植的胚胎质量及数量均无差异, 提示精子的来源并不影响优质胚胎的体内发育潜能综上所述,ICSI 可应用不同来源的精子, 但在严格掌握 ICSI 指征的基础上的临床回顾性研究证实,ESA 来源的精子正常受精率高于射出精子 ( 严重少弱畸精子症隐匿精子症 ) 和 TESA 来源的精子同时发现不同来源的精子对卵母细胞正常受精后的卵裂率优质胚胎形成率低质胚胎继续培养的囊胚形成率, 以及新鲜胚胎移植的着床率临床妊娠率均无显著影响, 提示着不同来源的精子对胚胎的质量及发育潜能无明显影响参考文献 : [1] Buffat C, atrat C, Merlet F, et al. ICSI outcomes in obstructive azoospermia: influence of the origin of surgically retrieved spermatozoa and the cause of obstruction[j]. Hum Reprod, 2006, 21 (4): [2] Hameed N, Ozturk O. Testicular versus epididymal spermatozoa in intracytoplasmic sperm injection treatment cycles[j]. J Ayub Med Coll Abbottabad, 2012, 22(4): [3] World Health Organisation. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen[j]. World Health Organization, 2010: 16. [4] 邱卓琳, 褚庆军, 毛向明, 等. 不同生精功能障碍无精子症患者行 ICSI 后胚胎发育潜能的研究 [J]. 中华男科学杂志, 2012, 18(5): [5] 张杨, 皮洁. 辅助生殖技术中精液处理 [J]. 中国优生与遗传杂志, 2010(8): [6] Brinsden R. A textbook of in vitro fertilization and assisted reproduction[m]. New York: The arthenon ublishing Inc, 1999: [7] Matsuura K, Hayashi N, Takiue C, et al. Blastocyst quality scoring based on morphologic grading correlates with cell number[j]. Fertil Steril, 2010, 94(3): [8] Amirjannati N, Heidari-Vala H, Akhondi MA, et al. Comparison of intracytoplasmic sperm injection outcomes between spermatozoa retrieved from testicular biopsy and from ejaculation in cryptozoospermic men[j]. Andrologia, 2012, 44(Suppl 1): [9] Bendikson KA, Neri QV, Takeuchi T, et al. The outcome of intracytoplasmic sperm injection using occasional spermatozoa in the ejaculate of men with spermatogenic failure[j]. J Urol, 2008, 180(3): [10]O'connell M, Mcclure N, Lewis SE. Mitochondrial DNA deletions and nuclear DNA fragmentation in testicular and epididymal human sperm[j]. Hum Reprod, 2002, 17(6): [11]Berger DS, Abdelhafez F, Russell H, et al. Severe teratozoospermia and its influence on pronuclear morphology, embryonic cleavage and compaction[j]. Reprod Biol Endocrinol, 2011, 9: 37. [12]Lewin A, Reubinoff B, orat-katz A, et al. Testicular fine needle

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doi 10.3969/j.issn.1673-4254.2013.06.15 861 临床研究口服地屈孕酮对冻融胚胎移植周期临床妊娠结局的影响口服地屈孕酮对冻融胚胎移植周期临床妊娠结局的影响郭薇陈薪叶德盛何于夏黎璞牛静杨新红唐妍陈士岭南方医科大学南方医院妇产科生殖医学中心广东广州 510515 摘要目的探讨口服地屈孕酮片在冻融胚胎移植 FET 周期中进行黄体支持对临床结局的影响