第 18 卷第 1 期 生命科学研究 Vol.18 No.1 2014 年 2 月 Life Science Research Feb. 2014 嗜酸热古菌病毒 STSV2 密码子偏嗜性及其对 dutpase 外源表达的影响 谷丰, 朱国东, 张琦, 季秀玲, 魏云林, 林连兵 * ( 昆明理工大学生命科学与技术学院, 中国云南昆明 650500) 摘要 : 病毒和宿主之间的密码子使用频率差异是病毒在宿主中生存的重要调控机制之一 利用生物学软件 Editseq 和 RSCU 算法统计病毒 STSV2 及其宿主 Sulfolobussolfataricus P2 中的 6 个不同基因的遗传密码偏嗜性, 并对病毒 STSV2 的 dutpase 在大肠杆菌 BL21 和 Rosetta 中分别进行外源表达并分析其差异 结果表明, 病毒 STSV2 密码子的偏嗜性总体与其宿主菌 P2 相似,STSV2 基因组的不同蛋白编码基因的密码子偏嗜性有区别, 病毒和宿主的相似蛋白编码序列密码子偏嗜性也有差异 分别以 BL21(DE3) 和 Rosetta(DE3) 为宿主表达 STSV2 的 dutpase 基因显示, 以 BL21(DE3) 为宿主时表达量大于以 Rosetta(DE3) 为宿主时目的蛋白表达量, 进一步说明了病毒 STSV2 的密码子的偏嗜性对其蛋白的外源表达影响 关键词 : 密码子偏嗜性 ; 尿嘧啶脱氧核酸核苷三磷酸酶 (dutpase); 病毒 STSV2; 基因外源表达中图分类号 :Q786 文献标识码 :A 文章编号 :1007 鄄 7847(2014)01 鄄 0033 鄄 06 Effect of Codon Usage Bias on the Heterologous Expression of a dutpase Gene from a Thermophilic Acidophilic Archaeavirus STSV2 GU Feng, ZHU Guo-dong,ZHANG Qi, JI Xiu-ling, WEI Yun-lin, LIN Lian-bing * (College of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500,Yunnan, China) Abstract:The difference in codon usage frequency between viruses and hosts is one of the important regulatory mechanisms for the viruses to survive in their hosts. Software Editseq and the RSCU algorithm were used to analyze genetic code usage bias of six different analogous genes of virus STSV2 and its host Sulfolobussolfataricus P2, which was further tested by the expression of a STSV2 dutpase gene in E.coli BL21 and Rosetta, respectively. The results showed that STSV2 had similar tropism of genetic codon usage bias to its host bacteria P2, but there was slightly difference between STSV2 genes and between analogous genes of STSV2 and P2. Furthermore, the expression of STSV2 dutpase gene showed that the yield of target protein expressed in host BL21 (DE3) was significantly higher than that in Rosetta (DE3), which further demonstrated that the codon usage bias of virus STSV2 affected the heterologous expression of its proteins in different hosts. Key words: codon usage bias; dutpase;stsv2;protein heterologous expression (Life Science Research, 2014, 18(1): 033~038) 目前, 地球上大多数已知的物种都使用相同的遗传密码, 其中具有两个以上的密码子的氨基酸占大多数, 即生物体往往偏好使用同义密码子 [1] 中的某一个或者两个密码子, 生物体也普遍存在 [2] 同义密码子使用非均衡的现象, 在密码子的使用上往往表现出一定的偏嗜性 (codon usage bias), 表 收稿日期 :2013-09-09; 修回日期 :2013-11-26 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (31160035;31260034) 作者简介 : 谷丰 (1988-), 男, 湖北襄阳人, 硕士研究生, 主要从事分子生物学研究 ; * 通讯作者 : 林连兵 (1969-), 男, 湖南湘潭人, 昆明理工大学生命科学与技术学院教授, 主要从事分子生物学 生物信息学和应用微生物学研究,Tel:0871-65920570,E-mail: 13987681986@139.com
34 生命科学研究 2014 年 现为在蛋白质翻译过程中偏好使用其中某一个或 [3] 两个密码子 影响同义密码子中不同密码子使用频率的因素很多, 比如 GC 含量 (AT-rich 的生物倾向于使用 AT-rich 的密码子 ); 施加于 DNA 序列上的突变压力 ; 基因表达水平的因素 : 高表达基因使用的密码子常与生物体中对应 trna 的丰度一致, [4~6] 以减少翻译落空的几率 近年来的研究表明 : 病毒密码子使用频率和宿主之间的差异是病毒在宿主中生存的重要调控 [7] 机制之一 载体病毒本身密码子的偏嗜性是制 [8] 约外源基因表达的重要因素 已有研究表明密码子的偏嗜性对外源基因的表达有较大影响, 把外源基因中含有的稀有密码子变为大肠杆菌常用 [9] 的高频密码子, 从而成功地提升了蛋白的表达量 因此, 研究密码子的偏嗜性对于如何高效地表达外源基因有着重要的意义 本文以分离自腾冲热海高温酸性热泉的硫化叶菌病毒 STSV2 基因组 [10] 序列为材料, 分析其遗传密码偏嗜性与硫化叶菌宿主菌株 P2 相同功能蛋白遗传密码偏嗜性, 并探索其对基因外源表达的影响 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 基因序列硫化叶菌病毒 STSV2 保存于本实验室, 在其宿主菌 Sulfolobussolfataricus p2 中的最适生长温度为 80, 最适生长 ph 为 3, 其全基因组已经测序完成 ; 其宿主菌 P2 全基因组序列通过 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 网站获取 选取硫化叶菌病毒 STSV2 及硫化叶菌宿主菌 P2 都具有的基因, Translation initiation factor IF-2 Glutamyl-tRNAsynthetase DNA double-strand break repair rad50 ATPase Probable deoxycytidine triphosphate deaminase Transcription elongation protein nusa ATP synthase Subunit b 进行同义密码子偏嗜性分析 1.1.2 菌株与质粒研究中采用的表达质粒载体 pet32a (+)/ DH5α 宿主菌 E.coli DH5α,E.coli BL21 和 Rosetta 菌株为本实验室保存 STSV2 病毒 : 分离于云南腾冲热海, 由本实验室保存并完成全基因组测序 1.1.3 培养材料寡核苷酸引物序列由上海生物工程公司合成 PremixrTaq 和 Premix extaq 购自日本 TAKARA 公司 LB 培养基 (1% 蛋白胨,1%NaCI, 0.5% 酵母膏 ), 氨苄霉素终浓度为 100 mg/l 1.2 实验方法 1.2.1 密码子使用频率的计算由 RSCU (relative synonymous codon usage) 定义可知 :RSCU 是将密码子出现次数的预期值作为分母 ( 密码子预出现的次数为该密码子编码的氨基酸所有的密码子平均使用时的次数 ), 以某一 [11] 同义密码子使用次数的观察值为分子 该指标计算简单, 而且能够比较直观地反映出密码子使用的偏好性, 例如对于一个给定的氨基酸 i, 其第 j 个密码子的 RSCU 值为 : RSCU ij = m ij ( 移 ) -1 n i 其中 i 代表编码氨基酸的密码子种类数, 其范围从 l 到 6;j 表示第 j 个编码氨基酸 ;mij 为该密码子出现次数的实际观察值 如果每个密码子使用的频率相同则代表无偏嗜性, 其 RSCU 值为 l; 如果哪个密码子比其他同义密码子出现得频繁, 则 RSCU 值大于 l, 反之亦然 RSCU 值越高, [12] 该密码子使用频率越大, 其偏嗜性就越强 RSCU 的值被用来表示同义密码子的使用频率, 其值不受不同基因中氨基酸组成的影响, 通过 Lasergene 软件包中的 EditSeq 软件进行统计然后通过上式进行计算 1.2.2 基因的异源表达 1) 引物合成 : 根据 STSV2 基因组功能蛋白 dutpase 序列设计引物 : n i j=1 Table 1 表 1 扩增 STSV2 dutpase 基因所用引物 Primers used for the cloning of dutpase gene from virus STSV2 Primer Forward primer H5 Reverse primer H3 Sequence 5 -CATGCCATGGACATGATTTTCAGTGATAGAG-3 5 -CCCAAGCTTTGAGAGCTTGGCCGGCGTCAC-3 注 : 下划线处分别为 NcoⅠ 和 HindⅢ 位点 Notes:The underline of NcoⅠ respectively and HindⅢ site.
第 1 期 谷丰等 : 嗜酸热古菌病毒 STSV2 密码子偏嗜性及其对 dutpase 外源表达的影响 35 2)PCR 目的片段的扩增 : 用上述引物和 STSV2 基因组作为模板, 进行目的片段的扩增 3) 目的片段的胶回收 :PCR 产物用北京百泰克公司试剂盒进行胶回收 4) 线性质粒的获得 : 质粒 pet-32a 在菌液 DH5α 中保存, 用带有氨苄青霉素的 LB 培养基 ( 终浓度 100 mg/l) 培养菌液, 并用质粒提取试剂盒提取质粒 提取的质粒 pet-32a 用 NcoⅠ 和 HindⅢ 进行酶切回收得到线性质粒片段 5) 表达载体的构建 : 将 3) 中的目的片段与线性质粒混合, 并用 T4 DNA 连接酶进行连接, 得到重组质粒 STSV2-dUTPase/Pet32a 6) 目的蛋白在大肠杆菌中的诱导表达 : 重组质粒分别转入大肠杆菌 BL21 和 Rosetta 菌株中, 在含有氨苄青霉素 ( 终浓度 100 mg/l) 的 LB 培养基中用 IPTG(238.30 mg/l) 诱导目的蛋白的表达 7) 对目的蛋白进行 SDS-PAGE 并分析 : 诱导后的大肠杆菌用 SDS-PAGE 跑出总蛋白, 并用软件 IPP6.0 进行条带的分析, 分析并计算出目的蛋白的表达量与各自载体总蛋白表达量的百分比 2 结果与分析 2.1 p2 和 STSV2 中 6 个基因的遗传密码的偏嗜性分析在硫化叶菌病毒 STSV2 及硫化叶菌宿主菌 P2 中都含有以下 6 种相同的蛋白基因序列 :Translation initiation factor IF-2 Glutamyl-tRNAsynthetase DNA double -strand break repair rad50 ATPase Probable deoxycytidine triphosphate deaminase Transcription elongation protein nusa ATP synthase Subunit b 以 Translation initiation factor IF-2 的编码序列为例, 其密码子使用频率如表 1 所示 由表 2 可看出, 硫化叶菌病毒 STSV2 与硫化叶菌宿主菌 P2 优势密码子一致的氨基酸有 A- gcu R-aga N-aau D-gau Q-caa E-gaa H-cau I-aua L-uua K-aaa M-aug F-uuu P-ccu T-aca Y-uau 和 V-guu; 硫化叶菌病毒 STSV2 单独具有的偏嗜性密码子有 W-ugg; 硫化叶菌宿主菌 P2 单独具有的偏嗜性密码子有 uaa 在此 Translation initiation factor IF-2 编码的氨基酸序列中其偏嗜性具有较高的一致性, 同法分析其他 5 种蛋白的密码子偏嗜性结果如表 3 所示 由表 3 数据可知,STSV2 和 P2 Translation initiation factor IF -2 Glutamyl -trnasynthetase DNA double -strand break repair rad50 ATPase Probable deoxycytidine triphosphate deaminase Transcription elongation protein nusa ATP synthase Subunit b 相似性达到 71.4% 57.1% 47.6% 66.7% 71.4% 42.9% 总体上在硫化叶菌病毒 STSV2 和硫化叶菌宿主菌 P2 中都有较为明显的密码子偏嗜性, 但以和宿主密码子偏嗜性类似为多 其中 DNA double-strand break repair rad50 ATPase 和 ATP synthase Subunit b 与宿主的相似性不到 50%, 可能与病毒 STSV2 基因自身进化的特殊性有关, 还有可能与基因的横向转移有关 此外, 在同一个基因组的不同蛋白编码基因的密码子偏嗜性也有不同, 相似蛋白编码序列中的密码子偏嗜性也有差异 2.2 STSV2 中 dutpase 密码子使用频率和 E.coli 密码子偏嗜性的分析 E.coli 是重要的外源基因表达菌株, 本文将 STSV2 的 dutpase 使用的高频优势密码子与 E.coli [13,14] 基因组编码的蛋白的高频优势密码子进行比较, 结果如表 4 所示 如表 4 所示, 硫化叶菌噬菌体 STSV2 与 E.coli 相比, 相似的密码子占 70%, 两者的密码子偏嗜性具有较大的相似性 因此用大多数的大肠杆菌工程菌株作为表达菌株应该都能很好地表达该蛋白 2.3 密码子的偏嗜性对外源基因在转化菌中表达的影响用大肠杆菌 Rosetta 和 E.coli BL21 (DE3) 作为转化菌株, 将编码 STSV2 病毒 dutpase 的基因克隆到 pet-32a(+) 中, 并分别转化进入大肠杆菌 E.coli BL21(DE3) 和 Rosetta 中 结果如图 1 所示 硫化叶菌病毒 STSV2 中 dutpase 在外源表达结果显示,dUTPase 基因在 E.coli BL21 及 Rosetta 中都可以表达 ( 如图 1) 用软件 IPP6.0 对上图中的条带进行光密度分析可得到实验结果如表 5 所示 由表 5 中数据可知, 硫化叶菌病毒 STSV2 中 dutpase 在 E.coli BL21 中的表达量略高于在 E.coli Rosetta 中的表达量 3 讨论本文通过对 STSV2 和其宿主菌 P2 中 6 种蛋白编码序列的分析, 知道病毒密码子的偏嗜性跟其宿主菌在密码子偏嗜性上具有较高的一致性 病毒是利用宿主的蛋白翻译系统进行复制增殖, 因此病毒迫于宿主的选择压力, 在进化过程中需
36 生命科学研究 2014 年 Table 2 表 2 STSV2 和宿主菌 P2 的转译起始因子 IF-2 密码子使用频率分析 Codon usage frequency analysis of translation initiation factor IF-2 of STSV2 and host P2 AA Codon IF-2 STSV2 P2 STSV2 P2 AA Codon N RSCU N RSCU N RSCU N RSCU Ala gca 5 1 0 0 Lys aaa* 17 1.17 3 1.2 gcc 3 0.6 1 1.33 aag 12 0.83 2 0.8 gcg 1 0.2 1 1.33 Met aug 10 1.0 2 2 gcu* 11 2.2 1 1.33 phe uuc 6 0.8 1 0.67 Arg aga* 6 4 2 12 uuu* 9 1.2 2 0.27 agg 2 1.33 0 0 Pro cca 3 1.71 0 0 cga 1 0.67 0 0 ccc 0 0 1 1 cgc 0 0 0 0 ccg 0 0 0 0 cgg 0 0 0 0 ccu* 4 2.29 3 3 cgu 0 0 0 0 Ser agc 5 2.3 1 1.49 Asn aac 5 0.67 1 0.33 agu 2 0.92 3 4.48 aau* 10 1.33 5 1.67 uca 1 0.46 0 0 Asp gac 7 0.67 1 0.33 ucc 2 0.92 0 0 gau* 14 1.87 5 1.67 ucg 0 0 0 0 Cys ugc 0 0 0 0 ucu 3 1.43 0 0 ugu 0 0 0 0 Ter uaa 0 0 1 3 Gln caa* 3 1.5 3 6 uag 0 0 0 0 cag 0 0.5 0 0 uga 0 0 0 0 Glu gaa* 13 1.3 8 1.78 Thr aca* 8 1.68 4 2.67 gag 7 0.7 1 0.22 acc 2 0.42 0 0 Gly gga 1 0.57 2 1.33 acg 3 0.63 0 0 ggc 3 1.71 0 0 acu 6 1.26 2 1.33 ggg 1 0.58 2 1.33 Trp ugg 1 1 0 0 ggu 2 1.14 2 1.33 Tyr uac 7 0.78 1 0.67 His cac 0 0 0 0 uau* 11 1.22 2 1.33 cau* 4 8 1 2 Val gua 2 0.64 4 1.45 Ile aua* 19 2.19 3 1.29 guc 2 0.67 2 0.73 auc 2 0.23 1 0.43 gug 3 1 1 0.36 auu 5 0.58 3 1.29 gug* 5 1.67 4 1.45 Leu cua 7 1.56 3 1.8 Leu cuu 2 0.44 1 0.6 cuc 1 0.22 0 0 uua* 11 2.44 4 2.4 cug 0 0 0 0 uug 6 1.33 2 1.2 注 : *: STSV2 和 P2 的 Translation initiation factor IF-2 编码序列的同义密码子使用频率, 标有 * 的密码子为 STSV2 和 P2 共有优势密码子 ; N: 表示密码子个数 Notes: *: STSV2 and P2 Translation initiation factor IF-2 coding sequence of the synonymous codon usage frequency, marked with * codes for STSV2 codon and P2 mutual advantage; N: number of codes. 要让其对宿主菌形成较好的适应性, 从而进化出与宿主相似的密码子的偏嗜性 病毒与宿主之间密码子偏嗜性的差异与他们的协同进化有关, 两者直接关系时间越长, 则一致性越高 ; 噬菌体与宿主菌翻译转录系统的适应程度也与这种差异的大小有关, 病毒密码子使用频率和宿主之间的差异 [15] 是病毒在宿主中生存的重要调控机制之一, 差异越小, 病毒对其宿主的适应性就越好 通过对 STSV2 的 dutpaes 基因的外源表达结果的分析可知 : 由于 Rosetta 宿主菌是 BL21 衍生菌, 能明显增强带有大肠杆菌稀有密码子的蛋白的表达 该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子 AUA AGG AGA CUA CCC 和 GGA 的 trnas, 能实现 万能 的翻译 当目的基 因中含的稀有密码子较多, 用此菌种表达比较合适, 但其表达量就相应地减少 以栖热菌噬菌体 TSP4 为例, 选取 TSP4 基因组中一个潜在分子伴侣基因序列在 E.coli BL21 和 E.coli Rosetta 中进行异源表达, 结果显示分子伴侣基因在 E.coli BL21 中未见明显表达, 但在 [8] Rosetta 中高效表达 由于 TSP4 噬菌体的密码子使用偏嗜性与大肠杆菌差异较大, 所以分子伴侣基因在 Rosetta 中的高效表达表明了密码子的偏嗜性对蛋白的外源表达有较重要的影响 和 Rosetta(DE3) 相比,STSV2 的 dutpase 密码子偏嗜性与 BL21(DE3) 密码子偏嗜性更相似, 其以 BL21 (DE3) 为宿主进行表达时表达量相对较大, 这种现象进一步说明了病毒 STSV2 的密码子
第 1 期谷丰等 : 嗜酸热古菌病毒 STSV2 密码子偏嗜性及其对 dutpase 外源表达的影响 37 Table 3 Synthetase AA Ala GCU GCU Arg AGA AGA Asn AAU AAU Asp Cys UGC UGC Gln CAA CAA Glu GAG GAG Gly GGG GGA His CAU CAU Ile AUA AUA Leu Lys AAA AAA Phe UUU UUC Met Pro CCA CCU Ser AGU UCA Ter / UGA Thr ACU ACA Trp Tyr UAU UAU Val GUU GUA 表 3 5 种蛋白在 STSV2 和 P2 中的同义密码子使用频率 Synonymous codon usage frequency of 5 analogous proteins of STSV2 and P2 ATPase GCA GCU AGG AGG AAC AAU UGU / CAA CAA GAA GAG GGA GGA CAU CAU AUA AUA AAA AAA / CCU UCA UCA ACA ACA UAU UAU GUU GUA Deaminase GCA GCA AGA AGA AAU AAU / UGU CAA CAA GAA GAA GGA GGU CAU CAU AUU AUU AAA AAG CCA CCA UCA UCU ACU ACU UAU UAU GUA GUA 注 : 下划线处表示 5 种蛋白质中最大的 RSCU 值的氨基酸 Notes: The data underlined means maximum RSCU of every amino acid in 5 proteins. Protein nusa GCU GCU AGA AGA AAU AAU / / CAA CAA GAA GAA GGC GGA CAU CAU AUA AUA AAA AAA CCU CCU AGC AGU UGG / UAU UAU GUU GUU ATP synthase subunit b GCA GCA AGA AGA AAC AAU UGC / CAA CAG GAG GAA GGC GGA CAC CAC AUA AUA AAG AAA CCA CCA AGU AGU ACU ACU UAC UAU GUA GUA 表 4 STSV2 和 E.coli 的优势密码子比较 Table 4 Comparison of optimal codons in STSV2 and E.coli STSV2 E.coli AA (RSCU) (RSCU) Ala GCU(1.68) GCU(1.88) Asp GAC(1.87) GAC(1.39) Cys UGC(1.16) UGC(1.33) Phe UUU(1.20) UUC(1.54) Glu GAA(1.30) GAA(1.59) His CAU(3.74) CAC(1.55) Gly GGC(1.56) GGC(1.65) Lys AAA(1.14) AAA(1.60) Ile AUA(2.14) AUC(2.52) Met AUG(1.00) AUG(1.00) Leu CUG(1.76) CUG(5.33) Pro CCG(1.12) CCG(3.29) Asn AAU(1.64) AAC(1.90) Gln CAG(1.55) CAG(1.78) Ser UGU(1.12) UCU(2.57) Arg AGA(2.79) CGU(4.38) Val GUU(1.98) GUU(2.24) Thr ACC(1.44) ACC(1.87) Tyr UAU(1.32) UAC(1.61) Trp UGG(1.00) UGG(1.00) kd 116 66.2 45 35 25 18.4 14.4 M 1 2 3 M 38 kd 图 1 硫化叶菌病毒 STSV2 dutpase 基因的异源表达 M: 蛋白 Marker;1:32a-dUTPase 在 E.coli BL21 诱导前电泳图 ;2:32a-dUTPase 在 E.coli BL21 诱导 6 h 后电泳图 ; 3:32a-dUTPase 在 Rosetta 诱导 6 h 后电泳图 Fig.1 Heterogenous expression of STSV2 dutpase gene M:Protein Marker; 1:electrophoresis of 32a-dUTPase in E.coli BL21 before induced; 2:electrophoresis of 32a-dUTPase in E.coli BL21 after induced 6 h; 3:electrophoresis of 32a-dUT 鄄 Pase in Rosetta after induced 6 h. Table 5 表 5 STSV2 中 dutpase 在 E.coli BL21 与 Rosetta 中表达比较 Expression analysis of STSV2 dutpase gene expressed in E.coli BL21 and Rosetta Combined optical density of the dutpase Average combined optical density of the total protein Combined optical density ratio Expression in E.coli BL21 27.162 54 61.744 39 43.99% Expression in Rosetta 58.154 72 171.706 7 33.87%
38 生命科学研究 2014 年 的偏嗜性影响其蛋白的外源表达 致谢 : 本研究 STSV2 基因组测序由丹麦哥本哈根大学古菌研究中心彭旭 佘群新协助完成 特此致谢! 参考文献 (References): [1] SHARP P M, LI W H. An evolutionary perspective on synonymous codon usage in unicellular organisms[j]. Journal of Molecular Evolution, 1986, 24(1-2):28-38. [2] CARBONE A. Codon bias is a major factor explaining phage evolution in transnationally biased hosts[j]. Journal of Molecular Evolution, 2008, 66(3):210-223. [3] 招丽婵, 邓雨修, 王东东, 等. 不同 PRRSV 毒株间 ORF1a 基因密码子偏爱性差异分析 [J]. 生命科学研究 (ZHAO Li-chan, DENG Yu-xiu, WANG Dong-dong, et al. Analysis of the ORF1a gene codon bias disparity in different PRRSV strains [J]. Life Science Research), 2009, 13(5):422-429. [4] LAURA A S, CPLIN R P, EDWARD C H. Evolutionary basis of codon usage and nucleotide composition bias in vertebrate DNA viruses[j]. Molecular Evolution, 2006, 62(5):551-563. [5] KNIGHT R D, FREELAND S J, LANDWEBER L F. Rewiring the keyboard: evolvability of the genetic code[j]. Nature Reviews Genetics, 2001, 2(1):49-58. 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