Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase P501-d1/d2/d3 Vazyme biotech co., ltd. 使用说明书 Version 7.1
目录 Contents 01/ 产品概述... 02 02/ 产品组分... 02 03/ 保存条件... 02 04/ 单位定义... 02 05/ 质量控制... 02 06/ 实验流程... 03 06-1/ 普通 PCR 操作流程... 03 06-2/ 高 GC 含量模板 PCR 操作流程... 04 07/ 应用实例... 04 07-1/ 值得信赖的高保真度... 04 07-2/ 广泛的适用性... 05 08/ 注意事项... 05 09/ 常见问题与解决方案... 06
01/ 产品概述 Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 是一种基于 Pfu DNA Polymerase 改造而成的新一代超保真 DNA 聚合酶, 具有极高的扩增效率和广泛的模板适应性, 几乎适用于所有 PCR 反应 经过对 Pfu DNA Polymerase 的基因工程改造,Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 的行进性得到了大幅度提升, 即使是非常复杂的模板, 也能准确快速地完成反应 其错配率是普通 Taq 酶的 1/52, 是 Pfu 酶的 1/6, 并且扩增速度可以达到 15-30 sec/kb 高保真性以及卓越的扩增效率使得 Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 成为高保真 PCR 反应的优选用酶 Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 具有 5 3 聚合酶活性和 3 5 外切酶活性, 扩增产物为平端, 适用于 ClonExpress 快速克隆试剂盒 (C112/C113/C114) 02/ 产品组分 组分 5 SF Buffer (with 10 mm MgSO 4 ) 25 mm MgSO 4 dntp Mix (10 mm each) Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 5 PCR Enhancer DMSO 10 Loading buffer P501-d1 (100 U) 1.25 ml 1 ml 100 μl 100 μl 500 μl 100 μl 1.25 ml P501-d2 (500 U) P501-d3 (1,000 U) 5 P501-d1 10 P501-d1 03/ 保存条件 -20 保存 避免反复冻融 04/ 单位定义 用活化的大马哈鱼精子 DNA 作为模板 / 引物,74 30 min 内, 摄入 10 nmol 的全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为 1 个活性单位 (U) 05/ 质量控制 核酸内切酶残留检测 :10 U 的本酶和 0.3 μg Supercoiled pbr322 DNA 在 37 下孵育 4 h,dna 的电泳谱带不发生变化 大肠杆菌残留 DNA 检测 10 U 本酶中残留的核酸经 E.coli gdna 特异性引物进行 SYBR Green qpcr 检测,E.coli 基因组残留低于 10 拷贝 01/ 02
功能检测 1 50 μl PCR 体系中加入 1 U 本酶, 以 100 ng 人基因组 DNA 为模板, 扩增 30 个循环后取 1/10 的 PCR 产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳,EB 染色, 可见单一的 7.5 kb 条带 功能检测 2 50 μl PCR 体系中加入 1 U 本酶, 以 10 ng λdna 为模板, 扩增 30 个循环后取 1/10 的 PCR 产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳,EB 染色, 可见单一的 15 kb 条带 06/ 实验流程 06-1/ 普通 PCR 操作流程反应体系所有操作请在冰上进行, 各组分解冻后请充分混匀, 用完之后请及时放回 -20 保存 ddh 2 O 5 SF Buffer (with 10 mm MgSO 4 ) dntp Mix (10 mm each) 25 mm MgSO a 4 上游引物 (10 μm) 下游引物 (10 μm) 模板 DNA b Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase to 50 μl 10 μl optional x μl a. 对于大多数反应,Mg 2+ 最佳终浓度为 1.5-2 mm 体系中已含有终浓度为 2 mm Mg 2+, 如有需要, 可用试 剂盒中提供的 25 mm MgSO 4, 以 0.2-0.5 mm 为间隔向上摸索 Mg 2+ 最佳使用浓度 b. 不同模板最佳反应浓度有所不同, 下表为 50 μl 体系推荐模板使用量 : 基因组 DNA 质粒或病毒 DNA cdna <1 kb 50-250 ng 10 pg-20 ng 1-10 kb >10 kb 100-300 ng 150-400 ng 10 pg-20 ng 1-30 ng 1-5 μl ( 不超过 PCR 反应总体积的 1/10) 反应程序 循环步骤 温度 时间 循环数 预变性 a 变性 b 退火 c 延伸彻底延伸 95 95 60 30 sec-3 min 5-10 sec 10-30 sec 15-30 sec/kb 5-10 min } 25-35 a. 推荐大多数模板的预变性温度为 95 若扩增子超过 10 kb, 预变性温度可降至 92, 时间不超过 2 min b. 对于大多数模板,95 变性时间设为 5-10 sec 即可 若扩增子超过 10 kb, 预变性温度可降至 92, 并延长变性时间至 15 sec c. 一般来说, 退火温度设置为引物 Tm 值 ±3 范围之内即可 如果需要可以建立一个温度梯度反应区寻找引物模板结合的最适温度 退火时间过长可能导致扩增产物呈弥散状 因此, 推荐退火时间设置为 10 sec 即可 对于一些困难模板, 退火时间可在 10-30 sec 之间调整
06-2/ 高 GC 含量模板 PCR 操作流程 反应体系 ddh 2 O 5 SF Buffer (with 10 mm MgSO 4 ) dntp Mix (10 mm each) 模板 DNA 上游引物 (10 μm) 下游引物 (10 μm) Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase DMSO a 5 PCR Enhancer b to 50 μl 10 μl x μl optional optional a. DMSO 的量可以 1% 的浓度递增, 调整范围为 0%-8% b. 推荐仅当扩增子 GC 含量 >60% 时使用, 可能会降低部分保真度 反应程序 循环步骤预变性 a 变性 b 退火 c 延伸彻底延伸 温度 98 98 45- 时间 3 min 10 sec 10-30 sec 15-30 sec/kb 5-10 min } 循环数 25-35 a 对于高 GC 含量模板, 预变性温度可提升至 98, 预变性时间为 2-4 min b. 对于高 GC 含量模板, 变性温度可提升至 98, 变性时间为 10 sec c. 对于困难模板, 退火温度和退火时间可根据实际情况进行调整 07/ 应用实例 07-1/ 值得信赖的高保真度 使用 LacI 法测定 (Cline et al., Nucleic Acids Research, 24: 3546-3551(1996)), Phanta Super- Fidelity DNA Polymerase 保真性是普通 Taq DNA Polymerase 的 52 倍, 是野生型 Pfu DNA Polymerase 的 6 倍 Fidelity Compared to Taq 60 50 40 30 20 10 0 52 48 11 12 Phanta Phusion PrimerSTAR GXL KOD FX 8 Pfu 1 Taq 03/ 04
07-2/ 广泛的适用性以人基因组 小鼠基因组 水稻基因组和 λdna 为模板, 使用 Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 以 30 sec/kb 的延伸速度分别扩增 3 kb 5 kb 10 kb 和 15 kb 目标片段 所有扩增引物 Tm 值均为 60 左右 ( 使用 Primer Premier 5 计算 ) 反应体系及扩增程序如下: 反应体系 ddh 2 O 5 SF Buffer (with 10 mm MgSO 4 ) dntp Mix (10 mm each) 上游引物 (10 μm) 下游引物 (10 μm) Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 模板 DNA to 50 μl 10 μl 反应程序 循环步骤 温度 时间 循环数 预变性 95 30 sec/3 min 变性 95 10 sec 退火 60 15 sec 延伸 30 sec/kb } 35 彻底延伸 10 min 扩增 3 kb 5 kb 时, 预变性时间设置为 30 sec; 扩增 10 kb 15 kb 时, 预变性时间设置为 3 min 扩增产物电泳检测结果 5 6 7 8 9 10 11 M2 M1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M2 M1: DL15,000 DNA Marker 1: 人基因组,3 kb 2: 小鼠基因组,3 kb 3: 小麦基因组,3 kb 4: 人基因组,5 kb 5: 小鼠基因组,5 kb 6: 水稻基因组,5 kb 7: 人基因组,10 kb 8: 小鼠基因组,10 kb 9: λdna,15 kb 10: 人基因组,15 kb 11: 空白 M2: 1 kb DNA Ladder 08/ 注意事项 1. 请使用高质量的模板 2. 请勿使用 dutp 和带有尿嘧啶的引物和模板 3. 如实验需要, 可适当提高 Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 的使用量, 但 50 μl 体系内酶量建议不要超过 2 U 4. Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 具有较强的校对活性 因此, 如扩增产物需要进行 TA 克隆, 加 A 之前必须进行 DNA 纯化
5. 为了防止 Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 的校对活性降解引物, 在配置反应体系时请最后加入聚合酶 6. 引物设计引物 3 端最后一个碱基最好为 G 或者 C; 引物 3 端最后 8 个碱基应避免出现连续错配 ; 引物 3 端应避免出现发夹结构 ; 正向引物和反向引物的 Tm 值相差不超过 1 为佳,Tm 值调整至 55-65 为佳 ( 引物 Tm 值推荐使用 Primer Premier 5 进行计算 ); 引物额外附加序列, 即与模板非配对序列, 不应参与引物 Tm 值计算 ; 引物的 GC 含量控制在 40%-60% 之间 ; 引物 A G C T 整体分布要尽量均匀, 避免使用 GC 或者 AT 含量高的区域 ; 引物内部或者两条引物之间避免有 5 个碱基以上的互补序列, 两条引物的 3 端避免有 3 个碱基以上的互补序列 ; 引物设计完毕请使用 NCBI BLAST 功能检索引物特异性, 以避免非特异性扩增产生 09/ 常见问题与解决方案 无产物或产物量少引物退火温度引物浓度延伸时间循环数模板纯度模板使用量酶使用量 有杂带或弥散条带引物退火温度引物浓度延伸时间循环数反应程序模板纯度模板使用量酶使用量 优化引物设计设置退火温度梯度, 找到合适的退火温度适当提高引物浓度适当增加延伸时间至 30 sec/kb-1 min/kb 增加循环数至 35-40 个循环使用高纯度模板使用量可参照反应体系推荐量并适量增加适当增加或减少高保真酶的使用量优化引物设计尝试提高退火温度并设置退火温度梯度降低引物浓度至终浓度为 0.2 µm 有大于目标条带的杂带时可适当减少延伸时间减少循环数至 25-30 个循环使用两步法或 Touch down PCR 程序使用高纯度模板使用量参照反应体系推荐量调整或适当减少适当减少高保真酶的使用量 05/ 06
Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase P501-d1/d2/d3 Vazyme Biotech Co., Ltd Web: Tel: 400-600-9335 Sales: sales@vazyme.com Support: support@vazyme.com Service: service@vazyme.com Vazyme biotech co., ltd. SYSTEMS 企业已通过 ISO 9001:2015 国际质量管理体系认 证 使用说明书 Version 7.1