序 近 十 年 来, 在 人 类 基 因 组 计 划 的 带 动 下, 临 床 分 子 生 物 学 步 入 了 一 个 快 速 发 展 的 阶 段 O 这 一 阶 段 层 出 不 穷 的 新 理 论 和 新 技 术 的 诞 生 发 展 与 应 用, 积 极 地 促 进 和 提 高 了 临 床 诊 断

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2 序 近 十 年 来, 在 人 类 基 因 组 计 划 的 带 动 下, 临 床 分 子 生 物 学 步 入 了 一 个 快 速 发 展 的 阶 段 O 这 一 阶 段 层 出 不 穷 的 新 理 论 和 新 技 术 的 诞 生 发 展 与 应 用, 积 极 地 促 进 和 提 高 了 临 床 诊 断 准 确 率 O 现 在 已 经 没 有 人 怀 疑, 临 床 分 子 生 物 学 在 21 世 纪 将 成 为 推 动 医 学 检 验 发 展 的 主 要 力 量 O 作 为 一 门 综 合 性 强 的 交 叉 学 科, 临 床 分 子 生 物 学 的 快 速 发 展 对 临 床 检 验 人 员 提 出 了 更 高 的 要 求, 我 们 注 意 到 新 技 术 的 出 现 和 应 用 在 临 床 分 子 生 物 学 的 建 立 和 发 展 中 扮 演 着 重 要 的 角 色 o 1986 年 per 技 术 的 诞 生 从 某 种 意 义 上 与 DNA 双 螺 旋 结 构 的 揭 示 具 有 同 等 重 要 的 意 义 O 与 以 往 临 床 检 验 工 作 的 传 统 方 式 不 同, 每 一 种 临 床 分 子 生 物 学 检 测 新 手 段 都 毋 庸 置 疑 地 将 成 为 该 领 域 的 一 个 重 要 技 术, 并 将 在 今 后 一 段 时 期 内 取 得 迅 速 的 发 展 和 普 及 O 本 书 在 简 要 介 绍 人 类 基 因 组 与 医 学 遗 传 学 基 本 理 论 的 基 础 上, 着 重 介 绍 了 医 学 细 胞 遗 传 学 与 医 学 分 子 遗 传 学 的 常 用 技 术 新 进 展 新 方 法, 并 较 详 细 地 阐 述 了 该 领 域 实 验 室 质 量 控 制 的 要 求 和 规 范, 是 一 本 理 论 紧 密 联 系 实 际 的 在 建 立 和 开 发 相 关 实 验 诊 断 技 术 的 工 作 中 具 有 重 要 参 考 价 值 的 好 书 O 本 书 作 者 均 为 较 长 期 直 接 从 事 该 领 域 实 验 室 工 作 的 专 家 和 技 术 骨 干, 有 较 丰 富 的 实 践 经 验 O 本 书 的 出 版 必 将 为 推 动 我 国 临 床 分 子 生 物 学 的 发 展 作 出 应 有 的 贡 献 O 康 格 非 二 00 二 年 七 月

3 目 IJ J=I 从 DNA 双 螺 旋 结 构 的 发 现 到 生 物 中 心 法 则 的 确 定, 从 核 酸 杂 交 技 术 的 出 现 到 体 外 基 因 扩 增 技 术 的 广 泛 使 用, 从 人 类 基 因 组 计 划 到 蛋 白 质 组 学, 分 子 生 物 学 始 终 是 生 命 科 学 基 础 研 究 成 果 与 技 术 进 步 紧 密 结 合 的 产 物, 这 也 正 是 分 子 生 物 学 蓬 勃 发 展 的 基 础 和 原 动 力 O 人 类 基 因 组 计 划 的 启 动 和 获 得 的 研 究 成 果 使 人 类 对 自 身 生 命 过 程 的 认 识 迈 进 了 一 大 步 O 人 们 在 认 识 正 常 生 命 活 动 遗 传 基 础 的 同 时, 疾 病 基 因 组 学 应 运 而 生, 对 后 者 的 研 究 则 直 接 导 致 了 分 子 生 物 学 技 术 临 床 应 用 的 第 二 次 浪 潮 一 一 基 因 诊 断 与 分 子 细 胞 遗 传 学 检 测 O 20 世 纪 80 年 代 基 因 水 平 上 检 测 镰 形 细 胞 贫 血 的 成 功, 标 志 着 基 因 诊 断 时 代 的 来 临 O 在 疾 病 基 因 组 研 究 的 推 动 下, 人 类 越 来 越 多 的 疾 病 相 关 基 因 被 确 定, 其 对 象 从 研 究 初 期 的 单 基 因 病 延 伸 到 肿 瘤 及 多 基 因 病 等 领 域, 目 前 已 能 进 行 基 因 诊 断 的 疾 病 达 数 百 种 O 肿 瘤 特 异 性 基 因 和 多 基 因 病 相 关 基 因 的 检 测, 将 继 单 基 因 病 之 后 成 为 基 因 诊 断 的 又 一 个 重 要 发 展 方 向 O 届 时 基 因 诊 断 的 目 的 将 不 仅 仅 局 限 于 疾 病 病 因 诊 断, 还 将 极 大 地 向 疾 病 治 疗 方 案 的 确 定 疗 效 观 察 及 预 后 判 断 等 方 面 延 伸 O 与 此 同 时, 与 人 类 疾 病 密 切 相 关 的 各 种 外 源 性 生 物 基 因 组 研 究 也 获 得 了 大 量 的 成 果, 感 染 性 病 原 体 的 基 因 诊 断 就 是 一 个 非 常 典 型 的 例 子 O 采 用 基 因 诊 断 的 技 术 从 人 体 各 种 标 本 中 区 分 出 病 原 体 的 遗 传 物 质, 进 而 判 断 有 无 感 染 的 方 法 在 过 去 5 年 中 已 得 到 广 泛 的 临 床 应 用, 其 快 速 灵 敏 和 特 异 的 检 测 提 高 了 临 床 感 染 性 疾 病 病 因 诊 断 的 水 平, 因 而 被 临 床 广 泛 接 受 O 随 着 分 子 检 测 技 术 的 进 步, 该 类 检 测 将 向 着 定 量 和 耐 药 基 因 检 测 等 方 向 发 展 O 在 细 胞 遗 传 学 领 域, 传 统 的 染 色 体 检 查 已 不 能 完 全 满 足 临 床 检 测 的 需 要, 先 进 的 分 子 检 测 技 术 正 逐 渐 向 细 胞 遗 传 学 领 域 渗 透, 分 子 细 胞 遗 传 学 检 测 在 染 色 体 微 缺 失 综 合 征 等 疾 病 诊 断 中 正 发 挥 越 来 越 明 显 的 作 用 O 透 过 临 床 分 子 生 物 学 的 发 展 历 程, 我 们 可 以 看 到 技 术 进 步 的 巨 大 推 动 作 用 O 作 为 基 因 诊 断 的 两 大 核 心 技 术, 核 酸 杂 交 技 术 与 基 因 体 外 扩 增 技 术 的 发 明 和 应 用, 极 大 地 推 动 了 基 因 诊 断 与 临 床 的 结 合, 而 这 些 技 术 的 临 床 应 用 也 同 时 促 进 其 不 断 改 进 成 熟 O 与 临 床 分 子 生 物 学 的 检 测 内 容 和 范 围 的 发 展 一 样, 检 测 技 术 的 发 展 和 进 步 是 又 一 个 同 等 重 要 的 方 向 O 从 经 典 的 Southern 杂 交 到 反 向 斑 点 杂 交, 再 到 基 因 芯 片 检 测 ; 从 聚 合 酶 链 反 应 到 连 接 酶 链 反

4 应, 再 到 核 酸 序 列 扩 增 法 ; 从 常 规 染 色 体 检 查 到 细 胞 分 子 遗 传 学 检 查, 比 如 荧 光 原 位 杂 交 技 术, 基 因 诊 断 发 展 的 过 程 中 无 不 涉 及 到 技 术 的 发 展 O 因 此, 可 以 看 出, 对 临 床 分 子 生 物 学 技 术 的 了 解 和 掌 握 是 进 行 临 床 分 子 与 细 胞 检 测 的 前 提 条 件 O 鉴 于 目 前 人 类 基 因 组 研 究 和 分 子 生 物 学 技 术 的 快 速 发 展, 考 虑 到 存 在 针 对 不 同 的 疾 病 与 不 同 的 检 测 目 的 有 许 多 可 供 选 择 的 检 测 技 术 的 现 状, 如 何 在 实 际 工 作 中 选 用 适 当 的 检 测 方 法 和 技 术 是 一 个 现 实 的 问 题 O 加 之 作 为 一 个 跨 专 业 的 边 缘 学 科 和 一 种 全 新 的 临 床 检 测 手 段, 绝 大 多 数 医 务 工 作 者 对 它 的 了 解 也 十 分 有 限, 因 此 我 们 编 撰 此 书 呈 给 读 者, 以 便 读 者 全 面 了 解 最 新 的 临 床 分 子 生 物 学 检 测 技 术 和 推 广 这 些 新 技 术 在 临 床 的 应 用 O 本 书 的 编 者 均 是 多 年 从 事 相 关 领 域 研 究 和 临 床 工 作 的 专 业 人 员, 有 系 统 的 理 论 知 识 和 丰 富 的 实 践 经 验 O 该 书 的 编 排 和 内 容 尽 量 靠 近 临 床, 所 涉 及 的 大 部 分 技 术 均 有 详 细 的 实 验 操 作 步 骤 和 临 床 应 用 的 范 围 介 绍, 是 一 本 实 用 性 较 强 的 工 具 书 O 该 书 适 合 的 读 者 群 是 医 学 院 校 的 师 生 研 究 生, 以 及 临 床 检 验 专 业 人 员 和 临 床 医 师 等 O 由 于 编 撰 时 间 有 限 及 编 者 水 平 的 限 制, 本 书 恐 难 避 免 存 在 某 些 疏 漏 和 不 足, 希 望 读 者 提 出 宝 贵 意 见 与 建 议 O 倘 若 此 书 有 助 于 帮 助 读 者 提 高 对 分 子 生 物 学 的 认 识, 并 对 实 践 工 作 起 到 积 极 的 推 动 作 用, 我 们 的 初 衷 就 实 现 了 O 编 者 二 00 二 年 七 月 于 成 都

5 第 一 章 人 类 基 因 组 基 本 知 识 第 一 节 从 DNA 到 人 类 基 因 组 一 DNA 的 化 学 组 成 与 分 子 结 构 脱 氧 核 糖 核 酸 (deoxyribonucleic acid, DNA) 是 遗 传 物 质, 主 要 以 与 组 蛋 白 等 蛋 白 质 组 合 成 染 色 体 (Ell(; 染 色 质 ) 的 形 式 存 在 于 细 胞 核 中 在 人 类 中, 还 有 少 量 DNA 以 游 离 形 式 存 在 于 细 胞 质 的 线 粒 体 中, 共 同 构 成 人 类 的 基 因 组, 控 制 着 人 体 的 生 长 发 育 繁 殖 遗 传 进 化 等 生 命 活 动 核 糖 核 酸 (ribonucleic acid, RN A) 则 主 要 存 在 于 细 胞 质 中, 作 为 合 成 蛋 白 质 的 直 接 模 板 核 糖 体 和 氨 基 酸 运 载 体 的 主 要 组 分 ( 一 ) DNA 和 RNA 由 化 学 组 成 DNA 是 由 核 昔 酸 通 过 了, 5' 磷 酸 二 醋 键 聚 合 而 成 的 巨 大 的 线 状 (Ell(; 环 状 ) 双 螺 旋 分 子, 其 基 本 组 成 单 位 是 核 昔 酸 组 成 DNA 的 核 昔 酸 主 要 有 4 种, 它 们 分 别 由 相 同 的 磷 酸 基 团 戊 糖 ( 脱 氧 核 糖 ) 和 4 种 不 同 的 碱 基 组 成 这 4 种 碱 基 分 别 是 腺 嘿 岭 (A), 鸟 瞟 岭 (G), 胞 P~ 院 (C) 和 胸 腺 P~ 院 (T) ( 图 1-1, 见 插 页 )0 RNA 也 是 由 核 昔 酸 通 过 了, 5' 磷 酸 二 醋 键 聚 合 而 成 的 巨 大 的 线 状 单 链 分 于, 其 基 本 组 成 单 位 也 是 核 昔 酸 但 组 成 RNA 的 戊 糖 为 核 糖, 4 种 碱 基 分 别 是 A, G, C 和 尿 P~ 院 (U) 核 昔 酸 的 戊 糖 的 C-1' 与 瞟 岭 碱 基 的 N - 9 Ell(; P 密 陡 碱 基 的 N-1 以 糖 昔 键 相 连 形 成 核 昔, 其 C 5' 上 的 起 基 与 磷 酸 基 团 再 以 醋 键 连 接 形 成 单 磷 酸 核 昔 这 样 组 成 DNA 的 脱 氧 核 昔 酸 有 damp, dgmp, dcmp, dtmp 等 4 种, 相 应 的 组 成 RNA 的 核 昔 酸 有 AMP, GMP, CMP, UMP 等 4 种 C- 5' 上 还 可 以 连 接 2 个 磷 酸 基 团, 称 之 为 二 磷 酸 核 昔, 如 ADP, dadp 等 ; C-5' 上 还 可 以 连 接 3 个 磷 酸 基 团, 称 之 为 三 磷 酸 核 昔, 如 ATP, CTP, GTP, UTP ( 合 并 记 为 NTP), datp, dgtp, dctp, dttp ( 合 并 记 为 dntp) 等, NTP Ell(; dntp 分 别 是 合 成 RNA Ell(; DNA 的 原 料 此 外, ATP, GTP 还 是 细 胞 内 供 应 细 胞 生 命 活 动 的 直 接 能 量 载 体 ( 二 ) DNA 分 予 的 一 级 结 呵 和 二 级 结 呵 DNA 是 damp, dgmp, dcmp, dtmp 等 4 种 核 昔 酸 通 过 了, 5' 磷 酸 二 醋 键 连 接 而 成 的 巨 大 双 螺 旋 分 于, 其 一 级 结 构 是 指 DNA 分 于 的 核 昔 酸 序 列, 是 由 2 条 反 向 平 行 的 碱 基 互 补 的 单 链 组 成, 即 如 果 一 条 链 的 阅 读 万 向 是 5' 3', 则 另 一 条 链 的 碱 基 排 列 与 其 互 补, 且 万 向 是 3' 5' 其 中 碱 基 配 对 的 规 律 是 damp 与 dtmp ( 图 1-2, 见 插 页 ) dgmp 与 dcmp 的 碱 基 通 过 氢 键 形 成 稳 定 的 碱 基 配 对 ( 图 1-3, 见 插 页 ) DNA 分 于 包 含 了 2 条 万 向 相 反, 通 过 碱 基 互 补 配 对 相 互 缠 绕 的 单 链 DNA ( 图 1 4, 5, 见 插 页 ), 其 一 级 结 构 决 定 着 DNA 的 二 级 结 构 和 高 级 结 构 DNA 的 二 级 结 构

6 指 DNA 的 双 螺 旋 结 构 其 中, 磷 酸 戊 糖 骨 架 由 于 亲 水 性 位 于 双 螺 旋 的 外 侧, 碱 基 对 由 于 疏 水 性 位 于 双 螺 旋 的 内 侧 碱 基 对 之 间 主 要 以 氢 键 连 接, A-T 碱 基 对 可 形 成 2 个 氢 键, G-C 碱 基 对 可 形 成 3 个 氢 键 ( 参 见 图 1-2, 3) 双 螺 旋 每 10 个 碱 基 对 旋 转 1 周 (360'), 螺 旋 上 升 3. 4 日 rna 双 螺 旋 DNA 还 可 进 一 步 盘 曲 折 叠 形 成 超 螺 旋 高 级 结 构 人 类 染 色 体 就 是 DNA 分 于 围 绕 组 蛋 白 核 心 形 成 核 小 体, 再 进 一 步 螺 旋 化 形 成 螺 线 管 和 超 螺 线 管 乃 至 显 微 镜 下 能 够 看 到 的 染 色 体 二 基 因 的 概 念 结 构 化 学 本 质 与 生 物 学 功 能 DNA 具 有 化 学 稳 定 性 高 度 复 杂 性 自 我 复 制 性 和 可 变 异 性 DNA 在 自 然 状 态 下 非 常 稳 定, 只 有 在 强 酸 作 用 下 才 发 生 阵 解 由 于 DNA 的 碱 基 数 目 可 以 非 常 巨 大, 而 且 4 种 碱 基 可 以 随 机 排 列, 因 此 DNA 的 一 级 结 构 可 以 十 分 复 杂 多 样, 其 中 可 以 储 存 巨 大 的 遗 传 信 息, 可 以 包 含 各 种 各 样 的 基 因 ( ) 基 因 的 概 念 基 因 (gene) 是 具 有 特 定 功 能 的 DNA 序 列, 是 染 色 体 DNA Ejj(; 线 粒 体 DNA 上 的 特 定 的 指 导 合 成 RNA 的 DNA 区 段 有 些 基 因 编 码 特 定 的 蛋 白 质, 如 血 洁 白 蛋 白 基 因 1 夷 岛 素 基 因 甲 基 化 酶 基 因 等, 而 有 些 基 因 并 不 编 码 蛋 白 质, 如 核 糖 体 RNA 基 因 转 运 RNA (trna) 基 因 等 ( 二 ) 基 因 由 化 学 本 质 和 生 物 学 功 能 基 因 的 化 学 本 质 是 具 有 一 定 功 能 的 一 段 DNA 序 列 其 生 物 学 本 质 就 是 遗 传 信 息 的 基 本 单 位, 其 功 能 就 是 决 定 个 体 的 性 状 ( 三 ) 基 因 的 结 呵 基 因 是 特 定 的 DNA 区 段, 一 个 完 整 的 基 因 由 转 录 区 ( 能 指 导 合 成 相 应 的 RNA 的 区 段 ) 和 非 转 录 区 ( 调 控 基 因 表 达 的 区 域 ) 两 大 部 分 组 成 其 中, 转 录 区 内 又 可 据 其 是 否 出 现 在 成 熟 的 信 使 RNA (mrna) 中 细 分 为 内 含 于 (i 日 tro 日 ) 和 外 显 于 ( extron) 内 含 子 为 mrna 成 熟 过 程 中 剪 切 除 去 的 转 录 区 部 分, 而 外 显 于 为 出 现 在 成 熟 mrna 中 的 转 录 区 部 分 在 结 构 基 因 的 外 显 于 中, 有 一 部 分 序 列 可 以 指 导 翻 译 成 相 应 的 蛋 白 质, 该 部 分 序 列 被 称 为 翻 译 区, 剩 余 部 分 不 编 码 蛋 白 质, 被 称 为 非 翻 译 区 在 非 转 录 区 内 包 含 了 启 动 于 (promoter) 增 强 于 (enhancer) 等 调 节 基 因 表 达 的 序 列 有 些 基 因 产 生 的 RNA 不 经 翻 译 成 蛋 白 质 而 直 接 参 与 组 成 细 胞 特 定 的 功 能 组 分, 行 使 其 生 物 学 功 能 但 大 多 数 基 因 的 最 终 产 物 为 蛋 白 质, 通 过 蛋 白 质 的 形 式 行 使 其 生 物 学 功 能 这 些 基 因 的 成 熟 mrna 中 既 含 有 指 导 蛋 白 质 合 成 的 区 域 即 编 码 区, 又 含 有 非 编 码 区, 同 时 在 其 5' 端 有 帽 于 结 构 (7 甲 基 鸟 昔 5' 三 磷 酸 ) 和 3' 端 多 腺 昔 酸 信 号 序 列 后 接 上 150 个 ~200 个 腺 昔 酸 的 poly (A) 尾 经 过 上 述 修 饰, mrna 才 能 顺 利 进 入 细 胞 质, 作 为 模 板 指 导 正 确 的 蛋 白 质 合 成 ( 四 ) 基 因 的 表 这 遗 传 信 息 从 DNA 转 移 到 RNA 再 转 移 到 蛋 白 质, 从 而 行 使 特 定 的 功 能, 产 生 相 应 的 性 状 这 一 过 程 包 括 基 因 转 录 RNA 的 加 工 mrna 翻 译 等 步 骤 1. 转 录 (tra 口 scnptlo 日 ) 转 录 是 指 以 DNA 为 模 板 合 成 单 链 RNA 的 过 程 人 类 细 胞 2.

7 中 的 转 录 过 程 是 以 双 链 DNA 的 1 条 链 为 模 板, 在 RNA 聚 合 酶 的 作 用 下, 以 ATP, GTP, CTP, TTP 为 原 料, 以 碱 基 互 补 万 式 按 5' 3' 万 向 合 成 与 DNA 的 另 一 条 链 序 列 一 致 的 RNA 单 链 的 过 程 其 中 参 与 转 录 的 RNA 聚 合 酶 有 3 种, 分 别 负 责 不 同 的 基 因 转 录 RNA 聚 合 酶 I 专 门 负 责 合 成 核 糖 体 RNA(rRNA); RNA 聚 合 酶 田 负 责 trna 和 5S RNA 的 合 成 ;RNA 聚 合 酶 H 则 负 责 编 码 蛋 白 质 的 基 因 的 转 录 以 及 用 于 这 些 转 录 物 转 录 后 剪 切 加 工 过 程 的 核 小 RNA(snRNA) 基 因 的 转 录 通 过 转 录, 遗 传 信 息 从 DNA 转 移 到 了 mrna 2. mrna 的 加 工 过 程 mrna 的 加 工 过 程 (mrna maturation) 是 指 RNA 转 录 后 不 能 直 接 作 为 翻 译 成 蛋 白 质 的 模 板, 还 要 进 行 一 个 加 工 和 成 熟 的 过 程 编 码 蛋 白 质 的 基 因 在 转 录 的 初 期, 即 在 原 始 的 转 录 产 物 的 5' 端 加 上 1 个 7 甲 基 鸟 昔 5' 三 磷 酸 " 帽 于 " 结 构, 转 录 完 成 后 还 要 进 行 内 含 于 剪 切 和 在 3' 端 接 上 150 个 ~200 个 腺 昔 酸 残 基 的 poly (A) 尾 剪 切 过 程 是 由 剪 接 小 体 识 别 内 含 于 的 GU / AG 剪 接 信 号, 切 除 内 含 于 并 将 外 显 于 连 接 在 一 起 经 过 上 述 加 工 过 程 形 成 成 熟 的 mrna, 才 能 进 入 细 胞 质, 作 为 有 效 的 合 成 蛋 白 质 的 模 板 3. 翻 译 (tra 口 slatio 日 ) 翻 译 是 以 mrna 为 模 板, 在 核 糖 体 上 根 据 mrna 的 碱 基 序 列 合 成 多 肤 链 的 氨 基 酸 序 列 的 过 程 mrna 首 先 通 过 其 核 糖 体 结 合 位 点 与 细 胞 质 核 糖 体 小 亚 基 结 合, 随 后 带 有 起 始 反 义 密 码 于 CAU 的 甲 硫 氨 酸 (Met) - trna 与 mrna 的 起 始 密 码 于 AUG 结 合, 形 成 翻 译 起 始 复 合 物, 然 后 核 糖 体 的 大 亚 基 与 其 结 合 成 完 整 的 核 糖 体 mrna 复 合 物 随 着 核 糖 体 在 mrna 上 以 5' 3' 万 向 移 动, 携 带 有 特 定 氨 基 酸 的 活 化 的 trna 以 其 反 密 码 于 识 别 并 结 合 mrna 上 的 密 码 于, 在 转 月 大 酶 的 催 化 下 不 断 地 将 特 定 氨 基 酸 连 接 在 延 伸 的 肤 链 的 C 端, 直 到 出 现 终 止 密 码 于 此 时 结 合 上 去 的 trna 不 携 带 任 何 氨 基 酸, 肤 链 合 成 即 告 终 止, 肤 链 从 核 糖 体 上 释 放 出 来 新 合 成 的 肤 链 往 往 需 经 过 翻 译 后 加 工, 如 切 除 信 号 肤 加 糖 基 磷 酸 化 等 才 表 现 出 特 定 的 生 物 学 功 能 如 果 某 基 因 的 DNA 的 碱 基 序 列 发 生 了 变 异, 可 使 该 基 因 的 最 终 产 物 蛋 白 质 的 结 构 也 发 生 改 变, 从 而 其 功 能 改 变, 并 导 致 遗 传 病 启 动 于 (promoter) 是 位 于 基 因 的 转 录 起 始 位 点 上 游 的 一 段 特 定 DNA 序 列, 能 够 与 特 定 的 转 录 因 于 结 合, 以 及 随 后 与 RNA 聚 合 酶 H 结 合 形 成 转 录 复 合 物, 并 最 终 导 致 转 录 的 启 动 很 多 真 核 启 动 于 在 转 录 起 始 位 点 上 游 25 bp~ 35 bp 处 含 有 TATA 盒 (TATA box), 而 在 一 些 基 因 的 启 动 于 上 游 还 含 有 提 高 转 录 活 性 的 上 游 调 节 元 (upstream 件 regu latory elements) 在 mrna 的 蛋 白 质 编 码 区, 从 翻 译 起 始 位 点 开 始, 相 邻 的 每 3 个 碱 基 决 定 合 成 蛋 白 质 的 1 个 特 定 的 氨 基 酸, 这 样 的 三 联 碱 基 序 列 构 成 相 应 氨 基 酸 的 密 码 于 如 AUG 决 定 ( 代 表 ) 甲 硫 氨 酸, 同 时 为 肤 链 的 起 始 密 码 于,AGG 为 精 氨 酸 密 码 于, UAA, UAG, UGA 为 终 止 密 码 于 等 ( 表 1-1) 遗 传 密 码 于 的 本 质 是 进 入 核 糖 体 的 携 带 特 定 氨 基 酸 的 trna 能 够 通 过 其 特 异 的 核 酸 区 段 序 列 识 别 特 异 的 三 联 体 核 酸 序 列, 从 而 使 核 酸 序 列 翻 译 成 特 定 的 蛋 白 质 序 列. 3.

8 表 1-1 mrna 遗 传 密 码 子 分 布 U C A G UUU Phe UCU Ser UAU Tyr UGU Cys U UUC Phe UCC Ser UAC Tyr UGC Cys UUA Leu UCA Ser UAA Stop UGA Stop UUG Leu UCG Ser UAG Stop UGG Trp CUU Leu CCU Pro CAU His CGU Arg C CUC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg CUA Leu CCA Pro CAA GIn CGA Arg CUG Leu CCG Pro CAG GIn CGG Arg AUU!Ie ACU Thr AAU Asn AGU Ser A AUC!Ie ACC Thr AAC Asn AGC Ser AUA!Ie ACA Thr AAA Lys AGA Arg AUG Met ACG Thr AAG Lys AGG Arg G GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gly GUC Val GCC Ala GAC Asp GGC Gly GUA Val GCA Ala GAA Glu GGA Gly GUG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly - 固 DNA 复 制 的 特 点 与 遗 传 信 息 流 动 的 基 本 规 律 DNA 的 复 制 即 通 过 复 杂 的 酶 促 反 应, 由 1 个 DNA 分 于 变 成 2 个 与 其 完 全 相 同 的 DNA 分 于 的 过 程 DNA 复 制 及 细 胞 有 丝 分 裂 实 现 了 遗 传 信 息 从 亲 代 ( 细 胞 ) 向 于 代 ( 细 胞 ) 忠 实 的 传 递, 即 遗 传 信 息 在 细 胞 或 个 体 间 的 传 递 真 核 生 物 DNA 分 于 复 制 属 于 双 向 复 制, 在 每 个 DNA 大 分 于 中 含 有 多 个 复 制 起 点 并 进 行 复 制 含 有 1 个 复 制 起 点 的 复 制 单 位 称 为 1 个 复 制 于 ( replico 日 ) 每 个 复 制 于 约 含 30 kb~300 kb, 人 类 基 因 中 约 有 10 5 个 复 制 于 人 类 核 基 因 组 的 DNA 以 半 保 留 复 制 (semiconservative replicatio 川 的 万 式 进 行 复 制 所 谓 半 保 留 复 制 是 指 双 螺 旋 DNA 在 解 旋 酶 的 作 用 下 解 螺 旋 后, 分 别 以 2 条 亲 代 链 为 模 板, 按 照 碱 基 配 对 的 原 则 在 DNA 聚 合 酶 的 作 用 下 分 别 合 成 其 新 的 互 补 链, 组 成 2 个 于 代 DNA 分 于, 其 碱 基 顺 序 与 复 制 前 的 亲 代 DNA 分 于 顺 序 完 全 相 同 由 于 新 合 成 的 于 代 DNA 分 于 中 分 别 含 有 亲 代 DNA 分 于 的 1 条 链 和 新 合 成 的 1 条 互 补 链, 所 以 DNA 的 复 制 为 半 保 留 复 制 DNA 的 半 保 留 复 制 以 简 单 的 复 制 形 式 确 保 了 于 代 DNA 与 亲 代 DNA 的 一 致 性, 是 遗 传 稳 定 性 的 分 于 基 础 之 一 中 心 法 则 (center dogma) 指 遗 传 信 息 只 能 通 过 DNA 复 制 从 亲 代 DNA 向 于 代 DNA 流 动, 通 过 转 录 由 DNA~ 口 D RNA 传 递 和 通 过 翻 译 再 由 RNA 向 蛋 白 质 流 动, 而 不 能 够 从 蛋 白 质 向 核 酸 流 动 中 心 法 则 是 遗 传 信 息 传 递 和 流 动 的 基 本 规 律, 反 映 了 DNA 在 遗 传 信 息 保 存 和 流 动 中 的 决 定 性 地 位 4.

9 四 DNA 变 异 与 基 因 突 变 DNA 变 异 是 指 DNA 一 级 结 构 即 DNA 碱 基 序 列 的 改 变, DNA 变 异 是 生 物 进 化 和 生 物 多 样 性 的 来 源 DNA 分 于 的 稳 定 性 是 相 对 的, 而 变 异 却 是 绝 对 的 在 各 种 物 理 化 学 因 素 的 作 用 下, DNA 分 于 在 复 制 过 程 复 制 问 期 以 及 损 伤 修 复 过 程 都 可 能 发 生 序 列 改 变, 导 致 DNA 序 列 的 遗 传 多 态 性 或 基 因 突 变 (gene mutation) 基 因 突 变 是 指 基 因 的 碱 基 序 列 发 生 了 改 变 ( 一 ) 基 因 突 变 的 类 型 1. 移 码 突 变 (frameshift mutation) 基 因 的 编 码 区 序 列 中 增 加 或 减 少 1 个 或 者 几 个 碱 基 对 ( 非 3 的 整 数 倍 ), 使 缺 失 或 者 插 入 点 以 下 的 DNA 编 码 全 部 发 生 改 变, 这 称 为 移 码 突 变 2. 点 突 变 (dot mutatio 川 点 突 变 一 般 是 指 基 因 序 列 中 的 某 个 碱 基 被 另 一 个 碱 基 所 替 换 ( 二 ) 基 因 突 变 到 真 表 这 产 物 的 影 响 DNA 分 于 中 的 点 突 变 移 码 突 变 均 可 引 起 核 昔 酸 序 列 的 变 化, 经 过 转 录 和 翻 译 对 多 肤 链 中 氨 基 酸 序 列 可 能 产 生 3 种 不 同 的 作 用 1. 同 义 突 变 (syno 叮 mous mutatlo 川 由 于 基 因 内 发 生 碱 基 替 换, 使 某 一 密 码 于 变 成 了 另 一 密 码 于, 但 是 所 编 码 的 氨 基 酸 未 发 生 改 变 这 是 由 于 编 码 同 一 种 氨 基 酸 的 密 码 于 有 多 种, 即 密 码 于 具 有 简 并 性 碱 基 替 换 后 组 成 的 密 码 于 仍 是 编 码 同 一 氨 基 酸 的 密 码 于, 这 称 为 同 义 突 变 例 如 UAC 编 码 酣 氨 酸, 如 果 在 DNA 分 于 中 1 个 碱 基 对 替 换, 使 mrna 分 于 上 的 UAC 转 换 为 UAU, 而 UAU 仍 旧 是 编 码 醋 氨 酸 的 密 码 于, 因 此 多 月 大 链 中 的 氨 基 酸 序 列 不 发 生 变 化 2. 错 义 突 变 (missense mutatio 川 在 基 因 中, 由 于 碱 基 对 的 替 换, 使 mrna 分 于 中 编 码 某 一 氨 基 酸 的 密 码 于 变 成 编 码 另 一 氨 基 酸 的 密 码 于, 这 叫 做 错 义 突 变 例 如 异 常 血 红 蛋 白 (HbC) ~ 链 基 因 的 第 1 个 外 显 于 的 第 6 个 密 码 于 发 生 碱 基 替 换 (GAA 中 碱 基 发 生 G A), 经 过 转 录 后, 在 mrna 分 于 中 成 为 AAA; 在 翻 译 的 多 肤 链 中, 由 赖 氨 酸 替 代 谷 氨 酸, 产 生 HbC o 3. 无 义 突 变 (nonsense mutatio 川 由 于 某 一 碱 基 的 替 换, 使 原 来 编 码 某 一 氨 基 酸 的 密 码 于 突 变 成 为 终 止 密 码 于 UAA, UGA EjX; UAG, 致 使 肤 链 的 合 成 提 前 终 止, 月 大 链 缩 短, 成 为 没 有 活 性 的 多 肤 链 片 段, 这 称 为 无 义 突 变 例 如 日 珠 蛋 白 基 因 第 17 位 密 码 于 AAG 编 码 赖 氨 酸, 密 码 于 AAG 中 的 A T, 变 成 终 止 密 码 于 TAG, 经 转 录 后 成 为 终 止 信 号 UAG; 所 合 成 的 多 肤 链 仅 有 16 个 氨 基 酸 残 基 因 其 在 细 胞 内 不 稳 定, 被 迅 速 降 解, 所 以 在 病 人 的 红 细 胞 内 检 测 不 到 自 珠 蛋 白, 导 致 目 地 中 海 贫 血 4. 终 止 密 码 于 突 变 在 DNA 分 于 的 终 止 密 码 于 中, 由 于 发 生 1 个 碱 基 的 替 换, 使 本 来 为 终 止 密 码 于 的 UAA 或 者 UGA, UAG 突 变 为 编 码 某 一 氨 基 酸 的 密 码 于, 这 称 为 终 止 密 码 于 突 变 例 如 α 珠 蛋 白 基 因 第 142 位 是 终 止 密 码 于 UAA, UAA 中 的 U C, 突 变 为 编 码 谷 氨 酌 肢 的 密 码 于 CAA, 结 果 合 成 的 α 链 延 长 为 172 个 氨 基 酸, 增 加 了 31 个 氨 基 酸 合 成 的 这 种 α 链 不 稳 定, 很 容 易 被 破 坏, 使 α 链 含 量 减 少, 导 致 旷 地 中. 5.

10 海 贫 血 ( 三 ) 基 因 突 变 产 生 的 后 果 1. 中 性 突 变 虽 然 一 些 突 变 改 变 了 DNA 分 于 的 碱 基 序 列 但 是 对 基 因 和 蛋 白 质 的 功 能 并 不 产 生 影 响 例 如 在 结 构 基 因 内 发 生 的 同 义 突 变, 不 影 响 蛋 白 质 ( 目 的 合 成 ; DNA 分 于 非 编 码 序 列 或 者 重 复 序 列 中 产 生 的 碱 基 改 变, 一 般 也 不 影 响 蛋 白 质 ( 酶 ) 合 成, 均 属 于 中 性 突 变 这 种 突 变 频 率 高, 在 基 因 组 中 每 100~200 bp 中 存 在 1 bp 改 变, 可 以 构 成 DNA 分 于 的 多 态 性 2. 分 于 病 由 于 基 因 突 变, 使 它 所 编 码 的 蛋 白 质 发 生 相 应 的 变 化, 结 构 异 常 或 者 数 量 减 少, 产 生 一 系 列 病 理 变 化 所 引 起 的 疾 病, 即 称 分 于 病 分 于 病 的 种 类 很 多, 主 要 包 括 血 红 蛋 白 病 血 浆 蛋 白 缺 乏 症 免 疫 球 蛋 白 缺 乏 症 受 体 缺 乏 及 转 运 机 制 障 碍 等 3. 先 天 性 代 谢 病 酶 参 与 体 内 所 有 物 质 代 谢 是 各 种 代 谢 途 径 的 催 化 剂 ; 基 因 通 过 合 成 特 定 的 酶 控 制 体 内 的 新 陈 代 谢 和 遗 传 性 状 的 产 生 由 于 基 因 突 变 引 起 酶 蛋 白 结 构 异 常 或 者 酶 蛋 白 合 成 数 量 的 减 少, 均 可 导 致 遗 传 性 酶 缺 陷 和 代 谢 紊 乱, 从 而 引 起 先 天 性 代 谢 病 先 天 性 代 谢 病 也 是 一 种 分 于 病 目 前 由 遗 传 性 酶 缺 乏 引 起 的 代 谢 病 计 200 余 种, 主 要 涉 及 氨 基 酸 糖 类 脂 类 和 核 酸 等 物 质 代 谢 异 常 例 如 白 化 病 是 由 于 缺 乏 酷 氨 酸 酶 导 致 的 先 天 性 代 谢 病 4. 恶 性 肿 瘤 体 细 胞 内 的 基 因 突 变 是 包 括 视 网 膜 母 细 胞 瘤 在 内 的 人 类 某 些 恶 性 肿 瘤 发 生 的 重 要 原 因 视 网 膜 母 细 胞 瘤 是 儿 童 时 期 视 网 膜 肿 瘤 遗 传 型 视 网 膜 母 细 胞 瘤 的 发 生 归 因 于 1 个 Rb 基 因 在 生 殖 细 胞 内 发 生 突 变 另 一 个 Rb 基 因 在 体 细 胞 内 发 生 突 变 在 Rb 杂 合 的 视 网 膜 细 胞 内 发 生 体 细 胞 突 变, 无 正 常 的 等 位 基 因, 因 此, 细 胞 无 限 制 性 增 殖, 形 成 视 网 膜 肿 瘤 散 发 型 视 网 膜 母 细 胞 瘤 的 发 生 归 因 于 2 个 Rb 等 位 基 因 发 生 2 次 独 立 的 突 变 因 为 儿 童 遗 传 型 视 网 膜 母 细 胞 瘤 仅 需 要 1 次 体 细 胞 突 变 就 可 以 发 生 肿 瘤, 其 发 生 率 大 大 高 于 散 发 型, 且 发 病 早 ; 后 者 需 要 同 一 个 体 细 胞 的 Rb 基 因 2 次 独 立 的 突 变, 故 发 病 晚, 且 多 为 单 侧 ~ 发 病 第 二 节 人 类 基 因 组 的 结 构 和 功 能 人 类 基 因 组 的 总 体 构 成 人 类 基 因 组 (human genome) 是 指 人 类 全 部 遗 传 物 质 的 总 和 人 类 的 遗 传 物 质 是 DNA, 分 别 存 在 于 细 胞 核 和 线 粒 体 中 细 胞 核 中 的 DNA 与 蛋 白 质 结 合, 以 染 色 体 的 形 式 存 在 ; 细 胞 质 中 线 粒 体 DNA 则 为 裸 露 的 环 状 双 螺 旋 分 于 人 类 正 常 体 细 胞 中 染 色 体 成 对 存 在, 共 23 对 46 条 染 色 体, 其 中 各 有 23 条 来 自 父 亲, 23 条 来 自 母 亲, 每 1 条 染 色 体 含 有 1 个 巨 大 的 线 状 DNA 分 于 在 46 条 染 色 体 中, 有 22 对 常 染 色 体, 它 们 在 男 女 中 相 同, 剩 余 1 对 为 性 染 色 体, 在 女 性 中 为 XX, 而 在 男 性 中 为 XY 所 以 人 类 基 因 组 可 以 表 示 为 22 条 常 染 色 体 DNA, X 与 Y 性 染 色 体 DNA 及 线 粒 体 DNA 的 总 和, 其 中 染 色 体 DNA 又 称 为 核 基 因 组, 线 粒 体 DNA 称 为 核 外 基 因 组 核 基 因 纽 约 有 3 X 10 9 bp, 核 外 基 因 组 有 bp, 共 编 码 了 3 万 ~5 万 个 基 因. 6.

11 核 基 因 组 (-) 核 基 因 组 的 结 呵 核 基 因 组 含 有 24 条 染 色 体 DNA, 约 30 亿 个 碱 基 对 根 据 其 是 否 编 码 基 因 可 分 为 基 因 序 列 ( 约 占 20% ) 和 基 因 外 DNA ( 约 占 80%) ; 在 基 因 序 列 中 只 有 不 到 10% 的 DNA 编 码 蛋 白 质, 而 超 过 90% 的 DNA 构 成 基 因 内 非 编 码 序 列 根 据 基 因 中 某 DNA 序 列 出 现 的 频 率, 核 基 因 组 DNA 又 可 分 为 以 下 几 种 1. 单 一 序 列 (unique sequence) 单 一 序 列 约 占 基 因 组 的 60% ~65%, 是 指 在 1 个 基 因 组 中 仅 有 1 个 或 少 数 几 个 拷 贝 的 序 列, 包 括 大 多 数 编 码 蛋 白 质 的 基 因 和 假 基 因 等 2. 重 复 序 列 (repetitive sequence) 重 复 序 列 指 在 1 个 基 因 组 中 存 在 很 多 拷 贝 的 序 列 根 据 重 复 次 数 的 多 寡 又 可 细 分 为 3 类 (1) 基 因 家 族 和 基 因 簇 : 基 因 家 族 (gene family) 是 来 源 相 同 结 构 相 近 功 能 相 关 的 一 组 基 因, 基 因 家 族 的 各 成 员 可 以 成 簇 存 在, 也 可 以 分 布 在 不 同 的 染 色 体 上 集 中 成 簇 存 在 的 一 组 基 因 称 为 基 因 簇 (gene cluster) (2) 中 度 重 复 序 列 (moderately repetitive sequence) : 重 复 单 位 长 度 为 300 bp ~ bp, 一 般 不 编 码 蛋 白 质 例 如 Alu 家 族 (Alu family) 由 300 bp 的 重 复 单 位 构 成, 在 第 170 位 附 近 都 有 Alu I 的 识 别 切 割 位 点 (AG CT), 在 基 因 组 中 重 复 30 万 ~ 50 万 次, 平 均 5 kb DNA 就 有 1 个 Alu 序 列 (3) 高 度 重 复 序 列 (highly repetitive sequence) : 重 复 单 位 长 度 可 以 是 2 bp 4 bp 6 bp 8 bp 直 至 200 bp, 重 复 拷 贝 数 可 达 百 万 次 例 如 染 色 体 着 丝 粒 端 粒 和 Y 染 色 体 长 臂 上 的 异 染 色 质 区 等, 这 些 序 列 不 转 录, 但 参 与 维 持 染 色 体 的 结 构, 并 可 能 与 减 数 分 裂 时 同 源 染 色 体 的 联 会 配 对 有 关 三 线 粒 体 基 因 组 人 类 线 粒 体 DNA (mitochondrial DNA, mtdna) 由 bp 组 成, 为 双 链 环 状 DNA 共 含 有 13 个 编 码 蛋 白 质 的 基 因, 2 个 rrna 基 因 和 22 个 trna 基 因, 其 中 编 码 蛋 白 质 的 基 因 分 别 为 7 个 呼 吸 链 还 原 型 烟 酌 肢 腺 瞟 岭 二 核 昔 酸 (NADH) 脱 氢 酶 亚 基 基 因, 3 个 细 胞 色 素 氧 化 酶 亚 基 基 因, 2 个 ATP 酶 组 分 基 因 和 1 个 细 胞 色 素 b 基 因 线 粒 体 基 因 组 是 独 立 于 细 胞 核 基 因 组 之 外 的 自 主 复 制 单 位, 具 有 自 己 的 特 点 :1 无 内 含 子, 基 因 排 列 非 常 紧 凑, 基 因 密 度 高 2 部 分 密 码 于 不 同 于 核 内 DNA 的 密 码 于, 即 有 些 密 码 于 为 线 粒 体 特 有, 不 能 通 用 ( 源 于 mt trna 基 因 的 特 性 ), 如 UGA 不 是 终 止 密 码 于, 而 是 色 氨 酸 密 码 于, AGA, AGG 不 编 码 精 氨 酸 而 是 终 止 蜜 码 于 起 始 甲 硫 氨 酸 密 码 于 有 4 个 (AUG, AUC, AUU, AUA), 内 部 甲 硫 氨 酸 密 码 于 有 2 个 (AUG 和 AUA), 而 核 基 因 的 甲 硫 氨 酸 密 码 于 只 有 1 个 (AUG) 7.

12 第 二 节 细 胞 的 有 丝 分 裂 和 减 数 分 裂 一 细 胞 周 期 与 有 丝 分 裂 人 类 个 体 始 于 1 个 细 胞 受 精 卵 正 是 由 于 受 精 卵 不 断 进 行 有 丝 分 裂, 才 形 成 了 多 细 胞 的 人 体, 同 时 保 证 了 每 个 体 细 胞 的 遗 传 物 质 相 同 细 胞 从 一 次 有 丝 分 裂 结 束 到 下 一 次 有 丝 分 裂 结 束 的 时 期 称 为 1 个 细 胞 周 期 细 胞 周 期 主 要 包 括 有 丝 分 裂 问 期 和 有 丝 分 裂 期 2 个 阶 段 其 中, 问 期 主 要 进 行 遗 传 物 质 DNA 的 复 制, 使 细 胞 的 DNA 含 量 增 加 一 倍, 有 丝 分 裂 期 则 保 证 使 细 胞 的 染 色 体 DNA 均 匀 地 一 分 为 二 ( 图 1-6) (DNA 合 成 前 期 (G 1 期 ) 有 丝 分 裂 问 期 (DNA 合 成 期 (3 期 ) 细 胞 周 期 \DNA 合 成 后 期 (G2 期 ) ( 前 期 中 期 有 丝 分 裂 期 (M 期 ) ~ 后 期 L 末 期 图 1-6 细 胞 周 期 和 有 丝 分 裂 各 期 (-) 青 丝 分 裂 闺 阁 细 胞 周 期 中 的 有 丝 分 裂 问 期 可 以 分 为 G 1 期 S 期 G 2 期 1. G 1 期 (DNA 合 成 前 期 ) 从 上 次 细 胞 分 裂 完 成 到 DNA 合 成 开 始 前 的 阶 段 为 G 1 期 G 1 早 期 由 于 细 胞 大 量 合 成 RNA 和 进 行 核 糖 体 组 装, 并 合 成 结 构 蛋 白 和 酶, 这 些 酶 控 制 着 用 于 形 成 新 细 胞 成 分 的 代 谢 活 动 进 入 G 1 后 期, 则 主 要 合 成 DNA 复 制 所 需 的 前 体 物 质 和 酶 类, 如 脱 氧 核 昔 酸 及 胸 昔 激 酶 等 这 一 时 期 细 胞 体 积 增 大, 核 仁 增 大 G 1 期 是 DNA 合 成 前 的 准 备 时 期, 也 是 细 胞 生 长 的 主 要 阶 段 2. S 期 (DNA 合 成 期 ) 从 DNA 合 成 开 始 到 DNA 合 成 结 束 的 全 过 程 S 期 是 DNA 进 行 复 制 的 阶 段, 使 体 细 胞 的 DNA 含 量 增 加 一 倍 主 要 特 点 是 进 行 DNA 复 制 及 合 成 组 蛋 白 及 与 DNA 复 制 相 关 的 酶 3. G 2 期 (DNA 合 成 后 期 ) 从 DNA 合 成 结 束 到 有 丝 分 裂 期 开 始 之 前 的 阶 段, 是 细 胞 进 入 有 丝 分 裂 前 的 准 备 时 期 主 要 特 点 是 有 丝 分 裂 促 进 因 于 (M - phase promoting factor, MPF) 的 活 化 和 微 管 蛋 白 等 有 丝 分 裂 器 组 分 的 合 成, 为 进 入 有 丝 分 裂 期 作 准 备 人 体 细 胞 的 G 2 期 一 般 要 经 历 2 h~5 h o ( 二 ) 青 丝 分 裂 期 有 丝 分 裂 (mitosis) 期 是 DNA 染 色 质 等 己 经 复 制 完 成 的 细 胞 将 染 色 质 加 工 包 装 成 染 色 体, 并 把 它 们 均 等 地 分 成 2 份, 形 成 2 个 于 细 胞 的 过 程 其 显 著 特 征 是 分 裂 过 程 中 形 成 有 丝 分 裂 器, 以 确 保 复 制 后 的 染 色 体 一 分 为 二, 分 别 准 确 地 形 成 2 个 遗 传 上 完 全 相 同 的 于 细 胞 根 据 该 过 程 出 现 的 细 胞 形 态 学 特 征, 可 将 有 丝 分 裂 期 划 分 为 前 期 中 期 后 期 和 末 期 4 个 连 续 的 时 段 8.

13 1. 前 期 (prophase) 前 期 的 主 要 表 现 为 染 色 体 凝 集, 分 裂 极 出 现 和 核 膜 核 仁 的 解 体 消 失 2. 中 期 (metaphase) 中 期 的 主 要 表 现 是 纺 锤 体 的 形 成, 染 色 体 在 纺 锤 丝 牵 引 下 排 列 在 细 胞 的 赤 道 面 上, 形 成 赤 道 板 纺 锤 体 是 由 微 管 在 两 极 的 中 心 粒 之 间 纵 向 排 列 组 成 的 纺 锤 状 的 结 构 3. 后 期 (anaphase) 染 色 体 的 着 丝 粒 一 分 为 二, 姐 妹 染 色 单 体 彼 此 分 离, 标 志 着 后 期 的 开 始 染 色 单 体 分 离 后, 在 纺 锤 丝 的 牵 引 下 分 别 移 向 两 极 关 于 染 色 体 向 两 极 移 动 的 机 制, 目 前 一 般 认 为, 其 动 力 来 源 于 动 粒 微 管 一 端 ( 染 色 体 动 粒 部 位 ) 不 断 解 聚, 使 染 色 体 微 管 缩 短, 同 时, 极 间 微 管 聚 合 伸 长, 导 致 两 极 的 远 离, 这 两 种 作 用 的 结 果, 使 染 色 体 移 向 两 极 0 4. 末 期 ( telophase) 末 期 是 细 胞 核 重 新 形 成, 细 胞 质 发 生 分 裂 并 形 成 2 个 于 细 胞 的 阶 段 2 组 于 染 色 体 到 达 细 胞 两 极, 开 始 去 I~ 是 集, 伸 展 变 为 细 丝, 最 终 恢 复 成 染 色 质 状 态 同 时, 细 胞 核 纤 层 蛋 白 去 磷 酸 化, 于 细 胞 核 膜 重 形 成 染 色 质 上 的 核 仁 组 织 区 也 开 始 进 行 rrna 转 录, 进 行 核 糖 体 亚 基 的 装 配, 核 仁 重 新 出 现 细 胞 质 分 裂 (cytokinesis) 是 有 丝 分 裂 的 最 后 一 个 环 节 2 个 于 细 胞 核 形 成 后, 细 胞 膜 从 中 部 凹 陷 ( 结 缩 ) 形 成 分 裂 沟, 继 而 细 胞 质 分 割 成 2 部 分, 形 成 2 个 于 细 胞 二 减 数 分 裂 减 数 分 裂 (meiosis) 是 在 精 于 或 卵 于 发 生 过 程 中, 精 母 细 胞 ( 或 卵 母 细 胞 ) 只 进 行 1 次 DNA 复 制 而 发 生 2 次 连 续 的 细 胞 分 裂, 形 成 4 个 精 于 (Ell(; 1 个 卵 于 和 3 个 极 体 ) 的 过 程, 结 果 是 在 成 熟 的 配 于 中 染 色 体 数 目 减 少 一 半 减 数 分 裂 在 有 性 生 殖 中 具 有 重 要 意 义, 一 万 面 通 过 受 精 过 程 使 于 代 的 染 色 体 数 目 恢 复 到 与 亲 代 相 同, 保 持 于 代 与 亲 代 的 遗 传 稳 定 性 ; 另 一 万 面, 在 减 数 分 裂 过 程 中, 由 于 同 源 染 色 体 的 联 会 和 交 换, 产 生 染 色 体 重 组, 以 及 非 同 源 染 色 体 的 自 由 组 合, 大 大 增 加 了 基 因 组 DNA 变 异 的 范 围 和 频 率, 在 进 化 上 具 有 重 要 作 用 减 数 分 裂 过 程 过 程 的 基 本 特 点 是 DNA 复 制 1 次, 细 胞 分 裂 2 次 ( 一 ) 减 数 第 1 次 分 裂 的 基 本 过 程 1. 前 期 前 期 分 为 5 个 时 期 :1 细 线 期 (leptotene stage), 染 色 体 完 成 复 制, 开 始 凝 集 2 偶 线 期 (zygotene stage), 同 源 染 色 体 侧 面 紧 密 相 贴, 发 生 配 对, 此 现 象 称 为 联 会 (synapsis) 联 会 的 染 色 体 是 专 一 性 的, 即 只 有 同 源 染 色 体 才 相 互 识 别 并 配 对, 形 成 联 会 复 合 体 (synaptonemal complex, SC) 配 对 的 2 条 同 源 染 色 体 分 别 由 4 条 染 色 单 体 组 成, 称 为 四 分 体 ( tetrad) 3 粗 线 期 (pachytene stage), 又 称 重 组 期 同 源 染 色 体 配 对 后, 染 色 体 明 显 变 短 变 粗, 结 合 紧 密, 同 源 染 色 体 之 间 发 生 DNA 交 换, 导 致 染 色 体 重 组 4 双 线 期 (diplotene stage), 联 会 复 合 体 逐 渐 消 失, 同 源 染 色 体 逐 渐 分 开, 但 仍 有 几 点 相 连 人 类 胚 胎 卵 巢 中 的 卵 母 细 胞 5 个 月 即 达 到 这 一 阶 段, 直 到 性 成 熟 排 卵 之 前, 每 月 1 次 的 卵 成 熟, 是 从 该 期 进 入 减 数 分 裂 的 其 余 阶 段 5 终 变 期 ( diaki nesis), 染 色 体 变 成 紧 密 凝 集 状 态, 核 仁 消 失, 染 色 体 I~ 是 集 成 短 棒 状, 开 始 形 成 纺 锤 体. 9.

14 2. 中 期 核 膜 破 裂, 分 散 于 核 中 的 四 分 体 在 纺 锤 丝 作 用 下 向 纺 锤 丝 中 部 移 动, 最 后 排 列 到 赤 道 面 上 3. 后 期 同 源 染 色 体 分 离 并 向 两 极 移 动, 每 一 极 获 得 单 倍 数 量 的 染 色 体, 每 条 染 色 体 含 有 2 条 染 色 单 体 同 时, 非 同 源 染 色 体 在 分 向 两 极 时 相 互 独 立, 父 万 和 母 万 来 源 的 非 同 源 染 色 体 实 现 了 自 由 组 合 4. 末 期 新 的 核 膜 重 新 形 成, 纺 锤 体 消 失, 形 成 2 个 于 细 胞 核, 每 个 核 中 的 染 色 体 数 目 比 体 细 胞 减 少 了 一 半 但 遗 传 物 质 的 总 量 与 体 细 胞 相 同 因 为 此 时 的 每 条 染 色 体 由 2 条 染 色 单 体 组 成, 并 由 同 一 着 丝 粒 相 连 ( 二 ) 减 数 第 2 次 分 裂 减 数 第 1 次 分 裂 完 成 后 并 不 进 行 DNA 的 复 制 而 是 直 接 进 入 又 一 次 分 裂 其 基 本 过 程 与 有 丝 分 裂 期 基 本 相 同, 包 括 纺 锤 体 的 重 新 形 成, 每 个 细 胞 核 中 的 姐 妹 染 色 体 排 列 到 赤 道 面 上, 姐 妹 染 色 体 在 纺 锤 丝 作 用 下 分 开 并 移 向 两 极, 最 后 由 1 个 性 母 细 胞 形 成 4 个 于 代 细 胞 核 在 男 性 的 精 于 发 生 过 程 中, 4 个 核 均 被 细 胞 质 所 包 围, 并 最 终 发 育 成 4 个 成 熟 的 精 于 ( 图 1-7) ; 在 女 性 的 卵 于 发 生 过 程 中, 则 细 胞 质 从 第 1 次 减 数 分 裂 时 就 发 生 不 等 分 配, 第 2 次 减 数 分 裂 时 继 续 发 生 细 胞 质 的 不 等 分 配, 最 终 形 成 1 个 卵 细 胞 和 3 个 极 体 ( 图 1-8) 础 产 制 6 9 姐 一 险 r( 棋 联 ι 前! -.j. 期 1 四 分 体 接 ) 申 期 虫 草 旦 唱 E 当 一 i 二 h< -.1 程 挠 应 3 C"~--~-- ~ 干 G 主 一 ζ 王 三 )----c= 写 三,.-"" C~ 王 三 ζ 主 主,.--- 一 精 于 细 胞 桔 子 图 1-7 减 数 分 裂 模 式 图, 示 精 子 发 生 过 程 参 考 文 献 1 Lewin E_ Genes VI _ Oxford: Oxford University Press, 王 培 林. 遗 传 病 学. 北 京. 人 民 卫 生 出 版 社, 李 建. 医 学 遗 传 学. 北 京 : 北 京 医 科 大 学 中 国 协 和 医 科 大 学 联 合 出 版 社,

15 剧 院 组 In 何 联 全 四 分 体 运 善 了 密 ( 挚 建 争 电 第 2 次 分 裂 官 8 3 苦 2~~1 极 体 字 才 感 了 事 J 次 级 卵 母 细 胞 卵 细 胞 图 1-8 减 数 分 裂 模 式 图, 示 卵 子 发 生 过 程 4 陈 兰. 医 学 遗 传 学. 北 京 : 人 民 卫 生 出 版 社, 汪 坊 仁, 薛 绍 明, 柳 惠 图. 细 胞 生 物 学, 第 2 版. 北 京 : 北 京 师 范 大 学 出 版 社, 桂 传 书. 医 学 遗 传 学 基 础, 第 2 版 北 京. 人 民 卫 生 出 版 社, 1997 ( 夏 庆 杰 傣 家 富 ). 11.

16 阶 男 立 旱 医 学 遗 传 学 基 本 知 识 医 学 遗 传 学 是 研 究 疾 病 与 遗 传 的 关 系 以 及 遗 传 病 传 递 规 律 的 科 学 由 于 生 殖 细 胞 或 受 精 卵 的 遗 传 物 质 (DNA 或 染 色 体 ) 异 常 导 致 的 疾 病 为 遗 传 病 (i 日 herited disease) 遗 传 病 具 有 亲 代 向 于 代 垂 直 传 递 的 特 性 遗 传 病 可 分 为 染 色 体 病 和 基 因 病 染 色 体 病 是 染 色 体 的 结 构 或 数 目 异 常 引 起 的 疾 病, 由 于 染 色 体 异 常 涉 及 较 多 的 基 因 异 常, 往 往 产 生 较 严 重 的 畸 形 或 疾 病 基 因 病 是 由 于 基 因 异 常 导 致 的 疾 病, 根 据 涉 及 到 的 异 常 基 因 的 性 质, 基 因 病 又 可 分 为 单 基 因 病 ( 由 单 个 基 因 座 位 异 常 决 定 ) 和 多 基 因 病 ( 由 多 个 微 效 基 因 共 同 决 定 ) 第 一 节 单 基 因 遗 传 与 单 基 因 病 单 基 因 病 的 概 念 与 分 类 单 基 因 病 (monogenic disease) 又 称 孟 德 尔 遗 传 病, 是 由 单 个 基 因 异 常 引 起 的 遗 传 病 根 据 致 病 基 因 是 显 性 的 或 隐 性 的 以 及 所 处 的 染 色 体 的 种 类, 可 分 为 常 染 色 体 显 性 遗 传 病 常 染 色 体 隐 性 遗 传 病 X 连 锁 显 性 遗 传 病 X 连 锁 隐 性 遗 传 病 Y 染 色 体 遗 传 病 等 多 种 类 型 (-) 常 染 色 体 显 性 遗 传 常 染 色 体 显 性 遗 传 (ωa 趴 川 u l tosomal 也 d omlnal 川 inhe 盯 en 山 且 ce, AD) 指 一 种 遗 传 性 状 或 遗 传 病 有 关 的 基 因 位 于 常 染 色 体 上, 其 性 质 是 显 性 的, 即 该 基 因 处 于 杂 合 状 态 时, 个 体 就 足 以 显 示 该 基 因 控 制 的 性 状 E\l(; 疾 病 由 这 种 致 病 基 因 导 致 的 疾 病 称 为 常 染 色 体 显 性 遗 传 病 1. 完 全 显 性 遗 传 (complete dominance) 致 病 基 因 在 杂 合 状 态 (Aa) 时, 表 现 出 与 纯 合 于 (AA) 完 全 一 样 的 显 性 性 状 或 遗 传 病, 该 显 性 性 状 称 为 完 全 显 性 常 染 色 体 完 全 显 性 遗 传 的 特 点 :1 患 者 双 亲 有 患 者, 即 连 续 几 代 发 病 ;2 患 者 于 女 中 约 1/2 发 病 ;3 男 女 发 病 机 会 大 致 均 等 下 面 以 短 指 ( 趾 ) 症 为 例 说 明 常 染 色 体 完 全 显 性 遗 传 的 特 点 短 指 ( 趾 ) 症 (brachydactyly) 是 较 常 见 的 手 ( 足 ) 部 畸 形, 由 于 指 骨 或 掌 骨 变 短,E\l(; 指 骨 缺 如, 致 使 手 指 ( 趾 ) 变 短 系 谱 ( 图 2-1) 所 示, 短 指 ( 趾 ) 症 男 女 都 有 发 病, 是 由 某 对 常 染 色 体 上 的 基 因 决 定 的 用 A 表 示 致 病 的 显 性 基 因 (dominant gene), 用 a 表 示 控 制 产 生 正 常 性 状 的 基 因 即 致 病 基 因 的 等 位 基 因, 在 杂 合 状 态 时 (Aa), 只 有 基 因 A 控 制 的 短 指 ( 趾 ) 症 呈 现 出 来, 而 基 因 a 的 作 用 没 有 表 达 出 来, 则 a 称 为 隐 性 基 因 (recessive gene) 临 床 症 状 是 表 现 出 来 的 性 状, 称 为 表 现 型 或 表 型 (phenotype) 例 如 患 者 有 短 指, 正 常 人 没 有 短 指, 这 是 不 同 的 表 现 型 控 制 各 种 表 现 12.

17 I H 皿 4 图 例 短 指 ( 趾 ) 症 系 谱 型 的 遗 传 组 成 称 为 基 因 型 E\l(; 遗 传 型 (genotype) 短 指 ( 趾 ) 症 患 者 的 基 因 型 是 Aa, 正 常 人 的 基 因 型 是 aa 基 因 型 为 Aa 的 人, 2 个 基 因 不 同, 称 为 杂 合 于 (heterozygote) 而 基 因 型 为 aa E\l(; AA 者, 称 为 纯 合 于 (homozygote) 因 为 A 对 a 是 显 性 的, 基 因 A 的 作 用 在 杂 合 于 时 表 现 出 来, 所 以 短 指 ( 趾 ) 症 的 遗 传 万 式 是 常 染 色 体 显 性 遗 传 短 指 ( 趾 ) 症 的 基 因 型 有 2 种, 纯 合 于 (AA) 和 杂 合 于 (Aa), 它 们 在 临 床 表 现 上 无 区 别, 故 为 完 全 显 性 杂 合 于 患 者 (Aa) 和 正 常 人 (aa) 娼 配, 后 代 中 短 指 ( 趾 ) 症 患 者 与 正 常 人 的 比 例 约 为 1 : 1, 即 后 代 有 约 1/ 2 于 女 发 病, 而 当 2 个 短 指 ( 趾 ) 症 杂 合 于 患 者 娼 配 时, 其 后 代 约 3/ 斗 的 于 女 将 发 病, 他 们 的 基 因 型 分 别 为 1 / 4 AA, 2 / 4 Aa, 只 有 约 1/4 于 女 表 型 正 常 上 述 系 语 显 示, 患 者 基 因 型 都 是 杂 合 于 (Aa), 他 ( 她 ) 们 的 致 病 基 因 A 来 自 双 亲 中 的 一 万, 即 双 亲 中 的 一 万 也 具 有 致 病 基 因 A, 当 然 也 是 患 者, 即 患 者 的 双 亲 之 一 是 患 者, 连 续 几 代 均 发 病 2. 不 完 全 显 性 (incomplete domina 时 e) 在 常 染 色 体 显 性 遗 传 病 中, 如 果 杂 合 于 (Bb) 的 症 状 较 纯 合 于 (BB) 轻, 这 种 遗 传 万 式 称 为 不 完 全 显 性 或 半 显 性 (semi - dominance), 也 称 为 中 间 型 遗 传 (interme - diate inherita 时 e) 这 是 因 为 杂 合 于 (Aa) 中 的 显 性 基 因 A 和 隐 性 基 因 a 的 作 用 都 得 到 一 定 程 度 的 表 达 3. 共 显 性 ( co - dominance) 一 对 常 染 色 体 上 的 等 位 基 因, 彼 此 间 没 有 显 性 和 隐 性 的 区 别, 在 杂 合 状 态 时, 2 种 基 因 控 制 的 性 状 都 能 表 现, 这 种 遗 传 万 式 称 为 共 显 性 遗 传 例 如 ABO 血 型 是 由 一 组 复 等 位 基 因 (multiple alleles) 决 定 的 所 谓 复 等 位 基 因 是 指 在 1 个 群 体 中, 某 特 定 的 基 因 座 位 上 的 等 位 基 因 种 类 有 3 种 或 3 种 以 上, 1 且 具 体 到 特 定 的 某 一 个 体 则 仅 含 有 其 中 的 1 种 ( 纯 合 于 ) E\l(; 2 种 ( 杂 合 于 ) 复 等 位 基 因 是 由 于 1 个 基 因 发 生 多 种 变 化, 从 而 产 生 多 种 基 因 型 的 结 果 ABO 血 型 的 基 因 是 由 r A r E 和 1 三 种 基 因 组 成 的 复 等 位 基 因 基 因 型 r A r A 和 rai 都 决 定 红 细 胞 膜 上 抗 原 A 的 产 生, 使 这 种 个 体 为 A 型 血 ; 基 因 型 r E r E 和 rei 都 决 定 红 细 胞 膜 上 抗 原 B 的 产 生, 这 种 个 体 为 B 型 血 ; 基 因 型 11 则 决 定 H 物 质 的 产 生 而 不 产 生 抗 原 A 和 抗 原 B, 这 种 个 体 为 0 型 血 因 此 基 因 r A 对 基 因 1 为 显 性, 基 因 r E 对 基 因 1 也 是 显 性 杂 合 于 r A r E 决 定 红 细 胞 膜 上 既 产 生 抗 原 A 又 产 生 抗 原 B, 这 种 个 体 为 AB 型 血 ; 如 果 2 个 杂 合 于 (I Ar E ) AB 型 血 的 人 结 婚 则 会 导 致 其 后 代 A 型 血 (I A r A ) AB 型 血 (I A r E ) B 型 血 (I E r E ) 的 比 率 为 1 : 2 : 1, 这 是 2 个 等 位 基 因 共 显 性 的 结 果 根 据 孟 德 尔 分 离 律 的 原 理, 己 生 日 双 亲 血 型, 就 可 以 估 计 出 于 女 中 可 能 出 现 的 血 型 和 不 可 能 出 现 的 血 型 ( 表 2-1), 这 在 法 医 学 的 亲 于 鉴 定 中 有 一 定 意 义. 13.

18 表 2-1 双 亲 和 子 女 之 间 血 型 遗 传 的 关 系 双 苯 子 女 中 可 能 出 现 的 血 型 子 女 中 不 可 能 出 现 的 血 型 血 型 产 生 配 子 基 因 型 AXA [AI ix[ai i A, B, AB AXO [AI i X i A, DB, AB AxB [AI ix[bi i A, B, AB, 0 AXAB [AI ix[ai [B A, B, AB BxB [B I i X [B I i B, A, AB BxO [BI i Xi B, A, AB BXAB [B I i X [A I [B A, B, AB ABxO [AI [B Xi A, B AB, 0 ABxAB [AI [BX[AI [B A, B, AB xo ix i A, B, AB 4. 不 规 则 显 性 (irregular dominance) 带 有 显 性 基 因 的 个 体 理 应 发 病, 但 事 实 上 并 非 完 全 如 此, 有 些 杂 合 于 并 不 发 病, 这 可 能 是 因 受 修 饰 基 因 等 因 素 的 影 响 不 表 现 出 临 床 症 状, 失 去 显 性 特 点 而 不 外 显, 有 时 表 现 程 度 有 差 异, 称 为 不 规 则 显 性 5. 延 迟 显 性 (delayed dominance) 有 些 显 性 遗 传 病 并 非 出 生 后 即 发 病, 而 是 到 个 体 发 育 的 较 晚 期 才 出 现 症 状, 这 种 情 况 称 为 延 迟 显 性, 如 慢 性 进 行 性 舞 蹈 病 Hun ( tlllgto 口 's chorea) 0 i 亥 病 为 常 染 色 体 显 性 遗 传 病, 杂 合 于 (Aa) 在 20 岁 时 只 有 1% 发 病, 40 岁 时 有 38% 发 病, 60 岁 时 有 94% 发 病 ( 图 2-2), 即 随 着 年 龄 的 增 高 发 病 率 不 断 提 高 I E 皿 ( 二 ) 常 染 色 体 隐 性 遗 传 图 J 慢 性 进 行 性 舞 蹈 病 系 谱 控 制 某 遗 传 性 状 或 遗 传 病 的 基 因 位 于 常 染 色 体 上, 但 在 杂 合 状 态 时 不 表 现 相 应 性 状, 只 有 当 致 病 基 因 处 于 纯 合 状 态 ( aa) 万 得 以 表 现, 称 为 常 染 色 体 隐 性 遗 传 (autosomal recessi 时 1 日 heritance, 遗 传 病 AR), 这 种 致 病 基 因 所 引 起 的 疾 病 称 为 常 染 色 体 隐 性 常 染 色 体 隐 性 遗 传 的 特 点 :1 患 者 的 双 亲 可 表 现 型 正 常, 但 均 为 致 病 基 因 的 肯 定 携 带 者 ;2 患 者 同 胞 中 约 1/4 个 体 发 病, 男 女 发 病 机 会 均 等, 患 者 大 部 分 出 现 在 同 胞 之 间, 子 女 往 往 正 常 ;3 系 谱 中 往 往 看 不 到 连 续 遗 传 现 象, 常 为 散 发 ;4 近 亲 娼 配 的 后 代 中 发 病 概 率 显 著 较 高 自 化 病 (albinism) 是 由 于 全 身 黑 色 素 细 胞 均 缺 乏 黑 色 素, 所 以 皮 肤 毛 发 呈 白 色 自 化 病 患 者 只 有 当 1 对 等 位 基 因 是 隐 性 致 病 基 因 纯 合 于 (aa) 时 才 发 病, 所 以 患 者 的 基 14.

19 因 型 都 是 纯 合 于 ( aa) 当 个 体 为 杂 合 状 态 (Aa) 时, 虽 然 本 人 不 发 病, 但 为 致 病 基 因 携 带 者, 他 ( 她 ) 能 将 致 病 基 因 a 传 给 后 代, 因 此 患 者 的 父 母 双 万 都 应 是 致 病 基 因 的 肯 定 携 带 者 (Aa) 如 果 2 个 杂 合 于 (Aa) 娼 配, 后 代 于 女 患 者 ( aa) 占 1 / 斗, 表 现 型 正 常 者 占 3 / 斗 表 现 型 正 常 的 人 中 2/3 为 杂 合 于 (Aa), 是 致 病 基 因 的 可 能 携 带 者, 1 / 3 基 因 型 为 正 常 纯 合 于 (AA) 国 2-3 是 白 化 病 的 1 个 家 系 系 谱, 基 本 反 映 了 常 染 色 体 隐 性 遗 传 的 特 点 表 现 在 : 1 患 者 的 双 亲 ( 田 1, 2 和 II 3, 4 ) 表 现 型 正 常, 但 均 为 致 病 基 因 的 肯 定 携 带 者 ;2 系 谱 中 看 不 到 连 续 遗 传 现 象, 常 为 散 发, 有 的 系 谱 中 只 见 先 证 者 ;3 同 胞 中 约 1/4 个 体 发 病, 男 女 性 发 病 机 会 均 等, 患 者 大 部 分 出 现 在 同 胞 之 间, 于 女 往 往 正 常 ;4 近 亲 娼 配 的 后 代 中 发 病 概 率 显 著 较 高 H 皿 N ( 三 ) 性 连 锁 遗 传 图 例 自 化 病 系 谱 由 于 在 两 性 中 性 染 色 体 的 组 成 不 同, 男 性 为 XY, 而 女 性 为 XX 对 于 男 性 而 言, X 染 色 体 只 有 1 份, 而 女 性 有 2 份 另 外, 由 于 男 性 的 X 染 色 体 只 传 给 女 儿, Y 染 色 体 只 传 给 儿 于, 所 以 性 染 色 体 上 的 基 因 所 控 制 的 遗 传 性 状 或 遗 传 病 相 对 于 常 染 色 体 上 的 基 因 所 控 制 的 遗 传 性 状 或 遗 传 病 有 自 己 的 特 点 目 前 己 知 的 性 连 锁 的 致 病 基 因 大 都 在 X 染 色 体 上, 与 性 别 相 关 联 的 遗 传 万 式 称 为 性 连 锁 遗 传 (sexlinked inheritance) 0 1. X 连 锁 隐 性 遗 传 (X -linked recessive inheritance, XR) 一 种 性 状 决 定 基 因 或 遗 传 病 致 病 基 因 位 于 X 染 色 体 上, 且 为 隐 性 基 因, 则 其 遗 传 万 式 为 X 连 锁 隐 性 遗 传 由 于 女 性 有 2 条 X 染 色 体, 只 有 当 2 条 X 染 色 体 上 等 位 基 因 都 是 隐 性 致 病 基 因 纯 合 于 (xax a ) 时 才 发 生 疾 病 而 隐 性 致 病 基 因 杂 合 于 (XAX a ) 的 女 性 为 表 现 型 正 常 的 致 病 基 因 携 带 者 在 男 性 中, 因 只 有 1 条 X 染 色 体, Y 染 色 体 上 缺 少 同 源 基 因, 男 性 的 细 胞 中 只 有 成 对 的 等 位 基 因 中 的 1 个 基 因, 故 称 为 半 合 于 (hemizygote), 所 以 只 要 X 染 色 体 上 有 致 病 基 因 (Xay) 就 发 病 以 红 绿 色 盲 为 例, 来 说 明 X 连 锁 隐 性 遗 传 的 特 占 色 盲 分 全 色 盲 (achromatopsia) 和 红 绿 色 盲 (dyschromatopsia of the prota 口 and deutan) 前 者 不 能 辨 别 任 何 颜 色, 一 般 认 为 是 常 染 色 体 隐 性 遗 传 ; 后 者 表 现 为 对 红 色 和 绿 色 的 辨 别 能 力 低 下, 呈 X 连 锁 隐 性 遗 传 红 绿 色 盲 的 男 性 发 生 率 约 为 7.0%, 女 性 约 为 0.5% 0 1 个 红 绿 色 盲 男 患 者 (Xby) 和 正 常 辨 色 能 力 女 性 (XBX B ) 结 婚, 他 们 的 15.

20 女 儿 都 从 父 亲 那 里 获 得 1 个 x b 染 色 体, 从 母 亲 那 里 得 到 1 条 正 常 的 X 染 色 体 而 成 为 致 病 基 因 携 带 者 (XBX 勺, 他 们 的 儿 于 则 只 从 母 亲 那 里 获 得 1 条 XB, 故 辨 色 能 力 全 部 正 常 (XBy) 凡 携 带 致 病 基 因 的 女 性 (XBX b ) 与 正 常 辨 色 能 力 的 男 性 结 婚, 下 一 代 中, 儿 于 有 一 半 是 正 常 (XBy) 的, 一 半 是 红 绿 色 盲 (Xby), 女 儿 中 一 半 是 致 病 基 因 携 带 者 (XBX b ), 一 半 则 完 全 正 常 (XBX B ) 因 此, 男 性 患 者 的 双 亲 表 现 型 都 正 常, 1 旦 男 性 患 者 的 母 亲 是 致 病 基 因 的 携 带 者, 致 病 基 因 必 定 来 自 母 亲 ( 携 带 者 ), 他 将 来 一 定 传 给 女 儿 ; 女 性 患 者 的 父 亲 一 定 是 患 者, 其 母 亲 是 致 病 基 因 携 带 者 这 里 可 见 " 外 公 通 过 女 儿 传 给 外 孙 " 的 交 叉 遗 传 (criss - cross inheritance) 现 象, 如 果 女 性 携 带 者 (XBX b ) 与 男 性 患 者 (Xby) 结 婚, 后 代 中, 女 儿 1 / 2 可 能 发 病, 1 / 2 可 能 为 携 带 者, 儿 于 中 发 病 者 和 正 常 者 各 占 1/2 0 从 图 2-4 红 绿 色 盲 系 谱 中, 可 看 出 X 连 锁 隐 性 遗 传 的 基 本 特 点 :1 男 性 患 者 远 多 于 女 性 患 者 ;2 男 性 患 者 的 双 亲 都 无 病, 其 致 病 基 因 来 自 携 带 者 ( 母 亲 ) ;3 由 于 交 叉 遗 传, 男 性 患 者 的 同 胞 舅 父 姨 表 兄 弟 外 甥 中 常 见 到 患 者, 偶 见 外 祖 父 发 病, 在 此 情 况 下, 男 性 患 者 的 舅 父 一 般 正 常 ;4 由 于 男 性 患 者 的 于 女 都 是 正 常 的, 所 以 代 与 代 间 可 见 明 显 的 不 连 续 ( 隔 代 遗 传 ) I 2 E 1 2 皿 1 2 图 J 红 绿 色 盲 系 谱 2. X 连 锁 显 性 遗 传 (X -linked dominant i 日 herita 口 ce) 当 引 起 性 状 或 遗 传 病 的 基 因 位 于 X 染 色 体 上, 其 性 质 是 显 性 的 时, 这 种 遗 传 万 式 称 为 X 连 锁 显 性 遗 传, 这 种 疾 病 称 为 X 连 锁 显 性 遗 传 病 目 前 所 知 X 连 锁 显 性 遗 传 病 不 足 20 种 由 于 致 病 基 因 是 显 性 的, 并 位 于 X 染 色 体 上, 因 此, 不 论 男 性 (XAy) 和 女 性 (X A X a ) 只 要 含 有 1 个 致 病 基 因 X A 就 会 发 病 与 常 染 色 体 显 性 遗 传 不 同 之 处 是, 女 性 患 者 的 儿 于 女 儿 都 可 发 病, 且 机 会 均 等 ; 而 男 性 患 者 因 只 能 将 X 染 色 体 传 给 女 儿, 其 上 的 致 病 基 因 也 只 能 传 给 女 儿, 不 传 给 儿 于, 所 以 只 有 女 儿 发 病 因 此, x 连 锁 显 性 遗 传 的 女 性 患 者 多 于 男 性, 大 约 为 男 性 的 2 倍 另 外, 从 临 床 上 看, 女 性 患 者 大 多 数 是 杂 合 子, 病 情 一 般 较 男 性 轻, 而 男 患 者 病 情 较 重 从 国 2-5 抗 维 生 素 D 向 倭 病 系 谱 中, 可 以 看 出 X 连 锁 显 性 遗 传 的 特 点 :1 女 性 患 者 多 于 男 性 ;2 患 者 双 亲 之 一 必 定 是 患 者, 女 性 患 者 都 是 杂 合 于, 他 们 的 致 病 基 因 可 传 给 儿 于 也 可 传 给 女 儿, 1 旦 男 性 患 者 的 致 病 基 因 只 传 给 女 儿, 因 此 系 谱 中 男 性 患 者 的 女 儿 全 部 发 病 ;3 可 看 到 连 续 2 代 以 上 都 有 患 者 抗 维 生 素 D 向 倭 病 (viami 日 D resistant rickets, VDRR) 可 以 作 为 X 连 锁 显 性 遗 传 病 的 实 例 16. VDRR 患 者 身 体 矮 小, 有 时 伴 有 向 倭 病 等 各 种 表 现 i 亥 病 是 一 种 以 低 磷 酸

21 血 症 导 致 骨 发 育 障 碍 为 特 征 的 遗 传 性 骨 病, 患 者 主 要 是 肾 远 曲 小 管 对 磷 元 素 的 转 运 机 制 发 生 障 碍, 通 过 尿 液 排 出 的 磷 酸 盐 增 多, 血 中 磷 酸 盐 浓 度 降 低 而 影 响 骨 质 钙 化 患 者 用 常 规 剂 量 的 维 生 素 D 治 疗 不 能 奏 效, 故 有 抗 维 生 素 D 向 倭 病 之 称 从 临 床 观 察, 女 性 患 者 的 病 情 较 男 性 患 者 轻, 多 数 只 有 低 血 磷, 向 倭 症 状 不 太 明 显, 表 现 为 不 完 全 显 性, 这 可 能 是 女 性 患 者 多 为 杂 合 于, 其 中 正 常 X 染 色 体 的 基 因 还 发 挥 一 定 的 作 用 E 皿 ( 四 ) 从 性 遗 传 图 J 抗 维 生 素 D 1' 旬 倭 病 系 谱 从 性 遗 传 (sex - infl 盯 er 旧 ed inh 肚 e 盯 n 山 且 ce) 和 性 连 锁 遗 传 的 表 现 都 与 性 别 有 密 切 关 系, 但 它 们 却 有 本 质 的 区 别 性 连 锁 遗 传 的 基 因 位 于 性 染 色 体 上, 而 从 性 遗 传 的 基 因 位 于 常 染 色 体 上, 且 致 病 基 因 性 质 仍 有 显 性 和 隐 性 之 别 这 种 常 染 色 体 上 的 基 因 所 控 制 的 性 状 显 著 受 性 别 影 响, 在 男 性 和 女 性 中 症 状 出 现 的 比 例 或 表 现 程 度 显 著 不 同, 即 同 样 的 基 因 型 由 于 性 别 不 同 而 表 现 型 不 同, 这 种 遗 传 万 式 称 为 从 性 遗 传 原 发 性 血 色 病 (primary hematochromatosis) 可 作 为 从 性 遗 传 万 式 的 实 例 本 病 为 一 种 遗 传 性 代 谢 障 碍, 其 典 型 症 状 是 皮 肤 色 素 沉 着 肝 硬 化 糖 尿 病 三 联 综 合 征 i 亥 病 是 由 于 含 铁 血 黄 素 在 组 织 中 大 量 沉 积, 造 成 多 种 器 官 损 害 所 致 本 病 症 状 出 现 较 迟, 是 由 于 铁 质 蓄 积 达 到 15 g~30 g 万 产 生 症 状, 所 以 80% 病 例 在 40 岁 以 后 发 病 本 病 致 病 基 因 在 常 染 色 体 上, 1 旦 男 性 多 于 女 性 10 倍 ~20 倍, 而 且 女 性 发 病 较 迟, 这 是 因 为 女 性 通 过 月 经 饪 摄 和 哺 乳, 一 生 中 可 丧 失 铁 10 g~35 g, 故 难 以 表 现 铁 质 沉 着 症 状 遗 传 性 早 秃 (hereditary alopecia) 是 从 性 遗 传 的 又 一 例 于 遗 传 性 早 秃 为 常 染 色 体 显 性 遗 传 病, 男 性 显 著 多 于 女 性, 女 性 仅 表 现 为 头 发 稀 疏, 极 少 全 秃, 杂 合 于 (Bb) 男 性 会 出 现 早 秃 ; 相 反, 女 性 杂 合 于 (Bb) 不 出 现 早 秃, 只 有 纯 合 于 (BB) 才 出 现 早 秃 ( 五 ) 限 性 遗 传 一 种 遗 传 性 状 或 遗 传 病 的 致 病 基 因 位 于 常 染 色 体 或 性 染 色 体 上, 其 性 质 可 以 是 显 性 或 隐 性, 但 只 限 定 在 一 种 性 别 中 表 现, 而 在 另 一 性 别 完 全 不 能 表 现, 只 是 这 些 致 病 基 因 都 可 以 向 后 代 传 递, 这 种 遗 传 万 式 称 为 限 性 遗 传 二 不 同 于 孟 德 尔 遗 传 规 律 的 遗 传 现 象 ( 一 ) 由 系 遗 传 母 系 遗 传 (maternal inher 山 川 e) 是 指 核 外 遗 传 物 质 所 控 制 的 遗 传 现 象, 在 人 类 中 主 要 是 线 粒 体 基 因 控 制 的 性 状 遗 传 因 为 男 性 产 生 的 配 于 精 于 几 乎 不 含 有 细 胞 质, 受 精 过 程 中 与 卵 于 融 合 的 精 于 头 部 几 乎 没 有 线 粒 体, 而 女 性 产 生 的 配 于 卵 于 含 有 大 17

22 量 的 细 胞 质 及 线 粒 体, 因 此, 受 精 卵 的 线 粒 体 主 要 由 母 亲 遗 传, 线 粒 体 基 因 控 制 的 性 状 表 现 为 母 系 遗 传 母 系 遗 传 的 特 点 :1 母 亲 将 她 的 mtdna 传 递 给 儿 于 和 女 儿, 但 只 有 女 儿 能 将 其 mtdna 传 递 给 下 一 代 ;2 人 的 细 胞 里 通 常 有 上 千 个 mtdna 拷 贝, 在 突 变 和 正 常 mtdna 共 存 的 细 胞 中, mtdna 在 细 胞 的 复 制 和 分 离 过 程 中 发 生 遗 传 漂 变, 可 导 致 于 细 胞 出 现 3 种 基 因 型 : 纯 合 的 突 变 mtdna 纯 合 的 正 常 mtdna 突 变 和 正 常 mtdna 的 杂 合, 这 是 由 于 mtdna 的 遗 传 不 遵 帽 孟 德 尔 定 律, 被 随 机 分 配 到 于 细 胞 中 所 致 ; 线 粒 体 病 的 发 病 有 一 阔 值, 只 有 当 异 常 的 mtdna 超 过 阔 值 时 才 发 病 女 性 携 带 者 的 细 胞 内 突 变 的 mtdna 未 达 到 阔 值 或 在 某 种 程 度 上 受 核 基 因 的 影 响 而 未 发 病, 但 仍 可 以 将 mtdna 突 变 体 向 下 代 传 递 女 性 患 者 细 胞 里 mtdna 同 样 可 能 存 在 杂 合 性, 于 女 中 得 到 较 多 突 变 mtdna 的 个 体 发 病, 得 到 较 少 的 病 情 较 轻 或 不 发 病 Leber 遗 传 性 视 神 经 病 (Lebe r' s hereditary optic neuropathy, LHON) 也 称 Leber 病, 其 主 要 表 现 为 视 神 经 退 行 性 变, 是 性 亚 是 性 视 力 减 退, 中 心 视 野 丧 失 最 明 显 此 病 发 病 机 制 一 般 认 为 是 由 于 mtdna 点 突 变 导 致 其 第 1178 位 精 氨 酸 天 冬 酌 肢 1. 亥 突 变 使 编 码 呼 吸 链 NADH 脱 氢 酶 的 mtdna 第 340 位 精 氨 酸 被 组 氨 酸 取 代, 改 变 了 mtdna 空 间 构 型, 导 致 NADH 脱 氢 酶 活 性 降 低, 线 粒 体 产 能 下 降, 因 而 对 需 能 量 多 的 视 神 经 组 织 损 害 最 大, 久 之 导 致 视 神 经 细 胞 退 行 性 变, 直 至 萎 缩 由 于 mtdna 为 母 系 遗 传, 因 此 由 mtdna 基 因 突 变 所 致 的 Leber 病 也 遵 守 母 系 遗 传 的 传 递 规 律, 即 患 者 都 与 母 亲 有 关, 男 性 患 者 的 后 代 中 尚 未 见 有 直 接 传 代 者 但 并 非 女 性 患 者 的 后 代 全 部 发 病, 而 且 发 病 年 龄 也 不 一 致 ; 甚 至 一 些 女 性 本 身 表 现 型 正 常, 1 且 可 将 本 病 传 给 下 一 代 ( 二 ) 遗 传 印 记 在 正 常 孟 德 尔 式 遗 传 中, 理 论 上 来 自 父 万 或 母 万 的 基 因 所 产 生 的 表 现 型 效 应 是 相 同 的, 即 同 一 个 基 因 不 管 来 自 父 万 还 是 母 万, 都 能 同 样 表 达, 产 生 同 样 的 作 用 而 实 际 情 况 发 现, 有 些 基 因 当 其 来 自 不 同 的 亲 本 时, 其 功 能 E\l(; 表 现 型 效 应 可 以 不 同, 即 这 些 基 因 是 被 父 亲 或 母 亲 " 印 记 " 了 的, 称 为 遗 传 印 记 或 基 因 组 印 记 (genomic imprinting) 现 己 发 现 数 十 种 遗 传 病 存 在 着 遗 传 印 记 现 象, 这 种 现 象 难 以 用 经 典 的 孟 德 尔 定 律 来 解 释, 也 不 能 用 性 连 锁 遗 传 线 粒 体 遗 传 及 多 基 因 遗 传 来 回 答 遗 传 印 记 是 由 于 在 不 同 的 生 植 细 胞 分 化 成 熟 过 程 中 特 定 基 因 或 基 因 群 受 到 不 同 修 饰 的 结 果, 一 些 基 因 在 精 于 生 成 过 程 中 被 印 记, 另 一 些 基 因 在 卵 于 生 成 过 程 中 被 印 记, 被 印 记 了 的 基 因 的 表 达 受 到 抑 制 DNA 的 甲 基 化 可 能 是 遗 传 印 记 的 分 于 机 制 之 一 一 些 基 因 在 精 于 和 卵 于 中 甲 基 化 程 度 不 同, 高 度 甲 基 化 ( 被 印 记 ) 的 基 因 不 表 达 E\l(; 表 达 程 度 降 低, 当 胚 胎 发 育 过 程 中 发 生 去 甲 基 化 时, 这 些 基 因 即 开 始 表 达 总 之, 基 因 的 印 记 影 响 到 性 状 或 许 多 遗 传 病 和 肿 瘤 的 发 生, 影 响 发 病 年 龄 外 显 率 表 现 度, 甚 至 遗 传 万 式 在 对 某 些 遗 传 现 象 不 能 用 经 典 孟 德 尔 定 律 解 释 时, 用 遗 传 印 记 可 以 得 到 合 理 解 释 例 如, Prader - Willi 综 合 征 (PWS) 和 Angelman 综 合 征 (AS) 是 两 种 不 同 的 遗 传 病, 但 都 有 共 同 的 15q11-13 缺 失 父 源 染 色 体 缺 失 时 临 床 上 表 现 为 PWS, 而 母 源 染 色 体 缺 失 时 表 现 为 AS 这 提 示 来 源 不 同 的 等 位 基 因 有 不 同 的 表 达 某 些 常 染 色 体 显 18

23 F 性 遗 传 病 的 发 病 年 龄 和 病 情 轻 重 似 乎 与 传 递 基 因 的 亲 本 有 关 慢 性 进 行 性 舞 蹈 病 患 者 发 病 年 龄 一 般 在 30 岁 ~50 岁, 1 旦 有 5%~10% 患 者 在 20 岁 以 前 发 病, 且 病 情 严 重, 这 些 患 者 致 病 基 因 均 由 父 亲 遗 传 母 亲 遗 传 者, 于 女 发 病 年 龄 多 在 40 岁 ~50 岁 囊 性 纤 维 化 (cystic fibrosis, CF) 是 一 种 常 染 色 体 隐 性 遗 传 病, 己 发 现 某 些 CF 患 者 的 2 条 7 号 染 色 体 均 来 自 母 亲, 即 单 亲 二 体 性 (uniparental disomy, UPD) 人 类 的 胚 胎 发 育 也 有 类 似 现 象, 拥 有 父 源 2 套 染 色 体 的 受 精 卵 发 育 成 葡 萄 胎, 而 拥 有 母 源 2 套 染 色 体 的 发 育 成 畸 胎 瘤 此 外, 无 论 是 双 雄 三 倍 体 还 是 双 雌 三 倍 体 都 发 育 成 畸 胎 儿 因 此, 正 常 的 胚 胎 发 育 必 须 拥 有 亲 代 双 万 染 色 体 或 基 因 组 一 些 胚 胎 性 肿 瘤 中 也 存 在 亲 源 性 非 随 机 的 染 色 体 或 基 因 丢 失 现 象, 而 且 主 要 是 母 源 染 色 体 的 丢 失 如 散 发 的 肾 母 细 胞 瘤 (Wilms tumor ) 有 llp13-15 的 丢 失, 且 皆 来 自 母 万, 而 遗 传 型 基 因 丢 失 多 来 自 父 万 ; 遗 传 型 视 网 膜 母 细 胞 瘤 中 有 13q14 杂 合 性 去 夫, 且 丢 失 的 多 为 母 源 Rb 基 因 ( 三 ) 动 态 突 变 疾 病 动 态 突 变 疾 病 (dynamic disease) 是 由 于 基 因 编 码 区 或 非 编 码 区 的 CGG, CTG, CAG 等 三 核 昔 酸 重 复 序 列 拷 贝 数 增 加 或 过 度 扩 展 引 起 的 一 系 列 疾 病 这 类 疾 病 发 病 率 较 高, 危 害 重 且 难 以 治 疗 ( 表 2-2, 3) 表 2-2 常 见 动 态 突 变 疾 病 及 其 基 因 异 常 脆 性 X 综 合 征 动 态 突 变 所 致 疾 病 脆 性 XE 精 神 障 碍 (FRAXA) (FRAXE) 基 因 F 肌 1R1 FRAXE 定 位 Xq27.3 Xq28 三 核 背 酸 eee-- UTR) GCC 正 常 人 三 核 患 者 三 核 背 酸 拷 贝 数 背 酸 拷 贝 数 10~ 50 LUU 000 6~25 >200 L 慢 性 进 行 性 舞 蹈 病 强 直 性 肌 营 养 不 良 (HD) (DM) 脊 髓 延 髓 肌 萎 缩 (SBMA, Kennedy 氏 病 ) 脊 髓 小 脑 共 济 失 i 周 1 型 (SCA l) Machado - ] oseph 氏 病 ( M]D ) / 俗 供 领 泣 核 苍 白 球 丘 脑 下 部 萎 缩 LA) 遗 传 性 非 息 肉 性 结 肠 癌 (HNPCC) (DRP IT 15 MT-PK AR SCA1 M]D/ SCA3 DRPLA1 2pll 4p q13.3 Xq p q q12 - ter CAG (GIn) CTG (3' UTR) CAG (GIn) CAG (GIn) CAG (GIn) CAG (GIn) 9~34 30~100 5~35 80~ ~31 40~62 19~38 42~81 14~40 68~82 7~25 49~75 例 如 脆 性 X 综 合 征 是 一 种 常 见 的 X 连 锁 的 单 基 因 显 性 遗 传 病 其 主 要 临 床 表 现 为 中 度 到 重 度 智 力 低 下 大 辜 丸 大 耳 轮, 有 些 患 者 还 伴 有 高 膊 弓 语 言 障 碍 多 动 孤 僻 癫 痛 等 在 男 性 中 发 病 率 约 为 1 / ~ 1 / 在 先 天 性 智 力 低 下 病 因 中 仅 次 于 唐 氏 综 合 征 细 胞 遗 传 学 检 查 可 在 Xq27.3 处 见 到 叶 酸 敏 感 的 脆 性 位 点 脆 性 X 综 合 征 由 于 发 病 率 高, 无 有 效 治 疗 万 法, 因 而 是 优 生 工 作 重 点 预 防 的 遗 传 病 之 一 再 如 常 染 色 体 显 性 小 脑 共 济 失 调, 仅 由 于 SCA3 的 CAG 重 复 序 列 扩 展 引 起 的 一 种 亚 型 发 病 率 就 高 达 1 /4000 这 类 疾 病 一 般 还 具 有 遗 传 早 现 ( anticipation) 和 遗 传 印 记 现 象, 是 因 为 致 病 的 基 因 突 变 在 世 代 传 递 过 程 中 不 稳 定, 三 核 昔 酸 重 复 的 拷 贝 数 易 进 一 步 扩 大 常 见 的 动 态 突 变 疾 病 有 脆 性 X 综 合 征 强 直 性 肌 营 养 不 良 慢 性 进 行 性 舞 蹈 病 (Hu 口 tlllg to 日 's disease, HD) 肯 尼 边 氏 病 常 染 色 体 显 性 小 脑 共 济 失 调 齿 状 核 红 核 苍 白 球 丘 脑 小 部 萎 缩 Machado - Joseph 氏 病 脆 性 XE 综 合 征 等 此 外, 在 一 些 肿 瘤 也 发 现 有 19

24 - 固 三 核 昔 酸 重 复 序 列 拷 贝 数 增 加 E\l(; 过 度 扩 展, 某 些 类 型 的 精 神 疾 患 如 双 向 情 感 性 精 神 病 某 些 类 型 的 精 神 分 裂 症 孤 僻 症 等 也 有 遗 传 早 现 现 象, 它 们 也 可 能 与 动 态 突 变 有 关 因 而 动 态 突 变 可 能 是 一 种 较 普 遍 的 现 象, 动 态 突 变 疾 病 是 一 大 类 医 学 上 非 常 重 要 的 疾 病 表 2-3 基 因 内 (CAG) n 异 常 扩 展 所 致 神 经 系 统 退 行 性 变 疾 病 病 名 基 因 定 位 蛋 白 功 能 Huntingto 巳 s ITIS 4p16.3 Huntingtin 未 知 SBMA AR Xq11- q12 Androger 工 receptor 雄 激 素 受 体 SCA1 SCA1 6p23 Ataxin - 1 未 知 SCA2 SCA2 12q24 Ataxin - 2 未 知 SCA3/ M]D SCA3 14q q31 Ataxin - 3 未 知 Ca 2 + 通 道 蛋 SCA6 EA1 19p13 αla Ca 2 + chan 巳 el 白 SCA7 SCA7 3p12 - p Ataxin - 7 未 知 DRPLA DRPLA 12P13.31 Atrophin - 1 未 知 常 见 单 基 因 病 举 例 ( ) 血 红 蛋 白 病 血 红 蛋 白 病 (hemoglo binopathy) 是 指 由 于 珠 蛋 白 分 于 的 结 构 或 合 成 量 异 常 所 引 起 的 疾 病 血 红 蛋 白 病 可 分 为 两 大 类, 即 异 常 血 红 蛋 白 病 和 地 中 海 贫 血 1. 异 常 血 红 蛋 白 病 异 常 血 红 蛋 白 (abnormal hemoglo bi 日 ) 是 指 由 于 珠 蛋 白 基 因 突 变 导 致 珠 蛋 白 肤 链 结 构 异 常, 如 有 临 床 表 现 者 称 为 异 常 血 红 蛋 白 病 或 异 常 血 红 蛋 白 综 合 征 镰 形 细 胞 病 (sickle cell disease) 是 由 于 自 链 第 6 位 谷 氨 酸 被 蝴 氨 酸 取 代, 形 成 HbS, 导 致 电 荷 改 变, 在 脱 氧 情 况 下 HbS 聚 合 形 成 长 棒 状 聚 合 物, 使 红 细 胞 形 态 异 常, 由 圆 盘 状 变 为 镰 刀 形 由 于 红 细 胞 镰 变 引 起 血 站 度 增 高, 导 致 血 管 梗 阻, 发 生 一 过 性 剧 痛 ( 肌 肉 骨 悟 痛, 腹 痛 ) 急 性 大 面 积 组 织 损 伤 心 肌 梗 死 等 镰 变 细 胞 的 变 形 性 降 低 还 可 升 起 溶 血, HbS 纯 合 于 (HbSHbS) 表 现 为 镰 形 细 胞 性 贫 血 ; 杂 合 于 (HbAHbS) 表 现 为 镰 形 细 胞 性 状, 大 部 分 无 症 状, 但 也 可 有 轻 度 慢 性 贫 血 2. 地 中 海 贫 血 由 于 珠 蛋 白 基 因 缺 失 或 突 变 导 致 某 种 珠 蛋 白 链 合 成 障 碍, 造 成 α 链 和 自 链 合 成 失 去 平 衡 而 导 致 的 溶 血 性 贫 血 称 为 地 中 海 贫 血 (thalassemia) 根 据 合 成 障 碍 的 肤 链 不 同 可 把 地 中 海 贫 血 分 为 α 和 自 地 中 海 贫 血 两 类 此 外 还 有 少 见 的 部 和 州 地 中 海 贫 血 (1) α 地 中 海 贫 血 (α thalassemia) : 是 由 于 α 珠 蛋 白 基 因 的 缺 失 或 缺 陷 使 α 珠 蛋 白 链 (α 链 ) 缺 乏 而 引 起 的 溶 血 性 贫 血 (2) 目 地 中 海 贫 血 (~- thalassemia) : 是 由 于 自 珠 蛋 白 基 因 的 缺 失 或 缺 陷 使 自 珠 蛋 白 链 ( 自 链 ) 缺 乏 而 引 起 的 溶 血 性 贫 血 ( 二 ) 免 疫 缺 陷 病 免 疫 缺 陷 病 (immunodeficiency) 是 指 免 疫 系 统 功 能 障 碍 引 起 的 一 类 疾 病, 可 分 为 20

25 遗 传 性 ( 原 发 性 ) 与 继 发 性 两 大 类 根 据 参 与 免 疫 反 应 的 细 胞 种 类 又 可 分 为 B 细 胞 和 T 细 胞 以 及 联 合 免 疫 缺 陷 病 1. 无 丙 球 蛋 白 血 症 (agammaglobulinemia) 无 丙 球 蛋 白 血 症 Bruton 型 呈 X 连 锁 隐 性 遗 传 血 中 B 细 胞 缺 如, 导 致 血 中 19A, 19G 和 19M 完 全 或 基 本 缺 如 而 T 细 胞 不 受 影 响, 细 胞 免 疫 机 制 尚 保 存, 对 移 植 物 有 排 斥 反 应 患 儿 反 复 发 生 严 重 的 细 菌 感 染, 但 对 病 毒 或 真 菌 并 无 易 感 性 2. 严 重 联 合 免 疫 缺 陷 病 (severe combined immunodeficiency) 严 重 联 合 免 疫 缺 陷 病 指 B 细 胞 和 T 细 胞 均 有 缺 陷 的 一 类 免 疫 缺 陷 病 主 要 表 现 为 上 呼 吸 道 感 染 肺 炎 支 气 管 炎, 其 次 为 肠 炎 自 身 免 疫 性 疾 病 ( 类 风 湿 关 节 炎, 系 统 性 红 斑 狼 疮 ) 等 ( 三 ) 假 日 巴 大 型 肌 营 养 不 良 症 假 肥 大 型 肌 营 养 不 良 症 ( 又 称 Duchenne 型 肌 营 养 不 良 症, DMD) 是 一 种 严 重 致 残 致 死 性 X 连 锁 隐 性 遗 传 病, 在 存 活 男 婴 中 的 发 病 率 约 为 1 / 其 临 床 表 现 为 进 行 性 肌 肉 萎 缩 和 进 行 性 肌 无 力 患 者 多 在 3 岁 ~5 岁 发 病, 12 岁 左 右 便 不 能 行 走, 一 般 在 20 岁 前 死 亡 肌 肉 无 力, 走 路 困 难 呈 鸭 步, 大 部 分 患 者 有 排 肠 肌 假 性 肥 大 现 象 和 不 同 程 度 的 心 肌 损 害, 约 30% 伴 有 智 力 障 碍 肌 纤 维 萎 缩 变 性, 被 脂 肪 及 结 缔 组 织 替 代, 排 肠 肌 假 性 肥 大 血 清 磷 酸 肌 酸 激 酶 等 活 性 升 高 良 性 假 肥 大 型 月 几 营 养 不 良 症 ( 又 称 Becker 型 肌 营 养 不 良 症, BMD) 患 者 病 情 较 轻, 临 床 表 现 与 DMD 相 似, 在 5 岁 ~25 岁 发 病, 病 程 发 展 较 缓 慢, 存 活 期 较 长, 有 活 至 63 岁 者 现 在 己 证 实 DMD 和 BMD 是 同 一 基 因 发 生 不 同 突 变 的 后 果 人 群 中 DMD 病 例 约 2/ 3 有 家 族 史, 呈 X 连 锁 隐 性 遗 传, 有 约 1 / 3 病 例 为 散 发, 由 新 发 生 的 基 因 突 变 造 成 ( 四 ) 皿 友 病 血 友 病 (hemophilia) 分 甲 乙 丙 型 和 血 管 性 假 血 友 病 4 种 类 型 1. 甲 型 血 友 病 (hemophilia A) 甲 型 血 友 病 又 名 抗 血 友 病 球 蛋 白 (a 口 tihemophilic globuli 日, AHG) 缺 乏 症 或 第 四 因 于 缺 乏 症, 遗 传 万 式 为 X 连 锁 隐 性 遗 传 主 要 表 现 为 出 血 倾 向, 其 出 血 特 点 为 :1 缓 慢 持 续 渗 血 ;2 多 发 生 于 轻 微 创 伤 之 后 ;3 出 血 部 位 广 泛, 常 反 复 发 生, 可 形 成 血 肿, 关 节 变 形, 死 因 多 为 颅 内 出 血 2. 乙 型 血 友 病 (hemophilia B) 乙 型 血 友 病 又 名 血 浆 促 凝 血 酶 原 激 酶 组 分 (PTC) 缺 乏 症 或 第 IX 因 于 缺 乏 症, 临 床 表 现 类 似 甲 型 血 友 病,1 旦 发 病 率 较 低, 遗 传 万 式 为 X 连 锁 隐 性 遗 传, 由 于 杂 合 于 第 IX 因 于 活 性 仅 为 正 常 的 1 / 3, 某 些 杂 合 于 可 出 现 症 状, 故 女 性 病 人 较 甲 型 多 见 3. 丙 型 血 友 病 (hemophilia C) 丙 型 血 友 病 又 名 血 浆 促 凝 血 酶 原 激 酶 前 体 (PTA) 缺 乏 症 (plasma thromboplastic antecedent deficiency) 或 第 E 因 于 缺 乏 症, 症 状 较 甲 乙 型 轻 0 4. 血 管 性 假 血 友 病 (von Willebrand disease) 血 管 性 假 血 友 病 是 一 种 较 多 见 的 与 第 VIll 因 于 有 关 的 遗 传 性 凝 血 障 碍 ( 五 ) 家 族 性 高 胆 固 醇 皿 症 家 族 性 高 胆 固 醇 血 症 (familial hypercholesterolemia, FH) 临 床 表 现 是 : 出 生 时 即 存 在 高 胆 固 醇 血 症, 增 高 的 胆 固 醇 主 要 为 低 密 度 脂 蛋 白 胆 固 醇 (LDL-C) 和 自 极 低 密 21

26 度 脂 蛋 白 ( 自 LDLC), 黄 色 瘤 (xanthoma) 即 增 高 的 胆 固 醇 在 组 织 广 泛 沉 积 其 最 严 重 的 后 果 是 早 年 发 生 动 脉 粥 样 硬 化 纯 合 于 在 5 岁 ~30 岁 即 表 现 心 绞 痛 和 心 肌 梗 死 症 状, 可 猝 死 杂 合 于 发 生 冠 心 病 稍 迟 且 发 生 率 较 低 本 病 为 常 染 色 体 显 性 遗 传 病 在 人 群 中, 杂 合 于 发 生 率 为 1 / 500, 杂 合 于 临 床 表 现 较 轻, 故 属 不 完 全 显 性 遗 传, 外 显 率 高 (90% ~100%) 本 病 的 主 要 原 因 是 LDL 受 体 (LDLR) 的 遗 传 性 缺 乏 ( 六 ) 辜 丸 女 性 化 综 合 征 辜 丸 女 性 化 综 合 征 ( testicular ferminizatio 日 syndrome) 又 称 雄 激 素 完 全 不 敏 感 综 合 征 (complete androgen insensitivity syndrome, CArS), 为 最 常 见 的 男 性 假 两 性 畸 形 患 者 核 型 为 46, XY, 有 辜 丸, 能 分 泌 雄 激 素, 1 旦 雄 激 素 受 体 基 因 发 生 突 变, 缺 乏 有 功 能 的 雄 激 素 受 体, 使 雄 激 素 不 能 发 生 应 有 的 效 应 (t) 抗 膜 岛 秦 性 糖 尿 病 A 型 抗 月 夷 岛 素 性 糖 尿 病 A 型 患 者 对 月 夷 岛 素 不 敏 感, 多 为 女 性, 有 多 毛 多 囊 卵 巢 和 原 发 性 闭 经, 月 夷 岛 素 受 体 含 量 仅 为 正 常 量 的 5% ~30% ( 八 ) 曰 化 病 白 化 病 (albinism) 分 全 身 型 及 局 部 型 全 身 型 常 见, 患 者 皮 肤 呈 白 色, 毛 发 呈 银 白 或 淡 黄 色, 虹 膜 及 瞌 孔 呈 淡 红 色, 视 网 膜 无 色 素, 怕 光, ~ 球 震 颤 等, 发 病 率 约 为 1 / ~ 1 / , 呈 常 染 色 体 隐 性 遗 传 正 常 人 黑 色 素 由 黑 色 素 细 胞 合 成, 这 些 细 胞 中 有 特 殊 的 细 胞 器 黑 素 小 体 (mel anosome), 其 中 有 含 铜 的 酣 氧 化 酶, 即 酷 氨 酸 酶 (tyrosinase), 它 可 将 酷 氨 酸 转 变 成 黑 色 素 自 化 病 人 有 黑 色 素 细 胞, 1 旦 缺 乏 酷 氨 酸 酶, 使 黑 色 素 不 能 形 成, 病 人 因 缺 乏 黑 色 素 而 自 化 自 化 病 存 在 遗 传 异 质 性 己 生 日 白 化 病 至 少 有 7 种 不 同 类 型 酷 氨 酸 酶 基 因 (TYR) 定 位 于 llq14 - q22 0 ( 丸 ) 遗 传 性 甲 状 眼 肿 遗 传 性 甲 状 腺 肿 由 偶 联 酶 脱 腆 酶 或 腆 过 氧 化 物 酶 缺 乏 导 致 甲 状 腺 素 生 成 减 少 而 引 起, 患 者 身 材 矮 小 智 力 低 下 面 貌 丑 陋 ( 十 ) 苯 酣 尿 症 苯 丙 酣 尿 症 (phenylketouria, PKU) 以 智 能 发 育 不 全 为 主 要 特 征, 呈 常 染 色 体 隐 性 遗 传, 群 体 发 病 率 约 为 1 / , 由 苯 丙 氨 酸 丑 化 酶 ( phenylalani 日 e hydroxylase, PAH) 遗 传 性 缺 乏 引 起 现 己 知 苯 丙 氨 酸 丑 化 酶 基 因 定 位 于 12q24.1, 全 长 约 90 kb, 含 13 个 外 显 于, 在 中 国 人 中 己 发 现 10 余 种 点 突 变, 这 是 造 成 酶 活 性 缺 乏 的 原 因 典 型 PKU.i! 儿 出 生 时, 外 貌 正 常, 约 至 3 个 月 ~4 个 月 时, 渐 出 现 智 能 发 育 不 全 患 儿 步 伐 小, 姿 似 猿 猴, 月 几 张 力 增 高, 易 激 动, 甚 至 惊 厥,90% 以 上 患 者 毛 发 发 黄 肤 白, 甚 至 虹 膜 呈 黄 色 ( 白 种 人 呈 蓝 色 ) 此 外, 患 儿 尿 汗 有 一 种 特 殊 的 腐 臭 ( 十 一 ) 遗 传 性 肿 瘤 1. 家 族 性 结 肠 息 肉 (familial polyposis coli, FPC) 家 族 性 结 肠 息 肉 又 称 为 家 族 性 腺 瘤 样 息 肉 症, 在 人 群 中 的 发 病 率 为 1 / 表 现 为 青 少 年 时 结 肠 和 直 肠 己 有 多 发 性 息 肉, 其 中 一 些 早 晚 将 发 生 恶 变, 90% 未 经 治 疗 的 患 者 将 死 于 结 肠 癌 FPC 的 基 因 现 定 位 于 5q21 o 22

27 2. I 型 神 经 纤 维 瘤 (neurofibromatosis, NFl) 患 者 沿 躯 干 的 外 周 神 经 有 多 发 的 神 经 纤 维 瘤, 皮 肤 上 则 可 见 多 个 浅 棕 色 的 " 牛 奶 咖 啡 斑 ", 腋 窝 有 广 泛 的 雀 斑, 少 数 患 者 肿 瘤 还 有 恶 变 倾 向 现 生 日 与 NFl 发 生 密 切 有 关 的 1 个 肿 瘤 抑 制 基 因 称 为 NFl 基 因, 定 位 于 17q1 1. 2, 并 己 分 离 克 隆 3. 视 网 膜 母 细 胞 瘤 (retinob-lastoma) 视 网 膜 母 细 胞 瘤 为 眼 球 视 网 膜 的 恶 性 肿 瘤, 多 见 于 幼 儿, 大 部 分 患 者 (70%) 2 岁 前 就 诊, 发 病 率 为 1 / ~ 1 / 肿 瘤 的 恶 性 程 度 很 高, 可 随 血 液 帽 环 转 移, 也 能 直 接 侵 入 颅 内 4. Wilms 瘤 Wilms 瘤 即 肾 母 细 胞 瘤 (nephroblastoma), 是 一 种 婴 幼 儿 肾 的 恶 性 胚 胎 性 肿 瘤, 约 占 全 部 肾 肿 瘤 的 6%, 在 活 婴 中 的 发 病 率 约 为 1 / , 3 / 斗 的 肿 瘤 均 在 4 岁 以 前 发 病 本 病 可 分 为 遗 传 型 (38 %) 和 非 遗 传 型 (62% ) 前 者 双 侧 性 肿 瘤 较 多, 发 病 年 龄 较 早, 呈 常 染 色 体 显 性 遗 传, 有 明 显 的 家 族 聚 集 现 象 患 者 可 伴 有 虹 膜 症 半 侧 肥 大 假 两 性 畸 形 以 及 智 力 低 下 等 第 二 节 多 基 因 遗 传 与 多 基 因 病 一 多 基 因 遗 传 的 特 点 多 基 因 遗 传 即 指 由 微 效 多 基 因 控 制 的 性 状 的 遗 传 这 些 性 状 一 般 表 现 为 连 续 变 异 的 数 量 性 状, 同 时 受 环 境 的 影 响 也 更 明 显, 而 不 像 单 基 因 遗 传 那 样 表 现 为 非 此 即 彼 的 质 量 性 状 如 身 高 体 重 血 压 智 力 等 的 遗 传 0 多 基 因 遗 传 具 有 3 个 明 显 特 点 :1 2 个 极 端 表 现 型 ( 纯 种 ) 个 体 杂 交 后, 其 于 代 大 部 分 为 中 间 型, 具 有 一 定 变 异 范 围, 是 环 境 影 响 所 致 2 2 个 中 间 型 杂 交, 即 于 1 代 杂 交 后, 于 2 代 大 部 分 为 中 间 型, 但 其 变 异 范 围 要 比 于 1 代 广 泛, 也 可 出 现 少 量 的 极 端 的 个 体, 这 是 因 为 除 环 境 因 素 外, 基 因 的 分 离 组 合 也 有 作 用 3 在 随 机 杂 交 的 群 体 中, 变 异 范 围 很 广, 然 而 大 多 数 个 体 接 近 中 间 型, 极 端 个 体 很 少, 环 境 与 遗 传 因 素 都 起 作 用 二 多 基 因 病 的 概 念 与 遗 传 特 征 一 些 常 见 的 先 天 畸 形 (congenital malformatio 日 ) 和 常 见 而 病 因 复 杂 的 疾 病, 其 发 病 率 一 般 都 超 过 1 / 1 000, 疾 病 的 发 生 都 有 一 定 的 遗 传 基 础, 并 常 表 现 出 家 族 倾 向, 但 不 是 单 基 因 遗 传, 患 者 同 胞 的 发 病 率 不 遵 帽 1/2 或 1 / 斗 的 规 律, 仅 1%~10% 这 些 疾 病 是 由 多 基 因 控 制 的, 故 称 为 多 基 因 病 (polygenic disease) 和 多 基 因 遗 传 一 样, 多 基 因 病 有 如 下 特 点 1. 具 有 家 族 聚 集 倾 向, 但 无 明 显 的 遗 传 万 式 因 为 在 系 谱 分 析 中, 它 们 不 符 合 单 基 因 遗 传 万 式, 既 不 符 合 常 染 色 体 显 性 和 隐 性 遗 传, 也 不 符 合 X 连 锁 遗 传, 同 胞 中 发 病 率 远 低 于 1 /2 或 1 / 斗, 但 这 些 疾 病 及 其 在 于 代 的 再 发 风 险 确 实 比 群 体 发 病 率 高, 表 现 出 家 族 性 聚 集 倾 向 2. 随 亲 属 级 别 的 降 低, 患 者 亲 属 发 病 风 险 迅 速 下 降, 在 发 病 率 低 的 疾 病, 这 个 特 点 更 为 明 显 表 2-4 是 部 分 多 基 因 病 患 者 不 同 级 别 亲 属 发 病 风 险 的 比 较. 23.

28 3. 近 亲 娼 配 时, 于 女 患 病 风 险 增 高, 但 不 如 常 染 色 体 隐 性 遗 传 显 著, 这 可 能 与 多 因 于 的 积 累 效 应 有 关 4. 病 情 越 重 患 者 越 多 则 再 发 风 险 越 大 这 说 明 遗 传 因 素 起 着 重 要 作 用 5. 当 发 病 率 存 在 性 别 差 异 时, 表 明 发 病 率 高 的 性 别 其 发 病 阔 值 低, 发 病 率 低 者 其 阔 值 高 即 群 体 发 病 率 低 的 性 别 患 者, 只 有 他 们 带 有 相 当 多 的 易 患 性 基 因 时, 其 易 患 性 才 能 超 过 阔 值 而 发 病 如 果 他 们 己 发 病, 就 表 明 他 们 己 带 有 相 当 多 的 易 患 性 基 因, 其 后 代 的 发 病 风 险 将 会 增 高, 尤 其 是 与 其 性 别 相 反 的 后 代 群 体 发 病 率 高 的 性 别 患 者, 其 后 代 中 发 病 风 险 将 较 低, 尤 其 是 发 病 率 低 的 性 别 的 后 代 先 天 性 幽 门 狭 窄 患 者, 男 性 发 病 率 是 女 性 的 5 倍 ( 男 1/200, 女 1/1000) 如 为 男 性 患 者, 儿 于 发 病 风 险 为 5.5%, 女 儿 发 病 风 险 为 2.4% ; 相 反, 如 为 女 性 患 者, 儿 于 的 发 病 风 险 为 19.4%, 女 儿 风 险 为 7.3% 表 2-4 某 些 多 基 因 遗 传 病 患 者 不 同 级 别 亲 属 的 发 病 风 险 比 较 疾 病 群 体 发 病 率 发 病 风 险 一 卵 双 生 一 级 亲 属 二 级 亲 属 三 级 亲 属 唇 裂 或 / 和 1 号 裂 1 / x 400 x 10 X7 X3 足 内 翻 1 / x 300 x 25 X5 X2 神 经 管 缺 损 1 / 500 x8 X2 先 天 性 院 关 节 脱 臼 1 / 500 x 200 x 25 X3 X2 先 天 性 幽 门 狭 窄 1 / 200 x 80 x 10 X5 X 1. 5 第 节 肿 瘤 与 遗 传 恶 性 肿 瘤 是 严 重 危 害 人 类 健 康 的 重 要 常 见 多 发 疾 病 常 见 的 恶 性 肿 瘤 有 肝 癌 食 管 癌 胃 癌 肺 癌 鼻 咽 癌 乳 腺 癌 宫 颈 癌 结 直 肠 癌 白 血 病 等, 一 般 认 为 是 由 于 肿 瘤 相 关 基 因 或 肿 瘤 特 异 基 因 结 构 或 表 达 异 常, 导 致 细 胞 增 植 失 去 控 制 造 成 的 因 此, 肿 瘤 的 发 生 发 展 归 根 到 底 也 是 由 于 基 因 结 构 或 基 因 表 达 的 异 常 引 起 的, 但 一 般 情 况 下 并 非 生 殖 细 胞 或 受 精 卵 基 因 异 常 直 接 发 展 而 成 的 遗 传 病, 而 是 一 类 特 殊 的 体 细 胞 突 变 导 致 的 遗 传 病 一 体 细 胞 突 变 学 说 肿 瘤 由 细 胞 增 殖 失 控 造 成 人 体 基 因 在 各 种 物 理 化 学 因 素 作 用 下 会 发 生 白 发 或 诱 发 突 变, 如 果 突 变 发 生 在 与 细 胞 增 殖 有 关 的 基 因, 就 可 能 导 致 细 胞 出 现 生 长 和 增 殖 失 控, 发 生 恶 性 肿 瘤 因 此, 肿 瘤 可 以 看 作 是 在 个 体 遗 传 素 质 的 基 础 上, 尤 其 是 在 个 体 对 肿 瘤 的 遗 传 易 感 性 的 基 础 上, 致 癌 因 于 引 起 细 胞 遗 传 物 质 结 构 或 功 能 异 常 的 结 果 这 种 异 常 大 多 数 不 是 由 生 殖 细 胞 遗 传 得 来 而 是 在 体 细 胞 中 新 发 生 的 0 多 数 肿 瘤 可 看 成 是 一 种 体 细 胞 遗 传 病 许 多 致 癌 物 都 是 致 突 变 物, 它 们 大 多 数 都 能 引 起 DNA 变 异, 进 而 引 起 肿 瘤 发 生 许 多 肿 瘤 细 胞 群 都 具 有 相 同 的 染 色 体 畸 变 和 同 工 酶, 说 明 它 们 起 源 于 单 个 突 变 细 胞 ( 单 克 隆 ), 也 说 明 了 肿 瘤 是 体 细 胞 突 变 的 结 果 一 些 细 胞 的 恶 性 转 化 需 要 2 次 或 2 次 以 上 的 突 变 第 1 次 突 变 可 能 发 生 在 生 殖 细 胞 24

29 或 由 父 母 遗 传 得 来, 为 合 于 前 突 变, 也 可 能 发 生 在 体 细 胞 ; 第 2 次 突 变 则 均 发 生 在 体 细 胞, 这 就 是 2 次 突 变 学 说 2 次 突 变 学 说 对 一 些 遗 传 性 肿 瘤, 如 视 网 膜 母 细 胞 瘤 的 发 生 作 出 了 合 理 的 解 释 遗 传 型 的 视 网 膜 母 细 胞 瘤 发 病 很 早 并 多 为 双 侧 性 或 多 发 性 这 是 因 为 患 儿 出 生 时 全 身 所 有 细 胞 己 有 1 次 Rb 基 因 的 突 变 只 需 要 在 出 生 后 某 个 视 网 膜 母 细 胞 再 发 生 1 次 突 变 ( 第 2 次 突 变 ), 就 会 转 变 成 为 肿 瘤 细 胞, 故 较 易 表 现 为 双 侧 性 视 网 膜 母 细 胞 瘤 或 多 发 性 肿 瘤 非 遗 传 型 的 视 网 膜 母 细 胞 瘤 的 发 生 则 需 要 同 一 个 视 网 膜 母 细 胞 在 出 生 后 发 生 2 次 突 变, 而 且 2 次 要 分 别 发 生 在 同 源 染 色 体 的 同 一 基 因 座 位, 因 而 概 率 很 小, 发 病 较 晚, 并 多 为 单 侧 性 但 该 座 位 如 果 己 发 生 过 1 次 突 变, 则 较 易 发 生 第 2 次 突 变, 这 也 是 非 遗 传 型 肿 瘤 不 是 太 少 的 原 因 一 些 学 者 认 为, 体 细 胞 癌 变 并 不 一 定 有 基 因 结 构 的 改 变 当 基 因 以 外 的 物 质 或 因 素 ( 如 蛋 白 质, DNA, 生 物 膜 ) 发 生 了 改 变, 而 这 些 改 变 也 能 使 与 生 长 分 化 有 关 的 基 因 异 常 关 闭 E\l(; 启 动, 此 时, 细 胞 也 能 转 化 为 癌 细 胞 这 一 观 点 称 为 基 因 外 调 节 学 说 二 癌 基 因 学 说 肿 瘤 发 生 相 关 基 因 依 据 其 功 能 分 为 两 大 类 : 一 类 称 为 癌 基 因, 起 促 进 细 胞 的 生 长 和 增 殖 的 作 用 ; 另 一 类 称 为 肿 瘤 抑 制 基 因 或 抑 癌 基 因 它 们 能 抑 制 细 胞 的 增 殖 和 促 进 细 胞 的 分 化, 从 而 抑 制 肿 瘤 的 发 生 这 两 类 基 因 的 作 用 相 反 癌 基 因 的 激 活 或 抑 癌 基 因 的 失 活 都 能 使 细 胞 的 生 长 和 增 殖 失 去 控 制, 导 致 肿 瘤 的 发 生 (-) 癌 基 因 在 致 瘤 病 毒 人 体 和 动 物 肿 瘤 都 发 现 了 能 导 致 细 胞 恶 性 转 化 的 核 酸 片 段, 称 之 为 癌 基 因 ( oncogene) 来 自 病 毒 的 癌 基 因 称 为 病 毒 癌 基 因 ( v - oncogene) ; 来 自 细 胞 的 称 为 细 胞 癌 基 因 (c - 0 日 cogene) 或 原 癌 基 因 (proto - oncogene) 细 胞 癌 基 因 在 正 常 细 胞 内 的 表 达 受 到 严 格 的 调 控 一 旦 发 生 突 变 可 被 激 活 而 成 为 癌 基 因 人 类 癌 基 因 或 者 通 过 编 码 生 长 因 于 生 长 因 于 受 体 和 蛋 白 激 酶 在 生 长 信 号 的 传 递 和 细 胞 分 裂 中 发 挥 作 用 ; 或 者 编 码 DNA 结 合 蛋 白 参 与 基 因 的 表 达 或 复 制 的 调 控 与 细 胞 的 生 长 增 殖 等 基 本 功 能 按 原 癌 基 因 的 产 物 将 其 分 为 若 干 类 型 如 以 src 为 代 表 的 酷 氨 酸 激 酶 类, 以 ras 为 代 表 的 G 蛋 白 类, 以 myc 为 代 表 的 核 蛋 白 类, 以 SIS 为 代 表 的 生 长 因 于 类, 以 erb 为 代 表 的 生 长 因 于 受 体 类 等 原 癌 基 因 在 个 体 发 育 或 细 胞 分 裂 的 一 定 阶 段 十 分 重 要, 但 在 成 体 或 平 时 却 不 表 达 或 表 达 受 到 严 格 的 控 制, 当 其 发 生 突 变 或 被 异 常 激 活 时, 产 生 的 癌 蛋 白 在 性 质 或 数 量 上 异 于 正 常 就 可 能 导 致 细 胞 发 生 恶 性 转 化 原 癌 基 因 可 以 通 过 以 下 万 式 被 激 活 而 过 度 表 达 1. 突 变 激 活 原 癌 基 因 可 以 发 生 点 突 变 而 激 活 成 为 癌 基 因 例 如 膀 肮 癌 细 胞 株 由 于 癌 基 因 ras 的 12 位 密 码 于 GGC 变 为 GTC, 使 表 达 产 物 中 相 应 的 甘 氨 酸 变 为 蝴 氨 酸, 结 果 导 致 细 胞 具 有 转 化 细 胞 的 特 征 现 今 己 在 膀 肮 癌 结 肠 癌 等 许 多 肿 瘤 发 现 了 ras 基 因, 其 编 码 一 种 蛋 白, 称 为 p21 蛋 白 2. 易 位 激 活 易 位 导 致 癌 基 因 的 重 排 或 融 合 产 生 异 常 的 蛋 白 质 而 使 细 胞 转 化 如 慢 性 粒 细 胞 白 血 病 的 9; 22 易 位, 形 成 了 一 种 结 构 与 功 能 异 常 的 融 合 基 因 bcr- abl, 它 编 码 的 蛋 白 质 能 促 进 细 胞 的 恶 性 转 化. 25.

30 原 癌 基 因 通 过 易 位 插 入 到 强 启 动 于 附 近 也 可 导 致 激 活 Burkitt 淋 巴 瘤 的 t (8; 14) 即 c- myc 癌 基 因 由 8 号 染 色 体 易 位 到 14 号 染 色 体 的 免 疫 球 蛋 白 重 链 基 因 附 近, 使 c myt 置 于 免 疫 球 蛋 白 重 链 基 因 的 启 动 于 控 制 之 下 该 启 动 于 特 别 活 跃, 因 而 易 位 的 c- my d'j 甘 转 录 活 性 明 显 增 高 增 多 的 MYC 蛋 白 使 一 些 控 制 生 长 的 基 因 活 化, 最 终 导 致 细 胞 恶 变 3. 癌 基 因 扩 增 原 癌 基 因 还 可 因 某 种 原 因 自 身 扩 增 成 多 个 拷 贝, 由 于 基 因 的 剂 量 效 应 而 过 度 表 达 癌 蛋 白, 引 起 细 胞 恶 变 例 如 在 有 些 肝 癌 细 胞 中 c- 数 百 到 数 千 倍 myc 癌 基 因 可 扩 增 ( 二 ) 肿 瘤 叩 制 基 因 肿 瘤 抑 制 基 因 (tumor- suppressor gene) 的 功 能 是 抑 制 细 胞 的 生 长 和 促 进 细 胞 的 分 化 当 肿 瘤 抑 制 基 因 的 2 个 等 位 基 因 都 因 突 变 或 缺 失 而 丧 失 功 能 时, 细 胞 就 会 发 生 恶 性 转 化 以 视 网 膜 细 胞 瘤 的 Rb 基 因 为 例 遗 传 型 视 网 膜 母 细 胞 瘤 患 者 出 生 时 Rb 基 因 的 1 个 等 位 基 因 由 于 生 殖 细 胞 突 变 而 丧 失 功 能, 出 生 后 如 某 个 视 网 膜 母 细 胞 中 另 一 Rb 个 基 因 的 等 位 基 因 发 生 了 体 细 胞 突 变 这 个 细 胞 就 会 转 化 为 肿 瘤 细 胞 不 少 的 肿 瘤 均 己 证 实 了 相 应 的 抑 制 基 因 的 存 在 缺 失 及 其 在 肿 瘤 发 病 中 的 作 用 ( 表 2-5) 这 些 肿 瘤 在 临 床 上 都 呈 常 染 色 体 显 性 遗 传 万 式, 但 从 基 因 水 平 上 看, 它 们 都 是 隐 性 的, 因 2 个 等 位 基 因 均 有 突 变 才 能 使 细 胞 恶 性 转 化 表 2-5 肿 瘤 抑 制 基 因 及 其 产 物 肿 瘤 仰 制 染 色 体 基 因 异 常 引 起 的 肿 瘤 基 因 产 物 及 其 功 能 基 因 定 位 遗 传 型 散 发 型 p53 17p13. I P5 辛 辛 3 指 细 蛋 胞 周 白 期, 调 结 节 合 Li - Frameni 综 合 征 肺 癌, 乳 腺 癌 等 WT1 Ilpl3 Wilm 瘤 肺 癌 等 DNA RbI 13ql4 P li O, 调 节 细 胞 周 期 视 网 膜 母 细 胞 瘤 骨 肉 瘤, 小 细 胞 肺 癌 等 NFl 17ql 1. 2 GTP 酶 i 舌 化 蛋 白 I 型 神 经 纤 维 瘤 视 网 膜 母 细 胞 瘤 基 因 (Rb) 定 位 于 13 号 染 色 体 1 区 4 带, 全 长 约 200 kb, 有 27 个 外 显 于, 编 码 924 个 氨 基 酸 的 核 磷 蛋 白 (Rb 蛋 白 ), 相 对 分 于 质 量 为 110 kda, 具 有 抑 制 肿 瘤 细 胞 增 殖 生 长 的 作 用 Rb 基 因 的 缺 失 E\l(; 功 能 丧 失 不 仅 见 于 视 网 膜 母 细 胞 瘤, 而 且 还 见 于 骨 肉 瘤 小 细 胞 肺 癌 乳 腺 癌 等 肿 瘤 中 ( 三 ) 杂 合 性 丢 失 某 一 基 因 的 杂 合 于 体 细 胞 的 正 常 等 位 基 因 发 生 缺 失, 造 成 异 常 ( 或 致 病 等 位 基 因 ) 纯 合 化 的 过 程 称 为 杂 合 性 丢 失 (l oss of heterozygosity, LOH) 0 例 如, 表 现 型 正 常 的 组 织 细 胞 的 抑 癌 基 因 DNA 等 位 片 段 是 杂 合 的, 而 癌 组 织 的 该 等 位 片 段 却 变 成 了 纯 合 的, 表 明 抑 癌 基 因 发 生 了 杂 合 性 丢 失 ( 四 ) 肿 瘤 发 生 模 型 肿 瘤 发 生 是 一 个 多 阶 段 过 程, 往 往 涉 及 到 多 个 基 因 的 结 构 和 表 达 异 常 因 2-6 是 一 个 以 结 肠 癌 为 例 的 肿 瘤 发 生 模 式 图, 显 示 了 由 正 常 细 胞 演 化 为 结 肠 癌 可 能 经 历 的 一 系 列 事 件 在 肿 瘤 发 生 发 展 的 过 程 中 既 有 肿 瘤 抑 制 基 因 的 丢 失, 也 有 癌 基 因 的 活 化 如 结 肠 癌 发 生 的 过 程 中, 就 有 多 个 基 因 的 异 常, 其 中 包 括 ras 癌 基 因 和 p53 APC (ana 26

31 phase promoting complex, APC) 和 I MCC 等 儿 介 抑 癌 基 因 这 些 改 变 中 任 何 种 基 田 异 常 如 果 是 jill 传 性 的, 这 就 构 成 了 自 肿 暗 的 事 脏 性 且 感 性 的 基 础 L.OH to 同 缺 失 1ρH 17q 缺 失 P53 缺 失 缺 失 贝 变 国 2-6 绪!i 费 发 盒 的 各 个 阶 段 和 肿 瘤 精 美 摹 囚 的 异 常 ( 互 庆 杰 ) 第 四 节 染 色 体 峭 变 与 染 色 体 病 一 人 类 染 色 体 乡 和 色 你 是 越 传 物 册 的 班 体, 是 细 胞 illi 传 学 的 幢 心 研 究 对 且 立 每 个 人 体 细 胞 中 的 提 邑 体 趾 日 起 恒 定 的 I-I su (1952) 将 组 织 珩 养 技 术 应 用 于 染 色 体 的 研 究 Tjio 与 Levan (1956) 进 行 流 产 胎 儿 肺 组 织 培 棒, 加 拉 水 仙 索 及 低 语 址 理 在 人 类 的 最 邑 体 观 察 中 白 先 发 现 人 的 提 色 你 为 46 条, 出 性 为 46, XV, 女 性 为 46, XX 自 Moorhead (1 960) 发 表 外 用 血 白 细 胞 培 罪 与 染 色 体 制 备 方 法 且 来,1j! 染 色 体 制 备 有 了 良 虾 的 方 法, 从 此 提 色 体 分 忻 技 术 何 到 了 迅 边 的 fe 且 近 年 来, 提 包 体 检 查 且 革 世 分 析 己 成 为 临 阵 检 查 中 一 个 不 可 咄 少 的 手 段 目 前, 己 知 人 类 illi 传 嗣 中 由 于 染 色 体 异 常 而 引 起 的 在 捕 有 400 多 种 人 类 接 色 体 分 析 是 将 处 于 分 犁 中 期 货 II 胞 的 提 色 体 在 显 融 镜 下 放 大 或 拍 咸 阳 片, 再 将 各 染 色 体 温 个 进 行 分 析 每 条 最 巴 体 都 由 2 条 姐 蛛 费 也 单 体 组 成 2 条 单 体 借 着 草 鞋 连 接 萄 丝 植 卫 将 染 色 体 分 为 长 惜 平 )Im 惜 根 据 着 草 植 的 也 宜, 人 类 最 色 体 卫 分 为 中 央 草 草 植 染 色 体 亚 中 着 草 粒 蓝 色 体 和 1 近 端 着 单 扭 知 色 体 ( 国 2-7) 每 II< 染 色 体 Jil 主 要 的 耻 志 特 征 是 最 色 体 的 相 对 长 度 和 1 辑 盐 粗 的 位 置 很 据 丹 佛 会 议 (1960 年 ), 怆 驻 金 i5l. (1960 年 ) 和 主 加 哥 会 议 (1966 年 ) 提 出 的 际 准, 挂 染 色 体 的 长 庄 递 峰 顺 序 和 1 着 草 鞋 也 茸 的 特 点, 人 类 染 色 体 分 为 23 时 7 扭 其 中, 1-22 封 是 旦 女 所 共 有 的, 称 常 染 色 体 (autosome) 另 1 时 是 旦 女 所 不 同 的, 称 性 提 色 体 (sex chromosome) 并 将 X 染 色 体 列 入 C 组, Y 染 色 体 列 入 G 组 ( 阁 2 8) A 组 (1-3 号 ), I 号 和 I 3 号 均 为 中 央 草 草 粒 染 邑 体 2 号 为 亚 中 营 单 粒 染 色 体 8 组 (4-5 号 ), 2 对 染 色 体 都 是 目 ; 大 的 亚 中 看 盐 扭 染 邑 休 27

32 <I- 一 面 时 司 一 -. 事 丝 世 <l- 一 l 采 臂 轩 - 短 臂 <l-- jilt 粒 4 一 - 长 青 丝 粒 <l- 一 一 民 臂 a b E 因 2-7 中 央 w 丝 粒 (,) 亚 中 着 丝 桩 (0) 近 躺 着 丝 桩 (e) 袋 色 体 vt:rty 司 tf 飞 i 世 "7f a'44 II II II II II 1& II II II II II II '. I I I. I... 喝 I 吭 吭 W 叮 VJhVMA 同! 丸 1 二 ~ ι' 如 II II II II II t tmi lt t-t t a BE l l I) I~I '..'.~, 国 2-8 正 常 男 性 ( 左 ) 和 正 常 女 性 ( 在 ) 的 中 则 染 色 体 及 核 型 C 姐 (6-12 号. X) 此 组 染 色 体 均 为 亚 中 看 盐 粒 染 色 体 II 号 的 萄 草 鞋 比 较 近 中 些 X 蓝 色 体 的 大 小 在 8 号 和 9 号 最 色 体 之 间 D 组 ( 号 ) 均 为 大 的 近 端 珩 丝 粒 且 也 体, 阻 臂 上 常 庄 有 随 体 E 姐 ( 号 ), 16 号 为 中 央 看 草 植 染 色 体 号 均 为 小 的 亚 中 营 盐 粒 最 巴 体. 18 号 盟 臂 较 17 号 坦 F 组 (19-20 号 ) 均 为 小 的 中 央 着 丝 扯 最 色 体 G 组 (21-22 号, Y) 革 小 的 近 端 着 丝 粒 染 色 体 22 号 较 21 号 大, 随 臂 常 连 随 体 Y 班 邑 体 大 小 不 定, 国 臂 无 陆 体, 回 臂 甫 平 行 1'( 埠 挂 阳 巴 靠 全 议 (1971). 将 蓝 色 体 的 恒 定 而 且 苦 的 结 构 如 1 号 [j 丝 位 及 JRE 苦 的 染 色 体 协 作 为 界 标 (land - mark), 将 提 色 体 分 区, 最 巴 体 的 任 何 一 区, 均 分 布 在 相 邻 的 界 挥 之 间 每 28

33 条 染 色 体 区 与 带 号 从 靠 近 着 盖 世 区 沿 两 臂 向 外, 依 目 : 排 列, 即 盎 远 看 丝 植 区 为 I", 较 远 分 别 为 2", "3"... 如 此 类 稚 例 如 J 9q32, 9 表 示 染 色 体 号 盘 q 为 长 臂, 3 为 区 号, 2 为 带 号 根 据 Q 带 G 带 R 11~ 盐 邑 体 且 带 技 术 将 且 是 且 体 分 为 不 同 的 区 和 带 G 和 Q 带 是 一 致 的.G 带 与 R 带 E 好 相 反, 即 G 带 为 深 带 时 R 帝 为 战 带 ( 阁 2-9, 且 插 页 ) 在 蓝 色 体 识 别 过 程 中, 人 们 目 前 普 遍 来 用 ISCN (J 995) [ 人 类 细 胞 且 传 学 国 际 命 名 体 制 ] 的 标 准, 由 标 准 是 个 包 括 和 1995 年 共 8 性 ; 人 韭 细 胞 遗 传 学 国 际 命 书 委 且 会 所 制 定 的 国 际 法 规 为 了 简 便 描 述 人 类 染 色 体 &"'1 壶, 经 市 会 用 到 且 下 细 雨 符 号 p 染 色 体 目 悻 '" 无 着 草 植 断 片 q 提 邑 体 长 臂 die 双 珩 丝 拉 且 也 体 h 副 植 痕 'n 三 珩 丝 桂 染 缸 体 等 臂 染 色 体 ce" 萄 单 桂 r 环 状 蛊 色 体 del ~ 是 失 且 位 dnρ 盟 主 m" 标 记 蓝 色 体 ms 插 入 m" 来 自 母 亲 p" 来 自 父 亲 inv ins &. 向 插 入 断 裂 cop 相 互 岛 位 end 内 卫 制 rob ~ 伯 址 且 也 断 裂 与 直 撞 ree ill 姐 耻 色 体 从 到 tan : 但 联 ( 衔 接 ) 岛 位 + 增 加 co, 来 端 础 少 s 附 体 mos i 段 古 体 see 姐 蛛 染 邑!~ 体 史 性 对 于 拉 型 的 表 达, 首 先 写 出 染 也 体 的 总 曲, 随 之 为 逗 号 再 写 出 性 染 色 体 的 组 成 若 为 常 蓝 色 体 盘 目 就 结 构 的 异 常, 则 加 上 垣 号, 再 写 明 远 些 特 殊 改 变 的 情 况 46, XY 表 示 班 也 体 总 散 步 OJ 46 条, 性 染 且 体 为 XV 屿, x 表 示 45 条 墨 色 体, 只 有 1 条 X 染 色 体, 自 II 少 了 l 条 X 虫 也 体 47, XXV 表 示 47 条 染 色 体, 性 最 色 体 为 XXV; 47, XY+21 表 示 47 条 染 色 体, 性 最 色 你 为 XV, 如 21 号 染 色 体 宰 了 1 条, 而, XX. Iq+ 表 示 46 条 且 也 体, 性 染 邑 体 为 XX. 1 号 染 缸 体 长 曾 增 加 二 染 色 体 附 变 例 如 正 常 人 体 制 胞 为 二 陆 体, 染 色 体 数 目 为 46 盘, 稍 于." 鼻 子 为 主 在 桔 体 染 色 体 盘 目 备 为 23 品 提 包 体 叫 变 是 且 也 体 南 形 成 的 根 本 原 因 坠 且 体 盹 变 分 为 数 目 畸 E 型 和 Efi 构 时 变 阳 大 荣 { 一 ) 染 色 体 数 目 晒 歪 l 事 情 体 指 染 色 体 曲 目 增 加 了 l 套 Ii~ 盘 套, 即 吉 有 3 个 政 3 个 以 上 的 染 色 体 组 29

34 的 细 胞 或 个 体 三 倍 体 细 胞 是 有 3 个 染 色 体 组, 每 对 染 色 体 部 增 拥 了 l 条, 主 任 色 体 总 曲 为 69 (3 n) 四 情 体 细 胞 则 古 有 4 个 染 也 体 组, 染 色 体 屈 敢 为 92 (40), f 夜 IX 英 推 2 单 倍 体 正 常 人 体 细 胞 古 有 23 对 染 缸 体 单 的 体 的 染 缸 体 散 为 n, 即 每 又 I 且 也 体 都 H 吉 有 l 个 人 类 的 稍 子 和 1 卵 子 属 于 单 简 体, 但 单 { 击 你 胎 儿 ~ 新 生 儿 尚 未 E 现 3 单 体 且 对 坠 巴 体 减 少 了 l 条 (21 I ), 掬 l 胞 内 染 色 体 总 数 为 45 由 且 的 有 45, X; 45, XX (XY) -21; 45, xx (XY) -22 等 4 三 体 某 时 染 色 体 增 加 了 l 条 (20+1), 细 胞 内 染 缸 体,~, 散 为 47, 这 是 目 前 芷 现 的 人 类 最 色 体 盘 目 异 常 中 占 敲 辜 的 一 类, 儿 乎 世 且 每 一 号 染 色 体 市 染 色 体 中 21 以 三 体 市 且 性 提 包 体 中 有 XXX, XXV, XYY 3 种 5 非 监 借 体 如 邑 体 数 目 不 是 23 的 酷 的 勤 时, 叫 非 抱 借 体, 如 Lt 二 借 体 少, 叫 亚 二 倍 体 比 二 倍 体 事, UlJ 超 二 市 体 同 理, 少 号 三 倍 体 (3n = 69), nlj 亚 三 { 古 体 在 癌 细 胞 中 可 捉 到 许 多 不 同 的 染 色 体 数 目, 称 为 无 众 甜 非 整 悟 休 { 二 ) 染 色 体 结 向 瞄 歪 许 事 理 化 及 生 物 因 素 可 引 起 染 也 体 断 裂, 产 生 2 个 或 事 个 节 段, 这 些 片 段 直 接 时 宜 生 丁 错 误 连 搓, 阜 成 了 不 同 的 且 也 体 片 段 重 组, 即 染 缸 体 结 构 上 的 时 变 常 见 的 畸 变 有 以 下 儿 种 l 艘 失 (del) ~ 丧 失 指 坠 也 体 部 分 丢 失 ( I ) 末 端 幌 失 蓝 色 体 长 臂 ( q) 或 扭 臂 (p) 的 末 端 部 分 丢 失, 如! 46, XX, del (2) (q23) 或 46, del (2) (pi 盯 q23 : ) (2) 中 间 帧 失 l 条 最 色 你 在 盟 悻 Ii~ 长 臂 上 发 生 2 眈 断 提 醒 成 了 3 介 片 段, 中 间 片 段 丢 失 2 个 远 例 片 段 和 近 { 页 ' 片 段 卫 亚 军 结 古, HZ 成 中 间 映 失, 如 I 46, XX, del (2) (qllq21) 或 46, XX, del (2) (pter ql1: : q21 qterl, (3) 环 状 蜂 邑 体 l 条 且 也 体 阴 暗 同 时 世 生 断 裂 2 个 末 端 快 失, 古 有 着 丝 粒 的 中 间 部 分 重 新 连 接, IBI 提 到 收 且 也 体, 如 146, XV, r (2) (ρ21 ; q II) 或 46, XV,, (2) ( p21 qll) 2 盟 主 ( dup) 染 色 体 上 部 分 重 且 是 相 互 品 也 戒 插 入 的 结 果 重 旦 旦 分 E 住 的 (direct) 或 额 倒 的 (Inverted) 韭 宜 如 J 46, XX, In\' dup (2) (p23 p14) 或 46, XV, In\' dup (2) (pier p23::pi4 pi4::p23 qter) 3 倒 也 (inv) 2 且 ; 断 裂 后, 断 裂 的 片 段 倒 转 '80 重 新 连 接, 扉 成 f 纠 位 官 卫 分 惜 内 倒 也 和! 惜 问 倒 也, 如 46, XX, inv (2) (pis: p24) 或 46, XV, inv (2) (prer p24::pi5-p24::pi5 qlef); 46, XV, In\' (2) (p21: qll) 或 46, XV, In\' (2) ( p' 盯 p21: :q11 ρ21: :qll qter) 4 且 也 (t) 2 条 且 2 条 山 上 染 色 体 的 断 提 产 生 的 染 色 体 片 段 位 置 的 改 变 叫 品 位 且 也 卫 分 相 互 岛 位 和 J :l" ( 向 画 品 位 ( I ) 相 互 岛 位 2 条 蓝 色 体 监 生 断 裂 后 相 E 变 换 其 玉 带 丝 粒 断 片, 悔! 班 2 条 新 的 衍 生 且 也 体, 叫 相 互 且 位, 如 J 46, XV, 1 (2: 5) (q2l: q31) 或 46, XV, t (2: 5) (2p21 2q21: :5q31 5qrer: Sprer Sq31: :2q21 2qter) (2) 罗 伯 耻 且 也 2 条 近 揣 着 草 扭 染 色 体 在 着 草 鞋 处 ( 或 其 附 近 ) 断 裂 后 卫 相 互 连 30

35 接 并 H 草 成 2 条 衍 生 毕 色 体 时, 叫 罗 伯 赴 品 位, 如 屿, XX, τ(13, 14) (pii, qii) 或 屿, XX, 1 (l 3; 14) (13qlcr 13pll:: 14ql I 14q1Cr) o 5. ~ 着 丝 粒 蓝 色 体 ( die) 当 2 条 提 邑 体 断 裂 后, 具 有 带 丝 粒 的 2 条 染 且 体 片 段 相 埠, 扉 成 l 条 具 有 2 个 看 盖 世 的 染 色 体 称 为 现 着 单 桂 染 邑 你 如 46, X, die (Y) ( qi2) 或 46, X, die (Y) (pier qi2::qll pter) 6 等 臂 鞋 也 体 (ISO) 2 个 遗 传 上 和 形 态 上 相 同 的 臂 的 1(1 :l} 丝 粒 染 色 体 如 46, X, I (Xq) 或 46, X, I (X) (ql 盯 con qlc r) o 7 直 如 且 也 3 个 以 上 班 色 体 断 型 发 生 的 相 互 岛 位, 如 46, XX, r (2; 5; 7) (p21: q23; (22) 或 46, XV, I (2; 5; 7) (2qler 2p21 :: 7q22 7qrer; SpIer 5q23 2p21-2pl 盯 ; 7plcr 7q22: : 5q23 5qlCr) o 三 染 色 体 病 及 其 主 要 特 征 分 类 乡 和 色 体 畸 型 E 引 起 的 疾 病 叫 染 色 体 捕 据 报 迫, 染 色 体 畸 查 在 自 发 流 产 儿 中 的 占 50%, 占 " 产 凡 的 5%, 占 7 岁 内 死 亡 儿 童 的 5%, 大 的 占 存 活 婴 儿 的 0.5%-1% 染 且 体 痰 捅 严 重 黠 响 人 口 质 量, 给 家 庭 和 挝 会 都 带 来 丁 沉 重 的 负 担 因 此, 染 缸 体 晴 是 临 阵 Jill 传 学 研 究 的 主 要 内 容 之 { 一 ) 染 色 体 病 的 特 征 l 带 有 提 包 体 异 常 的 个 体? 其 生 长 监 育 和 智 力 通 常 迟 缓, 般 均 有 事 宜 性 先 天 畸 形 在 性 坠 邑 体 异 甫 的 个 体 巾 7 卫 生 长 和 性 芷 百 出 现 异 常, 如 1 第 二 性 1[ 不 宜 百, 男 性 乳 房 1<') 百 等 2 带 有 提 邑 体 异 常 的 个 体? 其 亲 代, ~J 最 邑 体 可 为 正 常 这 种 异 常 的 出 现 可 能 是 由 于 亲 代 生 植 细 胞 * 成 过 程 中 最 色 体 发 生 了 改 变 所 致 3 染 邑 体 平 衡 岛 位 拂 带 者? 其 表 现 型 正 常 的 亲 代 有 可 能 将 其 畸 变 坠 邑 体 传 至 于 代, 引 起 于 代 坠 邑 体 不 平 衡 im 致 捕 4 带 有 染 色 体 异 常 的 个 体, 可 于 其 每 亲 悴 孕 朋 间 利 用 城 毛 TIt 羊 水 细 胞 培 器 或 黄 先 原 位 杂 主 技 术 等 作 出 确 诊, 因 而 可 U 世 行 产 iilj i: 主 断 { 二 ) 染 色 体 病 的 分 量 提 邑 体 踊 咀 由 分 为 常 染 且 体 晴 和 性 盐 且 体 捕 l 常 且 的 常 染 色 体 嗣 (I) 21 三 体 肆 古 怔 (Down 氏 琼 合 怔 ) 且 是 一 种 占 3 见 的 衍 茹 色 体 桶, 群 体 中 发 嗣 率 约 为 1 I 750,.1J;l. 儿 呈 特 殊 面 在 ( 图 2-10), DR 裂 小, 外 例 上 阳, 且 根 ~\ 平, 翻 小, 膊 挠, 舌 常 外 伸 并 有 舌 裂 相 生 儿 常 有 第 三 囱 门 揣 踵, 小 指 向 弯, 其 巾 间 揣 骨 发 育 不 良 J 闰 1 趾 与 第 二 趾 之 间 相 距 宽 大 肌 张 力 低, 关 节 可 过 匪 后 illll o 50% 左 右 有 先 天 性 心 脏 病, 其 中 室 间 隔 M 拟 的 占 50% 忠 儿 生 长 迟 缓, 体 力 与 智 力 发 育 均 有 障 碍!H 性 出 者 可 有 隐 髦, 常 常 不 百 虽 邑 体 分 析 表 明, 患 儿 的 技 型 常 有 以 下 几 型 1 21 三 体 型 植 型 为 47, XX (XV) + 刀, 表 明 忠 儿 的 染 色 体 总 盘 为 47, 与 正 常 的 二 悟 你 (46) 相 比, 宰 了 I 条 ~j 21 号 染 色 体, 21 三 体 型 先 天 国 型 儿 ( 固 有 能 生 育 的, 后 代 中 的 有 J 12 将 发 育 成 先 天 IEi 型 3J

36 回 三 体 患 儿 ( 号 l 臼 刘 权 章 主 编 遗 传 咨 询 } ) 儿 2 世 合 型 如 果 不 分 离 ix.illi 失 发 生 于 莹 稍 酬 的 前 儿 品 ; 分 裂, 就 会 形 成 46, XX (XY) 147, xx (XY) +21 的 世 合 型 这 种 世 合 型 的 先 天 盟 型 儿 的 临 床 表 现 可 i;l1m 典 型, 也 可 以 只 有 较 轻 的 临 库 在 剧, 这 取 决 号 异 常 细 胞 系 是 否 占 优 势 3 且 也 型 多 宜 生 于 30 岁 以 下 年 轻 的 得 罪 所 生 的 也 儿, 的 占 全 部 先 天.I.!..~ 型 儿 的 10%, 其 中 的 I I 4 是 理 传 而 束, 3 I 4 是 肚 皮 的 品 位, 即 由 突 变 而 产 生 的 因 此, 在 年 轻 得 亲 所 韭 的 先 天 IEi 型 JL 中, 的 有 1 I 10 为 岛 位 型, 的 是 遗 传 而 来 岛 位 型 中 较? 暂 且 ~J 盐 14/21 -M 佳 也 儿 具 有 全 部 先 天 IEi 型 儿 的 临 席 表 现, 其 扭 型 为 46, XX (XV) - 14, + I (14q 21 q), 这 表 明 忠 JL 体 细 胞 中 的 蓝 色 体 且 数 仍 为 46, 但 是 少 了 l 条 第 14 号 染 也 体, 事 7 l 条 由 第 14 号 长 悻.1 11 如 21 号 " 臂 所 * 成 的 且 也 染 色 体 每 亲 如 果 是 DIG 的 平 衡 且 也 槐 带 者, 常 常 有 自 然 mt 产 虫, 所 生 小 孩 中 的 有 1 /3 为 先 天 血 型 坦 儿, 1 I 3 为 平 衡 品 也 隅 耕 者 (2) 18 三 体 埠 古 怔 (Edward 氏 综 合 怔 ) 此 怔 也 较 为 前 且 在 新 生 儿 中 注 嗣 2 祀 的 为 , 忠 儿 头 都 有 后 突 的 忱 部, OM 裂 桂 小, 耳 畸 形 ThT 低 位, 小 锁, 胸 骨 距 小, 骨 盐 小 而 大 腿 内 收 受 阻, 船 * 足, 手 U 特 障 些 势 握 拳, jf'j 指 紧 贴 掌 心, 中 捕 和 1 环 指 紧 贴 手 章, 示 阳 和! 小 指 压 于 其 上 ( 阁 2-11) 肌 张 jj 荫, 90% 有 先 天 性 心 脏 病, 直 间 隔 融 m 和 动 脏 导 管 未 闭 较 常 见 患 儿 生 长 发 自 也 绍, 事 号 半 岁 内 死 亡, 生 存 几 年 若 有 相 力 障 碍 植 型 分 析 表 明, 患 儿 的 核 型 为 47, XX (XV) + 18 个 别 的,1,B 儿 脏 型 可 为 46, XX (XY) 147, XX (XY) + 18 的 嵌 古 型 (3) 13 三 你 埠 合 怔 (Palau 氏 肆 合 征 ) 此 怔 较 为 少 见, 在 新 生 儿 中 的 提 捕 率 的 为 32

37 1/25000, 忠 儿 头 小, iilj 额 低 斜, lilj 脑 发 自 有 做 欠, 小 ft~ 球 或 无 D~ 甜, 耳 畸 形 低 位, 小 饭, 应 裂 与 愕 裂, 事 怖, 平 也 有 与 18 三 体 综 古 j[ 相 同 的 提 到 握 草, 且 事 指 88% 有 先 天 性 心 脏 嗣, 右 也 心, 室 间 隔 融 盼 和 l 未 闻 动 脉 导 '11~ 往 常 见 要 费 肾, 隐 串 斟 酒 III 子 宫 ( 阁 2-12) 骸 型 分 析 表 明, 患 儿 的 脑 型 为 47, XX(XY)+ 口 偶 有 DID 且 也 型 者, 因 2 - II 18 三 体 患 儿 因 三 体 患 儿 ( 引 自 刘 权 章 主 编 遗 传 咨 询 } ) ( 引 自 来 'I 权 章 主 编 遗 传 咨 询 }) 核 型 为 46. XX (XV) 口, + t (13([; 13q)o 0/ D 品 也 梅 奇? 者 所 生 的 后 代 中 由 于 流 产 所 辈 辈, DID 品 也 型 血 儿 只 占 1% (4) 5p 综 古 怔 ( 描 叫 综 古 怔 ) 此 j[ 恨 少 见, 只 占 相 生 儿 的 1/50000 血 儿 头 小, 脸 圃, 而 部 有 奇 异 机 警 表 情 ( 阁 2-13}, 眼 组 外 倒 下 帽, 眼 间 距 宽, 捕 颊, 哭 声 如 猫 叫, 因 此 得 名 血 儿 中 50% 有 先 天 性 心 脏 嗣, 以 室 间 隔 l;k 悦 和! 动 脉 导 tf 未 闭 为 常 见 生 长 缓 慢, 相 力 'Jl 百 障 碍!.!J 儿 的 技 型 为 蝠, XX (XY), 5γ, 这 表 明!!UL 核 型 中, 第 5 号 染 色 体 之 一 的 盟 悻 有 战 失 Z 常 见 的 性 染 包 体 病 ( I ) 先 天 性 性 即 发 育 不 主 综 古 怔 ( Turner 黯 古 怔 ) 本 晴 在 女 孩 中 的 监 踊 率 的 1) 1/31500 忠 il 成 年 后 你 瞌 ( 但 120 cm- 140 em), 上 颁 班, 下 顿 小 而 内 睛, 形 成 钳 哇 古, 真 叫 }f;; 低 位, 后 11 际 旺, 50% 有 睽 顿, I l' 杭 胸, 明 Lr, 同 距 宜, 乱 头 发 百 不 血, 手 L 脆 来 发 百, 肘 外 翻, 平 脚 背 面 有 淋 巴 廿 扩 张 性 水 肿, 揣!I I 址 百 不 庭, 第 4 5 草 叶 扭 小 35% 有 心 血 管 在 睛, 主 ~ 为 主 动 脉 缩 窄 阻 'l1. 闭 经, 性 服 呈 条 索 拙, 其 巾 有 卵 巢 基 质 而 无 滤 泡, 外 生 殖 器 世 育 胡 稚 ( 图 2-14)0 X 染 邑 质 和 Y 且 也 质 均 为 阴 性, 核 型 为 45, x 也 存 在 的. X I 46, xx 嵌 古 型 的 性 眼 发 自 不 完 全 的!,!,\ 者 由 于 46, XX 的 悻 型 存 33

38 "'".... U 户 囱 2-13 猫 叫 综 合 征 患 儿 的 面 容 ( 引 自 刘 权 章 主 编 { 遗 传 密 询 ) ) ' 民 图 2-14 T"mer 综 合 征 怠 者 ( 左 ) 及 外 主 殖 器 ( 右 ) ( 引 自 刘 权 章 主 编 { 遗 传 密 询 ) ) 34

39 在, 忠 若 你 证 可 以 不 典 型, 而 只 有 你 矮 原 发 闸 经 和 条 窜 状 性 隙 (2) 先 天 性 磐 丸 11 育 不 主 持 古 怔 ( Kltnefe l1 er 氏 综 古 in 本 晴 在 男 性 中 的 发 病 率 约 为 1 /800, 忠 者 儿 童 时 无 任 何 症 状, 青 春 朋 后 出 血 临 库 在 状 体 高, 的 25% 有 男 性 乳 房 发 帘, 你 毛 幅 少, 大 部 无 规 ( 国 2-1 升 串 丸 小, 长 径 的 2 em, 圳 稍 节 眼 睛 样 变 性, 无 刷 子 发 生, 不 宵 患 儿 的 每 亲 常 常 年 酣 较 大 X 染 色 盾 和 Iy 染 色 质 均 为 阳 性, 核 型 为 47, XXV 的 有 1 /3 自 r-j!.!j 者 技 型 为 蝠, XY / 47, XXV 徽 合 型, 患 者 可 倒 有 E 常 的 华 丸 而 有 生 百 他 力 也 有 的 血 者 核 型 为 48, XXXV, 并 有 2 个 x 且 也 质 在 们 正 发 现 有 49, XXXXY 的 患 者 如 果 棋 型 为 46, XV, 而 有 典 型 体 怔, 贝 IJ 为 串 丸 韭 殖 止 出 发 百 不 生, 多 提 宜 于 隐 哥 哥 l1! 丸 虫 或 射 线 ~yl 恼 囱 2-15 Klinefelter 氏 综 合 征 患 者 ( 引 自 刘 权 章 主 编 { 遗 传 密 询 ) I (3) XYY 结 合 \[ 本 晴 在 男 性 中 的 世 病 率 的 为 1/750-1/1 筑 队 患 者 体 高, 应 服 多 有 约 节 收 瘁, 挠 尺 Ff 楼 台, 性 服 Xj]fj 准 减 埠 X 染 邑 质 l 目 性, Y 坠 也 质 有 21 核 型 为 47, xyy 也 阳 lberg 首 先 报 道 本 捕 的 棋 型 分 析 结 果, 并 提 出 本 嗣 班 者 进 攻 性 强, 有 反 社 会 行 为 常 因 品 力 把 由 而 坐 牢 但 我 们 也 发 现 有 胆 型 为 47, XYY, 表 现 型 为 典 型 女 性 的 捕 例 (4) XXX 综 古 证 本 嗣 在 女 性 巾 的 武 病 率 的 为 [/ I (((), 1, 且 者 可 有 问 ~ 性 闭 经, 不 百, 有 的 血 者 则 可 生 出 正 常 儿 女 X 蓝 色 质 有 2 个, Y 染 邑 质 l 肉 性, 核 型 为 47, >..'XX (5) 两 性 畸 * 两 性 畸 * 是 指 些 担 者 性 眼 或 内 外 生 殖 器, 副 性 怔 有 两 性 特 征 包 括 We 儿 荣 I ) 男 性 假 阴 性 畸 形 患 者 有 率 丸, 内 生 盟 器 或 / 和 外 生 ili 器 具 有 阴 性 的 特 征, 副 性 征 发 甫 平 良 1 特 发 性 男 性 酣 两 性 畸 %,,I,B 若 有 或 无 阻 息, 串 丸 常 常 01: 育 不 金 内 生 殖 器 具 有 发 育 不 良 的 两 性 器 官, 发 育 不 全 的 男 性 或 女 性 然 宫, 外 韭 殖 含 量 多 再 不 同 程 匪 的 35

40 囱 2-16 真 两 位 璐 性 患 者 的 外 笠 殖 豁 尿 迫 下 剖, 男 性 ~J 性 怔 多 发 育 不 良 x 最 邑 服 阴 性 y 染 色 质 阳 性, 怯 型 为 46, XY 2 粤 丸 女 性 化 且 i 若 有 ~ 丸, 位 于 腹 腔 中, 股 股 均 告 中 或 大 阴 居 皮 下, 外 阴 为 发 百 良 虾 的 女 性, 可 有 阴 蒂 肥 大, 阴 道 阻 战, n 闸, 无 于 宫 和 附 件, 有 附 惑 和 轴 精 臂, 外 观 女 性, 乳 房 监 育, 原 址 闭 经, 不 百 7 阴 毛 和 腋 毛 快!lI 1 或 稀 少 血 者 的 星 在 丸 且 肚 恶 性 肿 瘤 X 染 色 服 阴 性, Y 染 色 liji 阳 性, 植 型 为 46, XY 2) 女 性 假 同 性 畸 扉 忠 者 有 w 巢, 外 阴 可 里 出 性, 有 尿 迫 下 裂, ~~ 女 性 而 阴 蒂 肥 大, 阴 毛 乡 里 女 性 分 布, 多 有 输 ~l:i' 刷 子 宫, 但 是 均 发 育 不 良 X 染 色 届 阳 性 Y 且 是 巴 届 阴 性, 拉 型 为 46, XX 3) 真 阴 性 畸 ) 险 的 409 也 血 者 的 性 刷 一 侧 有 卵 巢, 另 一 倒 为 星 在 丸, 的 40% 一 侧 有 阳 县 或 丢 在 丸, 另 侧 有 回 毕. 约 20% 阴 制 为 " 擎 内 外 生 也 暗 地 有 两 性 特 怔, 副 性 怔 可 为 血 性 成 立 性 ( 阁 2-1 的 1 46, XX!47, XXV 嵌 合 型 X 染 色 届 阳 性 y 染 色 服 阳 性, 两 型 货 II 胞 的 比 例 可 各 占 50%, 但 大 部 分 l;j. 46, XX 型 细 胞 占 优 势 2 46, XY / 屿, X 嵌 古 型 X 染 邑 m 阴 性, Y 蜂 邑 质 阳 性, 阴 型 细 胞 中 46, XY 者 占 优 势, 血 者 毕 丸 有 在 墅 的 也 卦 3 46, XY/46, XX! 艇 古 型 X 坠 也 质 阳 性, Y 染 色 质 阳 性, 两 型 细 胞 在 不 同 血 者 中 可 能 各 占 优 势 4 46, XX 型 远 是 Y 染 色 体 部 分 品 位 主 X 染 色 体 的 种 类 型 x 染 色 成 阳 性 Y 班 也 质 阴 性, 我 们 对 远 失 血 者 进 行 SRY 基 因 检 测, 也 桂 监 现 有 SRY 基 因 阳 性 这 可 能 是 由 于 Y 染 色 体 上 的 SRY 基 因 品 位 到 'I X 染 色 体 上 所 致 四 异 常 染 色 体 携 带 者 异 常 染 色 体 棉 带 若 是 m 带 有 染 色 体 结 怕 异 市 但 表 明 型 E 衍 的 介 体, I!X;X 辛 庄 韭 率 为 0.25%, 即 200 元 I 夫 妇 中 有 l 人 为 拥 叩 者. 国 内 统 讨 其 监 生 率 为 0, 47%, 因 此, 为 防 且 且 也 体 踊 忠 JL 出 生, 挂 出 隅 带 者 旦 进 行 产 前 居 断 在 我 国 具 有 直 辈 的 意 义 36 ( 丁 旦 乎 尹 向 东 )

41 第 五 节 遗 传 性 疾 病 基 因 诊 断 的 原 则 及 途 径 用 分 子 生 物 学 技 术 通 过 检 测 基 因 而 达 到 诊 断 疾 病 的 目 的, 最 初 只 是 许 多 分 子 生 物 学 家 的 设 想 1976 年 人 们 开 始 在 实 验 室 进 行 研 究, 1984 年 以 来, 基 因 诊 断 在 许 多 国 家 己 成 为 常 规 的 检 验 项 目, 主 要 用 于 遗 传 性 疾 病 的 诊 断 一 遗 传 性 疾 病 基 因 诊 断 的 原 则 尽 管 有 一 些 遗 传 性 疾 病 可 以 根 据 其 临 床 表 现 家 系 分 析 和 生 化 免 疫 等 传 统 的 检 测 手 段 被 诊 断 出, 但 是 对 于 隐 性 遗 传 性 疾 病 中 杂 合 于 的 诊 断 以 及 判 断 杂 合 于 的 后 代 是 否 患 病, 常 规 的 诊 断 手 段 就 显 得 无 能 为 力 了, 必 须 依 靠 基 因 诊 断 技 术 才 能 解 决 用 分 子 生 物 学 技 术 诊 断 遗 传 性 疾 病 的 策 略 分 为 直 接 诊 断 策 略 和 间 接 诊 断 策 略 (-) 直 接 诊 断 策 略 基 因 的 直 接 诊 断 策 略 就 是 通 过 各 种 分 子 生 物 学 技 术 检 测 基 因 的 缺 失 插 入 或 点 突 变 等 遗 传 缺 陷 因 此, 直 接 诊 断 的 前 提 是 被 检 测 基 因 的 正 常 序 列 和 结 构 必 须 己 被 阐 明 直 接 诊 断 由 于 是 直 接 揭 示 遗 传 缺 陷, 因 而 比 较 可 靠 ( 二 ) 闰 接 诊 断 策 略 目 前 大 多 数 遗 传 性 疾 病 的 致 病 基 因 尚 未 被 定 位 和 克 隆 而 无 法 进 行 直 接 诊 断, 还 有 些 基 因 长 度 达 数 百 至 数 千 个 凶, 突 变 种 类 多 且 分 布 广 泛 无 突 变 热 点, 这 种 情 况 下 突 变 检 测 便 十 分 复 杂 和 困 难, 此 时 可 用 间 接 诊 断 策 略 进 行 诊 断 间 接 诊 断 的 实 质 是 在 家 系 中 进 行 连 锁 分 析, 通 过 分 析 可 确 定 个 体 来 自 双 亲 的 同 源 染 色 体 并 确 定 其 中 哪 一 条 带 有 致 病 基 因, 从 而 判 断 该 个 体 是 否 带 有 该 致 病 染 色 体 进 行 间 接 诊 断 必 须 要 有 较 完 整 的 家 系, 家 系 中 必 须 有 先 证 者, 家 系 中 的 关 键 成 员 ( 如 父 母 ) 是 杂 合 于 等 间 接 诊 断 不 是 寻 找 DNA 的 遗 传 缺 陷, 而 是 通 过 分 析 DNA 的 遗 传 标 记 的 多 态 性 估 计 被 检 者 患 病 的 可 能 性 遗 传 标 i 己 的 选 择 是 进 行 间 接 诊 断 的 基 础, 所 用 标 记 越 多 离 基 因 ( 或 致 病 位 点 ) 越 近 杂 合 性 越 强, 信 息 量 就 越 大 用 于 间 接 诊 断 ( 和 基 因 定 位 ) 的 遗 传 标 记 主 要 有 以 下 几 类 1. 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 (restriction fragment length polymorphism, RFLP) 据 统 计, DNA 序 列 的 每 200 个 碱 基 在 不 同 个 体 问 便 发 生 1 次 变 异, 由 于 这 种 变 异 不 产 生 病 理 性 后 果 而 被 称 为 多 态 性, 是 构 成 个 体 多 样 性 的 基 础 如 果 这 些 多 态 性 位 于 限 制 性 内 切 酶 的 酶 切 位 点, 可 用 相 应 的 酶 水 解 DNA, DNA 被 酶 水 解 或 不 被 水 解 的 结 果 是 产 生 2 种 长 度 不 同 的 片 段, 即 为 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 只 有 在 杂 合 于 时,1 对 染 色 体 中 的 2 条 才 能 相 互 区 别 开, 而 成 为 杂 合 于 的 概 率 取 决 于 2 个 等 位 基 因 在 人 群 中 的 分 布 一 般 认 为 位 于 X 染 色 体 上 1 个 多 态 性 的 最 大 概 率 为 0.5, 位 于 常 染 色 体 上 1 个 多 态 性 的 最 大 概 率 为 0.38, 因 此, 这 种 双 等 位 基 因 多 态 性 所 含 的 信 息 量 很 有 限 ( 被 认 为 是 第 一 代 DNA 遗 传 标 记 ) 为 了 提 高 诊 断 的 准 确 性, 必 须 在 被 检 基 因 (Ell(; 位 点 ) 附 近 选 择 数 个 RFLP 标 记, 并 且 这 些 标 记 之 间 不 能 有 连 锁 不 平 衡 RFLP 的 检 测 主 要 依 靠 Southern 印 迹 技 术, 操 作 比 较 复 杂, 而 且 需 要 用 放 射 性 核 素 标 记 探 针, 这 些 因 素 限 制 了 实 际 应 用 37

42 随 着 第 二 代 甚 至 第 三 代 DNA 遗 传 标 记 的 发 现 和 应 用, 目 前 RFLP 在 间 接 诊 断 中 仅 用 于 一 些 特 殊 的 情 况 和 致 病 基 因, 如 脆 性 X 综 合 征 中 动 态 性 突 变 的 检 测 2. 串 联 重 复 可 变 数 目 (variable number tandem repeats, VNTR) 和 短 串 联 重 复 (short tandem repeats, STR) DNA 序 列 分 析 表 明, 在 人 类 基 因 组 的 非 编 码 区 中, 有 一 些 约 十 来 个 碱 基 组 成 的 片 段 往 往 重 复 好 几 次 这 些 重 复 顺 序 被 称 为 小 卫 星 或 串 联 重 复 可 变 数 目, 被 认 为 是 第 二 代 DNA 遗 传 标 记 它 的 重 复 次 数 根 据 孟 德 尔 遗 传 规 律 由 亲 代 传 递 给 于 代, 但 是 在 无 血 缘 的 不 同 个 体 之 间 这 些 序 列 的 重 复 次 数 可 以 不 同 VNTR 的 等 位 基 因 常 常 达 10 个 以 上, 因 而 它 的 信 息 量 比 RFLP 大 得 多 VNTR 可 以 用 Southern 印 迹 分 析 Ejj(; PCR 技 术 进 行 检 测 另 一 种 第 二 代 DNA 遗 传 标 记 即 STR, 又 被 称 为 微 卫 星 标 记, 也 是 一 种 多 等 位 基 因 多 态 性 遗 传 标 记, 是 一 些 由 2 个 ~6 个 碱 基 组 成 的 重 复 序 列 大 多 情 况 下 由 2 个 碱 基 组 成, 在 一 条 染 色 体 上 是 胞 口 密 院 (C) 和 腺 瞟 岭 (A), 另 一 条 染 色 体 上 是 鸟 嘿 岭 (G) 和 胸 腺 口 密 院 (T), 所 以 人 们 将 其 称 为 CA 重 复 (CA repeat) 微 卫 星 标 记 均 匀 地 分 布 在 人 类 基 因 组 中, 也 是 一 种 信 息 量 很 大 的 遗 传 标 记, 它 的 多 态 性 之 间 仅 仅 2 是 个 碱 基 的 差 别, 用 PCR 技 术 扩 增 含 重 复 序 列 的 片 段 后 再 行 聚 丙 烯 酌 肢 凝 胶 电 泳 分 离, 可 以 很 万 便 地 进 行 检 测 3. 单 核 昔 酸 多 态 性 (si 日 gle nucleotide polymorphism, SNP) 单 核 昔 酸 多 态 性 是 一 类 最 近 发 现 的 多 态 性 遗 传 标 记, 被 称 为 第 三 代 DNA 遗 传 标 记, 其 多 态 性 仅 表 现 为 单 个 核 昔 酸 的 变 异 由 于 每 1 个 核 昔 酸 的 突 变 率 大 约 为 109, 也 即 每 1 个 核 昔 酸 在 任 何 一 代 人 群 中 大 约 每 1 X 10 9 个 个 体 就 会 发 生 1 次 变 异 因 此 SNP 虽 然 是 一 种 双 等 位 基 因 多 态 性 遗 传 标 记, 但 由 于 其 在 人 类 基 因 组 中 的 数 目 可 达 300 万 个, 由 3 个 ~4 个 相 邻 的 这 种 标 记 便 可 构 成 8 种 ~16 种 单 倍 型, 所 以 SNP 仍 然 是 一 种 信 息 量 非 常 大 的 标 记 系 统 SNP 的 一 个 突 出 优 点 是 可 用 DNA 芯 片 技 术 而 无 须 使 用 常 规 的 电 泳 技 术 对 其 进 行 检 测, 因 此 它 将 有 广 阔 的 应 用 前 景 由 于 间 接 诊 断 是 通 过 分 析 遗 传 标 i 己 的 多 态 性 判 断 被 检 者 是 否 具 有 带 有 致 病 基 因 的 染 色 体, 是 判 断 被 检 者 患 病 的 可 能 性, 因 此 间 接 诊 断 有 时 会 造 成 一 些 人 为 因 素 以 外 的 错 误, 如 基 因 重 组 家 系 成 员 不 够 完 整 和 所 带 信 息 量 有 限 等, 应 特 别 注 意 二 基 因 检 测 的 标 本 制 备 基 因 诊 断 所 用 的 标 本 有 DNA 和 RNA, 这 些 物 质 可 来 自 外 周 血, 或 其 他 组 织 ( 如 毛 发, 皮 肤, 肌 肉, 器 官, 肿 瘤 组 织 等 ) 细 胞 体 液 和 分 泌 物 在 某 些 情 况 下, 人 们 还 可 从 木 乃 伊 Ejj(; 一 些 生 物 化 石 中 抽 提 DNA, 作 为 研 究 的 材 料 当 基 因 发 生 突 变 时, 一 般 取 患 者 外 周 血 基 因 组 DNA 作 为 检 测 标 本, 但 若 致 病 原 因 是 由 于 mrna 前 体 剪 切 加 工 时 发 生 突 变 而 产 生 异 常 的 mrna, 并 由 此 造 成 基 因 表 达 异 常, 一 般 应 取 RNA 作 为 检 测 标 本 由 于 基 因 表 达 具 有 组 织 特 异 性, 故 RNA 的 制 备 只 能 从 相 应 的 组 织 中 提 取 但 自 20 世 纪 80 年 代 以 来, 人 们 发 现 在 外 周 血 RNA 中 也 有 低 拷 贝 的 特 异 mrna 的 表 达, 因 此 用 外 周 血 中 RNA 通 过 逆 转 录 PCR 技 术 可 以 达 到 检 测 mrna 的 目 的. 38.

43 产 前 基 因 诊 断 是 单 基 因 病 基 因 诊 断 的 一 个 重 要 部 分, 产 前 基 因 诊 断 的 材 料 一 般 来 自 羊 水 细 胞 或 绒 毛 膜 细 胞 DNA 羊 水 采 集 的 最 佳 时 间 为 孕 16 周 ~24 周 绒 毛 取 样 的 最 佳 时 间 是 在 孕 6 周 ~8 周 比 羊 膜 穿 刺 采 集 羊 水 提 前 10 周 以 上 它 的 优 点 是 一 旦 发 现 胎 儿 有 遗 传 缺 陷, 可 及 早 采 取 有 效 措 施, 避 免 中 期 号 产 导 致 的 各 种 风 险, 但 是 绒 毛 取 样 引 起 流 产 的 机 率 较 羊 膜 穿 剌 稍 高 由 于 上 述 2 种 取 样 都 会 给 孕 妇 甚 至 胎 儿 造 成 一 定 的 创 伤, 近 年 来 有 许 多 实 验 室 正 致 力 于 无 创 伤 性 取 样 的 研 究, 力 图 从 孕 妇 的 外 周 血 中 分 离 胎 儿 细 胞, 尤 其 是 分 离 胎 儿 有 核 红 细 胞 进 行 产 前 基 因 诊 断 这 种 无 创 伤 性 的 取 样 途 径 无 疑 会 有 广 阔 的 应 用 前 景 三 基 因 突 变 的 检 测 (-) 点 突 变 的 检 测 基 因 突 变 最 常 见 的 类 型 是 单 个 碱 基 的 改 变 目 前 检 测 点 突 变 的 万 法 很 多, 根 据 患 者 是 己 知 突 变 还 是 未 知 突 变, 人 们 采 用 不 同 的 技 术 进 行 检 测 1. 己 知 点 突 变 的 检 测 (1) PCR - RFLP: 本 技 术 是 利 用 正 常 序 列 或 突 变 序 列 是 否 含 有 限 制 性 内 切 酶 的 酶 切 位 点 而 设 计 的 若 点 突 变 处 于 某 一 限 制 性 内 切 酶 的 酶 切 位 点 内, 可 在 突 变 点 两 侧 设 计 引 物, 使 PCR 产 物 含 有 该 突 变 序 列 用 相 应 的 内 切 酶 对 正 常 产 物 和 突 变 产 物 进 行 水 解 并 电 泳, 可 根 据 水 解 片 段 的 大 小 和 电 泳 位 置 区 分 二 者 PCR - RFLP 是 目 前 最 简 单 的 一 种 己 知 突 变 的 检 测 技 术, 应 用 十 分 广 泛 (2) 等 位 基 因 特 异 性 寡 核 昔 酸 杂 交 (allele - specific oligonucleotide hybridization, ASO): ASO 技 术 是 基 于 分 于 杂 交 原 理 而 建 立 的 一 种 突 变 检 测 万 法 被 检 基 因 经 PCR 扩 增 后 转 移 到 膜 上, 分 别 与 长 度 为 15 bp~20 bp 经 标 i 己 的 正 常 序 列 和 突 变 序 列 的 寡 核 昔 酸 探 针 杂 交 由 于 20 个 碱 基 中 仅 1 个 碱 基 的 差 异 便 会 使 DNA 分 于 的 融 点 温 度 ( T m ) 下 降 5 'c ~7. 5 'c, 因 此 通 过 严 格 控 制 杂 交 条 件, 可 以 使 PCR 产 物 仅 与 完 全 互 补 的 探 针 进 行 杂 交, 因 此 可 根 据 有 无 杂 交 信 号 判 断 被 检 者 的 扩 增 片 段 中 是 否 带 有 突 变 点 如 果 将 不 同 的 寡 核 昔 酸 探 针 固 定 于 膜 上, 用 样 品 DNA 与 之 进 行 杂 交, 可 同 时 检 出 多 种 突 变, 即 为 反 向 杂 交 ASO 技 术 的 缺 点 是 为 避 免 假 阳 性 或 假 阴 性, 必 须 严 格 控 制 杂 交 条 件 ; 检 测 1 个 突 变 点 需 1 对 引 物 和 1 对 寡 核 昔 酸 探 针, 成 本 相 对 较 高 (3) 等 位 基 因 特 异 性 扩 增 (allele - specific amplification, ASA): ASA 是 在 PCR 扩 增 的 寻 物 设 计 中, 设 计 2 个 5' 端 引 物, 其 中 一 个 与 正 常 序 列 DNA 互 补, 另 一 个 与 突 变 的 DNA 序 列 互 补 对 于 纯 合 性 突 变, 分 别 加 入 这 2 种 寻 物 及 3' 端 引 物 进 行 2 个 平 行 PCR 反 应, 只 有 与 突 变 DNA 完 全 互 补 的 引 物 才 可 延 伸 得 到 PCR 反 应 产 物 ASA 简 便 快 速, 只 需 1 个 PCR 反 应 便 可 得 到 结 果, 但 在 实 验 中 必 须 通 过 调 整 反 应 条 件 以 提 高 反 应 的 特 异 性, 避 免 可 能 发 生 的 引 物 与 靶 DNA 错 配 时 的 错 配 延 伸 ASO 和 ASA 己 被 成 功 地 用 于 自 地 中 海 贫 血 苯 丙 酣 尿 症 甲 型 血 友 病 α 抗 日 夷 蛋 白 酶 缺 乏 症 等 多 种 单 基 因 病 的 点 突 变 检 测 (4) PCR - ELISA: PCR - ELISA 是 将 PCR 产 物 用 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 法 ( enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 加 以 检 测 的 组 合 技 术 在 对 目 的 基 因 PCR 扩. 39.

44 增 时, dntp 中 同 时 泪 有 用 生 物 素 标 记 的 Bio dutp, 使 扩 增 产 物 带 有 生 物 素 标 记 扩 增 产 物 经 过 滤 除 去 游 离 核 昔 酸 寻 物 或 它 的 二 聚 体 后, 将 突 变 点 特 异 性 的 寡 核 昔 酸 探 针 3' 端 用 地 高 辛 (11 - Dig - ddutp) 标 记, 并 与 PCR 产 物 一 起 变 性 杂 交, 加 入 用 抗 生 物 素 包 被 的 酶 标 板 中 若 经 生 物 素 标 记 的 待 测 基 因 片 段 能 与 突 变 点 特 异 的 寡 核 昔 酸 杂 交, 则 该 产 物 便 带 有 地 高 辛 标 记 信 号, 可 利 用 与 抗 地 高 辛 抗 体 共 价 结 合 的 酶 标 检 测 系 统 进 行 显 色 反 应, 从 而 判 断 突 变 的 存 在 由 于 PCR 产 物 中 分 于 拷 贝 数 在 一 定 范 围 内 呈 剂 量 反 应 曲 线, 因 而 可 作 定 量 分 析 (5) 寡 核 昔 酸 连 接 检 测 (oligonucleotide ligation assay, OLA): OLA 的 原 理 是 设 计 2 个 探 针 ( 探 针 A 和 时, 探 针 A 位 于 被 检 片 段 的 5' 端, 探 针 B 位 于 被 检 片 段 的 3' 端, 探 针 A 的 3' 端 与 探 针 B 的 5' 端 紧 邻, 并 且 A 探 针 的 5' 端 和 B 探 针 的 3' 端 分 别 用 生 物 素 和 地 高 辛 标 记 在 设 计 引 物 时, 使 突 变 点 位 于 A 探 针 的 3' 端 处 被 检 标 本 经 PCR 反 应 后, 产 物 被 变 性, 同 时 与 2 个 探 针 杂 交, 若 i 亥 反 应 产 物 中 不 含 有 突 变 点, 2 个 探 针 可 同 时 与 其 互 补, 此 时 反 应 体 系 中 的 T4 连 接 酶 可 在 A B 探 针 间 形 成 了, 5' 磷 酸 二 醋 键, 通 过 ELISA 显 色 的 原 理 可 检 测 到 连 接 产 物 的 信 号 反 之, 若 PCR 反 应 产 物 中 含 有 突 变 点, A B 探 针 就 不 能 与 其 互 补, 2 个 探 针 间 也 因 之 不 能 互 相 连 接, 此 时 无 连 接 产 物 生 成, 呈 阴 性 反 应 (6) DNA 芯 片 技 术 (DNA chip): DNA 芯 片 是 20 世 纪 90 年 代 发 展 起 来 的 一 项 新 技 术, 其 概 念 来 源 于 计 算 机 芯 片 DNA 芯 片 技 术 是 在 固 相 支 持 物 ( 硅 片, 玻 璃, 聚 丙 烯, 尼 龙 膜 等 ) 表 面 有 序 地 阵 列 一 系 列 固 定 于 一 定 位 置 的 分 于 ( 探 针 ), 当 标 记 样 品 ( 如 用 化 学 荧 光 法 化 学 发 光 法 标 记 ) 与 探 针 进 行 杂 交 后, 用 共 聚 焦 荧 光 自 动 扫 描 等 技 术 获 取 信 息, 经 计 算 机 系 统 处 理 分 析 后 得 到 结 果 由 于 这 一 技 术 在 初 期 的 主 要 目 标 是 用 于 DNA 测 序 基 因 表 达 谱 鉴 定 和 基 因 突 变 体 的 检 测 和 分 析, 所 以 人 们 称 其 为 DNA 芯 片 ( 或 基 因 芯 片 )0 DNA 芯 片 的 分 于 识 别 基 于 分 于 杂 交 原 理, 经 过 标 记 ( 如 荧 光 标 记 ) 的 样 品 核 酸 (PCR 扩 增 或 逆 转 录 产 物 ) 与 点 加 于 基 片 上 的 寡 核 昔 酸 或 cdna ( 探 针 ) 杂 交 后 洗 涤, 以 去 除 未 被 杂 交 的 残 留 物 芯 片 的 判 读 依 据 报 告 分 于 的 标 记 种 类, 荧 光 标 记 是 目 前 最 理 想 的 报 告 标 志 用 激 光 作 为 激 发 光 源 的 共 聚 焦 扫 描 装 置 不 仅 具 极 高 的 分 辨 能 力 而 且 具 定 位 功 能, 是 目 前 较 为 普 遍 使 用 的 芯 片 杂 交 判 读 系 统 2. 未 知 点 突 变 的 检 测 万 法 (1) 单 链 构 象 多 态 性 (single - strand conformational polymorphism, SSCP): DNA 分 于 若 以 单 链 形 式 存 在 时, 能 在 空 间 白 发 地 形 成 二 级 结 构, 这 种 二 级 结 构 的 构 象 取 决 于 它 的 碱 基 组 成, 即 使 1 个 碱 基 的 差 别 也 会 形 成 不 同 的 二 级 结 构 突 变 DNA 的 PCR 产 物 经 变 性 后 产 生 2 条 与 正 常 DNA 空 间 构 象 不 同 的 单 链 在 非 变 性 聚 丙 烯 酌 肢 I~ 是 胶 电 泳 时, 不 同 构 象 的 片 段 显 示 不 同 的 电 泳 迁 移 率, 从 而 能 区 别 正 常 与 突 变 的 DNA 随 DNA 片 段 长 度 的 增 加, 迁 移 率 的 改 变 明 显 减 小, 也 即 SSCP 的 敏 感 性 随 PCR 产 物 长 度 的 增 加 而 降 低, 因 此 SSCP 只 适 用 于 检 测 150 bp~200 bp 长 度 的 DNA 片 段 尽 管 如 此, SSCP 由 于 其 技 术 简 便, 不 需 特 殊 设 备 以 及 可 同 时 分 析 较 大 量 样 本 等 优 点, 仍 然 是 目 前 最 广 泛 应 用 的 基 因 突 变 筛 查 技 术 之 一 SSCP 己 用 于 苯 丙 酣 尿 症 血 友 病 月 几 营 养 不 良 性 别 发 育 异 常 等 许 多 遗 传 病 的 突 变 基 因 筛 查 和 检 测 40

45 (2) 变 性 梯 度 凝 胶 电 泳 (denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE): DNA 分 于 的 物 理 特 性 之 一 是 当 DNA 分 于 被 加 热 至 其 L 时, DNA 分 于 的 双 链 被 打 开 Tm 取 决 于 DNA 分 于 本 身 的 序 列, 也 即 不 同 序 列 的 DNA 分 于 具 有 不 同 的 丑 DGGE 技 术 正 是 利 用 了 DNA 分 于 的 这 一 特 性 在 设 计 寻 物 时 使 被 扩 增 的 目 的 片 段 含 有 2 个 不 同 的 区 域, 其 中 一 个 L 较 高, 另 一 个 较 低 将 这 一 PCR 产 物 在 变 性 剂 梯 度 胶 上 进 行 电 泳, 当 其 泳 动 至 相 应 位 置 时, 片 段 中 Tm 较 低 一 端 的 双 链 被 部 分 解 链, 致 使 该 片 段 的 电 泳 迁 移 率 大 大 降 低 由 于 正 常 序 列 的 PCR 产 物 片 段 与 突 变 的 PCR 产 物 的 丑 不 同, 它 们 在 电 泳 过 程 中 被 部 分 解 链 的 先 后 不 同, 经 过 一 定 时 间 的 电 泳, 它 们 在 凝 胶 中 所 处 的 位 置 也 不 同 据 此, 人 们 可 以 区 别 正 常 片 段 与 突 变 片 段 DGGE 具 有 较 高 的 灵 敏 度 和 较 好 的 重 复 性, 对 于 长 达 600 bp 的 PCR 产 物 中 单 碱 基 突 变 的 检 出 率 达 95% 以 上, 但 它 只 能 确 定 突 变 的 存 在, 而 不 能 确 定 突 变 位 置 (3) 化 学 裂 解 (chemical cleavage method, CCM): CCM 即 化 学 错 配 裂 解 ( chemical mismatch cleavage, CMC), 是 在 Maxam - Gilbert 测 序 的 基 础 上 发 展 起 来 的 一 项 突 变 检 测 技 术 其 原 理 是 将 放 射 性 核 素 标 记 的 正 常 DNA 片 段 和 突 变 型 DNA (Ell(; RNA) 片 段 混 合 变 性, 复 性 时 可 形 成 DNA - DNA Ell(; DNA - RNA 异 源 双 链 在 反 应 中 加 入 四 氧 化 饿 (osmium tetroxide) 可 对 错 配 的 胸 腺 P~ 院 进 行 化 学 修 饰, 加 入 起 肢 可 对 错 配 的 胞 口 密 院 进 行 修 饰, 再 用 赈 院 (piperidine) 在 修 饰 位 点 裂 解 异 源 双 链, 然 后 通 过 测 序 电 泳 确 定 有 无 突 变 CCM 能 对 长 至 2 kb 的 片 段 进 行 分 析 并 能 确 定 突 变 的 具 体 部 位 及 性 质 在 所 有 的 筛 查 突 变 万 法 中, CCM 对 待 检 DNA 片 段 的 有 效 检 测 范 围 最 大, 其 主 要 缺 点 是 使 用 毒 性 物 质, 必 须 在 通 气 罩 下 操 作 (4) RNA 酶 A 裂 解 (RNase A cleavage method): 在 一 定 条 件 下, 异 源 双 链 核 酸 分 于 RNA 与 RNA Ell(; RNA 与 DNA 中 的 错 配 碱 基 可 被 RNase A 切 割, 切 割 产 物 可 通 过 变 性 胶 电 泳 得 以 分 离 但 是, 当 RNA 探 针 上 错 配 的 碱 基 为 日 票 岭 时, RNase A 在 错 配 处 的 切 割 效 率 很 低, 当 错 配 碱 基 为 口 密 院 时, 其 切 割 效 率 则 较 高, 所 以 应 同 时 分 析 被 检 DNA 分 于 的 正 链 和 反 链 以 提 高 检 测 效 率 尽 管 RNase 裂 解 技 术 有 局 限 性, 如 需 使 用 放 射 性 核 素 需 将 PCR 产 物 连 接 至 表 达 载 体 上 而 增 加 了 操 作 的 复 杂 性, 但 由 于 它 能 对 1 kb~2 kb 长 度 的 片 段 进 行 检 测, 并 能 确 定 突 变 位 置, 故 仍 被 广 泛 使 用 (5) 异 源 双 链 分 析 (heteroduplex analysis, HA): 正 常 DNA 和 突 变 DNA 在 一 起 变 性 后 再 缓 慢 复 性, 可 使 二 者 互 补 形 成 异 源 杂 合 双 链, 并 在 错 配 处 形 成 凸 起 在 非 变 性 胶 中 电 泳 时, 异 源 双 链 片 段 会 产 生 与 相 应 的 同 源 双 链 片 段 不 同 的 迁 移 率, 从 而 使 二 者 分 开 对 于 小 片 段 DNA ( 小 于 300 bp), 异 源 双 链 分 析 的 敏 感 性 与 SSCP 分 析 相 似, 并 且 由 于 其 操 作 简 单 而 受 关 注, 这 一 技 术 己 应 用 于 许 多 遗 传 病 的 研 究 和 一 些 病 毒 的 分 析, 它 的 缺 点 是 不 能 确 定 突 变 位 置 (6) 裂 解 片 段 长 度 多 态 性 (cleavage fragment length polymorphism, CFLP): CFLP 是 在 RFLP 和 SSCP 基 础 上 发 展 起 来 的, 其 原 理 是 单 链 DNA 能 在 空 间 白 发 地 形 成 二 级 结 构 ( 包 含 多 个 折 叠 的 发 夹 状 结 构 ), 这 种 二 级 结 构 取 决 于 DNA 的 核 昔 酸 组 成 和 顺 序, 即 使 有 1 个 碱 基 的 差 异 也 会 使 正 常 DNA 和 突 变 DNA 形 成 不 同 数 目 的 折 叠 状 发 夹 结 构 裂 解 酶 I 能 识 别 这 种 发 夹 结 构, 并 在 其 附 近 进 行 切 割, 形 成 许 多 该 DNA 链 41

46 特 有 的 片 段, 切 割 产 物 经 电 泳 检 测, 突 变 的 DNA 将 出 现 与 正 常 对 照 不 同 的 酶 切 图 谱 CFLP 可 检 测 2 kb 大 小 的 DNA 片 段 (7) 双 脱 氧 指 纹 图 谱 (dideoxy fingerpri 日 tl 吨, ddf): ddf 是 将 SSCP 和 Sanger 双 脱 氧 链 终 止 测 序 结 合 起 来 而 形 成 的 一 种 新 的 突 变 检 测 万 法 将 PCR 产 物 纯 化 后, 用 与 2 条 双 链 各 自 互 补 的 2 个 寻 物 分 别 作 出 nger 测 序 反 应, 但 不 同 的 是 仅 加 入 4 种 双 脱 氧 核 昔 中 的 1 种, 反 应 产 物 经 聚 丙 烯 酌 肢 凝 胶 电 泳 根 据 突 变 的 性 质, 在 电 泳 图 谱 上 会 显 示 丢 失 E\lG 获 得 1 条 带, 或 者 至 少 有 1 条 带 的 迁 移 率 会 发 生 改 变 双 脱 氧 指 纹 图 语 分 析 的 灵 敏 度 较 高, 所 测 PCR 产 物 长 度 可 达 500 bp, 对 突 变 位 置 能 相 对 定 位, 但 它 的 缺 点 是 需 使 用 放 射 性 核 素, 对 回 收 的 PCR 产 物 的 纯 度 要 求 也 较 高 (8) DNA 序 列 分 析 (DNA sequencing): 直 接 测 序 能 确 定 突 变 的 部 位 和 性 质, 各 种 突 变 检 测 技 术 检 测 的 未 知 突 变, 最 后 都 是 由 测 序 来 确 定 目 前 人 们 所 用 的 大 多 是 Sanger 测 序 技 术, 它 的 原 理 是 以 待 测 序 列 的 单 链 DNA 作 为 模 板, 加 入 1 个 引 物 和 dntp 作 为 底 物, 并 加 入 一 定 比 例 的 2', 3' 双 脱 氧 核 糖 核 昔 三 磷 酸 (ddntp), 在 DNA 聚 合 酶 的 作 用 下, 正 常 dntp 的 掺 入 使 链 延 伸, 若 ddntp 掺 入, 链 的 延 长 就 终 止 由 于 加 入 的 ddntp 的 量 很 小, 原 则 上 每 延 长 1 个 碱 基 仅 有 1 个 分 于 DNA 终 止 延 长 这 样 就 可 以 得 到 一 系 列 长 度 不 同 的 以 4 种 ddntp 结 尾 的 DNA 片 段, 经 电 泳 后 可 直 接 i 卖 出 碱 基 序 列 直 接 测 序 是 将 PCR 产 物 作 为 模 板 进 行 直 接 序 列 分 析 而 不 需 事 先 将 扩 增 产 物 克 隆 到 测 序 载 体 上 对 一 些 片 段 比 较 小 外 显 于 比 较 少 的 基 因 可 以 直 接 用 测 序 分 析 检 测 点 突 变 随 着 自 动 化 DNA 序 列 分 析 技 术 的 应 用, 直 接 测 序 的 效 率 大 大 提 高, 但 花 费 昂 贵 因 此, 对 较 大 的 外 显 于 较 多 的 基 因 以 及 大 批 量 样 本 不 宜 直 接 采 用 DNA 序 列 分 析 检 测 突 变, 一 般 应 首 先 进 行 突 变 筛 查, 只 有 提 示 突 变 存 在 时, 才 进 行 序 列 分 析, 以 确 定 突 变 的 部 位 和 性 质 (9) 蛋 白 截 短 测 试 (protein trunca tio 日 test, PTT): 该 技 术 主 要 从 蛋 白 质 水 平 检 测 基 因 突 变, 检 测 由 于 碱 基 突 变 导 致 终 止 密 码 产 生 使 蛋 白 质 合 成 提 前 终 止 所 产 生 的 截 短 的 蛋 白 质 PTT 的 基 本 原 理 是 将 正 常 人 和 病 人 的 RNA 逆 转 录 成 edna, 并 以 edna 作 为 模 板 进 行 PCR 反 应 扩 增 产 物 在 体 外 经 过 转 录, 在 无 细 胞 提 取 液 中 能 被 翻 译 成 蛋 白 质 所 合 成 的 蛋 白 质 经 聚 丙 烯 酌 肢 凝 胶 电 泳 检 测 时 会 出 现 比 正 常 蛋 白 质 短 的 截 短 蛋 白 片 段 PTT 突 变 检 出 率 高, 可 检 出 4kb~5kb 片 段 中 的 突 变, 但 对 不 产 生 截 短 蛋 白 的 各 种 突 变 则 无 法 检 测 目 前 己 成 功 地 利 用 该 技 术 对 APC DMD 基 因 等 的 点 突 变 进 行 检 测 ( 二 ) 片 段 性 突 变 的 检 测 片 段 性 突 变 可 以 是 缺 失 插 入 重 复 和 基 因 重 组 1. Southern 印 迹 技 术 Southern 印 迹 技 术 是 一 种 最 经 典 的 检 测 DNA 片 段 性 突 变 的 技 术 根 据 基 因 探 针 与 被 检 DNA 限 制 性 酶 切 片 段 杂 交 的 带 谱, 可 直 接 确 定 致 病 基 因 缺 陷 的 性 质 它 的 原 理 是 将 基 因 组 DNA 用 限 制 性 酶 水 解 成 无 数 片 段, 经 I~ 是 胶 电 泳 后 用 碱 处 理 使 I~, 是 胶 中 的 DNA 变 性 为 单 链, 将 单 链 DNA 转 移 至 硝 酸 纤 维 素 膜 E\lG 尼 龙 膜 上, 经 与 标 记 的 探 针 杂 交, 可 使 特 异 条 带 显 影 带 语 可 表 现 为 DNA 片 段 消 失 和 ( E\lG ) 片 段 长 度 改 变 探 针 所 检 测 的 DNA 酶 切 片 段 完 整 缺 失 时, 显 示 片 段 长 度 变 小 ; 若 缺 失 使 1 个 酶 切 位 点 丢 失, 产 生 融 合 片 段, 则 融 合 DNA 片 段 的 长 度 增 加 Southern 印 迹 需 要 大 42

47 量 的 DNA, 而 且 需 要 使 用 放 射 性 核 素 标 记 探 针, 操 作 十 分 复 杂 2. 多 重 PCR 当 基 因 的 外 显 于 发 生 缺 失 时, 可 以 用 PCR 技 术 扩 增 外 显 于, 根 据 扩 增 产 物 的 有 无 来 判 断 被 检 外 显 于 是 否 发 生 缺 失 当 被 检 基 因 较 大 外 显 于 数 目 较 多 时, 可 采 用 多 重 PCR 技 术, 即 在 1 个 PCR 反 应 体 系 中 放 入 多 对 寻 物 根 据 条 带 缺 失 的 数 目 和 寻 物 相 应 的 位 置, 便 可 判 断 基 因 中 哪 一 个 或 哪 几 个 外 显 于 发 生 缺 失 在 实 际 应 用 中, 多 重 PCR 技 术 己 运 用 于 DMD 基 因 的 检 测, 人 们 在 DMD 基 因 的 突 变 热 点 区 设 计 了 18 对 寻 物, 相 应 于 18 个 外 显 于, 分 成 2 个 PCR 反 应, 每 个 PCR 包 括 9 个 外 显 于 片 段, 这 一 多 重 PCR 可 检 出 98% 的 DMD 基 因 的 片 段 性 缺 失 ( 三 ) 动 态 突 变 的 检 测 动 态 突 变 的 基 因 检 测 与 其 他 单 基 因 遗 传 病 的 基 因 诊 断 相 比, 有 其 明 显 的 有 利 和 不 利 之 处 绝 大 多 数 单 基 因 病 往 往 有 多 种 多 样 的 突 变 类 型, 即 使 某 一 突 变 类 型 占 优 势, 也 还 是 有 其 他 突 变 同 时 存 在, 而 大 多 数 动 态 突 变 所 致 单 基 因 遗 传 病 都 只 表 现 为 重 复 序 列 拷 贝 数 的 增 加, 因 此 可 以 通 过 拷 贝 数 的 检 测 直 接 进 行 基 因 诊 断 但 是 动 态 突 变 中 基 因 的 重 复 序 列 的 拷 贝 数 是 连 续 变 化 的, 不 同 表 现 型 之 间 的 拷 贝 数 可 能 有 重 叠 另 外, 由 于 存 在 有 丝 分 裂 的 不 稳 定 性, 从 外 周 血 DNA 中 检 测 出 的 拷 贝 数 不 一 定 与 受 累 组 织 中 的 拷 贝 数 完 全 相 同, 这 给 判 断 病 情 带 来 一 定 困 难 PCR 和 Southern 印 迹 技 术 均 可 用 来 检 验 动 态 性 突 变 当 动 态 突 变 的 重 复 次 数 不 太 多 即 重 复 片 段 不 太 长 时, 可 用 PCR 进 行 检 测 在 重 复 片 段 的 两 侧 设 计 引 物, 所 得 扩 增 片 段 与 正 常 片 段 相 比, 即 可 知 ; 被 检 片 段 是 否 有 动 态 突 变 当 重 复 次 数 过 多 而 使 片 段 长 度 超 出 PCR 所 能 扩 增 的 极 限 时, 应 采 用 Southern 印 迹 技 术 进 行 检 测 用 这 两 种 技 术 检 测 动 态 突 变 的 遗 传 性 疾 病 主 要 有 脆 性 x 综 合 征 强 直 性 月 几 营 养 不 良 慢 性 进 行 性 舞 蹈 病 少 年 脊 髓 型 共 济 失 调 脊 髓 小 脑 共 济 失 调 I 型 脊 髓 小 脑 共 济 失 调 回 型 和 脊 髓 延 髓 肌 萎 缩 等 用 分 子 生 物 学 技 术 诊 断 致 病 基 因 的 历 史 虽 然 不 长, 它 的 发 展 却 很 迅 速 随 着 各 种 技 术 的 不 断 发 展, 使 诊 断 的 效 率 和 准 确 性 越 来 越 高, 应 用 范 围 也 越 来 越 广 基 因 检 测 不 仅 可 以 揭 示 基 因 缺 陷, 明 确 诊 断, 而 且 可 以 对 表 现 型 正 常 的 携 带 者 对 某 些 疾 病 的 易 感 者 作 出 诊 断 和 预 后 判 断, 可 对 家 系 中 的 高 风 险 者 作 出 产 前 诊 断, 因 此 基 因 诊 断 将 大 大 提 高 临 床 医 学 诊 断 水 平 ( 丁 显 平 顾 华 强 ) 参 考 文 献 1 Lewin B. Genes VI. Oxford: Oxford University Press, 李 璜 医 学 遗 传 学 北 京. 北 京 医 科 大 学 中 国 协 和 医 科 大 学 联 合 出 版 社, 陈 兰. 医 学 遗 传 学. 北 京. 人 民 卫 生 出 版 社, 汪 坊 仁, 薛 绍 明, 柳 惠 图. 细 胞 生 物 学, 第 2 版. 北 京 : 北 京 师 范 大 学 出 版 社, 桂 传 书. 医 学 遗 传 学 基 础, 第 2 版. 北 京 : 人 民 卫 生 出 版 社, 吴 冠 芸, 方 福 德 主 编 基 因 诊 断 技 术 与 应 用. 北 京 : 北 京 医 科 大 学 中 国 协 和 医 科 大 学 联 合 出. 43.

48 版 社, 张 思 仲. 动 态 突 变 疾 病 研 究 进 展 中 华 医 学 遗 传 学 杂 志, 1996, 13: 刘 权 章 主 编. 遗 传 咨 询. 哈 尔 滨 : 黑 龙 江 科 学 技 术 出 版 社, Turner G, Robinson H, Laing S, et a!. Preventive screening for the fragile X syndrome. N Engl J M 时, 1986, 315: Robitaille Y, Lopes - Cendes 1, Becher M, et a!. The neuropathology of CAG repeat diseases: review and update of genetic and molecular features. Brain Pathol, 1997, 7 (3): Jenkins EC, Brown 飞 可 T, Brooks J, et a1. Experience with prenatal fragile X detection. Am J Med Genet 1984, 17: Durr A, Brice A. Genetics of movement disorders. Curr Opin Neurol, 1996, 9: Ramos FJ, Emanuel BS, Spinner NB. Frequency of the common fragile site at Xq27. 2 under conditions of thymidylate stress: implications for cytogenetic diagnosis of the fragile - X syndrome. Am J Med Genet, 1992, 42: Rousseau F, Heitz D, Mandel JL. The unstable and methylatable mutations causing the fragile X syndrome. Hum Mutat 1992, 1: Richards RI, Holman K, Kozman H, et a1. Fragile Xsyndrome: genetic localisation by link age mapping of two microsatellite repeats FRAXAC1 and FRAXAC2 which immediately flank the fragile site. J Med Genet 1991, 28: Kremer EJ, Pritchard M, Lynch M, et a!. Mapping of DNA instability at the fragile X to a trinucleotide repeat sequence p (CCG) n. Science, 1991, 252 : Hecimovic S, Barisic I, Muller A, et a!. Expand Long PCR for fragile X mutation detection ClinGenet, 1997, 52:

49 第 三 章 常 用 染 色 体 制 备 技 术 第 一 节 外 周 血 淋 巴 细 胞 培 养 及 染 色 体 制 备 这 里 的 外 周 血 淋 巴 细 胞 主 要 是 指 外 周 血 中 的 T 淋 巴 细 胞, 它 能 在 非 特 异 性 有 丝 分 裂 原 (mitogen) 作 用 下 转 化 为 淋 巴 母 细 胞, 继 而 进 行 有 丝 分 裂 外 周 血 细 胞 的 培 养 万 法 通 常 有 两 种, 一 种 是 从 全 血 中 分 离 出 淋 巴 细 胞 培 养, 此 法 操 作 繁 琐, 不 易 被 普 遍 接 受 另 一 种 万 法 是 微 量 全 血 培 养 法, 此 法 所 需 血 量 少, 操 作 简 单, 设 备 要 求 低, 己 被 广 泛 采 用 现 就 微 量 全 血 培 养 法 进 行 介 绍 一 培 养 基 的 准 备 培 养 基 可 以 自 制 或 采 用 商 品 试 剂 盒, 现 介 绍 试 剂 盒 万 法 将 试 剂 盒 打 开, 取 出 培 养 基 及 配 套 的 溶 解 剂 瓶 在 培 养 基 及 溶 解 剂 瓶 铝 帽 上 开 一 小 孔, 依 次 用 腆 国 I 及 酒 精 进 行 常 规 消 毒, 在 酒 精 灯 焰 旁 用 无 菌 注 射 器 抽 取 溶 解 剂 5.0 ml, 注 入 培 养 基 瓶 内, 同 时 自 然 排 出 5 ml 气 体, 振 摇 使 培 养 基 完 全 溶 解 二 采 血 接 种 常 规 抽 取 静 脉 血.5 ml, 立 即 注 入 到 培 养 基 瓶 内, 泪 匀, 置 37 'c 孵 箱 中 培 养 三 培 养 培 养 72 h, 并 每 天 将 培 养 瓶 振 摇 1 次 ~2 次, 在 终 止 培 养 前 2 h~4 h, 每 小 瓶 培 养 物 中 加 入 试 剂 盒 中 的 秋 水 仙 素 溶 液 (10 mg/l) 0.1 ml~o. 2 r 址, 泪 匀, 继 续 培 养 到 收 获 四 收 获 (-) 离 l 山 将 培 养 物 转 入 刻 度 离 心 管 内, 以 r/ mi 日 离 心 10 mi 日, 弃 上 清 液, 留 下 沉 淀 物 ( 二 ) 低 渗 在 每 离 心 管 中 加 入 预 温 到 37 'c 的 低 渗 液 (0.075 mol/l KCI) 8 ml, 用 吸 管 轻 轻 吹 打 泪 匀 细 胞, 置 入 37 'c 水 浴 箱 中 低 渗 30 r 丑 1 日 ( 三 ) 预 固 定 低 渗 时 间 到 了 以 后, 在 每 离 心 管 中 加 入 固 定 液 [ <j; ( 甲 醇 : 冰 乙 酸 ) 二 3 : 1, 宜 新 鲜 配 制 ] 1 ml ~2 ml ~ 昆 匀 r/ mi 日 离 心 10 mi 日, 弃 上 清 液, 保 留 沉 淀 细 胞. 45.

50 ( 四 ) 第 1 次 固 定 每 离 心 管 中 加 入 新 鲜 固 定 液 8 ml, 并 将 细 胞 充 分 泪 匀, 在 室 温 中 固 定 30 min~ 40 mino r/ min 离 心 10 mi 日, 弃 上 清 液 ( 五 ) 第 2 次 固 定 每 离 心 管 中 加 入 新 鲜 固 定 液 8 r 址, 轻 轻 泪 匀, 置 室 温 20 min~30 mi 日, r/ mt 日 离 心 10 min o 弃 上 清 液, 留 沉 淀 物, 再 加 入 少 许 固 定 液 ( 通 常 加 到 O. 2 ml~o. 5 ml 刻 度 ), 轻 轻 吹 打 泪 匀 ( 六 ) 滴 片 用 气 干 法 滴 片, 即 用 吸 管 吸 取 细 胞 悬 液, 滴 2 滴 ~3 滴 于 事 先 用 冰 水 浸 泡 的 洁 净 载 玻 片 上, 用 口 吹 散 并 在 酒 精 灯 火 焰 上 通 过 3 次 ~5 次, 编 号, 放 入 37 'c 孵 箱 中 或 56 'c 烤 箱 中 烘 片 (t) 显 带 染 色 体 显 带 万 法 较 多, 主 要 有 G, C, Q Ejj(; T 显 带 技 术 如 果 该 标 本 片 用 作 FISH 等, 不 须 显 带, 若 用 作 核 型 分 析, 则 必 须 显 带 现 着 重 介 绍 G 显 带 和 C 显 带 万 法 1. G 显 带 万 法 (1) 将 染 色 体 玻 片 置 56 'c 烤 箱 过 夜 或 37 'c 孵 箱 老 化 2 d~3 do (2) 将 10 mg] 夷 蛋 白 酶 加 到 50 ml 0.85% NaCI 溶 液 或 D - Hank' s 液 中, 配 成 0.02% 的 膜 蛋 白 酶 溶 液 用 5.0%NaHC03 调 ph 值 到 6. 8~7. 0 (3) 将 膜 酶 溶 液 和 2 杯 ( 缸 ) 生 理 盐 水 同 时 放 37 'c 水 浴 箱 中 (4) 将 染 色 体 玻 片 置 入 膜 蛋 白 酶 消 化 液 中,4 s~6 s 后, 立 即 取 出, 并 依 次 在 2 杯 ( 缸 ) 生 理 盐 水 中 荡 洗 几 次, 以 去 除 剩 余 的 膜 酶 消 化 液 (5) 将 消 化 好 的 染 色 体 玻 片 置 入 10%Giemsa 染 色 液 中 染 色 5 mi 日 ~10 mino (6) 取 出 后 用 自 来 水 冲 洗, 持 干 后 镜 检 标 本 的 质 量 直 接 影 响 着 显 带, 分 裂 相 的 多 少 除 了 与 液 体 培 养 基 质 量 有 关 外, 还 与 在 整 个 制 片 过 程 中 的 染 色 体 的 去 夫 有 关 染 色 体 分 散 的 好 坏 与 低 渗 及 滴 片 有 关 染 色 体 的 着 色 情 况 及 带 纹 的 清 晰 程 度 与 Giemsa 染 液 的 质 量 和 浓 度 有 关 显 带 的 好 坏 与 膜 酶 的 效 价 浓 度, 消 化 时 间 和 ph 值 有 关 同 时, 染 色 体 玻 片 未 完 全 烤 干 也 会 影 响 显 带 的 效 果 2. C 显 带 万 法 (1) 将 染 色 体 玻 片 置 入 0.2 mal/ L 的 HCI 中, 1 h 后 取 出, 用 蒸 情 水 冲 洗 (2) 然 后 将 玻 片 浸 入 预 热 到 50 'c 5% 的 Ba(OH)2 溶 液 中 2 mi 日 ~3 min, 取 出 后 用 茶 馆 水 冲 洗 次 (3) 再 将 玻 片 浸 入 预 热 到 60 'c 的 2 X SSC 溶 液 中 1. 5 h, 取 出 后 用 蒸 馆 水 冲 洗 3 (4) 用 5%Gimsa 染 液 染 色 10 min~15 mi 日, 用 自 来 水 冲 洗, 待 干 后 镜 检 五 微 细 胞 遗 传 学 技 术 做 细 胞 遗 传 学 是 运 用 高 分 辨 染 色 体 显 带 技 术, 研 究 染 色 体 细 微 结 构 及 结 构 改 变 后 的 遗 传 效 应 的 学 科 高 分 辨 染 色 体 显 带 技 术 是 在 细 胞 有 丝 分 裂 早 中 期 或 晚 前 期 制 备 染 色 体 46

51 标 本, 可 以 显 示 出 550 条 以 上 的 清 晰 细 微 的 带 纹, 可 以 发 现 常 规 染 色 体 G 显 带 不 能 发 现 的 染 色 体 的 细 微 异 常 高 分 辨 染 色 体 制 备 技 术 万 法 颇 多, 1 旦 大 都 较 为 繁 琐 现 介 绍 我 们 长 期 使 用 的 简 单 万 法 : 按 前 面 的 万 法 进 行 外 周 血 淋 巴 细 胞 接 种 培 养, 37'C 培 养 67 h~70 h 后 加 入 澳 乙 链, 使 终 质 量 浓 度 为 5 mg/l, 在 收 获 前 30 min 加 入 秋 水 仙 素 ( 终 质 量 浓 度 为 0.5 mg/l), 最 后 按 常 规 万 法 收 获 制 片 显 带, 可 获 得 550 条 ~850 条 带 的 高 分 辨 染 色 体 标 本 进 行 染 色 体 分 析 第 二 节 羊 水 细 胞 培 养 及 染 色 体 制 备 20 世 纪 60 年 代, 随 着 组 织 培 养 技 术 的 发 展, 羊 水 细 胞 培 养 在 世 界 上 首 次 获 得 成 功, 给 遗 传 性 疾 病 的 产 前 诊 断 开 辟 了 一 个 新 的 领 域 1977 年, 我 国 第 一 次 报 道 了 羊 水 细 胞 培 养 法, 此 后 又 陆 续 报 道 了 一 些 羊 水 细 胞 培 养 及 染 色 体 制 备 技 术 近 十 余 年 来, 我 国 的 计 划 生 育 政 策 作 为 基 本 国 策 提 上 日 程 优 生 优 育 问 题 受 到 高 度 重 视, 用 于 产 前 诊 断 的 羊 水 细 胞 培 养 亦 显 得 更 加 重 要 了 羊 水 细 胞 主 要 源 于 胎 儿 皮 肤 消 化 道 尿 道 呼 吸 道 等 脱 落 细 胞 这 些 细 胞 大 部 分 是 衰 老 和 固 缩 的, 所 以 羊 水 细 胞 培 养 技 术 较 其 他 组 织 培 养 更 为 困 难 尽 管 世 界 各 地 在 羊 水 细 胞 培 养 及 染 色 体 制 备 万 法 上 己 有 不 断 改 进, 但 由 于 羊 水 细 胞 培 养 的 成 功 率 不 高, 甚 至 很 多 单 位 尤 其 是 设 备 技 术 落 后 的 基 层 单 位 无 法 开 展 该 项 目 的 检 查 作 者 针 对 这 些 问 题, 在 四 川 省 计 生 委 的 支 持 下, 研 制 出 了 配 套 的 质 量 稳 定 的 羊 水 细 胞 培 养 试 剂 盒, 解 决 了 这 一 难 题 一 羊 膜 腔 穿 刺 的 时 间 许 多 资 料 介 绍 羊 膜 腔 穿 剌 最 理 想 的 时 间 是 孕 16 周 ~20 周, 作 者 认 为 孕 16 周 ~ 24 周 均 可 此 期, 胎 儿 己 较 大, 一 般 可 确 定 出 胎 儿 的 大 致 位 置, 羊 水 量 也 较 多, 一 般 都 在 250 ml 以 上, 抽 取 20 ml 左 右 的 羊 水, 对 胎 儿 和 母 体 均 不 会 有 影 响 此 时 羊 水 代 谢 活 跃, 增 长 快, 被 抽 出 的 羊 水 可 很 快 得 到 补 充, 这 样 对 胎 儿 的 外 环 境 不 会 造 成 大 的 变 化 二 羊 水 的 抽 取 在 B 型 超 声 仪 监 视 下, 事 先 确 定 胎 盘 和 胎 头 位 置, 然 后 穿 刺 抽 取 羊 水 ml, 注 入 无 菌 带 盖 的 离 心 管 内, 供 羊 水 细 胞 培 养 用 ml~ 三 羊 水 细 胞 培 养 及 染 色 体 制 备 ( 一 ) 培 养 基 的 准 备 打 开 羊 水 细 胞 培 养 试 剂 盒, 取 出 培 养 基 及 配 套 的 溶 解 剂, 在 培 养 基 及 溶 解 剂 瓶 铝 盖 上 打 一 小 孔, 依 次 用 腆 国 I 和 酒 精 常 规 消 毒, 用 无 菌 注 射 器 准 确 抽 取 溶 解 剂 5.0 ml, 注 入 培 养 基 瓶 内, 振 摇 待 培 养 基 溶 解 后, 抽 取 2 ml~3 ml 转 入 万 形 培 养 瓶 内, 剩 余 液 体 培 养 基 置 4 'c 冰 箱 保 存, 持 换 液 时 使 用 47

52 ( 二 ) 接 种 培 养 将 抽 取 的 羊 水 15 ml ~20 ml 贮 入 无 菌 离 心 管 中, 以 r/min 离 心 10 mi 日, 吸 除 上 清 液 留 沉 淀 1. 0 ml, 用 吸 管 轻 轻 吹 成 悬 浮 液, 转 入 培 养 瓶 中, 塞 紧 瓶 口, 置 37 温 箱 中 静 置 培 养 'c 恒 ( 三 ) 换 液 培 养 至 5 d~7 d 时, 观 察 细 胞 的 贴 壁 生 长 情 况, 此 时 可 见 大 量 的 羊 水 细 胞 贴 壁 生 长 倒 去 培 养 瓶 中 的 旧 液 体 培 养 基, 加 入 接 种 时 剩 余 的 液 体 培 养 基 ( 从 冰 箱 中 取 出 后 应 恢 复 到 室 温 ) 2 ml, 置 孵 箱 中 继 续 培 养 ( 四 ) 收 获 换 液 后, 每 天 观 察 细 胞 生 长 情 况, 在 10 x 10 倍 显 微 镜 下 看 见 有 较 大 的 细 胞 " 克 隆 " ( 通 常 覆 盖 整 个 视 野 ), 并 有 10 个 及 以 上 球 形 发 亮 的 分 裂 相 细 胞, 即 可 收 获 制 片 在 终 止 培 养 前 3h~6h 加 10 mg/l 秋 水 仙 素 溶 液 适 量 ( 一 般 5 号 针 头 2 滴 ~4 滴 ) ( 五 ) 制 片 1. 将 培 养 瓶 中 的 液 体 培 养 基 倒 去, 加 乙 二 肢 四 乙 酸 (EDTA) 膜 酶 消 化 液 2 ml, 置 37 'c 恒 温 箱 中 5 min, 滴 管 吹 打 3 次 ~4 次, 使 贴 壁 细 胞 全 部 洗 下 来, 然 后 把 消 化 液 吸 到 刻 度 离 心 管 中, 再 用.85% 生 理 盐 水 2 ml 冲 洗 培 养 瓶 内 残 留 细 胞 后 亦 倒 入 刻 度 离 心 管 中 或 者 不 倒 去 液 体 培 养 基, 直 接 用 刮 削 器 轻 轻 刮 下 所 有 贴 壁 细 胞, 然 后 用 弯 头 吸 管 冲 洗 瓶 壁, 以 便 洗 下 所 有 贴 壁 细 胞, 将 细 胞 悬 液 吸 至 离 心 管 中 2. 离 心 800 r/min ~ r/ min 离 心 8~10 mi 日, 弃 上 清 液, 留 细 胞 沉 淀.1 ml ~o. 2 ml a 3. 低 渗 先 加 预 温 到 37 'c 的 低 渗 液 [<j; (0.4% 拧 棱 酸 铀 :0.4%KCI 液 ) 二 1 : 1] 4 滴, 用 吸 管 轻 轻 冲 吸 2 次 ~3 次 或 吹 气 ; 包 冲 匀, 然 后 再 加 低 渗 液 至 1 ml, 1 昆 匀, 37'C 低 渗 5 r 丑 1 日 最 后 加 固 定 液 [<j; ( 甲 醇 : 冰 乙 酸 ) 二 3 : 1] 7 滴, 轻 轻 用 气 泡 冲 匀, 800 r/mi 日 ~ r/ mi 日 离 心 8 r 丑 1 日 ~10 mi 日, 弃 上 清 液, 留 沉 淀. 1 ml~o. 2 ml a 4. 第 1 次 固 定 加 新 配 固 定 液 2 滴 ~3 滴, 用 手 指 轻 轻 击 离 心 管 底 部, 使 细 胞 泪 匀, 再 加 固 定 液 4 ml, 轻 轻 以 气 泡 吹 匀, 固 定 40 min a 800 r/ mi 日 ~ r/ min 离 心 8 mi 日 ~10 mi 日, 弃 上 清 液, 留 沉 淀. 1 ml~o. 2 ml a 5. 第 2 次 固 定 万 法 同 第 1 次 固 定, 固 定 液 改 为 2 r 址, 固 定 时 间 为 20 min a 6. 1 商 片 离 心, 弃 上 清 液, 加 新 鲜 固 定 液 2 滴 ~3 滴, 用 手 指 轻 击 离 心 管 底 部, 便 成 细 胞 悬 浮 液 后, 用 气 干 法 滴 片 2 张 ~3 张 将 玻 片 置 56 'c 烤 箱 烘 烤 24 h, 即 可 显 带 7. 显 带 显 带 万 法 和 外 周 血 染 色 体 标 本 基 本 相 同, 所 不 同 的 是 用 膜 酶 消 化 染 色 体 的 时 间 较 外 周 血 稍 长, 一 般 来 讲, 羊 水 染 色 体 用.02% 膜 酶 溶 液 需 泊 ' 化 10 s~30 Sa 四 羊 水 细 胞 培 养 中 存 在 的 问 题 (-) 污 染 羊 水 细 胞 培 养 时 间 较 长, 在 整 个 操 作 过 程 中 稍 有 疏 忽 就 可 能 被 细 菌 病 毒 支 原 体 污 染 因 此, 器 皿 灭 菌 后, 从 抽 取 羊 水 接 种 培 养 换 液, 直 到 最 后 收 获 前 都 应 严 格 执 行 无 菌 操 作, 严 防 污 染 48

53 ( 二 ) 细 胞 不 贴 壁 生 长 造 成 羊 水 细 胞 不 贴 壁 生 长 的 原 因 很 多, 作 者 认 为, 培 养 瓶 清 洗 不 沽, 瓶 壁 残 留 有 污 垢, 是 羊 水 细 胞 不 贴 壁 生 长 的 常 见 原 因 还 有 支 原 体 污 染, 也 是 造 成 不 贴 壁 生 长 的 重 要 原 因 再 有 培 养 基 ph 值 不 当, 低 于 6.4 或 高 于 7. 斗, 细 胞 都 不 会 生 长 羊 水 中 细 胞 太 少 或 活 细 胞 太 少, 也 不 易 生 长 ( 三 ) 由 体 细 胞 污 染 羊 水 穿 刺 过 程 中, 母 体 细 胞 污 染 机 会 是 存 在 的 若 造 成 了 母 体 细 胞 污 染, 后 果 相 当 严 重 因 此, 最 好 在 每 次 穿 刺 时, 把 最 先 抽 得 的 1 ml~2 ml 羊 水 弃 掉, 以 减 少 母 体 细 胞 的 污 染 有 条 件 的 单 位, 可 用 染 色 体 多 态 现 象 的 测 试 以 排 除 母 体 细 胞 的 污 染, 或 者 用 羊 水 细 胞 和 母 体 细 胞 的 HLA 定 型 鉴 别 五 羊 膜 腔 穿 刺 的 适 应 证 和 禁 忌 证 (-) 适 应 iie 1. 孕 妇 年 龄 超 过 35 岁 以 上 者 2. 己 生 过 21 三 体 患 儿 及 有 相 应 家 族 史 者 3. 有 染 色 体 异 常 家 族 史 或 父 母 一 万 有 染 色 体 异 常 者 4. 疑 有 性 连 锁 遗 传 病 者 5. 己 生 过 开 放 性 神 经 营 缺 陷 儿 者 6. 有 畸 形 儿 痴 呆 儿 家 族 史 及 近 亲 结 婚 者 7. 羊 水 过 多 与 有 习 惯 性 流 产 史 者 8. 饪 撮 3 个 月 内 曾 有 病 毒 感 染 E\l(; 长 期 大 量 服 用 不 适 当 的 药 物 或 接 触 X 线 和 毒 性 物 品 者 ( 二 ) 禁 忌 证 孕 周 小 于 14 周, 穿 刺 的 成 功 率 较 低, 大 于 26 周, 羊 水 培 养 的 成 功 率 也 较 低, 故 不 宜 作 此 手 术 此 外, 在 先 兆 流 产 习 惯 性 流 产 的 危 险 期 不 适 于 作 羊 水 穿 刺, 否 则 将 增 加 流 产 率, 故 应 尽 量 避 免 第 二 节 绒 毛 细 胞 的 染 色 体 制 备 近 年 来, 用 绒 毛 为 材 料 进 行 早 期 产 前 诊 断, 由 于 其 操 作 技 术 简 易 快 速 准 确 对 孕 妇 损 伤 小, 己 成 为 优 生 学 和 预 防 医 学 的 一 个 新 万 向 绒 毛 滋 养 层 细 胞 是 受 精 卵 有 丝 分 裂 的 衍 生 物, 可 准 确 反 应 胎 儿 的 遗 传 特 性 娃 撮 早 期 的 绒 毛 细 胞 有 较 高 的 有 丝 分 裂 活 性, 可 以 作 为 早 期 检 出 胎 儿 染 色 体 异 常 的 材 料 所 以, 利 用 绒 毛 进 行 染 色 体 病 的 产 前 诊 断, 是 当 前 的 重 要 万 法 之 一 一 绒 毛 的 取 材 选 择 孕 6 周 ~1O 周 产 前 诊 断 适 应 证 的 孕 妇 查 明 于 宫 位 置 大 小 和 胚 胎 着 床 的 可 能 部 位, 在 B 超 指 示 下 吸 取 或 盲 吸 用 长 210 mm, 直 径 1. 5 mm~2 mm 的 硅 胶 管, 在. 49.

54 卵 圆 钳 的 帮 助 下, 由 宫 颈 口 进 入 宫 腔, 以 5 ml~10 ml 的 空 针 负 压 吸 取 胚 胎 着 床 部 位 附 近 的 叶 状 绒 毛 ( 以 上 操 作 均 需 无 菌 操 作 ) 取 样 后, 标 本 立 即 放 入 含 2 种 抗 生 素 的 RP M11640 或 Ha 此 '81 容 液 中, 漂 洗 2 次 ~3 次, {; 共 绒 毛 直 接 制 备 染 色 体 标 本 或 绒 毛 细 胞 培 养 用 二 绒 毛 的 识 别 用 前 首 先 确 认 为 绒 毛 组 织, 并 取 绒 毛 组 织 置 载 玻 片 上, 在 显 微 镜 下 辨 认 绒 毛 组 织 的 特 点 如 下 :1 绒 毛 组 织 一 般 呈 鹿 茸 状 分 支 2 绒 毛 支 的 周 围 一 般 由 合 体 细 胞 和 微 绒 毛 支 组 成 的 平 滑 无 色 的 透 明 带 3 一 般 绒 毛 组 织 中 央 可 见 到 褐 色 的 极 细 的 毛 细 血 管 如 果 镜 下 辨 认 非 绒 毛 组 织 特 征, 似 蜕 膜 组 织, 需 重 新 取 材 三 绒 毛 细 胞 的 染 色 体 制 备 绒 毛 细 胞 染 色 体 制 备 的 万 法 主 要 有 直 接 制 备 法 和 培 养 法 两 大 类 而 不 同 实 验 室 所 采 用 的 无 论 是 直 接 法 还 是 培 养 法 又 不 完 全 相 同 现 介 绍 几 种 常 用 的 万 法 ( 一 ) 绒 毛 细 胞 直 接 制 备 染 色 体 的 万 法 1. 哈 尔 滨 医 科 大 学 遗 传 研 究 室 万 法 (1) 将 所 吸 取 的 绒 毛, 用 D- Hank's 溶 液 或 生 理 盐 水 反 复 冲 洗, 去 除 血 污 (2) 置 入 含 有 5 ml 无 血 清 的 RPM11640 液 体 培 养 基 的 离 心 管 中, 力 口 秋 水 仙 素 ( 终 质 量 浓 度 为 1 mg/l), 1 昆 匀 后 置 37 'c 水 浴 箱 中 温 育 18 min ~ 20 min o (3) 吸 出 液 体 培 养 基, 加 入 0.4%KCI 和 0.4% 拧 棱 酸 铀 等 体 积 混 合 的 低 渗 液 8 ml, 37 'c 低 渗 10 min ~ 12 min o (4) 加 入 2 ml 新 配 固 定 液 [ <j; ( 甲 醇 冰 乙 酸 ) 二 3 : 1], 室 温 下 预 固 定 3 mi 日 (5) 吸 尽 所 有 液 体, 立 即 加 入 70% 乙 酸 1 ml, 静 置 解 离 细 胞 1 r 丑 1 日 ~2 mi 日 后, 立 即 加 入 2 ml 甲 醇, 泪 匀 然 后 继 续 缓 慢 加 入 固 定 液 5 r 址, 重 复 固 定 30 min o (6) 离 心 (1200 r/min) 8 mi 日, 去 上 清 液 再 加 入 5ml 固 定 液, 重 复 固 定 30 min o (7) 用 吸 管 轻 轻 吹 吸 细 胞 悬 浮 液 后, 挑 去 绒 毛 支 架, 离 心, 去 上 清 液 (8) 加 入 数 滴 固 定 液, 用 吸 管 轻 吹 气 j 包 使 细 胞 呈 悬 浮 液 后, 用 冰 湿 片 滴 片, 将 玻 片 标 本 置 37 'c 48 h 老 化 (9) G 显 带 用 D- Hanl 王 s 液 配 制 的 % 膜 酶 工 作 液 (10 ml 0.25% 膜 酶 原 液 + 40 ml D - Hanl 王 s 液, ph 6.2), 37'C 预 温 后, 将 玻 片 标 本 置 入 处 理 4 mi 日 ~6 日 uno (1 0) 在 37 'c 生 理 盐 水 中 轻 轻 漂 洗 后, Giemsa 染 液 染 色 8 mi 日, 用 自 来 水 冲 洗, 待 干 后 镜 检 2. 河 北 省 医 院 朱 俊 真 万 法 取 绒 毛 10 mg 左 右, 直 接 放 入 预 温 37 'c 低 渗 液 (1% 拧 棱 酸 铀 内 含 秋 水 仙 素. 1 mg/l~o. 4 mg/l) 5 ml, ~ 昆 匀, 低 渗 30 r 丑 1 日 预 固 定 加 甲 醇 : 冰 乙 酸 ( 功 二 3 : 1) 1 ml, 泪 匀 5 min o 更 换 新 鲜 固 定 液 置 室 温 固 定 30 mi 日 然 后 弃 去 固 定 液, 顺 管 壁 加 入 60% 冰 乙 酸 1 ml, 1 mi 日 ~2 mi 日, 由 管 底 部 缓 缓 加 入 甲 醇 3 ml, 然 后 轻 轻 泪 匀, 10 min ( 在 固 定 5 min 时 用 滴 管 把 绒 毛 挑 出 ) 然 后 离 心 5 min 去 上 50

55 i 青 液 再 加 入 新 鲜 固 定 液 2 滴 ~3 滴, 轻 轻 泪 匀, 以 冰 片 进 行 滴 片, 立 即 放 入 60 'c 烤 箱 16 h~24 h 或 37 'c 放 置 72h 自 然 冷 却 后 即 可 显 带 ( 二 ) 绒 毛 细 胞 培 养 及 染 色 体 制 备 万 法 1. 悬 浮 培 养 法 (1) 培 养 基 的 准 备 : 在 培 养 基 及 配 套 的 溶 解 剂 瓶 铝 帽 上 打 一 小 孔, 常 规 消 毒, 用 无 菌 注 射 器 抽 取 溶 解 剂 6.0 ml 注 入 培 养 基 瓶 内, 振 摇 使 其 完 全 溶 解, 备 用 (2) 培 养 万 法 : 取 绒 毛 约 10 mg, 用 含 有 2 种 抗 生 素 的 无 菌 D - Hank' s 液 (ph 7. 2~7. 斗, 青 霉 素 和 链 霉 素 各 100 u/ml) 反 复 冲 洗, 去 除 血 污, 吸 去 D - Hank' s 液 经 低 倍 显 微 镜 下 鉴 定 为 绒 毛 后, 用 ~ 科 手 术 小 剪 剪 成 小 支 或 小 块, 放 入 25 ml 组 织 培 养 瓶 内, 加 入 上 述 己 溶 解 好 的 液 体 培 养 基 3.0 ml ( 余 下 的 3.0 ml 液 体 培 养 基 置 4 'c 冰 箱 内 保 存, 持 换 液 时 使 用 ) 盖 上 瓶 帽 ( 塞 ), 置 37 'c 下 培 养 3d~10d ( 在 培 养 5 d 左 右 换 液 1 次, 培 养 的 具 体 时 间 由 用 户 根 据 各 实 验 室 的 情 况 及 绒 毛 标 本 的 数 量 和 质 量 而 定 据 作 者 的 体 会, 一 般 培 养 3 d~6 d 可 获 得 足 够 而 良 好 的 分 裂 相 细 胞 供 分 析 ) 在 收 获 前 2 h 加 入 10 mg/l 秋 水 仙 素 溶 液.1 ml 继 续 培 养 到 收 获 (3) 收 获 制 片 : 将 绒 毛 培 养 物 吸 入 离 心 管 中, 弃 去 液 体 培 养 基, 加 入 低 渗 液 [ψ (0.4% 拧 棱 酸 铀 : 0.4% KCI 液 ) 二 1 : 1] 8. 0 ml, 1 昆 匀, 37'C 1 民 渗 10 mi 日 ~15 mi 日, 去 低 渗 液, 加 入 新 鲜 固 定 液 [<j; ( 甲 醇 : 冰 乙 酸 ) 二 3 : 1] 5.0 ml, 固 定 10 mi 日, 如 此 重 复 3 次 去 固 定 液, 用 40 % 冰 乙 酸.5 ml, 37'C 处 理 约 1 mi 日, 见 绒 毛 支 周 围 出 现 明 显 乳 白 色 浑 浊 时, 缓 慢 加 入 固 定 液 [ <j; ( 甲 醇 冰 乙 酸 ) 二 5 : 1] 2.0 ml, 轻 轻 泪 匀, 离 心 (l 000 r/ min 月 mt 日, 弃 上 清 液, 加 新 鲜 固 定 液 [<j; ( 甲 醇 : 冰 乙 酸 ) 二 3 : 1] 3 滴 ~4 滴, 轻 轻 泪 匀, 用 气 干 法 滴 片, 56'C 烘 烤 24 h, 自 然 冷 却 后 即 可 G 显 带 2. 贴 壁 培 养 (1) 培 养 基 的 准 备 : 同 悬 浮 培 养 (2) 培 养 万 法 : 取 绒 毛 适 量, 用 含 有 2 种 抗 生 素 的 无 菌 D- Hank' s 液 (ph 7. 2~ 7. 斗, 青 霉 素 和 链 霉 素 各 100 L 山 nl) 反 复 冲 洗, 去 除 血 污, 吸 D- Hanl 王 s 液, 在 低 倍 显 微 镜 下 确 认 为 绒 毛 后, 用 无 菌 镇 将 绒 毛 夹 入 10 ml 无 菌 离 心 管 中, 用 小 剪 剪 碎, 加 入 O. 25 % 膜 酶 ( 己 除 菌, 试 剂 盒 中 配 备 有 1 支 ) 2 ml ~ 3 r 址, 用 吸 管 吹 打, 置 37 'c 水 浴 中 孵 育 5 mi 日, 以 3000 r/ mi 日 离 心 5 mi 日, 弃 上 清 液 ( 尽 量 将 上 清 液 吸 干 ), 留 沉 淀 加 入 上 述 准 备 好 的 液 体 培 养 基 1 ml, 反 复 吹 打, 使 细 胞 尽 可 能 分 散, 将 细 胞 悬 浮 液 吸 入 25 ml 万 形 培 养 瓶 中, 再 补 加 3.0 ml 液 体 培 养 基 ( 余 下 的 2 ml 液 体 培 养 基 置 4 'c 冰 箱 中 保 存, 待 换 液 时 使 用 ), 置 37 'c 培 养 通 常 24 h 可 见 大 量 细 胞 和 组 织 块 贴 壁, 4 d 以 后 就 可 以 选 择 时 机 收 获 制 片 ( 如 果 培 养 时 间 超 过 5 d, 中 间 可 换 液 1 次 ) (3) 收 获 及 制 片 过 程 和 羊 水 细 胞 培 养 基 本 相 同 G 显 带 过 程 与 直 接 法 相 同 四 绒 毛 细 胞 染 色 体 制 备 应 注 意 的 问 题 绒 毛 标 本 直 接 制 备 染 色 体 最 突 出 的 问 题 是 细 胞 分 裂 相 少, 染 色 体 形 态 不 佳 如 染 色 体 分 叉 和 弯 曲 等 培 养 法 可 基 本 解 决 这 些 问 题 但 操 作 繁 琐 还 可 能 会 出 现 母 体 蜕 膜 细 胞 的 污 染 所 以, 绒 毛 的 选 择 和 识 别 非 常 重 要 { 旦 根 据 作 者 的 实 践 和 邓 汉 相 等 人 的 报 51

56 道, 绒 毛 细 胞 的 悬 浮 培 养 可 避 免 母 体 细 胞 的 污 染 因 此, 作 者 建 议, 在 条 件 允 许 的 情 况 下, 可 推 广 普 及 悬 浮 培 养 法 第 四 节 胸 腹 水 骨 髓 细 胞 的 染 色 体 制 备 胸 腹 水 及 骨 髓 细 胞 的 染 色 体 检 查 是 鉴 别 诊 断 恶 性 肿 瘤 的 一 种 有 效 万 法 这 些 检 材 中 的 染 色 体 数 目 和 结 构 异 常 可 作 为 恶 性 肿 瘤 的 标 志 胸 腹 水 及 骨 髓 细 胞 的 染 色 体 检 查 万 法 较 多, 但 仍 然 可 分 为 直 接 法 和 培 养 法 两 大 类 一 胸 腹 水 细 胞 的 染 色 体 制 备 (-) 直 接 法 制 备 胸 腹 71< 染 色 体 1. 取 新 鲜 胸 腹 水 20 ml~40 ml 置 于 无 菌 尖 嘴 离 心 管 中, 离 心 (l 000 r/min) 10 mt 日, 弃 上 清 液, 留 沉 淀. 3 ml~o. 5 ml, 然 后 轻 击 管 底 使 细 胞 团 松 开 2. 加 入 37 'c 预 温 的 液 体 培 养 基 (TC199 或 RPM11640) 或 D- Hank's 液 10 时, 泪 匀 3. 加 10 mg/l 秋 水 仙 素 溶 液. 1 r 址, 37'C 孵 育 1 h~ 5 h o ( 也 可 在 抽 取 的 新 鲜 胸 腹 水 中 直 接 加 入 秋 水 仙 素. 1 r 址, 然 后 37 'c 孵 育 1 h~5 h o ) 4. 离 心 (1 000 r/ mi 日 ) 10 mi 日, 弃 上 i 青 液, 加 入 37 'c 预 温 的 O. 075 mal/l KCI 低 渗 液, 于 37 'c 下 低 渗 5 mi 日 ~1O min 然 后 加 入 固 定 液 [ <j; ( 甲 醇 : 冰 乙 酸 ) 二 3 : 1] 1 1 址, 轻 轻 泪 匀 5. 离 心 (1 000 r/ mi 日 ) 5 r 丑 1 日 ~10 mi 日, 弃 上 清 液 6. 固 定 (2 次 ) 滴 片 染 色 等 与 外 周 血 染 色 体 制 备 完 全 相 同 ( 二 ) 培 养 活 1. 培 养 基 准 备 在 培 养 基 及 溶 解 剂 瓶 铝 帽 上 打 一 小 孔, 常 规 消 毒, 用 无 菌 注 射 器 抽 取 海 解 剂 5 ml 注 入 培 养 基 瓶 内, 同 时 排 出 5 ml 气 体, 振 摇 使 培 养 基 溶 解 2. 接 种 培 养 抽 新 鲜 胸 腹 水 10 ml~20 ml 置 于 无 菌 尖 底 离 心 管 中, 离 心 (1 000 r/min) 8 r 丑 1 日 ~1O mi 日, 弃 上 清 液, 留 沉 淀. 5 ml~ l. 0 m!, 用 吸 管 轻 轻 吹 成 悬 浮 液, 然 后 用 无 菌 注 射 器 将 此 悬 浮 液 注 入 上 述 培 养 基 瓶 中, 泪 匀 后 立 即 置 37 'c 孵 箱 培 养 24 h~72 h 在 终 止 培 养 前 2h 加 入 10 mg/l 秋 水 仙 素 溶 液.1 ml, 1 昆 匀, 继 续 培 养 到 收 获 0 3. 收 获 及 制 片 步 骤 和 外 周 血 基 本 相 同 二 骨 髓 细 胞 的 染 色 体 制 备 (-) Hazier 等 的 直 接 制 备 75 法 1. 用 肝 素 润 滑 后 的 注 射 器 从 瞎 骨 抽 取 骨 髓.2 ml ~ O. 5 ml, 立 即 注 入 10 ml 温 育 液 中 [<j; (0.075 mal/l KCI : 0.25% 膜 蛋 白 酶 EDTA 液 ) 二 9 : 1, 最 后 按 终 质 量 浓 度 为 0.08 mg/l 加 入 秋 水 仙 素 ], 泪 匀 后 置 37 'c 孵 育 20 mi 日 2. 离 心 (1 200 r/ mi 日 ) 5 mi 日 3. 用 固 定 液 [ <j; ( 甲 醇 : 冰 乙 酸 ) 二 3 : 1] 置 室 温 固 定 20 min o. 52.

57 4. 离 心 弃 上 j 青 液, 再 换 新 鲜 固 定 液 数 次, 每 次 5 min o 5. 气 干 法 滴 片, 用 微 火 力 口 温 以 助 分 散 6. 瑞 氏 染 液 染 色 1. 5 mi 日 ~4 mi 日, 不 预 先 消 化 处 理 瑞 氏 染 液 的 配 制 和 染 色 : 用 甲 醇 配 制 25 gil 瑞 氏 染 液, 配 制 0.06 ma l/ L 磷 酸 盐 缓 冲 液 (ph 6.8), 将 上 述 二 液 以 功 二 1 : 3 混 合 染 色 1. 5 min~4 mi 日 后 水 洗, 空 气 干 燥 ( 二 ) 骨 髓 细 胞 的 短 期 培 养 活 1. 培 养 基 的 准 备 同 Hazier 等 的 万 法 2. 接 种 培 养 从 瞎 骨 抽 取 骨 髓. 2 ml ~ O. 5 m!, 无 菌 操 作 注 入 上 述 培 养 基 瓶 中, 泪 匀 后 置 37 'c 下 培 养 23 h ~25 h, 在 终 止 培 养 前 4 h~6 h, 加 10 mg/l 秋 水 仙 素 溶 液. 05 ml~o. 1 m!, 1 昆 匀, 继 续 培 养 到 收 获 (3) 收 获 及 制 片 步 骤 和 外 周 血 基 本 相 同 ( 丁 显 平 ) 参 考 文 献 1 厉 光 坤, 王 应 雄, 丁 显 平 编 著. 实 用 人 类 染 色 体 技 术 与 临 床. 重 庆 : 西 南 师 范 大 学 出 版 社, 朱 俊 真 主 编. 产 前 实 验 室 诊 断. 石 家 庄 : 河 北 科 学 技 术 出 版 社, 刘 权 章 主 编. 人 类 染 色 体 方 法 学. 北 京 : 人 民 卫 生 出 版 社, 丁 显 平. 羊 水 细 胞 培 养 试 剂 盒 的 研 制 及 应 用 中 华 妇 产 科 杂 志, 1993, 28 (7): 丁 显 平. 绒 毛 细 胞 液 体 培 养 基 成 分 改 进 的 研 究 及 应 用. 中 华 医 学 遗 传 学 杂 志, 1996, 28 (2): 孟 平, 高 锦 生, 陈 忠. 优 生 优 育 实 验 诊 断 学. 北 京 : 中 国 人 口 出 版 社,

58 第 四 章 医 学 细 胞 遗 传 学 检 验 的 质 量 控 制 随 着 医 学 科 学 的 飞 速 发 展, 医 学 遗 传 学 检 验 在 临 床 诊 断 中 的 作 用 显 得 日 益 重 要 而 细 胞 遗 传 学 检 验 是 医 学 遗 传 学 检 验 的 基 础, 尤 其 是 在 细 胞 遗 传 学 基 础 上 发 展 起 来 的 细 胞 分 子 遗 传 学 技 术, 如 荧 光 原 位 杂 交 (fl uorescence in situ hybridizatio 日, FISH) 染 色 体 涂 抹 (chromosome painting, CP) 引 物 介 导 的 原 位 标 记 (primed in situ labelling, PRINS) 比 较 基 因 组 杂 交 (comparative genomic hybridizatio 日, CGH) 等 均 需 要 获 得 质 量 优 良 的 染 色 体 片, 故 而 必 须 加 强 细 胞 遗 传 学 检 验 的 质 量 控 制 细 胞 遗 传 学 工 作 的 特 点 是 研 究 对 象 为 活 的 细 胞, 子 工 操 作 较 多 环 节 多 时 间 长 易 受 多 种 因 素 影 响 而 导 致 结 果 错 误 要 避 免 检 验 结 果 出 现 错 误, 必 须 对 操 作 的 各 个 环 节 进 行 质 量 控 制 目 前, 国 内 尚 无 统 一 的 细 胞 遗 传 学 质 量 控 制 办 法 及 标 准, 建 立 一 套 行 之 有 效 的 关 于 细 胞 遗 传 学 检 验 的 质 量 控 制 万 法, 是 每 一 个 细 胞 遗 传 学 工 作 者 都 应 重 视 的 问 题 作 者 根 据 多 年 从 事 细 胞 遗 传 学 工 作 的 经 验, 结 合 并 借 鉴 其 他 医 学 检 验 的 质 量 控 制 万 法, 提 出 了 一 套 细 胞 遗 传 学 检 验 的 质 量 控 制 办 法, 供 大 家 参 考 大 家 都 知 道, 任 何 医 学 检 验 万 法 的 质 量 控 制 都 包 括 两 个 万 面, 即 室 内 质 控 和 室 问 质 控, 细 胞 遗 传 学 检 验 也 是 如 此 第 一 节 细 胞 遗 传 学 检 验 的 室 内 质 量 控 制 一 对 细 胞 遗 传 学 检 验 人 员 的 要 求 细 胞 遗 传 实 验 室 的 工 作 有 其 自 身 的 特 点, 在 细 胞 遗 传 实 验 室 工 作 的 技 术 人 员, 除 应 具 备 相 关 医 学 知 识 和 系 统 的 医 学 遗 传 学 基 础 理 论 知 识 外, 还 应 该 具 备 熟 练 的 操 作 技 能 高 度 的 责 任 心 和 严 谨 的 科 学 态 度 实 验 的 每 一 步 操 作 都 十 分 重 要, 稍 不 留 心 就 会 导 致 整 个 实 验 的 失 败 因 此, 每 个 实 验 工 作 人 员 都 应 严 格 要 求 自 己, 熟 练 掌 握 各 项 操 作 技 术, 准 确 地 按 事 先 制 定 的 操 作 规 程 进 行 实 验 操 作, 以 保 证 取 得 的 结 果 稳 定 可 靠 实 验 室 工 作 人 员 对 每 一 项 实 验 工 作 都 必 须 采 取 科 学 的 态 度, 要 尊 重 客 观 事 实, 对 观 察 到 的 现 象 和 获 得 的 实 验 结 果 要 进 行 详 细 记 录, 绝 不 允 许 凭 主 观 想 象 进 行 取 舍, 尤 其 是 在 显 做 镜 下 进 行 核 型 分 析, 更 应 如 此 随 着 科 学 技 术 的 发 展, 实 验 室 工 作 人 员 必 须 不 断 更 新 知 识, 努 力 学 习 新 理 论, 掌 握 新 技 术, 尤 其 是 以 细 胞 遗 传 学 为 基 础 而 又 与 人 类 基 因 组 研 究 相 关 的 新 技 术, FISH 如, CGH, SKY 等, 要 求 细 胞 遗 传 学 技 术 人 员 更 应 掌 握 学 习 新 知 识 新 技 术 的 万 式 有 多 种, 一 般 以 自 学 为 主, 或 者 由 主 治 医 师 以 上 职 称 的 专 业 技 术 人 员 定 期 讲 课, 也 可 派 出 去 学 习 进 修 等, 以 达 到 提 高 专 业 技 术 水 平 的 目 的. 54

59 建 立 标 准 化 的 操 作 方 法 卫 生 部 组 织 专 家 编 写 了 临 床 检 验 操 作 规 程 ), 要 求 全 国 各 级 医 疗 单 位 的 检 验 室 都 要 按 照 该 规 程 进 行 操 作, 但 里 面 并 未 涉 及 到 染 色 体 检 查 的 内 容 因 此, 细 胞 遗 传 实 验 室 应 该 根 据 本 室 的 具 体 情 况 制 定 规 范 的 操 作 规 程, 并 编 印 成 册, 供 本 室 工 作 人 员 使 用, 也 可 作 为 研 究 生 进 修 生 实 习 生 用 教 材 每 年 可 修 订 1 次, 对 不 合 理 的 内 容 进 行 取 舍, 并 不 断 增 加 一 些 新 知 识 新 技 术 三 制 定 仪 器 设 备 的 专 人 管 理 制 度 实 验 室 内 的 仪 器 设 备 应 实 行 专 人 管 理 并 定 期 监 测 如 对 二 氧 化 碳 孵 箱 应 定 期 测 定 CO 2 浓 度, 并 作 记 录, 每 天 记 录 其 温 度 的 变 化 恒 温 箱 干 燥 箱 水 浴 箱 等 应 每 天 在 上 班 和 下 班 时 分 别 记 录 其 温 度, 若 是 培 养 用 恒 温 箱, 要 求 温 度 变 化 应 控 制 在 土 0.5'C 内 冰 箱 冰 丰 巨 等 冷 冻 流 藏 设 备 也 应 定 期 观 察 并 记 录 温 度 变 化, 要 定 期 除 霜 并 做 好 清 洁 卫 生, 保 存 的 物 品 要 分 类 存 放, 便 于 使 用 高 压 灭 菌 器 要 严 格 按 照 操 作 规 程 进 行 使 用, 并 务 必 在 每 次 使 用 时 放 入 指 示 装 置 以 便 随 时 监 控 是 否 己 达 到 灭 菌 效 果 分 析 天 平 的 使 用 应 严 格 按 照 说 明 书 进 行, 尤 其 是 在 使 用 完 毕 时 务 必 清 扫 秤 盘, 以 免 药 品 对 秤 盘 金 属 的 腐 蚀 天 平 必 须 定 期 请 技 术 监 督 部 门 校 正 各 种 器 皿 的 准 备 必 须 按 药 典 要 求 严 格 处 理 和 灭 菌 值 得 强 调 的 是, 用 于 细 胞 培 养 的 所 有 器 具 在 洗 涤 完 毕 后 都 要 用 三 蒸 水 荡 洗 2 次 ~ 3 次, 万 可 使 用 四 培 养 基 及 其 他 试 剂 的 质 量 控 制 1. 基 础 培 养 基 内 含 多 种 氨 基 酸 维 生 素 和 其 他 多 种 营 养 及 促 生 长 物 质, 是 细 胞 生 长 的 物 质 基 础 根 据 不 同 的 需 要 选 择 不 同 的 培 养 基, 如 RPM I1 640, HamF 1o, F 12, DMEM 等 要 求 所 用 培 养 基 一 定 要 在 有 效 期 内, 批 号 越 近 越 好 ( 尤 其 是 羊 水 培 养 基 ), 超 过 有 效 期 受 潮 或 变 色 均 不 能 再 用 2. 小 牛 血 清 血 清 中 含 多 种 促 细 胞 生 长 因 于 血 洁 的 质 量 是 培 养 效 果 的 关 键 要 求 血 清 应 为 无 溶 血 桶 黄 色 清 亮 透 明 的 站 稠 状 液 体, 无 细 菌 无 支 原 体 污 染 保 存 时 间 不 宜 过 长, 一 般 以 20'C 下 不 超 过 2 年 为 宜 目 前, 国 内 己 研 制 出 国 产 的 血 清 代 用 品, 用 于 羊 水 绒 毛 等 细 胞 培 养, 效 果 不 错 3. 植 物 凝 集 素 (PHA) PHA 是 一 种 特 异 性 的 促 分 裂 原, 可 促 使 淋 巴 细 胞 有 丝 分 裂 它 含 有 糖 肢 聚 糖 和 蛋 白 质, 前 者 促 有 丝 分 裂, 后 者 有 凝 血 作 用 在 一 般 情 况 下, 糖 肢 聚 糖 和 蛋 白 质 含 量 成 正 比 我 们 用 盐 水 浸 提 法 自 制 PHA, 新 提 取 的 PHA, 先 作 如 下 检 测, 然 后 再 使 用 :1 兔 血 凝 集 效 价 二 三 1 : 紫 外 吸 收 法 蛋 白 质 测 定 二 三 3.5 gil 3 用 紫 外 可 见 分 光 光 度 计 在 波 长 190 日 m~350 日 m 内 扫 描 无 异 常 吸 收 峰 4 促 进 细 胞 转 化 及 分 裂 试 验, 要 求 淋 巴 细 胞 转 化 率 二 三 70%, 分 裂 比 率 二 三 7.6% 若 购 市 售 PHA, 也 应 进 行 上 述 指 标 检 测, 合 格 后 才 使 用 4. 培 养 用 水 水 是 细 胞 的 主 要 化 学 成 分 和 生 存 环 境 营 养 物 质 和 代 谢 产 物 都 必 须 溶 解 在 水 中, 才 能 被 细 胞 吸 收 和 排 泄 体 外 培 养 细 胞 对 水 的 质 量 很 敏 感, 要 求 很 高 水 55

60 的 质 量 不 符 合 标 准, 即 使 含 有 一 些 含 量 极 微 的 元 素, 有 时 也 会 对 细 胞 有 不 利 影 响, 甚 至 引 起 中 毒 死 亡 笔 者 所 在 实 验 室 要 求 用 全 玻 蒸 情 器 蒸 馆 的 新 鲜 三 蒸 水 每 次 制 得 的 水 都 必 须 检 测 比 电 阻 值 和 ph 值, 要 求 比 电 阻 值 二 三 万 fl, ph 6. 0~6. 5 万 可 使 用 5. 缓 冲 体 系 细 胞 在 液 体 培 养 基 中 生 长 时, 液 体 培 养 基 ph 值 会 发 生 改 变 笔 者 所 在 实 验 室 在 液 体 培 养 基 中 除 了 添 加 NaHC0 3 外, 还 加 有 Hepes 粉 Hepes 粉 是 一 种 强 力 的 有 机 缓 冲 剂, 对 缓 冲 液 体 培 养 基 ph 的 变 化 有 很 好 的 作 用 要 求 上 述 两 种 试 剂 的 纯 度 都 要 达 到 分 析 纯 及 以 上, 且 在 有 效 期 内 0 6. 其 他 试 剂 在 实 验 过 程 中 所 需 的 其 他 各 种 试 剂, 均 要 求 纯 度 达 到 分 析 纯 及 以 上, 尤 其 是 用 于 羊 水 细 胞 培 养 及 制 片 的 试 剂 更 是 如 此 五 标 本 检 验 的 质 量 控 制 1. 采 集 标 本 的 时 间 绒 毛 应 在 孕 6 周 ~8 周, 取 5 mg~7 mg 为 宜 ; 羊 水 采 集 应 控 制 在 孕 16 周 ~24 周, 采 集 量 为 20 ml 左 右 ; 胎 儿 脐 血 在 孕 17 周 以 后 根 据 检 查 目 的 而 定 各 种 标 本 均 应 严 格 无 菌 操 作 并 盛 于 无 菌 容 器 内, 立 即 送 实 验 室 接 种 培 养 2. 培 养 及 染 色 体 标 本 制 作 根 据 标 本 性 质 临 床 诊 断 意 见, 选 择 适 当 的 培 养 基 和 相 应 的 培 养 万 法 培 养 时 间 因 研 究 目 的 而 定 这 里 特 别 提 出 羊 水 细 胞 培 养 的 成 熟 收 获 时 间 问 题, 很 多 同 行 都 提 出 羊 水 细 胞 成 熟 收 获 时 间 很 难 掌 握, 根 据 作 者 经 验, 认 为 在 10 X lo 倍 显 微 镜 下 看 见 有 较 大 的 细 胞 " 克 隆 " ( 通 常 覆 盖 整 个 视 野 ), 并 有 10 个 及 以 上 球 形 发 亮 的 分 裂 相 细 胞, 即 可 收 获 我 们 采 用 这 个 标 准 收 获 羊 水 细 胞 制 备 染 色 体, 成 功 率 极 高 然 后 将 制 备 的 染 色 体 标 本 进 行 显 带 和 核 型 分 析 关 于 染 色 体 的 制 片 和 显 带 技 术 的 质 量 判 定, 我 们 采 取 的 万 法 是 : 先 将 染 色 体 片 作 G 显 带, 然 后 把 每 组 染 色 体 的 第 1 号, 按 其 分 散 铺 展 的 情 况, 染 色 体 的 长 度 及 带 纹 的 着 色 清 晰 程 度 等 给 予 记 分, 如 :A 组 的 第 1 号 染 色 体 分 散 铺 展 良 好, 大 小 长 度 适 中, 带 纹 清 晰 ( 符 合 ISCN 标 准 ), 记 为 10 分 ;B 组 的 第 1 号 染 色 体 ( 即 第 4 号 染 色 体 ) 达 到 上 述 标 准 记 为 9 分, 依 次 类 推, 直 到 G 组 的 第 1 号 染 色 体 i 己 为 4 分, 总 的 积 分 为 49 分, 30 分 为 合 格, 37 分 为 良 好, 45 分 为 优 秀, 这 样 就 可 将 定 性 的 指 标 定 量 化, 通 过 量 的 变 化 来 进 行 实 验 室 内 或 室 间 的 质 量 比 较, 以 达 到 质 量 控 制 的 目 的 3. 染 色 体 分 析 计 数 10 个 ~20 个 细 胞 的 染 色 体 数, 分 析 3 个 ~5 个 分 裂 相 细 胞 的 核 型, 对 核 型 异 常 者, 分 析 5 个 ~1O 个 分 裂 相 细 胞 若 发 现 少 见 或 罕 见 的 核 型, 送 上 一 级 实 验 室 或 请 有 经 验 的 同 行 专 家 鉴 定, 必 要 时 作 染 色 体 高 分 辨 显 带 或 FISH 等 进 行 鉴 定 第 二 节 细 胞 遗 传 学 检 验 的 室 问 质 量 控 制 细 胞 遗 传 学 检 验 的 室 问 质 控 工 作, 目 前 我 国 尚 没 有 普 遍 开 展, 但 这 项 工 作 非 常 必 要 室 问 质 控 的 目 的 是 相 互 了 解 各 参 与 实 验 室 测 定 结 果 的 准 确 性, 从 而 达 到 互 相 提 高 工 作 质 量 和 取 长 补 短 的 目 的 但 这 种 质 控 多 数 是 回 顾 性 的, 因 为 各 实 验 室 之 间 的 相 互 比 较 要 经 过 一 定 时 间 之 后 才 能 获 得 结 果, 所 以 并 不 能 控 制 实 验 当 天 所 出 的 报 告, 也 不 能 代 替 56

61 室 内 质 控 只 有 在 实 验 室 正 确 地 开 展 室 内 质 控 试 验 结 果 保 证 有 较 高 的 可 靠 性 后, 才 能 通 过 室 问 质 评 判 定 其 准 确 ' 生 一 室 间 质 控 的 组 织 形 式 室 问 质 控 可 由 主 持 单 位 定 期 或 不 定 期 地 发 送 质 控 物 ( 如 经 鉴 定 的 同 一 正 常 标 本 E\l(; 异 常 核 型 标 本 ), 以 该 质 控 物 检 查 结 果 进 行 评 价 根 据 目 前 我 国 遗 传 学 检 验 工 作 的 现 状, 可 采 取 全 国 性 和 地 区 性 相 结 合 的 万 式, 全 国 性 活 动 可 由 中 国 细 胞 遗 传 中 心 或 卫 生 部 临 床 检 验 中 心 负 责, 组 织 各 省 自 治 区 直 辖 市 较 大 的 细 胞 遗 传 实 验 室 参 加 地 区 性 活 动 可 由 省 自 治 区 直 辖 市 的 遗 传 中 心 组 织, 有 关 单 位 参 加 二 室 间 质 评 的 要 求 室 问 质 评 活 动 是 为 了 提 高 检 测 质 量, 开 展 活 动 首 先 要 投 入 一 定 的 人 力 物 力, 因 此 各 行 业 主 管 部 门 应 予 以 重 视 和 支 持 评 价 的 所 有 质 控 物 要 有 一 定 的 代 表 性 和 稳 定 性, 评 定 万 法 和 标 准 要 为 大 家 所 公 认 在 质 评 过 程 中, 发 现 的 问 题 要 通 过 适 当 的 万 式 帮 助 解 决, 比 如 推 荐 统 一 的 万 法 E\l(; 吸 收 来 参 加 进 修 培 训 等, 或 者 推 荐 质 量 优 良 的 商 品 化 配 套 的 细 胞 培 养 试 剂 盒 等 这 些 措 施 可 明 显 地 提 高 检 验 结 果 的 质 量 三 室 间 质 评 的 方 法 可 参 照 其 他 医 学 检 验 室 问 质 评 的 万 法, 比 如, 由 主 持 单 位 将 所 有 参 加 的 实 验 室 统 一 编 号, 统 一 分 发 质 控 物, 要 求 各 参 与 实 验 室 在 同 一 时 间 内 统 一 进 行, 并 要 求 在 指 定 日 期 内 发 出 报 告, 寄 送 主 持 单 位 主 持 者 应 及 时 对 所 得 结 果 进 行 分 析 评 价 然 后 及 时 将 评 价 结 果 反 馈 给 参 与 单 位 对 所 有 参 与 实 验 室 发 出 报 告 时 一 律 用 编 号 形 式, 而 不 能 用 单 位 名 称, 以 免 造 成 人 为 的 印 象 误 差 各 参 与 实 验 室 应 正 确 对 待 室 问 质 评, 使 报 告 的 结 果 能 够 正 确 反 映 本 室 的 真 实 检 验 水 平 参 考 文 献 1 丁 显 平. 细 胞 培 养 及 染 色 体 诊 断 技 术 质 量 控 制. 重 庆 医 学, 1994, 23 (1): 36 2 丁 显 平. 医 学 细 胞 遗 传 学 检 验 的 质 量 控 制. 中 国 优 生 与 遗 传 杂 志, 2001, 9 (1): 53 3 丁 显 平. 血 清 代 用 品 在 羊 水 细 胞 培 养 染 色 体 分 析 中 的 应 用 中 华 医 学 遗 传 学 杂 志, 2002, 19 (2): 丁 显 平. 血 清 代 用 品 在 绒 毛 细 胞 培 养 诊 断 染 色 体 中 的 应 用. 中 国 优 生 与 遗 传 杂 志, 2002, 10 (3): 61 ( 丁 显 平 顾 华 强 ). 57.

62 第 五 章 核 酸 提 取 技 术 临 床 分 于 遗 传 学 是 现 代 医 学 遗 传 学 的 一 个 重 要 组 成 部 分, 是 医 学 分 于 遗 传 学 知 识 的 临 床 应 用 随 着 20 世 纪 80 年 代 以 聚 合 酶 链 反 应 为 代 表 的 基 因 体 外 扩 增 技 术 的 出 现 和 90 年 代 人 类 基 因 组 计 划 的 启 动 与 完 成, 为 临 床 分 于 遗 传 学 的 发 展 提 供 了 充 分 有 利 的 条 件 在 此 基 础 上, 目 前 己 有 近 百 种 遗 传 性 疾 病 数 十 种 感 染 性 病 原 体 和 多 种 肿 瘤 相 关 基 因 能 做 出 明 确 的 临 床 基 因 诊 断 在 临 床 分 于 遗 传 学 的 发 展 中, 大 量 简 便 可 靠 的 现 代 分 于 核 酸 检 测 技 术 的 出 现 和 应 用 起 到 了 巨 大 的 推 动 作 用 临 床 分 于 核 酸 诊 断 是 临 床 分 于 遗 传 学 技 术 的 应 用, 是 以 基 因 诊 断 为 主 要 内 容 的 一 类 崭 新 的 诊 断 万 法, 能 够 直 接 从 DNA / RNA 水 平 检 测 人 类 疾 病 的 突 变 基 因 和 病 原 体 基 因, 与 传 统 的 表 现 型 诊 断 相 比, 基 因 诊 断 更 准 确 快 速 便 捷 自 1978 年 Kan 首 次 成 功 进 行 镰 形 细 胞 贫 血 的 产 前 基 因 诊 断 至 今, 短 短 20 余 年 时 间, 基 因 诊 断 以 基 础 研 究 成 果 为 依 托, 己 能 完 成 近 百 种 遗 传 病 的 完 全 或 部 分 基 因 诊 断, 在 对 感 染 性 疾 病 的 病 原 诊 断 中 也 正 显 示 出 强 大 的 技 术 优 势 可 以 预 计, 21 世 纪 作 为 分 于 生 物 学 的 世 纪, 也 必 将 是 医 学 核 酸 诊 断 发 展 最 快 的 世 纪 临 床 分 于 核 酸 诊 断 应 用 广 泛 每 一 种 生 物 都 有 核 酸 遗 传 物 质, 每 一 种 生 物 核 酸 都 有 其 特 点, 这 就 是 生 物 界 遗 传 物 质 的 共 性 和 个 性, 是 基 因 诊 断 及 其 应 用 广 泛 性 的 基 础 具 体 而 言, 基 因 诊 断 主 要 用 于 遗 传 病 感 染 性 病 原 体 和 肿 瘤 的 诊 断 遗 传 病 的 基 因 诊 断 是 核 酸 诊 断 的 直 接 应 用 目 前 对 单 基 因 病 的 诊 断 主 要 基 于 其 分 于 致 病 机 制 己 基 本 明 确 的 条 件 下, 国 外 能 在 专 业 和 临 床 实 验 室 完 成 的 基 因 诊 断 病 种 己 近 百 种, 其 中 部 分 疾 病 诊 断 率 在 90% 以 上, 包 括 多 种 遗 传 性 代 谢 病 先 天 畸 形 等 虽 然 每 一 种 遗 传 病 的 发 病 率 均 较 低, 1 旦 遗 传 病 的 总 发 病 人 数 却 是 惊 人 的, 尤 其 以 我 国 的 人 口 基 数 而 言, 积 极 开 展 疾 病 的 直 接 基 因 诊 断 和 产 前 基 因 诊 断 对 提 高 人 口 素 质 和 生 存 质 量 具 有 重 要 的 意 义 就 病 因 复 杂 发 病 率 高 的 多 基 因 疾 病 而 言, 己 发 现 部 分 致 病 的 主 要 基 因, 与 单 基 因 疾 病 比 较, 其 诊 断 困 难 较 大, 但 随 着 其 分 于 病 因 逐 步 被 揭 示, 随 着 基 因 芯 片 等 技 术 的 发 展 成 熟, 对 这 类 疾 病 的 基 因 诊 断 将 有 所 突 破 遗 传 病 中 的 染 色 体 病 一 直 以 来 采 用 的 是 染 色 体 检 查, 即 在 细 胞 水 平 上 进 行 诊 断, 近 年 来 随 着 染 色 体 微 缺 失 的 发 现 和 荧 光 原 位 杂 交 等 技 术 的 应 用, 细 胞 遗 传 学 诊 断 与 分 于 遗 传 学 诊 断 出 现 融 合, 己 能 检 测 部 分 染 色 体 做 小 异 常 另 外, 线 粒 体 病 的 基 因 诊 断 也 正 在 相 继 开 展 感 染 性 病 原 体 的 基 因 诊 断 在 近 10 年 来 发 展 很 快, 并 在 临 床 中 迅 速 推 广 不 管 何 种 病 原 体, 均 有 其 特 定 的 核 酸 组 成, 在 己 知 其 碱 基 序 列 的 基 础 上, 对 其 特 有 的 核 酸 组 成 进 行 检 测 以 判 断 有 无 感 染 是 该 检 测 的 基 本 思 想 与 传 统 的 万 法 相 比, 基 因 诊 断 具 有 快 速 准 确 和 便 捷 等 显 著 优 点 目 前 能 进 行 检 测 的 病 原 体 己 涉 及 到 消 化 道 呼 吸 道 和 泌 尿 生 植 道 等 组 织 器 官 的 感 染, 使 病 原 体 检 出 率 大 为 提 高 在 进 一 步 的 应 用 中, 病 原 体 的 基 因 检 测 还 将 向 病 原 体 分 型 耐 药 性 检 测 和 病 原 体 定 量 检 测 等 万 向 发 展 为 临 床 提 供 更 多 更. 58.

63 有 价 值 的 信 息 肿 瘤 是 目 前 威 胁 人 类 生 存 的 主 要 疾 病 之 一, 由 于 其 发 病 率 高 病 因 复 杂 预 后 差 而 受 到 广 泛 重 视 对 肿 瘤 相 关 基 因 的 研 究 表 明, 肿 瘤 的 发 生 是 多 基 因 共 同 作 用 的 结 果, 包 括 肿 瘤 特 异 性 融 合 基 因 癌 基 因 抑 癌 基 因 和 肿 瘤 转 移 抑 制 基 因 等 对 这 些 基 因 及 其 异 常 的 检 测 对 肿 瘤 的 发 展 和 预 后 估 计 具 有 重 要 的 指 导 意 义, 可 以 预 计 在 今 后 10 年 里 将 建 立 肿 瘤 的 基 因 检 测 体 系 就 基 因 诊 断 所 采 用 的 技 术 而 言, 除 发 展 己 相 当 成 熟 的 常 规 PCR 分 于 杂 交 及 突 变 检 测 技 术 外, 目 前 还 相 继 涌 现 出 许 多 新 的 核 酸 诊 断 技 术, 如 荧 光 定 量 检 测 技 术 FISH PRINS 及 基 因 芯 片 技 术 等, 它 们 的 应 用 使 基 因 诊 断 更 加 有 效 从 分 子 生 物 学 角 度, 遗 传 物 质 是 指 核 糖 核 酸 和 脱 氧 核 糖 核 酸, 一 般 统 称 为 核 酸 临 床 分 子 遗 传 学 就 是 通 过 检 测 人 体 或 病 原 微 生 物 的 核 酸, 为 临 床 诊 断 提 供 实 验 依 据 因 此 从 各 种 标 本 中 分 离 提 取 可 供 有 效 检 测 的 核 酸 是 进 行 临 床 分 子 生 物 学 检 测 的 基 础 目 前 针 对 不 同 的 检 测 目 的 和 万 法 有 许 多 相 应 的 核 酸 提 取 技 术, 在 本 章 中 结 合 临 床 应 用 介 绍 几 种 常 见 的 提 取 万 法 第 一 节 通 用 的 核 酸 提 取 技 术 一 DNA 提 取 方 法 (-) 酣 氯 仿 提 取 法 在 分 子 生 物 学 研 究 中, 最 经 典 和 最 常 用 的 基 因 组 DNA 提 取 万 法 是 酣 氯 仿 提 取 法, i 亥 万 法 提 取 DNA 的 优 点 是 纯 度 高 完 整 性 好, 适 合 于 基 因 组 DNA 的 直 接 分 析 ( 如 Southern 杂 交 ) 及 多 重 PCR 等 对 DNA 质 量 要 求 较 高 的 检 测 但 i 亥 万 法 亦 有 程 序 复 杂 操 作 时 间 较 长 DNA 丢 失 较 大 和 酣 污 染 重 等 问 题, 临 床 适 应 性 欠 佳 1. 材 料 与 试 剂 准 备 (1) 饱 和 酣 : DNA 在 酸 ' 生 ph 条 件 下 存 在 于 有 机 相 中, 因 此 在 酣 使 用 前 必 须 进 行 平 衡, 使 其 ph 值 在 7.8 以 上 其 基 本 步 骤 :1 将 20 'c 保 存 的 酌 取 出, 在 68 'c 使 酣 溶 解, 加 入 起 基 日 奎 琳 至 终 浓 度 为 0.1 %, 其 黄 颜 色 有 助 于 万 便 地 识 别 出 有 机 相 ;2 加 入 等 体 积 的 缓 冲 液.5 mol/ L 三 起 甲 氨 基 甲 : 院 (Tris) - HCr (ph 8.0), 用 眼 力 搅 拌 器 混 合 15 min 溶 化 酌, 关 上 搅 拌 器 持 两 相 分 开 后 尽 可 能 彻 底 地 移 出 水 相 ;3 加 入 等 体 积 o. 1 mol/l Tris - HCr (ph 8.0) 到 酌 中, 搅 拌 15 r 丑 1 日, 两 相 分 开 后 移 出 上 层 水 相 ;4 重 复 抽 提 过 程, 直 到 酣 相 的 ph 值 大 于 7.8; 5 移 出 液 相 后, 加 入 O. 1 体 积 含 有 0.2% 自 至 在 基 乙 醇 的 0.1 mol/l Tris- HCr (ph 8.0) 酣 溶 液 可 装 在 不 透 光 的 瓶 中 并 处 于 10 mol/l Tris- HCr (ph 8.0) 缓 冲 液 层 之 下, 于 4 'c 保 存 1 个 月 目 前 己 有 市 售 饱 和 酣 可 直 接 用 于 DNA 提 取 (2) 酌 : 氯 仿 : 异 戊 醇 ( 功 二 25 : 24 : 1): 从 核 酸 样 品 中 去 除 蛋 白 质 时 常 常 使 用 等 体 积 混 合 的 饱 和 酣 和 氯 仿 : 异 戊 醇 ( 功 二 24 : 1) 其 中 的 氯 仿 可 使 蛋 白 质 变 性 并 有 助 于 水 相 与 有 机 相 的 分 离 异 戊 醇 则 有 助 于 消 除 抽 提 过 程 中 出 现 的 泡 沫 氯 仿 和 异 戊 醇 在 使 59

64 用 前 均 无 需 处 理, 放 在 不 透 光 的 瓶 中 并 处 于 100 mol/l Tris - HCI (ph 8.0) 缓 冲 液 之 下 的 酣 : 氯 仿 : 异 戊 醇 混 合 液 可 在 4 'c 保 存 1 个 月 (3) 蛋 白 酶 K 主 要 作 用 是 阵 解 核 酸 标 本 中 的 蛋 白 质 以 去 离 于 水 溶 解 粉 末 状 蛋 白 酶 K, 贮 存 浓 度 为 20 gil, - 20 'c 保 存 可 直 接 加 入 DNA 抽 提 缓 冲 液, 其 反 应 浓 度 为 50 mg/l~100 mg/la (4) TE 缓 冲 液 (ph 8.0): 10 mmol/l Tris- HCI (ph 8. 的, 1 mmol/l EDTA (ph 8. 的 (5) 磷 酸 盐 缓 冲 液 (PBS): 8gNaCI 0.2 g KCI g Na2 HP g KH 2 P0 4 溶 解 于 800 ml 茶 馆 水 中, 用 HCI 调 节 ph 7. 斗, 力 口 水 定 容 至 1L, 高 压 灭 菌, 室 温 保 存 (6) 抽 提 缓 冲 液 : 10 mmol/l Tris - HCI (ph 8.0), 0.1 mol/l EDTA (ph 8. 的, 20 mg/l ] 夷 RNase, 0.5% 十 二 炕 基 硫 酸 铀 (SDS) (7) 材 料 : 15 ml, 1. 5 ml 离 心 管, 刻 度 吸 管 等, 高 压 蒸 汽 灭 菌 2. 操 作 步 骤 (1) 外 周 血 标 本 DNA 提 取 1) 临 床 为 避 免 新 鲜 血 液 分 离 白 细 胞 的 复 杂 操 作, 一 般 采 用 流 藏 血 液 5 ml, 室 温 解 冻, 加 入 等 体 积 PBS, 1 昆 匀 稀 释 ; 2) 室 温 g 离 心 15 mi 日, 弃 上 清 液 重 复 PBS 洗 涤, 直 至 标 本 中 未 见 明 显 的 红 细 胞 碎 片 为 止 ; 3) 加 入 10 ml 抽 提 缓 冲 液, 37'C 温 育 1 h; 的 加 入 蛋 白 酶 K 至 终 浓 度 100 mg/l, 充 分 泪 匀 37 'c 过 夜 或 56 'c 3 h 消 化, 注 意 保 持 蛋 白 酶 K 的 均 匀 状 态 ; 5) 将 溶 液 冷 却 至 室 温, 加 入 等 体 积 饱 和 酌, 缓 慢 颠 倒 离 心 管 泪 匀 10 mi 日 ; 6) 室 温 5000 g 离 心 15 r 丑 1 日, 小 心 转 移 上 清 液 到 另 一 离 心 管 重 复 饱 和 酌 提 取 1 次 ; 7) 加 入 等 体 积 酣 : 氯 仿 : 异 戊 醇 ( 功 二 25 : 24 : 1) 抽 提 1 次 ; 8) 加 入 等 体 积 氯 仿 抽 提 1 次 ; 9) 加 入 0.2 体 积 的 10 mo l/ L 乙 酸 按 和 2 倍 体 积 20 'c 的 无 水 乙 醇 沉 淀 DNA, 挑 出 絮 状 DNA; 10) 加 入 70% 乙 醇 洗 涤 1 次, 真 空 干 燥 或 置 于 空 气 中 干 燥, 加 入 200 ILl TE 缓 冲 液 溶 解 DNA, 4'C 保 存 (2) 其 他 临 床 标 本 中 提 取 DNA 酣 氯 仿 提 取 法 适 合 于 大 多 数 临 床 标 本 的 DNA 提 取, 如 组 织 和 局 部 体 液 标 本 等, 其 处 理 与 外 周 血 基 本 一 致, 但 在 进 行 蛋 白 酶 K 消 化 前, 均 有 一 个 细 胞 富 集 或 匀 浆 过 程 另 外 在 沉 淀 DNA 时, 由 于 标 本 中 细 胞 数 量 有 限, 常 常 见 不 到 DNA 的 絮 状 沉 淀, 因 此 必 须 进 行 高 速 离 心, 使 微 量 的 DNA 附 着 于 管 底, 最 后 加 入 TE 溶 解 DNA 这 时 TE 的 体 积 一 般 不 应 太 大, 20μl 比 较 合 适. 60.

65 ( 二 ) 盐 析 ; 去 盐 析 法 提 取 标 本 中 的 DNA 也 是 目 前 实 验 室 广 泛 采 用 的 万 法, 其 优 点 是 快 速 万 便 和 无 污 染, 在 临 床 外 周 血 DNA 提 取 中 使 用 较 多, 完 全 能 满 足 常 规 PCR 扩 增 对 DNA 质 量 的 要 求 但 该 万 法 提 取 的 DNA 纯 度 比 酣 氯 仿 提 取 法 低, 且 有 时 会 因 蛋 白 质 污 染 而 影 响 扩 增, 尤 其 不 适 合 于 对 DNA 模 板 完 整 性 和 纯 度 要 求 较 高 的 实 验 在 临 床 标 本 量 较 小 时, 一 般 建 议 不 采 用 盐 析 法, 以 免 DNA 丢 失 过 多 1. 材 料 与 试 剂 准 备 (1) O. 1 % NP - 40: 1 ml NP - 40 加 入 去 离 于 水 至 1000 ml a (2) 饱 和 NaCI: 200 g NaCI 加 入 去 离 于 水 至 600 ml a (3) 蛋 白 酶 K 贮 存 浓 度 为 20 gil, - 20 'c 保 存 可 直 接 加 入 DNA 抽 提 缓 冲 液, 其 反 应 浓 度 为 50 mg/l~ 100 mglla (4) 抽 提 缓 冲 液 : 10 mmol/l Tris - HCI (ph 8.0), 0.1 mol/l EDTA (ph 8.0), 20 mg/l] 夷 RNase, 0.5%SDSa (5) TE 缓 冲 液 (ph 8.0): 10 mmol/l Tris - HCI (ph 8.0), 1 mmol/l EDTA (ph 8.0) (6) 材 料 : 15 ml, 1. 5 ml 离 心 管, 刻 度 吸 管 等, 高 压 蒸 汽 灭 菌 2. 外 周 血 DNA 提 取 操 作 步 骤 (1) 冻 藏 血 液 5 ml, 室 温 解 冻 ; (2) 在 解 冻 标 本 中 加 入 茶 馆 水 至 12 ml 颠 倒 泪 匀, 室 温 下 9000 r/ mi 日 离 心 10 mi 日 ; (3) 弃 上 清 液, 力 日 蒸 情 水 至 12 ml 颠 倒 泪 匀 至 无 明 显 沉 淀, 室 温 下 r/ mi 日 离 d 心 10 r 丑 1 日 ; (4) 弃 上 清 液, 加 入 0.1 %NP - 40 至 5 r 址, 泪 匀 至 无 明 显 沉 淀, 室 温 下 r/ mt 日 离 心 10 mi 日 ; (5) 弃 上 清 液, 加 入 3 ml 裂 解 液, 15μI 20 gil 的 蛋 白 酶 K, 震 荡? 昆 匀, 42'C 过 夜 ; (6) 加 入 1 ml~2 ml 饱 和 NaCI 溶 液, 室 温 下 9000 r/ mi 日 离 心 15 r 丑 1 日 ; (7) 转 移 上 清 液 至 15 ml 刻 度 离 心 管 中, 加 入 2 倍 体 积 无 水 乙 醇, 静 置 至 絮 状 沉 淀 出 现 ; (8) 挑 出 沉 淀 至 1. 5 ml 离 心 管 中, 加 入 500μ170% 乙 醇 清 洗, 离 心 弃 上 j 青 液 ; (9) 置 室 温 下 10 mi 日, 加 入 200 ILl TE 缓 冲 液 溶 解 DNA 作 为 扩 增 模 板 ( 三 ) 高 温 裂 解 法 高 温 裂 解 法 是 快 速 获 得 粗 制 DNA 的 一 种 万 法, 由 于 其 操 作 容 易 步 骤 少 DNA 丢 失 少 等 显 著 优 点, 在 临 床 病 原 体 检 测 中 被 广 泛 使 用 但 该 万 法 获 得 的 DNA 纯 度 较 低, 加 之 模 板 溶 液 中 可 能 存 在 较 多 的 PCR 的 抑 制 物, 因 此 造 成 检 测 假 阴 性 的 可 能 性 比 其 他 万 法 大 1. 材 料 与 试 剂 准 备 (1) 蛋 白 酶 K 贮 存 浓 度 20 gil, - 20 'c 保 存 可 直 接 加 入 DNA 抽 提 缓 冲 液, 其 反 应 浓 度 50 mg/l~ 100 mglla. 61.

66 菌 (2) 抽 提 缓 冲 液 : 1 x PCR 缓 冲 液 成 分, 0.05%NP-40, 0.05% 聚 山 梨 醋 20 0 (3) 材 料 : O. 5 ml, 1. 5 ml 离 心 管, 20μ 1, 200μl 微 量 移 液 器 吸 头 等, 高 压 蒸 汽 灭 2. 操 作 步 骤 (1) 转 移 500μl 待 检 标 本 于 0.5 ml 离 心 管 中 ; (2) 室 温 r/ mi 日 离 心 5 mi 日, 弃 上 清 液 ; (3) 沉 淀 中 加 入 50 ILl 抽 提 缓 冲 液, 振 荡 打 散 沉 淀 ; (4) 在 热 帽 环 仪 上 100 'c 高 温 裂 解 10 min, 冷 却 至 室 温 ; (5) 室 温 r/ mi 日 离 心 2 mi 日, 上 清 液 3μ1~5μl 作 为 扩 增 模 板 ; (6) 如 扩 增 效 果 差 或 电 泳 显 示 背 景 高, 可 再 用 蛋 白 酶 K 重 新 消 化 上 清 液 模 板, 高 温 变 性 后 重 新 扩 增 ( 四 ) 固 相 眼 附 j 先 脱 ; 去 国 相 吸 附 洗 脱 法 是 一 类 以 固 相 硅 质 载 体 特 异 性 吸 附 DNA 和 洗 脱 获 得 高 纯 度 DNA 的 万 法, 其 获 得 的 DNA 纯 度 高 丢 失 少, 操 作 也 比 较 简 便, 适 合 临 床 检 测 的 要 求, 但 其 DNA 提 取 的 成 本 偏 高 目 前 该 类 技 术 主 要 有 2 种 万 法, 一 是 将 含 有 DNA 的 溶 液 过 柱, 利 用 离 心 柱 上 的 硅 质 特 异 性 吸 附 DNA, 然 后 将 洗 脱 液 过 柱, 洗 脱 和 溶 解 被 滞 留 的 DNA, 这 种 万 法 能 从 标 本 中 快 速 获 得 尽 可 能 多 的 DNA 模 板 ; 二 是 将 硅 质 直 接 加 入 DNA 溶 液 中, 在 液 相 特 异 性 吸 附 DNA, 通 过 离 心 分 离 硅 质 后, 用 洗 脱 液 洗 脱 DNA 这 种 万 法 也 能 很 好 地 获 得 纯 度 较 高 的 模 板 DNA o i 亥 类 万 法 一 般 均 分 为 4 步, 即 标 本 中 细 胞 裂 解 硅 质 吸 附 溶 液 中 的 DNA 洗 涤 硅 质 DNA 结 合 体 与 洗 脱 溶 解 DNA 下 面 以 玻 璃 粉 吸 附 提 取 DNA 为 例 进 行 说 明 1. 材 料 与 试 剂 准 备 (1) 细 胞 裂 解 液 : 1 %SDS, 10 mmol/l EDTA o (2) 4 mo l/ L 饱 和 NaCl o (3) 玻 璃 粉 溶 液 (4) 洗 涤 液 : 50% 乙 醇, 10 mol/l Tris - HCI (ph 7.4), 1 mol/l EDTA, 50 mmol/l NaCl o (5) TE 缓 冲 液 (ph 8.0): 10 mmol/l Tris - HCI (ph 8.0), 1 mmol/l EDTA (ph 8.0) (6) 材 料 : 15 ml, 1. 5 ml 离 心 管, 刻 度 吸 管 等, 高 压 蒸 汽 灭 菌 2. 操 作 步 骤 (1) 在 外 周 血 单 核 细 胞 的 标 本 中 加 入 1 %SDS 破 裂 细 胞, 1 昆 匀 ; (2) 加 入 4 mo l/ L 饱 和 NaCI 和 玻 璃 粉 溶 液, 1 昆 匀 ; (3) 冰 浴 5 r 丑 1 日, 每 1 min~2 min 1 昆 匀 1 次 ; (4) r/mi 日 离 心 1 mi 日, 弃 上 清 液 ; (5) 加 入 洗 涤 液 洗 涤 沉 淀 3 次, 弃 上 清 液 ; (6) 加 入 TE 缓 冲 液 E\l(; 去 离 于 水, 1 昆 匀, 室 温 放 置 3 min; (7) r/ min 离 心 1 mi 日, 上 清 液 为 DNA 模 板 62.

67 8.0) ( 五 ) 微 量 全 皿 提 取 法 做 量 全 血 提 取 法 又 称 为 腆 化 专 内 提 取 法, 特 别 适 合 于 从 微 量 全 血 中 快 速 提 取 DNA 1. 材 料 与 试 剂 准 备 (1) 6 mol/l NaI (2) 氯 仿 异 戊 醇 ( 功 二 24 : 1) (3) 异 丙 醇 (4) 37% 异 丙 醇 (5) TE 缓 冲 液 (ph 8.0): 10 mmol/l Tris - HCl (ph 8.0), 1 mmol/l EDTA (ph (6) 材 料 : 15, 1. 5 ml 离 心 管, 刻 度 吸 管 等, 高 压 蒸 汽 灭 菌 2. 操 作 步 骤 (1) 微 量 抗 凝 外 周 血 中 加 入 等 体 积 6 mo l/ LNaI, 来 回 颠 倒 20 s 泪 匀 ; (2) 加 入 等 体 积 氯 仿 : 异 戊 醇, 来 回 颠 倒 20 s 1 昆 匀 ; (3) 室 温 r/ mi 日 离 心 5 mi 日, 转 移 水 相 ; (4) 加 入 1/2 体 积 的 异 丙 醇, 1 昆 匀, 静 置 3 min; (5) 室 温 r/ min 离 心 5 mi 日, 去 上 清 液 ; (6) 加 入 37% 异 丙 醇 洗 涤 DNA 沉 淀 ; (7) 室 温 r/ mi 日 离 心 5 mi 日, 去 上 清 液 ; (8) 空 气 自 然 干 燥 DNA, 加 入 等 体 积 TE 缓 冲 液 溶 解 DNA o ( 六 ) DNA 提 取 技 术 的 发 展 趋 势 与 问 题 上 面 介 绍 了 一 些 常 用 的 DNA 提 取 技 术, 目 前 临 床 甚 至 出 现 了 将 微 量 全 血 直 接 加 入 PCR 体 系 中 扩 增 靶 基 因 的 技 术, 因 此 面 对 这 种 情 况, 在 临 床 使 用 时 一 定 要 注 意 根 据 不 同 的 实 验 目 的 和 实 验 要 求 灵 活 选 用, 选 择 合 适 的 DNA 提 取 技 术 可 以 节 约 时 间 和 试 剂 成 本, 提 高 检 测 的 可 靠 性 和 准 确 性 建 议 使 用 的 DNA 提 取 技 术 见 表 表 5-1 DNA 提 取 技 术 的 适 用 范 围 方 法 常 规 per 及 其 相 关 实 验 多 位 点 共 扩 增 杂 交 检 测 盼 氯 仿 提 取 法 可 选 用 可 选 用 应 选 用 盐 析 法 可 选 用 应 选 用 可 选 用 高 温 裂 解 法 应 选 用 不 宣 选 用 不 宜 选 用 国 相 I 吸 附 洗 脱 法 可 选 用 可 j 在 用 可 选 用 帧 化 纳 提 取 法 可 选 用 可 选 用 可 选 用 可 以 预 计, 随 着 临 床 分 子 生 物 学 的 发 展, 将 会 出 现 更 多 更 好 和 更 万 便 的 临 床 核 酸 提 取 技 术 因 此, 临 床 如 何 选 择 适 合 于 自 己 实 验 目 的 的 核 酸 提 取 万 法, 如 何 规 范 临 床 实 验 室 核 酸 提 取 程 序, 如 何 避 免 不 同 标 本 之 间 核 酸 提 取 质 量 的 差 异, 并 保 证 核 酸 提 取 质 量 的 高 效 性 和 一 致 性 等 问 题 将 日 益 突 出 1 旦 值 得 高 兴 的 是 目 前 越 来 越 多 的 仪 器 厂 家 正 在 不 断 推 出 全 自 动 的 核 酸 提 取 仪, 这 将 有 利 于 统 一 和 保 持 实 验 室 核 酸 提 取 的 质 量, 有 力 地 推 动 临 床 分 子 生 物 学 的 发 展 但 我 们 也 看 到, 大 多 数 这 类 仪 器 使 用 的 是 非 开 放 性 的 系 统, 63

68 造 成 核 酸 提 取 成 本 过 高, 会 在 一 定 程 度 上 阻 碍 临 床 实 验 室 核 酸 提 取 自 动 化 的 进 程 二 RNA 提 取 方 法 在 临 床 上, 以 前 较 常 见 的 是 提 取 标 本 中 的 DNA 进 行 检 测 近 年 来, 随 着 功 能 基 因 组 学 的 发 展, 越 来 越 多 的 基 因 功 能 被 确 定, 其 转 录 产 物 mrna 的 检 测 正 逐 步 被 临 床 采 用, 对 RNA 的 检 测 成 为 继 DNA 检 测 后 又 一 个 新 的 发 展 万 向 鉴 于 标 本 中 RNA 提 取 与 DNA 提 取 有 较 大 的 差 异, 故 专 门 介 绍 如 下 不 管 采 用 何 种 万 法 进 行 RNA 提 取, 都 必 须 避 免 操 作 过 程 RNase 污 染 而 致 的 RNA 阵 解, 因 此 RNA 提 取 需 要 进 行 严 格 的 用 品 和 试 剂 的 准 备, 清 除 E\l(; 抑 制 RNase o 通 常, 可 用 两 种 主 要 的 万 法 防 止 提 取 过 程 中 RNA 的 阵 解 一 是 采 用 焦 磷 酸 二 乙 醋 (DEPC), 它 是 RNase 的 强 抑 制 剂, 利 用.1%DEPC 浸 泡 实 验 用 器 具, 可 有 效 降 低 RNase 对 实 验 的 影 响 另 外, 0.1 %DEPC 可 用 于 RNA 提 取 试 剂 溶 液 的 配 制 中, 防 止 水 和 化 学 试 剂 中 的 RNase 污 染 二 是 同 时 采 用 其 他 RNase 抑 制 剂, 如 RNase 的 蛋 白 抑 制 剂 氧 饥 核 糖 核 昔 复 合 物 及 硅 藻 土 等, 通 过 与 RNase 的 结 合 与 吸 附, 最 大 限 度 抑 制 RNase 的 活 性 目 前, 许 多 试 剂 公 司 生 产 了 使 用 万 便 的 RNA 提 取 试 剂 盒, 包 括 酣 氯 仿 法 试 剂 盒 和 柱 提 取 法 试 剂 盒, 其 中 后 者 因 其 快 速 便 捷 的 操 作 和 稳 定 高 效 的 RNA 质 量 而 得 到 越 来 越 多 的 使 用 尽 管 如 此, 酣 氯 仿 结 合 异 硫 氨 酸 腻 的 使 用 仍 然 是 最 常 用 的 RNA 提 取 万 法, 其 中 异 硫 氨 酸 肌 可 使 RNase 灭 活 1. 试 剂 准 备 (1) 提 取 缓 冲 液 : 4 mo1/ L 异 硫 氨 酸 腻, 25 mo 1/ L 拧 棱 酸 纳, 100 mmo1/l ~ 琉 基 乙 回 事 (2) 饱 和 酣 : 氯 仿 : 异 戊 醇 ( 古 50 : 49 : 1) (3) 3 mo 1/ L 乙 酸 铀 (ph 5.2) (4) DEPC 处 理 的 去 离 于 水 (5) RNase 抑 制 剂 (6) 20% 聚 乙 二 醇 (PEG) (7) 15 r 址, 1. 5 ml 等 离 心 管, 高 压 蒸 汽 灭 菌 2. 操 作 步 骤 (1) 将 20%PEG6000 与 血 清 等 标 本 等 体 积 泪 匀 ; (2) 4'C 放 置 3 h, 4'C r/ mi 日 离 心 15 mi 日, 弃 上 清 液 ; (3) 加 入 一 定 量 的 提 取 缓 冲 液, 1 昆 匀 ; (4) 加 入 等 体 积 饱 和 酣 氯 仿 : 异 戊 醇, 泪 匀, 冰 浴 10 mi 日 ; (5) 4'C r/ min 离 心 5 mi 日, 小 心 转 移 水 相 ; (6) 氯 仿 : 异 戊 醇 ( 功 二 1 : 1) 抽 提 1 次, 转 移 水 相 ; (7) 加 入 1 / 10 体 积 的 3 mo 1/ L 乙 酸 铀 和 2. 5 倍 无 水 乙 醇, 1 昆 匀, 冰 浴 1 h; (8) 4'C r/ min 离 心 10 mi 日, 弃 上 清 液 ; (9) 75 % 乙 醇 清 洗 1 次, 空 气 自 然 干 燥 或 真 空 干 燥 ; 64

69 (1 0) 小 体 积 DEPC 处 理 的 去 离 于 水 溶 解 RNA, 可 加 入 少 量 RNase 抑 制 剂, 20 'c ~ -70 'c 保 存 上 面 介 绍 的 是 最 经 典 的 RNA 提 取 万 法 与 DNA 提 取 一 样, RNA 提 取 技 术 也 是 多 种 多 样 的, 过 滤 柱 提 取 与 固 体 颗 粒 吸 附 释 放 提 取 都 可 以 获 得 丰 度 和 纯 度 较 高 RNA 的 模 板 用 于 临 床 检 测, 尤 其 是 近 年 来 自 动 化 核 酸 提 取 仪 的 出 现 在 很 大 程 度 上 是 为 操 作 相 对 复 杂 的 RNA 提 取 设 计 的 第 二 节 临 床 标 本 核 酸 提 取 方 法 II 备 床 标 本 的 来 源 与 特 点 临 床 基 因 诊 断 所 涉 及 的 标 本 来 源 广 泛 这 些 标 本 中 各 种 物 质 组 成 有 较 大 的 差 异, 其 中 所 含 基 因 扩 增 的 抑 制 物 也 各 有 不 同, 如 何 将 它 们 统 一 到 一 种 规 范 的 核 酸 提 取 程 序 与 万 法 中, 始 终 是 临 床 分 子 生 物 学 所 要 解 决 的 一 个 重 要 问 题 目 前, 为 了 能 较 好 地 获 得 检 测 所 需 的 核 酸 模 板, 针 对 不 同 来 源 的 标 本 各 有 不 完 全 相 同 的 提 取 万 法 因 此 首 先 应 对 临 床 各 种 常 见 标 本 特 点 有 初 步 的 认 识 ( 一 ) 全 皿 标 本 采 用 全 血 标 本 提 取 核 酸 可 获 得 人 体 自 身 基 因 组 DNA 或 RNA, 亦 可 得 到 标 本 中 各 种 外 源 性 核 酸 临 床 上 主 要 用 于 遗 传 病 与 肿 瘤 基 因 诊 断 病 原 体 基 因 诊 断 等 i 亥 类 标 本 一 般 用 拧 棱 酸 抗 I~ 是 剂 (ACD) Ejj(; EDTA 抗 i 疑, 勿 用 基 因 扩 增 抑 制 剂 肝 素 为 尽 量 万 便 临 床 操 作, 全 血 标 本 在 采 集 后 一 般 置 于 20 'c 保 存, 以 保 证 解 冻 时 部 分 红 细 胞 己 破 裂, 使 核 酸 提 取 更 加 容 易 标 本 如 仅 用 于 DNA 提 取, 可 在 20 'c 长 期 保 存, 如 用 于 RNA 提 取, 则 应 尽 快 处 理 标 本 在 全 血 标 本 核 酸 提 取 中, 其 提 取 的 质 量 在 很 大 程 度 上 依 赖 于 : 一 是 模 板 溶 液 中 是 否 残 存 红 细 胞 碎 片 或 其 分 解 产 物, 它 们 是 基 因 扩 增 的 强 抑 制 剂, 是 造 成 检 测 假 阴 性 的 常 见 原 因 因 此 在 裂 解 红 细 胞 或 分 离 有 核 细 胞 时, 必 须 保 证 上 述 抑 制 剂 的 有 效 去 除 二 是 核 蛋 白 是 否 被 分 解 或 脱 离 核 酸, 蛋 白 质 消 化 不 彻 底 也 是 基 因 扩 增 失 败 的 原 因 之 一 因 此 在 蛋 白 酶 K 进 行 消 化 时, 应 注 意 经 常 泪 匀, 并 持 续 足 够 的 时 间 ( 二 ) 皿 清 标 本 血 清 标 本 是 临 床 最 常 见 的 标 本 之 一, 主 要 针 对 某 些 外 源 性 病 原 体 的 基 因 检 测 血 清 标 本 的 离 心 分 离 比 较 简 单, 但 一 定 注 意 标 本 有 无 溶 血 现 象, 因 为 这 也 是 模 板 溶 液 血 红 蛋 白 及 其 分 解 产 物 污 染 最 常 见 的 原 因 血 清 标 本 应 尽 快 处 理, 否 则 应 将 己 分 离 的 血 清 置 于 20 'c 保 存 ( 三 ) 体 液 标 本 体 液 标 本 种 类 众 多, 来 源 各 异 其 提 取 核 酸 万 法 的 选 择 主 要 以 其 站 稠 程 度 和 蛋 白 质 含 量 等 因 素 决 定 在 脑 脊 液 尿 液 等 水 样 标 本 中 提 取 时, 可 采 取 离 心 取 沉 淀, 高 温 裂 解 提 取 核 酸 的 万 法 对 于 胸 腹 水 服 液 等 浓 稠 标 本, 可 先 对 标 本 做 适 度 稀 释, 如 加 入 少 量 生 理 盐 水, 再 振 荡 离 心, 沉 淀 加 入 抽 提 缓 冲 液 与 蛋 白 酶 K, 对 标 本 中 大 量 的 蛋 白 质 进 行 消 化, 以 提 高 核 酸 模 板 的 质 量 对 于 痰 液 标 本 的 处 理 相 对 特 殊, 可 先 用 1 mal/l NaOH. 65.

70 液 化 痰 液, 然 后 离 心 获 得 沉 淀, 用 生 理 盐 水 反 复 洗 涤 沉 淀 后 提 取 核 酸 ( 四 ) 组 织 标 本 组 织 标 本 也 是 临 床 上 常 见 的 标 本 之 一 由 于 其 细 胞 量 和 密 度 均 大 于 液 体 标 本, 其 处 理 的 基 本 原 则 是 尽 量 研 磨 匀 浆, 加 入 适 当 的 液 体 稀 释, 蛋 白 酶 K 消 化 应 是 必 须 的 步 骤 石 蜡 切 片 需 先 用 二 甲 苯 脱 蜡, 无 水 乙 醇 和 乙 醇 去 除 二 甲 苯, 然 后 进 行 核 酸 提 取 二 II 备 床 标 本 核 酸 提 取 方 法 RNA 提 取 一 般 采 用 外 周 血 和 组 织 标 本, 提 取 万 法 和 步 骤 与 前 述 基 本 一 致, 这 里 不 再 重 复 临 床 标 本 DNA 提 取 则 各 有 其 特 点, 因 此 简 要 介 绍 如 下 ( 一 ) 细 菌 与 病 毒 DNAt~ 取 细 菌 与 病 毒 存 在 于 人 体 的 各 种 标 本 中, 如 血 清 中 的 乙 型 肝 炎 病 毒 (HBV) 与 I 型 单 纯 植 莎 病 毒 (HSV - I) 泌 尿 生 植 道 标 本 中 的 人 乳 头 瘤 病 毒 (HPV) 与 H 型 单 纯 殖 莎 病 毒 (HSV - II) 等 由 于 这 类 标 本 往 往 体 积 较 小 (1. 0 ml) 及 标 本 中 病 毒 量 有 限 等 原 因, 对 其 DNA 进 行 精 细 提 取 可 能 使 DNA 丢 失 过 多, 导 致 假 阴 性 结 果, 因 此 临 床 上 往 往 采 用 高 温 裂 解 法 提 取 DNA, 以 避 免 DNA 的 损 失 1. 材 料 与 试 剂 准 备 (1) 抽 提 缓 冲 液 : 1 X PCR 缓 冲 液 成 分, O. 05 % NP - 40, O. 05 % 聚 山 梨 醋 20 0 (2) 材 料 : O. 5 ml, 1. 5 ml 等 离 心 管 和 微 量 吸 头, 高 温 蒸 汽 灭 菌 2. 操 作 步 骤 (1) 将 标 本 放 入 1. 5 ml 离 心 管 中, 如 系 拭 纸, 放 入 装 有 1 ml 生 理 盐 水 的 1. 5 ml 离 心 管 中 ; (2) 标 本 泪 匀 后 转 移 500μl 到 0.5 ml 干 净 离 心 管 中, r/ mi 日 离 心 10 mi 日 ; (3) 弃 上 清 液, 加 入 0.5 ml 生 理 盐 水 洗 涤 沉 淀 1 次 ; (4) 弃 上 清 液, 加 入 50μl 抽 提 缓 冲 液, 振 荡 泪 匀 ; (5) 100'C 裂 解 10 min, 冷 却 到 室 温 ; (6) r/ mi 日 离 心 5 mi 日, 4'C 保 存 备 用, 上 清 液 作 为 模 板 ( 二 ) 痰 标 本 结 极 分 枝 杆 菌 DNA 提 取 1. 材 料 与 试 剂 准 备 (1) 5 mal/l NaOH o (2) 磷 酸 盐 缓 冲 液 (PBS) (3) 20 gil 蛋 白 酶 K o (4) 抽 提 缓 冲 液 : 1 X PCR 缓 冲 液 成 分, 0.05%NP-40, 0.05% 聚 山 梨 醋 20 0 (5) 材 料 : O. 5 ml, 1. 5 ml 离 心 管, 20μ1, 200μl 微 量 移 液 器 吸 头 等, 高 压 蒸 汽 灭 菌 2. 操 作 步 骤 (1) 少 许 痰 液 中 加 入 5 mal/l NaOH 1 昆 匀, 使 痰 液 变 稀, 室 温 中 30 mi 日 ; (2) 加 入 PBS, r/mi 日 离 心 5 mi 日 ; (3) 弃 上 清 液, PBS 洗 涤 沉 淀 1 次 ; 66

71 (4) 弃 上 清 液, 加 入 抽 提 缓 冲 液 泪 匀 ; (5) 100'C 高 温 裂 解 10 mi 日, 冷 却 到 室 温 ; (6) 加 入 蛋 白 酶 K, 56'C 消 化 1 h; (7) 100'C 高 温 裂 解 10 mi 日, 冷 却 到 室 温 ; (8) r/ mi 日 离 心 5 mi 日, 置 4 'c 冰 箱 保 存 备 用, 上 清 液 作 为 检 测 模 板 ( 三 ) 体 液 标 本 DNA 提 取 月 句 腹 水 等 体 液 标 本 各 种 物 质 成 分 比 较 复 杂, 为 避 免 基 因 扩 增 抑 制 剂 的 影 响, 这 类 标 本 的 处 理 相 对 复 杂 一 些 1. 材 料 与 试 剂 准 备 (1) 20 gil 蛋 白 酶 K o (2) 抽 提 缓 冲 液 : 1 X PCR 缓 冲 液 成 分, 0.05%NP-40, 0.05% 聚 山 梨 醋 20 0 (3) 材 料 : O. 5 ml, 1. 5 r 址, 15 ml 离 心 管, 20 vi, 200μl 微 量 移 液 器 吸 头 等, 高 压 蒸 汽 灭 菌 2. 操 作 步 骤 (1) 在 15 ml 离 心 管 中 将 上 述 体 液 全 部 8000 r/ min 离 心 15 mi 日 ; (2) 弃 上 清 液, 打 散 沉 淀, 加 入 10 ml 生 理 盐 水, 8000 r/ mi 日 离 心 15 min; (3) 弃 上 清 液, 加 入 1 ml 抽 提 缓 冲 液 泪 匀, 转 移 到 1.5 ml 离 心 管 中 ; (4) 100'C 高 温 裂 解 10 mi 日, 冷 却 到 室 温 ; (5) 加 入 蛋 白 酶 K, 56'C 消 化 1 h; (6) 100'C 高 温 裂 解 10 mi 日, 冷 却 到 室 温 ; (7) r/ mi 日 离 心 5 mi 日, 置 4 'c 冰 箱 保 存 备 用, 上 清 液 作 为 检 测 模 板 ( 四 ) 组 织 DNA 提 取 组 织 DNA 提 取 的 重 点 是 均 浆 与 蛋 白 酶 K 泊 ' 化 由 于 组 织 细 胞 量 较 大, 因 此 可 采 用 酣 氯 仿 提 取 以 获 得 大 量 的 DNA 这 里 介 绍 操 作 简 便 的 高 温 裂 解 法 1. 材 料 与 试 剂 准 备 : (1) 20 mg/l 蛋 白 酶 K o (2) 抽 提 缓 冲 液 : 1 X PCR 缓 冲 液 成 分, 0.05%NP-40, 0.05% 聚 山 梨 醋 20 0 (3) 组 织 匀 浆 液 (4) 材 料 : O. 5 ml, 1. 5 ml, 15 ml 离 心 管, 20μ1, 200μl 微 量 移 液 器 吸 头 等, 高 压 蒸 汽 灭 菌 2. 操 作 步 骤 (1) 将 组 织 标 本 置 于 研 钵 中, 用 ~ 科 剪 剪 碎 组 织 或 手 术 刀 片 切 刮 组 织 ; (2) 加 入 适 量 的 组 织 匀 浆 液, 研 磨 组 织 碎 片 至 匀 浆 ; (3) 转 移 部 分 匀 浆 至 1. 5 ml 离 心 管 中, 加 入 抽 提 缓 冲 液 i 昆 匀 ; (4) 加 入 蛋 白 酶 K, 37'C 过 夜 ; (5) 100'C 高 温 裂 解 10 mi 日, 冷 却 到 室 温 ; (6) r/ mi 日 离 心 5 mi 日, 置 4 'c 冰 箱 保 存 备 用, 上 清 液 作 为 检 测 模 板. 67.

72 ( 五 ) 石 蜡 包 t~ 组 织 DNA 提 取 石 蜡 包 埋 组 织 提 取 DNA 较 多 用 于 遗 传 病 基 因 诊 断, 因 此 对 DNA 质 量 要 求 较 高, 采 用 酣 氯 仿 提 取 较 为 常 见 1. 材 料 与 试 剂 准 备 (1) 二 甲 苯 (2) 无 水 乙 醇 与 70% 80% 90% 乙 醇 (3) 饱 和 酌 与 氯 仿 (4) 饱 和 酌 : 氯 仿 : 异 戊 醇 ( 古 25 : 24 : 1) (5) 20 gil 蛋 白 酶 K o (6) 抽 提 缓 冲 液 : 10 mmol/l Tris - HCI (ph 8.0), 0.1 mol/l EDTA (ph 8.0), 20 mg/u~ RNase, 0.5%SDS o (7) TE 缓 冲 液 (ph 8.0): 10 mmol/l Tris - HCI (ph 8.0), 1 mmol/l EDTA (ph 8.0) (8) 材 料 : O. 5 ml, 1. 5 r 址, 15 ml 离 心 管, 20 vi, 200μl 微 量 移 液 器 吸 头 等, 高 压 蒸 汽 灭 菌 2. 操 作 步 骤 (1) 将 石 蜡 切 片 放 入 1. 5 ml 离 心 管 中, 加 入 二 甲 苯, 室 温 放 置 15 mi 日, 以 利 于 石 蜡 的 充 分 溶 解 ; (2) r/ mi 日 离 心 5 mi 日, 去 上 清 液 ; (3) 加 入 二 甲 苯, 室 温 放 置 15 min; (4) r/ mi 日 离 心 5 mi 日, 去 上 清 液 ; (5) 加 入 无 水 乙 醇, 室 温 放 置 15 mi 日, 以 利 于 去 除 二 甲 苯 ; (6) r/ mi 日 离 心 5 mi 日, 去 上 清 液 ; (7) 依 次 加 入 90% 80% 70% 乙 醇 洗 涤 组 织, 去 除 二 甲 苯 ; (8) 加 入 生 理 盐 水 洗 涤 2 次, 离 心 去 上 清 液 ; (9) 加 入 抽 提 缓 冲 液 与 蛋 白 酶 K, 56'C 保 温 2 h; (1 0) 等 体 积 酣 氯 仿 与 饱 和 国 升 : 氯 仿 : 异 戊 醇 抽 提 DNA, 无 水 乙 醇 沉 淀 DNA, TE 缓 冲 液 溶 解 DNA, 4'C 贮 存 备 用 ( 六 ) 言 皿 标 本 的 DNAt~ 取 在 临 床 实 践 中, 经 常 可 以 见 到 一 些 标 本 中 有 红 细 胞 的 污 染, 如 不 能 有 效 去 除, 其 中 的 血 红 蛋 白 分 解 产 物 将 抑 制 随 后 的 PCR 扩 增, 造 成 假 阴 性 结 果, 因 此 应 尽 可 能 地 除 去 红 细 胞 及 其 碎 片 去 除 红 细 胞 及 其 碎 片 一 般 采 用 的 办 法 有 几 种, 举 例 如 下 1. 等 渗 溶 血 法 等 渗 溶 血 液 组 成 : 155 mmol/l N H 4 CI, O. 1 mmol/l EDTA, 10 mmol/l KHC0 3 (ph 7.4) 按 1 倍 体 积 标 本 加 入 2 倍 体 积 等 渗 溶 血 液 的 比 例 混 合, 置 冰 洛 15 mi 日, r/ mi 日 离 心 5 min; 弃 上 清 液, 如 仍 有 污 染, 再 重 复 洗 涤 1 次 ; 沉 淀 中 加 入 原 体 积 的 TE 缓 冲 液 2. 低 渗 溶 血 法 按 1 倍 体 积 标 本 加 入 5 倍 体 积 重 蒸 水 混 合, 置 低 温 5 min, 68

73 r/ mi 日 离 心 5 mi 日 ; 弃 上 清 液, 可 重 复 洗 涤 1 次 ; 沉 淀 中 加 入 原 体 积 的 TE 缓 冲 液 3. TT 溶 血 法 TT 溶 血 剂 : 1 % 聚 乙 二 醇 辛 基 苯 基 膛, 20 mmol/l Tris - Hel (ph8.3) 按 等 体 积 混 合 标 本 与 TT 溶 血 剂, r/min 离 心 5 mi 日 ; 弃 上 清 液, 可 重 复 洗 涤 1 次 ; 沉 淀 中 加 入 原 体 积 TE 缓 冲 液 第 二 节 核 酸 浓 度 与 纯 度 测 定 在 临 床 分 子 生 物 学 检 测 中, 核 酸 浓 度 虽 然 不 是 决 定 实 验 成 败 的 主 要 因 素, 但 合 适 的 模 板 浓 度 却 可 以 便 实 验 结 果 更 容 易 判 断, 减 少 实 验 的 重 复 次 数 尤 其 是 近 年 来 基 因 转 录 产 物 检 测 的 增 加, 对 RNA 进 行 准 确 定 量 己 是 一 个 实 验 的 基 本 条 件, 因 此 从 业 人 员 应 该 掌 握 基 本 的 核 酸 定 量 万 法 DNA 的 测 定 紫 外 分 光 光 度 计 测 定 DNA 浓 度 是 实 验 室 最 常 用 的 办 法, 也 是 目 前 实 验 室 最 准 确 的 测 量 万 法, 通 过 读 出 稀 释 样 品 在 260 日 m 与 280 日 m 处 的 吸 光 值 ( 用 D 值 表 示 ), 可 以 计 算 出 样 品 的 DNA 浓 度 与 纯 度 其 计 算 公 式 如 下 : 样 品 DNA 浓 度 二 测 定 的 OD26o X 50μg x 稀 释 倍 数 样 品 DNA 纯 度 二 测 定 的 OD26o -;- 测 定 的 OD 28o 纯 度 较 好 时 比 值 应 在 1. 8 左 右, 低 于 1. 6 提 示 蛋 白 质 污 染 较 重, 需 进 行 纯 化 处 理 当 样 品 DNA 浓 度 低 于 紫 外 分 光 光 度 计 测 定 范 围 时, 可 采 用 澳 乙 皖 染 色 法 粗 略 测 定 双 链 DNA 浓 度 RNA 的 测 定 RNA 测 定 同 样 采 用 紫 外 分 光 光 度 计, 其 计 算 公 式 如 下 : 样 品 RNA 浓 度 二 测 定 的 OD 26o X 40μg x 稀 释 倍 数 样 品 RNA 纯 度 二 测 定 的 OD 26o -;- 测 定 的 OD 28o 纯 度 较 好 时 比 值 应 在 2. 0 左 右, 太 低 提 示 蛋 白 质 污 染 较 重, 需 进 行 纯 化 处 理 ( 杨 元 黄 文 方 ) 参 考 文 献 1 Blin N, Stafford DW. A general method for isolation of high - moleclar weight DNA from eukaryotes. Nucleic Acids Res, 1976, 3: Bowtell DDL. Rapid isolation of eukaryotic DNA. Anal Biochem, 1987, 162: Gross - Bellard M, Oudet P, Chambon P. Isolation of high - moleclar weight DNA from mam malian cells. Eur J Biochem, 1987, 36: Gustafson S, Proper JA, Bowie EJW, et a!. Parameters affecting the yield of DNA from human. 69.

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75 第 六 章 基 因 体 外 扩 增 技 术 1953 年 Waston 和 Crick 提 出 的 DNA 双 螺 旋 结 构 与 半 保 留 复 制 模 型, 标 志 着 医 学 分 子 生 物 学 核 酸 研 究 进 入 了 一 个 全 新 的 阶 段, 为 基 因 体 外 扩 增 技 术 奠 定 了 坚 实 的 理 论 基 础 1971 年 Khorana 等 发 表 文 章 首 次 提 出 体 外 扩 增 基 因 的 设 想, 但 由 于 当 时 技 术 条 件 的 限 制 而 未 被 采 纳 直 到 1983 年, 美 国 Cetus 公 司 人 类 遗 传 研 究 室 科 学 家 Mullis 发 明 了 在 分 子 生 物 学 领 域 具 有 里 程 碑 意 义 的 聚 合 酶 链 反 应 技 术, 使 体 外 基 因 扩 增 真 正 得 以 实 现 1986 年 1988 年 随 着 耐 热 DNA 聚 合 酶 的 分 离 纯 化 和 使 用, PCR 技 术 逐 渐 在 分 于 生 物 学 领 域 得 到 广 泛 应 用 从 1989 年 起, 床 分 子 生 物 学 检 验 最 重 要 的 技 术 平 台 PCR 技 术 开 始 进 入 临 床 应 用, 并 迅 速 成 为 临 第 一 节 聚 合 酶 链 反 应 聚 合 酶 链 反 应 (polymerase chain reactio 日, PCR) 是 1983 年 由 美 国 科 学 家 Mullis 等 发 明 的 一 种 试 管 内 基 因 扩 增 技 术 该 技 术 能 在 数 小 时 内 针 对 性 极 强 地 将 待 检 测 的 基 因 片 段 扩 增 上 百 万 倍, 从 而 使 痕 量 的 目 的 基 因 片 段 在 实 验 室 采 用 常 规 检 测 手 段 被 检 出 PCR 技 术 具 有 易 操 作 快 速 准 确 可 靠 等 显 著 优 点, 在 分 于 生 物 学 领 域 得 到 最 广 泛 应 用, 并 获 得 1993 年 诺 贝 尔 化 学 奖 常 规 PCR 技 术 出 现 后, 一 万 面 继 续 衍 生 出 诸 如 巢 式 PCR 锚 定 PCR 不 对 称 PCR 长 片 段 PCR 等 技 术, 另 一 万 面 与 其 他 分 子 生 物 学 技 术 相 结 合 产 生 如 逆 转 录 PCR PCR - RFLP PCR - SSCP PCR- ASO 等 技 术, 都 进 一 步 拓 展 了 PCR 技 术 的 应 用 范 围 随 着 多 学 科 的 交 融, 尤 其 是 结 合 先 进 的 物 理 学 技 术, 1998 年 出 现 了 一 系 列 全 自 动 荧 光 定 量 PCR 检 测 技 术 其 中, 以 Taqman 技 术 为 典 型 代 表 该 类 技 术 将 PCR 扩 增 与 分 于 荧 光 探 针 杂 交 融 为 一 体, 不 仅 提 高 了 检 测 的 特 异 性, 而 且 克 服 了 常 规 PCR 技 术 不 能 进 行 起 始 模 板 量 确 定 的 不 足, 成 为 目 前 最 精 确 的 靶 基 因 定 量 万 法 的 台 阶 i 亥 类 技 术 使 以 PCR 技 术 为 代 表 的 体 外 基 因 扩 增 技 术 的 应 用 又 边 上 了 一 个 新 一 常 规 聚 合 酶 链 反 应 技 术 的 基 本 原 理 与 特 点 常 规 PCR 技 术 是 目 前 基 因 体 外 扩 增 技 术 的 核 心, 其 本 质 是 分 于 核 酸 杂 交 该 技 术 扩 增 DNA 片 段 的 原 理 和 过 程 与 细 胞 周 期 DNA 复 制 类 似, 惟 一 的 区 别 在 于 其 应 用 了 DNA 1±: 不 同 温 度 条 件 下 快 速 的 复 性 变 性 这 个 物 理 特 性, 使 DNA 的 复 制 能 在 体 外 高 速 地 进 行 常 规 PCR 扩 增 DNA 片 段 大 致 分 为 3 个 步 骤 : 首 先, 双 链 模 板 DNA 在 临 近 j 弗 点 的 温 度 条 件 下 解 链 成 单 链 DNA; 然 后, 在 较 低 温 度 下 形 成 引 物 和 单 链 模 板 DNA 的 稳 定 杂 交 体 ; 最 后, 在 中 等 温 度 下, DNA 聚 合 酶 利 用 4 种 脱 氧 核 昔 三 磷 酸 为 原 料, 在 杂 交 寻 物 的 引 导 下, 按 碱 基 互 补 原 则 合 成 新 的 DNA 双 链 完 成 上 述 3 个 温 度 条 件 下 的 一 个 帽 环 后, 模 板 DNA 数 71

76 量 较 上 一 个 帽 环 末 增 加 1 倍, 如 此 重 复 35 个 帽 环, 则 最 后 理 论 上 模 板 DNA 量 可 扩 增 2 34 { 音 ( 图 6-1) 5' ( 3/ 模 板 DNA 变 性 ~ 3' 刊 基 因 与 引 物 复 性 5' 3' 伸 啊 皿 甲 qdfhun4u JJ' 引 嗣 仲 与 揣 在 合 成 5 第 2~35 次 PeR 拍 环, 步 骤 同 t 理 谁 上 玩 得 NX2 34 拷 贝 产 物 (N 为 起 她 拷 贝 数 ) 图 6-1 per 原 理 示 意 从 上 述 基 本 原 理 不 难 看 出, 常 规 PCR 有 两 个 最 基 本 的 特 点, 即 高 灵 敏 度 与 高 特 异 性 前 者 是 指 该 技 术 对 极 其 微 量 的 模 板 DNA 所 进 行 的 指 数 扩 增, 经 过 常 规 的 35 个 帽 环, 模 板 DNA 可 增 加 数 百 万 倍, 从 而 非 常 容 易 地 被 检 测 到 ; 后 者 是 指 常 规 PCR 选 择 性 扩 增 DNA 片 段 的 针 对 性 极 强, 通 过 设 计 与 模 板 DNA 完 全 互 补 的 一 对 特 异 性 寡 核 昔 酸 引 物, 扩 增 两 引 物 间 的 DNA 片 段, 扩 增 片 段 的 特 异 性 完 全 由 寻 物 序 列 的 特 异 性 决 定 以 两 条 引 物 共 40 个 碱 基 为 例, 其 序 列 的 理 论 特 异 性 高 达 1- (1/4)40 因 此, 在 基 因 组 中 同 时 出 现 两 处 与 两 引 物 完 全 互 补 且 扩 增 片 段 大 小 接 近 的 序 列 几 乎 是 不 可 能 的, 这 正 是 常 PCR 规 高 特 异 性 的 保 证 到 目 前 为 止, 国 外 报 道 常 规 PCR 扩 增 检 测 的 灵 敏 度 达 99% 以 上, 特 异 性 达 98% 以 上 此 外, 常 规 PCR 还 具 有 操 作 简 便 对 标 本 要 求 低 和 快 速 等 显 著 优 点 在 PCR 技 术 出 现 以 前, 常 规 的 分 于 核 酸 检 测 是 提 取 大 量 基 因 组 DNA, 然 后 用 放 射 性 核 素 等 标 i 己 的 寡 核 昔 酸 探 针 进 行 杂 交 检 测 该 万 法 不 仅 对 标 本 量 和 质 的 要 求 甚 高, 而 且 操 作 复 杂 耗 时 长 随 着 PCR 技 术 的 出 现, 检 测 中 不 再 需 要 大 量 的 DNA 模 板, 对 模 板 纯 度 的 要 求 也 大 大 降 低 尤 其 是 耐 热 DNA 聚 合 酶 的 广 泛 应 用, 常 规 PCR 反 应 不 再 需 要 每 个 帽 环 添 加 聚 合 酶, 只 需 在 扩 增 前 将 所 有 原 料 : 昆 匀, 放 入 自 动 化 扩 增 仪 即 可, 因 此 操 作 非 常 万 72

77 便 同 时 由 于 省 去 了 杂 交 及 放 射 自 显 影 等 步 骤, 使 检 测 时 间 大 为 缩 短 1 次 PCR 反 应 与 产 物 分 析 仅 需 3h~4h 即 可 完 成, 充 分 体 现 了 快 速 的 优 点 二 常 规 聚 合 酶 链 反 应 技 术 的 基 本 条 件 (-) PCR 体 系 的 组 成 1. 耐 热 Taq DNA 聚 合 酶 1986 年 1988 年, 耐 热 Taq DNA 聚 合 酶 被 分 离 纯 化 并 应 用 于 PCR 中, 从 而 带 动 了 PCR 技 术 在 分 于 生 物 学 领 域 的 广 泛 应 用 耐 热 Taq DNA 聚 合 酶 与 早 期 PCR 中 使 用 的 大 肠 杆 菌 DNA 聚 合 酶 I 相 比 较, 具 有 耐 高 温 和 最 佳 聚 合 反 应 温 度 较 高 等 明 显 优 势 耐 热 Taq DNA 聚 合 酶 的 应 用 使 PCR 反 应 更 加 简 便, 扩 增 的 特 异 性 更 好 耐 热 Taq DNA 聚 合 酶 同 时 具 有 5' 3' 的 DNA 聚 合 活 性 与 5' 3' 的 核 酸 外 切 酶 活 性 前 者 是 进 行 常 规 PCR 中 合 成 新 链 DNA 的 基 本 条 件, 后 者 则 被 巧 妙 地 应 用 于 近 年 来 出 现 的 一 些 荧 光 定 量 PCR 技 术 中, 如 Taqman 技 术 由 于 耐 热 Taq DNA 聚 合 酶 在 体 外 不 具 备 了 5' 的 核 酸 外 切 酶 活 性, 同 时 缺 乏 细 胞 内 DNA 复 制 时 的 其 他 纠 错 功 能, 因 此 与 体 内 进 行 的 DNA 复 制 相 比, 基 因 体 外 扩 增 更 容 易 发 生 碱 基 的 错 误 配 对 一 般 认 为, 细 胞 内 DNA 复 制 发 生 错 误 的 概 率 大 约 是 1 / 10 9 个 核 昔 酸, 而 体 外 基 因 扩 增 发 生 碱 基 错 配 的 可 能 性 约 为 1 / 10 4 个 核 昔 酸 尽 管 如 此, 在 常 规 PCR 中, 由 于 扩 增 片 段 较 小, 加 之 可 能 发 生 错 配 的 合 成 链 在 扩 增 产 物 中 所 占 比 例 有 限, 因 此 这 种 合 成 过 程 中 的 碱 基 错 配 并 不 对 检 测 结 果 造 成 大 的 影 响 目 前 随 着 一 些 忠 实 程 度 更 高 的 DNA 合 成 酶 如 Tth Pfu 等 的 出 现, 该 问 题 在 常 规 检 测 中 基 本 不 予 考 虑 在 实 际 工 作 中, 一 个 标 准 化 的 PCR 体 系 中 一 般 仅 需 加 入 1 U~2 U 的 耐 热 Taq DNA 聚 合 酶 聚 合 酶 浓 度 不 当 可 导 致 扩 增 质 量 的 下 降 浓 度 过 低, PCR 扩 增 效 率 低 下, 可 导 致 扩 增 失 败 或 产 物 检 测 困 难 ; 反 之, 浓 度 过 高 引 起 错 误 扩 增, 进 而 竞 争 性 抑 制 特 异 性 靶 基 因 扩 增, 甚 至 使 特 异 扩 增 产 物 与 非 特 异 扩 增 难 以 区 分 目 前 国 内 外 各 试 剂 公 司 均 有 高 效 价 的 商 品 化 耐 热 Taq DNA 聚 合 酶 出 售 2. 寡 核 昔 酸 引 物 在 PCR 扩 增 中 引 物 有 引 导 新 链 合 成 的 重 要 作 用, 是 保 证 PCR 扩 增 高 灵 敏 度 和 高 特 异 性 的 重 要 因 素 之 一 在 PCR 技 术 中 主 要 涉 及 引 物 的 设 计 和 引 物 用 量 两 万 面 问 题 首 先 是 引 物 的 序 列 设 计, 一 般 认 为 引 物 序 列 选 择 必 须 满 足 以 下 几 个 基 本 条 件 1 每 条 引 物 的 长 度 应 为 16~25 个 碱 基 寻 物 过 短 会 降 低 扩 增 的 特 异 性, 造 成 非 特 异 扩 增 增 加, 竞 争 性 抑 制 特 异 扩 增, 从 而 降 低 扩 增 的 灵 敏 度 ; 引 物 过 长 则 容 易 形 成 稳 定 的 杂 合 体, 同 时 还 使 检 测 成 本 增 加 引 物 合 成 的 纯 度 下 降, 同 样 不 利 于 实 验 2 每 条 寻 物 的 GC 含 量 应 为 45% ~55%, Tm 值 在 55 'c 以 上 L 值 最 简 单 的 计 算 万 法 是 4 (G+C)+2 (A+T) 3 每 条 引 物 内 或 每 对 引 物 间 不 能 有 多 个 连 续 的 互 补 碱 基 4 每 条 寻 物 自 身 形 成 的 二 级 结 构 中, 非 环 结 构 碱 基 配 对 数 小 于 3 5 两 条 引 物 各 自 的 3' 端 碱 基 不 互 补 6 每 条 引 物 均 有 3' 端 与 5' 端 的 万 向 ' 生 以 上 只 是 引 物 设 计 中 应 注 意 的 一 些 基 本 问 题 实 际 上 影 响 寻 物 作 用 的 因 素 很 多, 在 日 常 工 作 中, 较 多 的 是 采 用 计 算 机 软 件 进 行 辅 助 设 计 其 次, 在 PCR 中 引 物 浓 度 也 非 常 重 要 一 般 认 为 终 浓 度 1 vmol/ L 能 满 足 PCR 反 73

78 应 的 需 要, 在 实 际 工 作 中, 建 议 将 最 低 引 物 浓 度 设 在 0.5 vmo l/ L 左 右 过 低 将 导 致 扩 增 效 率 的 下 降, 反 之 过 高 可 导 致 异 位 引 导 而 使 扩 增 的 特 异 性 下 降 除 以 上 介 绍 的 等 位 基 因 特 异 性 的 寡 核 昔 酸 引 物 的 设 计 外, 随 着 PCR 技 术 的 发 展, 针 对 不 同 的 实 验 检 测 目 的, 有 时 还 需 要 设 计 一 些 与 DNA 模 板 不 完 全 互 补 的 简 并 引 物, 甚 至 错 配 引 物 等 另 外, 在 一 个 PCR 反 应 中 有 时 需 要 两 条 以 上 的 引 物, 如 多 重 PCR 半 巢 式 PCR 等 因 此, 在 PCR 反 应 中 引 物 的 设 计 和 使 用 是 灵 活 多 样 的, 许 多 衍 生 的 PCR 技 术 正 是 在 寻 物 设 计 上 有 许 多 独 特 的 优 势, 从 而 建 立 了 用 途 相 对 专 一 的 技 术 平 台 目 前 国 内 己 有 较 多 的 公 司 在 进 行 寻 物 的 DNA 合 成 3. 脱 氧 核 昔 三 磷 酸 在 PCR 反 应 中 新 链 的 合 成 是 在 寻 物 引 导 下, 耐 热 Taq DNA 聚 合 酶 发 挥 5' 3' 的 DNA 聚 合 活 性, 以 4 种 脱 氧 核 昔 三 磷 酸 dttp, datp, dctp, dgtp 为 基 本 原 料 完 成 的 因 此, 脱 氧 核 昔 三 磷 酸 是 PCR 反 应 3 个 主 要 的 化 学 成 分 之 一 在 PCR 反 应 中, 4 种 脱 氧 核 昔 三 磷 酸 的 浓 度 相 对 恒 定, 即 各 自 的 终 浓 度 均 为 0.2 mmo l/ L 脱 氧 核 昔 三 磷 酸 浓 度 不 宜 过 高, 否 则 会 引 起 非 特 异 扩 增 增 加 由 于 脱 氧 核 昔 三 磷 酸 要 与 游 离 的 旗 高 于 相 结 合, 因 此 其 终 浓 度 的 变 化 调 整 应 同 时 注 意 旗 高 于 浓 度 的 增 减 目 前 各 生 物 试 剂 公 司 都 有 商 品 化 的 脱 氧 核 昔 三 磷 酸 出 售, 使 用 也 相 当 万 便 0 4. 模 板 DNA PCR 的 模 板 DNA 可 以 是 线 形 DNA 如 基 因 组 DNA Ejj(; edna 等, 亦 可 是 环 状 DNA 如 质 粒 Ejj(; 线 粒 体 DNA 等, 其 中 前 者 扩 增 优 于 后 者 通 常 PCR 的 模 板 DNA 量 在 O. 1μg~lμg 基 因 组 DNA, 1 旦 实 际 上 PCR 对 模 板 DNA 的 要 求 很 低, 这 与 既 往 杂 交 检 测 高 纯 度 大 量 DNA 的 要 求 有 很 大 区 别 即 使 是 fg 级 的 模 板 DNA, 通 过 PCR 扩 增 仍 可 达 到 检 出 的 目 的 同 样 PCR 对 DNA 的 纯 度 要 求 也 很 低, 如 在 临 床 病 原 体 检 测 中, 标 本 经 过 高 温 裂 解 即 可 用 于 扩 增, 而 勿 需 进 行 DNA 纯 化 等 步 骤 尽 管 如 此, 应 提 请 注 意 在 模 板 DNA 溶 液 中 的 一 些 抑 制 PCR 的 化 学 物 质 仍 可 能 使 PCR 扩 增 失 败 在 有 类 似 情 况 发 生 时, 万 法 一 是 将 模 板 DNA 溶 液 进 行 稀 释, 从 而 使 抑 制 剂 浓 度 下 降 到 不 至 于 影 响 PCR 的 程 度 ; 万 法 二 是 纯 化 模 板 DNA 再 用 于 扩 增 5. PCR 缓 冲 液 与 细 胞 内 的 DNA 复 制 类 似, PCR 反 应 也 需 要 一 定 的 环 境 条 件, 包 括 各 种 金 属 离 于 ph 值 等 PCR 的 标 准 缓 冲 液 含 有 50 mmol/l KCl, 10 mmol/l Tris - HCl 和 1. 5 mmol/l MgCb 其 中 以 旗 高 于 浓 度 最 为 重 要 在 PCR 中 寻 求 一 个 最 佳 的 佳 离 于 浓 度 与 扩 增 结 果 好 坏 密 切 相 关 通 常 可 以 将 MgCb 设 置 成 不 同 的 浓 度, 如 O. 5 mmo l/ L~5 mmo l/ L, 对 不 同 浓 度 下 扩 增 结 果 进 行 比 较, 从 而 获 得 最 佳 的 旗 高 于 浓 度 应 注 意 的 是 模 板 DNA 溶 液 中 不 应 含 有 高 浓 度 的 EDTA 等 茧 合 剂 以 及 磷 酸 根 等 高 浓 度 的 负 电 荷 离 于 基 团 因 其 可 导 致 PCR 体 系 中 游 离 的 棋 高 于 浓 度 下 降 而 影 响 扩 增 目 前 在 商 品 化 的 耐 热 Taq DNA 聚 合 酶 中 一 般 同 时 带 有 10 X PCR 缓 冲 液, 不 需 自 行 配 制 6. PCR 增 强 剂 在 PCR 反 应 中, 一 些 特 殊 的 化 学 物 质 有 促 进 PCR 反 应 的 作 用, 如 DMSO, PEG , BSA 等 将 其 加 入 反 应 体 系 中 可 以 提 高 PCR 的 产 量, 增 强 其 特 异 性 目 前 部 分 试 剂 公 司 己 有 商 品 化 的 PCR 增 强 剂 出 售 7. 常 用 的 PCR 反 应 体 系 组 成 常 用 的 PCR 反 应 体 系 组 成 详 见 表

79 表 6-1 per 反 应 体 系 组 成 PCR 组 分 耐 热 Taq DNA 聚 合 酶 寡 核 昔 酸 引 物 脱 氧 核 昔 三 磷 酸 模 板 DNA 10 x PCR 缓 冲 液 其 他 成 分 与 去 离 子 水 终 浓 度 4 X 10 4 U/L 0.2μmol/ L~5μmol/ L, 通 常 每 条 0.5μmol/ L 每 种 dntp 200μmol/ L O. 004 g/l ~O. 04 gil 1 x PCR 缓 冲 液 补 足 25μl 体 积 8. PCR 加 样 中 应 注 意 的 问 题 PCR 是 目 前 核 酸 检 测 中 的 核 心 步 骤 为 保 证 PCR 的 成 功 进 行, 在 各 成 分 的 泪 匀 加 样 中 务 必 注 意 一 些 实 际 问 题 包 括 :1 耐 热 Taq DNA 聚 合 酶 从 20 'c 冰 箱 拿 出 后, 应 置 于 冰 上 ;2 脱 氧 核 昔 三 磷 酸 应 缓 慢 解 冻, 切 勿 加 热, 解 冻 后 置 于 冰 上 ;3 寡 核 昔 酸 引 物 如 常 规 使 用, 可 分 成 小 体 积 置 于 4 'c 保 存, 以 免 反 复 解 冻 ;4 模 板 DNA 溶 液 使 用 体 积 一 般 控 制 在 5 ILl 以 下, 否 则 PCR 抑 制 剂 可 能 影 响 结 果 ;5 根 据 各 试 剂 的 加 样 体 积 和 溶 液 性 质, 最 好 固 定 一 定 的 加 样 顺 序, 如 去 离 于 水 10 XPCR 缓 冲 液 脱 氧 核 昔 三 磷 酸 寡 核 昔 酸 引 物 耐 热 Taq DNA 聚 合 酶 ;6 目 前 为 了 获 得 更 特 异 的 PCR 扩 增 产 物, 可 采 用 热 启 动 PCR 的 万 法, 即 在 反 应 温 度 升 到 80 'c 以 上 时, 才 让 所 有 的 反 应 成 分 混 合, 这 样 可 避 免 反 应 成 分 预 先 混 合 后 在 低 温 下 产 生 引 物 二 聚 体 或 非 特 异 结 合 所 造 成 的 非 特 异 扩 增 但 该 万 法 由 于 成 本 较 高, 临 床 应 用 有 限 ( 二 ) PCR 的 循 环 条 件 1. 模 板 DNA 变 性 双 链 DNA 标 本 必 须 先 经 过 高 温 变 性, 使 其 解 链 成 单 链 DNA 才 有 可 能 与 引 物 结 合 形 成 杂 合 体 因 此, 模 板 DNA 变 性 非 常 重 要 变 性 的 温 度 一 般 在 92 'c ~95 'c 之 间 温 度 过 低, 模 板 变 性 不 彻 底 可 能 减 低 扩 增 效 率 ; 温 度 过 高, 可 能 使 耐 热 TaqDNA 聚 合 酶 活 性 下 降 过 快, 同 样 不 利 于 PCR 扩 增 DNA 变 性 除 温 度 要 求 外, 对 高 温 持 续 的 时 间 亦 需 严 格 掌 握 一 般 常 规 PCR 在 进 入 帽 环 前, 需 要 一 个 持 续 时 间 较 长 的 高 温 状 态, 通 常 3 min~5 min, 以 利 于 双 链 DNA 的 充 分 变 性 进 入 帽 环 后, 每 个 帽 环 变 性 持 续 时 间 一 般 在 30 s~45 s 变 性 时 间 长 短 对 PCR 扩 增 的 影 响 与 温 度 类 似 2. 引 物 与 单 链 模 板 复 性 PCRt 盾 环 第 二 个 步 骤 是 低 温 复 性 随 着 反 应 体 系 温 度 从 高 温 迅 速 下 降 到 低 温, 体 系 内 发 生 各 种 复 性 反 应, 包 括 原 有 DNA 双 链 自 身 复 性 和 DNA 单 链 与 引 物 复 性 其 中, 后 者 是 实 验 所 需 的 由 于 体 系 中 引 物 分 于 数 量 巨 大, 因 此 肯 定 有 部 分 引 物 能 与 DNA 单 链 模 板 形 成 稳 定 的 杂 交 体, 从 而 为 新 链 延 伸 提 供 必 要 条 件 PCR 反 应 复 性 温 度 的 控 制 非 常 重 要, 一 般 围 绕 引 物 序 列 的 Tm 值 确 定, 通 常 为 55 'c ~65 'c 之 间 温 度 过 低 可 造 成 较 多 的 非 特 异 扩 增 ; 温 度 过 高 虽 然 为 反 应 提 供 了 更 严 格 的 条 件, 但 也 可 能 使 靶 基 因 扩 增 失 败 因 此, 通 过 实 验 选 择 一 个 合 适 的 复 性 温 度 是 PCR 实 验 中 经 常 面 临 的 问 题 至 于 复 性 时 间, 一 般 30 s~45 s 可 以 满 足 常 规 PCR 的 要 求 3. 寻 物 延 伸 与 新 链 合 成 PCR t 盾 环 第 三 步 是 中 温 延 伸 在 耐 热 Taq DNA 聚 合 酶 的 作 用 下, 以 结 合 在 单 链 DNA 上 的 引 物 为 引 导, 利 用 体 系 中 的 脱 氧 核 昔 三 磷 酸 为 原 料, 根 据 碱 基 互 补 原 则, 新 链 不 断 合 成 该 步 骤 的 温 度 一 般 在 72 'C, 该 温 度 最 有 利 于 耐 热 Taq DNA 聚 合 酶 发 挥 聚 合 作 用 其 持 续 的 时 间 与 扩 增 的 靶 片 段 长 度 有 关, 片 段 越 长,. 75.

80 时 间 越 长 一 般 45 s~90 s 己 能 满 足 常 规 PCR 的 要 求, 持 续 时 间 过 长 可 导 致 非 特 异 扩 增 4. 常 用 的 PCR 反 应 条 件 常 用 的 PCR 反 应 条 件 详 见 表 表 6-2 per 的 反 应 条 件 步 骤 温 度 持 续 时 间 'lt-'e 'D 预 变 性 3 min~5 min C 92 c ~ 95 变 性 30 s~45 s C 55 c ~ 65 复 性 u 句 30 s~45 s q 年 25 uζ 个 循 环 C 延 伸 72 c 45 s~90 s 充 分 延 伸 72 c 5 min 5. PCR 条 件 设 置 应 注 意 的 问 题 在 PCR t 盾 环 条 件 中,1 复 性 温 度 的 摸 索 是 最 常 见 的, 可 先 设 置 55 'C, 如 非 特 异 扩 增 较 多, 依 次 升 高 l'c~2'c, 直 到 得 到 较 好 的 扩 增 产 物 ;2PCR 反 应 中 高 温 时 间 最 好 不 要 超 过 1 mi 日, 以 免 DNA 聚 合 酶 夫 活 过 快 ;3 在 一 些 PCR 反 应 中, 由 于 复 性 温 度 与 延 伸 温 度 接 近, 可 以 把 复 性 与 延 伸 合 并, 进 而 形 成 两 步 法 扩 增, 但 这 种 情 况 下 第 二 步 的 时 间 相 应 延 长 至 60 s ~ 90 s; 4 在 一 些 衍 生 的 PCR 技 术 中, 如 多 重 PCR 等, 扩 增 条 件 应 做 相 应 的 变 动 三 常 规 聚 合 酶 链 反 应 产 物 的 分 析 PCR 只 是 将 获 得 的 微 量 DNA 标 本 在 体 外 进 行 了 靶 基 因 片 段 的 充 分 扩 增, 还 必 须 有 相 应 的 扩 增 产 物 检 测 万 法 才 能 进 行 观 察 目 前 最 常 用 的 常 规 PCR 产 物 检 测 万 法 是 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 结 合 澳 化 乙 陡 染 色 与 聚 丙 烯 酌 肢 凝 胶 电 泳 结 合 银 染 显 色 技 术 (-) 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 琼 脂 糖 I~ 是 胶 电 泳 是 实 验 室 最 常 用 的 分 离 鉴 定 DNA 片 段 的 万 法 将 荧 光 染 料 澳 化 乙 陡 加 入 琼 脂 糖 I~ 是 胶, 在 电 泳 后 直 接 在 紫 外 光 下 可 见 橙 红 色 的 DNA 条 带 其 检 出 的 灵 敏 度 可 达 1 日 g 以 上 的 DNA o 在 琼 脂 糖 I~ 是 胶 电 泳 时 应 注 意 以 下 几 个 万 面 的 问 题 1. 琼 脂 糖 浓 度 与 有 效 分 离 范 围 电 泳 中 琼 脂 糖 的 使 用 浓 度 取 决 于 待 检 测 的 靶 片 段 的 长 短, 不 同 的 浓 度 有 不 同 的 DNA 分 于 有 效 分 离 范 围 由 于 常 规 PCR 通 常 的 扩 增 片 段 为 100~600 个 碱 基, 因 此 可 选 择 表 6-3 的 浓 度 表 6-3 琼 脂 糖 质 量 浓 度 (gi L) 琼 脂 糖 分 离 DNA 片 段 的 有 效 范 围 DNA 的 有 效 分 离 范 围. 4~6 O. 2~3 O. 1 ~2 (kb) 2. 电 泳 电 压 与 电 泳 时 间 电 泳 电 压 的 变 化 要 影 响 琼 脂 糖 的 有 效 分 离 范 围, 因 此 在 常 规 PCR 产 物 的 分 离 时, 每 厘 米 凝 胶 所 加 电 压 一 般 在 lo V~15V, 电 泳 时 间 在 20 mi 日 ~40 min 电 压 过 大 不 仅 会 降 低 有 效 分 离 范 围, 而 且 由 于 电 流 过 大 会 导 致 琼 脂 糖 温 度 过 度 升 高, 引 起 漠 化 乙 睫 的 蒸 发, 对 环 境 造 成 危 害 3. 澳 化 乙 睫 的 使 用 作 为 一 种 琼 脂 糖 中 DNA 的 染 色 剂, 首 先 要 指 出 它 是 一 种 中. 76.

81 度 毒 性 的 强 诱 变 剂 使 用 过 程 中 必 须 加 强 自 我 保 护, 含 漠 化 乙 睫 的 废 液 必 须 经 净 化 处 理 澳 化 乙 院 后 才 能 丢 弃, 否 则 会 造 成 环 境 污 染 澳 化 乙 睫 的 储 存 质 量 浓 度 通 常 为 10 gil, 室 温 闭 光 保 存, 在 琼 脂 糖 中 终 质 量 浓 度 为 0.5 mgll 也 可 以 上 述 浓 度 加 入 电 泳 缓 冲 液 中 电 泳 或 电 泳 后 用 含 漠 化 乙 睫 的 溶 液 浸 泡, 但 由 于 易 扩 大 污 染, 建 议 直 接 混 入 琼 脂 糖 凝 胶 中 使 用 在 电 泳 中 漠 化 乙 院 也 要 发 生 迁 移, 其 万 向 与 DNA 相 反 因 此, 在 经 过 较 长 时 间 电 泳 后 可 以 发 现 琼 脂 糖 凝 胶 的 负 极 端 荧 光 强 度 明 显 低 于 正 极, 此 为 正 常 现 象 但 也 提 示, 电 泳 时 间 不 宜 过 长, 以 免 过 多 的 漠 化 乙 院 进 入 电 泳 缓 冲 液 琼 脂 糖 可 以 反 复 使 用, 1 且 更 容 易 造 成 实 验 室 污 染, 因 此 并 不 提 倡 0 4. 电 泳 缓 冲 液 电 泳 缓 冲 液 的 作 用 是 为 电 泳 提 供 足 够 的 高 于 强 度, 使 DNA 在 琼 脂 糖 中 发 生 迁 移 目 前 较 为 常 用 的 缓 冲 液 是 TAE 与 TEE, 其 中 TEE 由 于 能 提 供 更 强 的 缓 冲 容 量, 因 此 在 实 验 中 被 广 泛 使 用 二 者 的 基 本 组 成 详 见 表 表 6-4 电 j 永 缓 冲 j 夜 组 成 与 配 置 缓 冲 液 使 用 液 贮 存 液 TAE TBE 1 x 0.04 mol/l Tris 乙 酸.01 mol/l EDTA 0.5 X: mol/l Tris 棚 酸.01 mol/l EDTA 50 X: 242 g Tris 碱 57.1 m! 冰 乙 酸 5 x 54 g Tris 碱 27.5 g 棚 酸 20 m! O. 5 mmo!/l EDTA (ph 8.0) 电 泳 缓 冲 液 使 用 量 以 淹 没 凝 胶 为 准 琼 脂 糖 I~ 是 胶 配 制 时 使 用 的 缓 冲 液 应 与 电 泳 缓 冲 液 一 致 由 于 电 泳 缓 冲 液 一 般 均 重 复 使 用 因 此 进 入 其 中 的 澳 化 乙 院 也 是 实 验 室 的 污 染 源 之 一 另 外, 缓 冲 液 的 重 复 使 用 一 般 不 应 超 过 3 次, 以 免 其 ph 值 的 变 化 影 响 电 泳 效 果 5. 电 泳 上 样 缓 冲 液 在 PCR 产 物 电 泳 上 样 前 必 须 与 上 样 缓 冲 液 混 合 其 目 的 主 要 是 : 增 加 产 物 密 度, 使 上 样 孔 中 的 产 物 DNA 更 易 沉 入 孔 底 ; 上 样 缓 冲 液 起 着 颜 色 指 示 剂 的 作 用, 使 电 泳 操 作 更 为 万 便 其 次, 缓 冲 液 中 的 澳 酣 蓝 在 电 泳 中 有 一 定 的 迁 移 率, 可 以 提 示 产 物 DNA 移 动 的 距 离, 有 助 于 判 断 电 泳 结 束 的 时 间 常 规 使 用 的 双 链 DNA 电 泳 上 样 缓 冲 液 类 型 详 见 表 6-50 表 6-5 常 规 使 用 的 双 链 DNA 电 泳 上 样 缓 冲 液 类 型 缓 冲 液 类 型 I E 6x 缓 冲 液 25% 滨 盼 蓝 0.25% 二 甲 苯 青 FF 400 gil 煎 糖 水 溶 液.25% 滇 西 方 蓝 0.25% 二 甲 苯 青 FF 贮 存 温 度 4 C 室 温 15 % 聚 煎 糖 水 溶 液 旧 旧 25% 滇 西 方 蓝 4 C 400 gil 煎 糖 水 溶 液 6. PCR 产 物 的 观 察 将 电 泳 完 毕 的 琼 脂 糖 凝 胶 置 于 波 长 为 254 日 m Ejj(; 302 日 m 的 紫 77

82 外 光 照 射 下, 可 以 清 楚 地 看 到 PCR 产 物 所 产 生 的 DNA 条 带 由 于 强 紫 外 光 对 角 膜 和 皮 肤 有 损 害, 建 议 在 观 察 时 戴 眼 镜, 持 续 时 间 不 宜 过 长 7. 琼 脂 糖 电 泳 中 应 注 意 的 问 题 琼 脂 糖 电 泳 是 PCR 产 物 最 常 用 的 检 测 手 段, 与 其 他 检 测 相 比 更 万 便 快 速 但 在 电 泳 操 作 中 应 注 意 一 些 实 际 问 题 :1 根 据 产 物 片 段 大 小 选 择 最 佳 的 琼 脂 糖 浓 度 ;2 电 泳 电 压 不 宜 过 大, 以 免 琼 脂 糖 分 辨 率 下 降 ;3 当 电 泳 目 的 是 分 离 产 物 片 段 时, 可 适 当 延 长 电 泳 时 间 ;4 琼 脂 糖 胶 与 电 泳 缓 冲 液 不 应 长 时 间 使 用, 一 般 使 用 3 次 后 应 更 换, 同 时 冲 洗 电 泳 槽 ;5 凡 是 操 作 中 涉 及 到 澳 化 乙 睫, 均 应 戴 一 次 性 手 套 以 加 强 自 我 保 护 ( 二 ) 聚 丙 f 蒂 固 先 服 服 胶 电 泳 聚 丙 烯 酌 肢 I~ 是 胶 电 泳 是 PCR 产 物 检 测 的 重 要 万 法 之 一 其 与 琼 脂 糖 电 泳 相 比 较, 特 别 适 合 于 片 段 大 小 相 近 的 多 个 PCR 产 物 的 分 离, 分 辨 率 可 高 达 1 个 碱 基 / 500 个 碱 基 片 段 在 基 因 诊 断 中 可 用 于 基 因 突 变 筛 查 微 卫 星 等 位 基 因 分 析 等 1 旦 聚 丙 烯 酌 肢 I~ 是 胶 电 泳 操 作 较 琼 脂 糖 电 泳 复 杂, 成 本 也 较 高 1. 聚 丙 烯 酌 肢 凝 胶 质 量 浓 度 与 有 效 分 离 范 围 详 见 表 表 6-6 聚 丙 烯 酷 肢 凝 胶 的 DNA 片 段 有 效 分 离 范 围 聚 丙 烯 肮 胶 (gil) 有 效 分 离 范 围 60~400 40~200 6~ 100 (bp) 2. 非 变 性 聚 丙 烯 酌 肢 I~ 是 胶 的 制 备 首 先 需 配 置 如 下 贮 存 液 (1) 30% 丙 烯 酌 肢 (29 / 1) : 丙 烯 酌 肢 29 g, N, N' 亚 甲 双 丙 烯 酌 肢 1 g, 加 水 至 100 ml, 4'C 保 存 (2) 10xTBEa (3) 10 % 过 硫 酸 按 : 过 硫 酸 按 1 g, 力 口 水 至 10 ml, 4'C 保 存 配 置 不 同 浓 度 的 聚 丙 烯 酌 肢 凝 胶 详 见 表 表 6-7 不 同 浓 度 的 聚 丙 烯 酷 肢 凝 胶 配 置 试 剂 80 gil 120 gil 200 gil 30% 丙 烯 肮 胶 26.6 m! 40.0 m! 66.6 m! 10 x TBE 0.0 m 0.0 m 0.0 m 10% 过 硫 酸 饺 7 m! 0.7 m! 7 m! TE 肌 1ED m!.035 m! m! 去 离 子 水 62.7 m! 43.9 m! m! 3. 电 泳 玻 板 的 硅 化 处 理 聚 丙 烯 酌 肢 凝 胶 电 泳 一 般 是 将 I~, 是 胶 灌 入 两 块 玻 璃 板 之 间 实 现 的, 在 电 泳 结 束 后, 必 须 将 两 块 玻 板 分 开, 以 进 一 步 染 色 观 察 因 此, 在 灌 胶 前 需 要 先 硅 化 玻 板, 使 玻 板 分 开 时 凝 胶 能 牢 固 地 附 着 在 其 中 一 块 玻 板 上, 同 时 另 一 块 玻 板 不 会 因 为 粘 连 而 使 凝 胶 破 裂 两 块 玻 板 应 分 别 用 亲 和 硅 ; 院 与 排 斥 硅 ; 院 处 理, 具 体 万 法 如 下 (1) 排 斥 硅 炕 处 理 : 玻 板 洗 净 后, 用 无 水 乙 醇 洗 1 次 然 后, 取 氯 仿 1 r 址, 排 斥 硅 ; 院 50 vi, ~ 昆 匀 后 均 匀 涂 抹 于 玻 板 上, 并 标 记 干 燥 后 用 无 水 乙 醇 洗 1 次 即 可 使 用 78

83 (2) 亲 和 硅 ; 院 处 理 : 玻 板 洗 净 后, 用 无 水 乙 醇 洗 1 次 然 后, 耳 又 无 水 乙 醇 ml, 冰 乙 酸 330μ1, 亲 和 硅 ; 院 4μ1, 乙 醇 洗 1 次 即 可 使 用 j 昆 匀 后 均 匀 涂 抹 于 玻 板 上, 并 标 记 干 燥 后 用 无 水 4. 聚 丙 烯 酌 肢 I~ 是 胶 电 泳 的 条 件 (1) 电 压 : 聚 丙 烯 酌 肢 凝 胶 电 泳 对 电 压 的 要 求 更 高, 一 般 需 要 高 压 电 源, 每 厘 米 凝 胶 电 压 5 V~15 V 电 压 过 高 可 能 导 致 电 流 过 大 而 使 凝 胶 温 度 升 高 或 不 均 匀, 产 生 电 泳 条 带 发 生 弯 曲 等 现 象 而 不 利 于 判 读 尤 其 是 当 电 泳 槽 无 帽 环 冷 却 水 时 更 应 适 当 控 制 电 压 (2) 电 泳 缓 冲 液 : 聚 丙 烯 酌 肢 I~, 是 胶 电 泳 所 需 要 的 缓 冲 强 度 比 琼 脂 糖 更 大, 因 此 常 规 使 用 1 x TEE 作 为 电 泳 缓 冲 液 可 反 复 使 用, 但 一 般 不 超 过 3 次 5. 聚 丙 烯 酌 肢 凝 胶 电 泳 结 果 的 观 察 以 往 电 泳 后 可 用 漠 化 乙 陡 染 色, 但 该 万 法 污 染 较 重, 因 此 现 在 很 少 使 用 另 外 放 射 性 核 素 标 记 寻 物 或 掺 入 合 成, 放 射 自 显 影 i 卖 取 结 果 也 是 常 用 的 万 法 但 该 法 存 在 放 射 性 核 素 污 染 等 问 题, 在 大 多 数 实 验 室 己 基 本 不 用 目 前 使 用 较 广 泛 的 检 测 万 法 是 DNA 银 染 DNA 银 染 操 作 万 法 如 下 : (1) 电 泳 后 将 玻 板 分 离, 将 附 着 凝 胶 的 玻 板 放 入 重 蒸 水 中 清 洗 1 次 ; (2) 倒 去 重 蒸 水, 用 10% 的 乙 醇 固 定 10 mi 日 ; (3) 重 蒸 水 清 洗 1 次 后, 用 1% 的 硝 酸 浸 泡 10 mi 日 ; (4) 重 蒸 水 清 洗 1 次 后, 用.2% 的 硝 酸 银 浸 泡 30 min; (5) 重 蒸 水 清 洗 1 次 后, 新 鲜 配 制 的 3% 碳 酸 铀 浸 泡, 直 至 DNA 条 带 显 影 ; (6) 10% 冰 乙 酸 浸 泡 定 影 DNA 银 染 的 灵 敏 度 比 漠 化 乙 陡 染 色 更 高, 与 放 射 性 核 素 放 射 自 显 影 相 近, 但 其 操 作 更 简 便, 无 污 染 及 快 速 等 优 点 显 著 在 操 作 中, 各 步 时 间 并 不 是 一 成 不 变 的, 可 根 据 实 验 室 的 情 况 自 行 摸 索 需 要 注 意 的 是 硝 酸 银 溶 液 和 碳 酸 铀 溶 液 应 保 持 新 鲜, 否 则 可 能 影 响 银 染 效 果 另 外, 在 室 温 较 低 的 冬 季, 为 保 证 较 快 显 色, 可 在 碳 酸 铀 显 色 时, 将 溶 液 温 度 升 高 至 40 'c 左 右 6. 聚 丙 烯 酌 肢 凝 胶 电 泳 应 注 意 的 问 题 聚 丙 烯 酌 肢 凝 胶 电 泳 操 作 较 复 杂, 因 此 应 尽 量 保 证 1 次 实 验 的 效 果, 以 避 免 重 复 在 实 验 中 应 注 意 :1 灌 胶 时 应 快 速 稳 妥, 以 避 免 时 间 过 长 导 致 未 注 入 的 液 状 凝 胶 凝 固, 必 要 时 可 将 盛 有 液 I~ 状 是 胶 的 容 器 置 于 冰 水 中 ; 2 灌 胶 时 应 匀 速, 避 免 产 生 气 泡 而 影 响 DNA 条 带 的 迁 移 ;3 在 凝 胶 交 联 凝 固 后 点 样, 届 时 可 从 梳 齿 底 部 的 折 光 度 变 化 观 察 ;4 点 样 前 可 先 在 低 电 压 下 预 电 泳 30 min, 以 使 凝 胶 保 持 均 一 状 态 ;5 电 泳 时 间 的 长 短 以 片 段 分 离 效 果 来 决 定, 应 注 意 上 样 缓 冲 液 中 颜 色 指 示 剂 与 片 段 的 相 对 迁 移 速 度 和 距 离, 以 免 片 段 逸 出 I~ 是 胶 四 常 规 聚 合 酶 链 反 应 的 常 见 问 题 与 解 决 办 法 常 规 PCR 的 原 理 虽 然 比 较 简 单, 但 其 结 果 的 不 确 定 性 非 常 强,PCR 所 涉 及 的 各 成 分 之 间 相 互 作 用 与 相 互 影 响 的 复 杂 程 度 是 其 他 分 子 生 物 学 技 术 无 法 比 拟 的 因 此, 在 常 规 PCR 的 实 验 中, 经 常 会 遇 到 各 种 问 题 而 要 解 决 这 些 问 题 则 需 要 对 PCR 有 比 较 深 刻 的 认 识. 79.

84 (-) 无 预 想 片 段 的 扩 增 1. 常 见 原 因 (1) Taq DNA 聚 合 酶 活 性 丧 失 (2) 模 板 DNA 污 染 阵 解 或 使 用 浓 度 过 高 (3) dntp 失 效 (4) 使 用 未 含 棋 高 于 的 反 应 缓 冲 液 或 棋 高 于 浓 度 过 低 (5) 操 作 误 差, 一 种 试 剂 未 加 入 反 应 体 系 (6) PCR 复 性 温 度 过 高 (7) 仪 器 控 温 故 障 2. 基 本 解 决 步 骤 (1) 观 察 仪 器 温 度 控 制 的 精 确 度 (2) 换 用 其 他 实 验 证 实 有 效 的 Taq DNA 聚 合 酶 (3) 换 用 其 他 实 验 证 实 有 效 的 dntpo (4) 降 低 PCR 复 性 温 度 (5) 提 高 棋 高 于 浓 度 (6) 加 入 BSA DMSO 等 PCR 增 强 剂 (7) 将 一 定 量 的 模 板 DNA 溶 液 ( 如 5μ1~10μ1) 进 行 琼 脂 糖 电 泳, 观 察 有 无 明 显 基 因 组 DNA 存 在, 如 无, 适 当 加 大 模 板 DNA 用 量 (8) 如 电 泳 有 明 显 基 因 组 DNA, 可 稀 释 模 板 DNA, 与 第 一 次 同 等 量 扩 增 (9) 选 用 一 对 PCR 各 种 条 件 均 明 确 的 引 物, 对 模 板 DNA 进 行 扩 增 仍 无 扩 增 提 示 模 板 DNA 存 在 问 题 ( 二 ) 菲 特 异 扩 增 产 物 过 多 1. 常 见 原 因 (1) PCR 复 性 温 度 过 低 (2) Taq DNA 聚 合 酶 使 用 量 过 大 (3) 旗 高 于 浓 度 过 高 (4) 引 物 浓 度 过 大 (5) 模 板 DNA 用 量 过 大 (6) 仪 器 控 温 故 障 2. 基 本 解 决 步 骤 (1) 观 察 仪 器 温 度 控 制 的 精 确 度 (2) 提 高 PCR 复 性 温 度 (3) 降 低 棋 高 于 浓 度 (4) 降 低 引 物 浓 度 (5) 减 小 模 板 DNA 用 量 (6) 减 少 PCRt 盾 环 次 数 ( 三 ) 西 面 化 试 剂 扩 增 无 预 想 产 物 1. 常 见 原 因 80

85 (1) 试 剂 失 效 (2) 仪 器 控 温 不 准 确 (3) 核 酸 模 板 溶 液 存 在 较 多 的 抑 制 PCR 反 应 化 学 成 分 (4) 核 酸 模 板 扩 增 位 点 变 异 导 致 寻 物 不 能 结 合 或 杂 交 不 稳 固 2. 基 本 解 决 步 骤 (1) 设 置 外 阳 性 对 照 (2) 稀 释 核 酸 模 板 溶 液 或 蛋 白 酶 K 消 化 重 提 取 核 酸 (3) 换 用 其 他 公 司 试 剂 以 扩 增 靶 基 因 的 其 他 位 点 五 常 规 聚 合 酶 链 反 应 的 局 限 性 常 规 PCR 以 其 不 可 替 代 的 技 术 优 势 而 被 广 泛 应 用 于 分 于 生 物 学 的 各 个 领 域, 并 很 快 成 为 核 心 技 术 然 而, 它 有 4 个 万 面 的 缺 陷 局 限 其 在 临 床 上 的 应 用 目 前 认 为 常 规 PCR 的 临 床 应 用 是 以 结 合 其 他 分 于 生 物 学 技 术 ( 如 核 酸 杂 交 ) 或 检 测 的 重 复 一 致 性 为 基 础 的 其 不 足 分 述 如 下 ( 一 ) 易 污 染 常 规 PCR 检 测 的 高 灵 敏 度 决 定 了 其 发 生 污 染 的 高 风 险 性 这 种 污 染 不 同 于 以 往 其 他 技 术 所 涉 及 的 范 畴, 而 主 要 是 指 实 验 室 内 的 PCR 产 物 污 染 ( carryover) 0 在 防 污 染 措 施 比 较 严 格 的 实 验 室, 污 染 源 常 常 是 PCR 扩 增 结 束 后, 进 行 开 管 的 产 物 检 测 过 程 中, 含 有 PCR 产 物 的 气 溶 胶 逸 入 空 气, 进 而 掉 入 新 扩 增 管 造 成 的 因 此, 在 进 行 常 规 PCR 电 泳 检 测 时, 比 较 容 易 出 现 实 验 室 污 染 在 实 验 室 应 建 立 污 染 预 警 机 制, 常 规 设 置 阴 性 对 照 一 旦 发 现 大 范 围 的 假 阳 ' 生, 应 首 先 考 虑 实 验 室 污 染 首 先 必 须 明 确 污 染 的 来 源, 以 避 免 污 染 的 扩 大 ; 其 次, 实 验 室 应 及 时 停 止 同 种 PCR 扩 增 ; 如 必 须 继 续 进 行 检 测, 应 变 更 实 验 场 所 和 所 用 器 材 和 工 具 ; 对 实 验 室 进 行 全 面 的 防 污 染 处 理, 包 括 加 强 空 气 流 动 稀 酸 擦 拭 用 具 与 台 面 近 距 离 紫 外 线 照 射 等 ; 经 上 述 处 理 后, 再 进 行 PCR 扩 增 阴 性 对 照 以 确 定 污 染 是 否 消 除 由 于 PCR 的 实 验 室 污 染 一 旦 发 生, 寻 找 原 因 和 消 除 污 染 比 较 困 难 因 此, 目 前 实 验 室 采 取 了 一 些 有 效 的 预 防 性 措 施, 包 括 :1 使 用 dutp - UNG 酶 系 统, 利 用 UNG 酶 阵 解 含 尿 P~ 睫 的 DNA 模 板 的 特 性, 防 止 PCR 产 物 污 染 该 万 法 在 广 泛 应 用 中 己 被 证 实 能 有 效 防 止 10 8 PCR 产 物 分 于 污 染 2 提 升 PCR 产 物 检 测 技 术, 利 用 完 全 闭 管 操 作 防 止 PCR 产 物 外 逸 目 前 荧 光 检 测 技 术 是 一 个 典 型 的 例 于 3 严 格 按 照 PCR 检 测 环 境 条 件 的 要 求 执 行 PCR 扩 增 实 验 室 必 须 将 PCR 产 物 检 测 前 操 作 与 PCR 产 物 检 测 在 空 间 上 严 格 区 分, 并 做 单 向 走 动, 在 最 大 限 度 上 防 止 PCR 产 物 对 新 扩 增 的 影 响 ; 同 时 各 区 域 使 用 的 器 具 必 须 严 格 固 定, 不 得 随 意 搬 动 等 PCR 扩 增 的 污 染 一 直 是 困 扰 其 临 床 使 用 的 核 心 问 题 如 何 最 大 限 度 地 避 免 污 染 是 摆 在 每 个 基 因 扩 增 实 验 室 面 前 的 难 题 这 就 促 使 每 个 从 业 人 员 必 须 严 格 按 照 操 作 规 程 进 行 实 验, 这 样 才 能 有 效 避 免 污 染 的 发 生 ( 二 ) 不 能 定 量 检 测 常 规 PCR 的 定 性 能 力 是 勿 庸 质 疑 的, 1 旦 缺 乏 对 起 始 模 板 量 的 确 定 能 力, 这 就 限 制 81

86 了 它 的 临 床 应 用 众 所 周 知, PCR 对 模 板 DNA 的 扩 增 分 为 3 个 时 期, 即 指 数 前 期 指 数 期 和 平 台 期 其 中, 在 不 考 虑 扩 增 效 率 差 异 的 前 提 下, 扩 增 指 数 期 的 起 始 点 帽 环 数 与 起 始 模 板 量 有 一 定 的 函 数 关 系 然 而, 常 规 PCR 是 一 个 无 法 实 时 检 测 的 过 程, 因 此, 根 本 不 知 道 扩 增 指 数 期 的 起 始 点 帽 环 数, 也 不 知 道 何 时 进 入 平 台 期 在 35 个 帽 环 结 束 时, 扩 增 可 能 己 进 入 平 台 期, 而 不 同 起 始 模 板 量 的 扩 增 可 能 在 平 台 期 的 DNA 产 量 相 近, 因 此 无 法 准 确 确 定 起 始 模 板 量 在 临 床 实 际 工 作 中, 对 病 情 的 观 察 和 疗 效 的 确 定 都 需 要 进 行 定 量 检 测 因 此, 常 规 PCR 无 法 承 担 这 一 工 作 目 前 PCR 技 术 与 荧 光 实 时 检 测 技 术 的 结 合 为 精 确 的 定 量 检 测 开 辟 了 一 条 道 路, 并 被 应 用 于 临 床 病 原 体 定 量 检 测 中 ( 三 ) 特 异 性 不 能 得 到 很 好 保 证 常 规 PCR 的 特 异 性 由 寻 物 序 列 的 特 异 性 决 定 引 物 共 40 个 ~50 个 连 续 的 碱 基, 在 理 论 上 其 序 列 的 特 异 性 极 高, 在 各 种 生 物 基 因 组 DNA 中 出 现 与 引 物 序 列 完 全 互 补 的 两 个 位 点 几 乎 不 可 能 发 生 但 即 使 如 此, 常 规 PCR 产 物 中 仍 然 有 许 多 非 特 异 扩 增 出 现 有 两 个 基 本 原 因 : 扩 增 时 少 数 碱 基 错 配 造 成 错 误 引 导, 故 而 扩 增 出 非 靶 序 列 ; 其 次, 寻 物 自 身 复 性 延 伸, 形 成 大 量 的 二 聚 体 等 因 此 不 难 看 出, 常 规 PCR 产 物 检 测 的 干 扰 因 素 较 多, 甚 至 造 成 结 果 判 断 的 困 难 常 规 PCR 的 特 异 性 可 以 通 过 PCR 产 物 杂 交 来 解 决, 即 通 过 杂 交, 利 用 特 异 性 探 针 对 PCR 产 物 内 部 碱 基 序 列 进 行 鉴 定, 以 确 定 PCR 产 物 是 否 是 持 检 的 靶 序 列 既 往 核 酸 杂 交 需 要 用 放 射 性 核 素 等 标 记, 操 作 复 杂 污 染 重 所 需 时 间 长, 并 不 适 合 于 临 床 使 用 目 前 采 用 荧 光 技 术 结 合 Taq DNA 聚 合 酶 的 核 酸 外 切 酶 活 性 进 行 检 测, 不 仅 保 证 了 PCR 扩 增 的 高 灵 敏 度, 而 且 由 于 加 入 了 一 条 与 靶 序 列 互 补 的 特 异 探 针, 使 PCR 扩 增 与 杂 交 同 时 完 成, 极 大 地 提 高 了 PCR 检 测 的 特 异 性 ( 四 ) 人 为 因 素 影 响 明 显 常 规 PCR 的 整 个 操 作 均 是 由 人 工 完 成, 尤 其 是 结 果 判 读 中 人 为 因 素 影 响 极 大 在 经 验 不 足 的 实 验 室, 人 为 因 素 的 干 扰 是 造 成 结 果 判 断 错 误 的 主 要 原 因 因 此, 可 以 认 为 人 的 因 素 在 常 规 PCR 检 测 中 占 有 举 足 轻 重 的 作 用 在 常 规 PCR 中, 人 为 因 素 造 成 实 验 误 差 可 能 有 如 下 原 因 : 人 员 素 质 低 下, 对 分 于 生 物 学 了 解 极 其 有 限, 无 法 独 立 作 出 判 断 或 判 断 错 误 ; 实 验 室 质 量 控 制 能 力 差, 出 现 实 验 室 污 染 而 导 致 假 阳 性 或 假 阴 性 结 果 ; 实 验 操 作 人 员 无 可 执 行 的 相 对 固 定 与 规 范 的 实 验 程 序, 随 意 性 大, 造 成 PCR 操 作 某 个 环 节 被 忽 略 或 错 误 执 行, 导 致 假 阳 性 或 假 阴 性 结 果 ; 操 作 人 员 不 能 认 识 和 分 析 电 泳 结 果, 直 接 造 成 判 读 错 误, 这 是 最 常 见 的 原 因 在 常 规 PCR 工 作 中, 人 的 因 素 也 是 比 较 难 以 避 免 的 问 题 这 也 正 是 现 在 临 床 病 原 体 基 因 检 测 中 不 提 倡 使 用 常 规 PCR 电 泳 万 法 的 主 要 原 因 之 一 但 在 遗 传 病 基 因 诊 断 中 不 可 避 免 地 要 使 用 常 规 PCR 技 术, 因 此 针 对 上 述 问 题, 可 以 从 3 个 万 面 着 手 解 决 首 先 加 强 人 员 素 质 培 养, 包 括 业 务 素 质 和 认 真 仔 细 负 责 的 精 神, 以 提 高 操 作 人 员 发 现 判 断 和 分 析 问 题 的 能 力 ; 其 次, 加 强 实 验 室 质 量 控 制 工 作, 从 制 度 上 保 证 检 测 结 果 的 可 靠 性 ; 再 次, 以 检 测 结 果 的 可 重 复 性 保 证 其 准 确 性. 82.

87 六 常 规 聚 合 酶 链 反 应 的 临 床 应 用 举 例 尽 管 常 规 PCR 电 泳 检 测 在 临 床 病 原 体 检 测 中 己 被 禁 止 使 用, 但 作 为 一 种 基 因 体 外 扩 增 的 技 术 平 台, 其 作 用 仍 然 是 不 可 替 代 的 在 国 内 外 遗 传 性 疾 病 的 基 因 诊 断 中 被 广 泛 使 用, 其 检 测 的 特 异 性 主 要 通 过 结 果 的 重 复 一 致 性 来 保 证 下 面 举 例 说 明 ( 一 ) 例 - 1. 疾 病 名 称 杜 / 贝 氏 肌 营 养 不 良 症 (Duchenne and Becker muscular dystrophy, DMD / BMD), 又 称 进 行 性 肌 营 养 不 良 症 或 假 肥 大 性 肌 营 养 不 良 症 2. 疾 病 临 床 简 介 杜 / 贝 氏 肌 营 养 不 良 症 是 由 于 肌 营 养 不 良 蛋 白 遗 传 缺 陷 而 致 的 一 种 X 连 锁 隐 性 遗 传 病 发 病 率 约 为 1/3500 是 一 种 临 床 最 为 常 见 的 神 经 肌 肉 系 统 疾 病 患 者 往 往 在 儿 童 期 发 病, 表 现 为 进 行 性 肌 无 力 和 排 肠 肌 假 性 肥 大, 一 般 在 12 岁 左 右 下 肢 瘫 痪, 约 20 岁 ~30 岁 死 于 帽 环 和 呼 吸 衰 竭, 给 家 庭 和 社 会 带 来 沉 重 的 负 担 由 于 该 病 治 疗 困 难, 因 此 通 过 产 前 基 因 诊 断 进 行 检 查 防 止 患 儿 出 生 成 为 避 免 该 病 发 生 最 有 效 的 手 段 3. 疾 病 的 分 于 病 理 改 变 DMD 基 因 己 被 定 位 于 Xp21, 由 79 个 exons 及 其 相 应 的 内 含 子 组 成, 约 2300 kb, 是 目 前 发 现 的 人 类 最 大 的 基 因, 也 是 分 于 病 理 学 机 制 己 基 本 明 确 的 遗 传 病 之 一 在 过 去 几 年 时 间 里, 世 界 范 围 内 对 患 者 DMD 基 因 的 异 常 进 行 了 大 量 的 研 究, 从 而 积 累 了 较 丰 富 的 正 常 群 体 和 患 病 群 体 的 资 料 现 有 研 究 表 明 :1 患 者 的 基 因 异 常 大 致 可 分 为 两 类, 即 缺 失 型 和 非 缺 失 型 ;2 缺 失 型 约 占 患 者 的 60%, 非 缺 失 型 约 占 40% ;3 基 因 缺 失 有 两 个 明 显 的 热 点, 分 别 在 基 因 5'~ 击 和 中 央 区 4. 基 因 诊 断 基 本 策 略 针 对 DMD 基 因 缺 失 高 发 区 外 显 于 设 计 引 物 进 行 多 重 PCR 扩 增, 通 过 扩 增 带 的 有 无 判 断 DMD 基 因 的 缺 失 情 况, 作 出 明 确 的 直 接 基 因 诊 断 5. 基 因 诊 断 万 法 多 重 PCR 高 分 辨 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 漠 化 乙 陡 染 色 / 多 重 PCR 聚 丙 烯 酌 肢 I~ 是 胶 电 泳 银 染 6. 寻 物 的 选 用 引 物 的 选 用 参 见 表 6-80 表 6-8 Chamberlain 和 Beggs 的 系 列 引 物 引 物 名 称 引 物 序 列 (5' 3') 片 段 大 小 (bp) 第 一 组 exon45 - F AAACATGGAACATCCTTGTGGGGAC 547 exon45 - R CATTCCTATTAGATCTGTCGCCCTAC exo 巳 48 - F TTGAATACATTGGTTAAATCCCAACATG 506 exo 巳 48 - R CCTGAATAAAGTCTTCCTTACCATAC exon19 - F GATGGCAAAAGTGTTGAGAAAAAGTC 459 exon19 - R TTCTACCACATCCCATTTTCTTCCA exon17-f GACTTTCGATGTTGAGATTACTTTCCC 416 exon17-r AAGCTTGAGATGCTGTCACCTTTTCC exon51 - F GAAATTGGCTCTTTAGCTTGTGTTTC 388 exon51 - R GGAGAGTAAAGTGATGGGGGGAAAATC exo 巳 8- F GGCCTCATTCGCATGTTCTAATTAG 360 exo 巳 8- R GTCCTTTACACACTTTACCTGTGGAG exon12 - F GATAGTGGGCTTTACTTACATCCTTC 331 exon12 - R GAAAGCACGCAACATAAGATACACCT 83

88 ( 续 表 6-8) 引 物 名 称 引 物 序 列 (5' 3') 片 段 大 小 (bp) exon44 - F CTTGATCCATATGCTTTTACCTGCA 268 exon44 - R TCCATCACCCTTCAGAACCTGATCT exon4 - F TTGTCGGTCTCTCTGCTGGTCAGTG 196 exon4 - R CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 第 二 组 exon1 - F GAAGATCTAGACAGTGGATACATAACAAATGCATG 535 exon1 - R TTCTCCGAAGGTAATTGCCTCCCAGATCTGAGTCC exon3 - F TCATCCATCATCTTCGGCAGATTAA 410 exon3 - R CAGGCGGTAGAGGATGCCAAATGAAAATCA exon43 - F GAACATGTCAAAGTCACTGGACTTCATGG 357 exon43 - R ATATATGTTTTACCTACCCTCGTCGGTCC exo 巳 50 - F CACCAAAGGGATTAAGATGTTCATGAAT 271 exo 巳 50 - R TCTCTCTCACCCAGTCATCACTTCATAG exon13 - F AATAGGAGTACCTGAGATGTAGCAGAAAT 238 exon13 - R CTGACCTTAAGTGTTCTTCCAAAGCAG exo 巳 6- F CCACATGTAGGTCAAAAATGTAATGAA 202 exo 巳 6- R GTCTCAGTAATCTTCTTACCTATGACTATGG exon47 - F CGTTGTTGCATTTGTCTGTTTCAGTTAC 181 exon47 - R GTCTAACCTTTATCCACTGGAGATTTG exo 巳 60 - F AGGAGAAATTGCGCCTCTGAAAGAGAACG 139 exo 巳 60 - R CTGCAGAAGCTTCCATCTGGTTTTCAGG exon52 - F AATGCAGGATTTGGAACAGAGGCGTCC 113 exon52 - R TTCGATCCGTAATGATTGTTCTAGCCTC 内 对 照 SRY-F GAATATTCCCGCTCTCCGGA 472 SRY-R GCTGGTGCTCCATTCTTGAG 7. 多 重 PCR 体 系 组 成 多 重 PCR 体 系 组 成 详 见 表 表 6-9 多 重 PCR 体 系 组 成 PCR 组 分 耐 热 Taq DNA 聚 合 酶 寡 核 背 酸 引 物 脱 氧 核 昔 三 磷 酸 终 浓 度 LOU 每 条 0.5μmol/ L 每 种 dntp 200μmol/ L 模 板 DNA O. 1μg~l fig 10 x PCR 缓 冲 液 1. 6 x PCR 缓 冲 液 其 他 成 分 与 去 离 子 水 补 足 25μl 体 积 8. 多 重 PCR 的 反 应 条 件 多 重 PCR 的 反 应 条 件 详 见 表 6-10 表 6-10 多 重 PCR 的 反 应 条 件 步 骤 温 度 持 续 时 间 预 变 性 94 C 3 min 变 性 94 C 30 s 复 性 3 句 5 个 循 :q; 55 C 30 s 84. 延 伸 72 C 60 s

89 9. 电 泳 检 测 条 件 电 泳 检 测 条 件 详 见 表 表 6-11 电 泳 条 件 电 泳 方 法 琼 脂 糖 i 疑 胶 电 泳 聚 丙 烯 眈 胶 凝 胶 电 泳 i 疑 胶 浓 度 电 泳 缓 冲 液 相 对 分 子 质 量 标 记 检 泪 方 法 4.5% 高 分 辨 胶 0.5 X TBE 100 bp Ladder 漠 化 乙 院 染 色 80 gil (29 : 1) 1. 0 X TBE 100 bp Ladder 银 染 显 色 10. 正 常 电 泳 图 举 例 详 见 图 SlZl a Exon b Size.. Exon b 3 国 r~ 国 彗 Pm 图 6-2 DMD/BMD 外 显 子 缺 失 筛 查 电 泳 图 ( 摘 自 Chamberlain 和 Beggs) 11. 检 测 结 果 的 判 断 具 备 以 下 条 件 的 基 因 缺 失 结 果 可 被 判 断 为 有 效 :1 内 对 照 SRY 基 因 被 扩 增 ;2 阴 性 对 照 无 扩 增 ;3 两 次 以 上 的 检 测 均 提 示 某 一 片 段 或 某 些 片 段 的 缺 失,E\l(; 家 系 中 两 个 以 上 患 者 均 发 生 相 同 的 基 因 缺 失 需 要 注 意 DMD 基 因 缺 失 最 常 见 于 第 45 外 显 于 到 第 52 外 显 于 区 域 12. 基 因 诊 断 的 临 床 意 义 DMD 的 直 接 基 因 诊 断 具 有 重 要 的 临 床 意 义 其 一, 对 肌 病 患 者 进 行 临 床 确 诊 ; 其 二, 对 月 几 病 患 者 进 行 异 常 基 因 的 鉴 别 诊 断 ; 其 三, 确 定 家 系 中 DMD 基 因 异 常 性 质, 为 携 带 者 筛 查 与 产 前 基 因 诊 断 提 供 必 要 的 核 酸 信 息 13. 基 因 诊 断 的 有 效 范 围 与 局 限 DMD 基 因 的 缺 失 筛 查 范 围 较 广, 涵 盖 了 所 有 缺 失 热 区, 可 以 检 测 出 98% 的 缺 失 患 者 但 仍 有 2% 的 缺 失 患 者 漏 检 另 外, 尚 有 15% ~40% 的 患 者 系 DMD 基 因 微 小 缺 失 插 入 或 基 因 单 碱 基 突 变 引 起, 用 该 万 法 无 法 检 出 因 此, 在 出 示 基 因 诊 断 报 告 时 必 须 客 观 陈 述, 不 能 简 单 地 作 出 肯 定 或 否 定 的 结 论 ( 二 ) 例 二 1. 疾 病 名 称 遗 传 性 脊 髓 小 脑 性 共 济 失 调 (hereditary spinocerebellar ataxia,. 85.

90 SCA)o 2. 疾 病 临 床 简 介 该 疾 病 是 一 组 以 慢 性 进 行 性 步 态 失 调 为 特 征 的 遗 传 性 疾 病, 常 伴 有 手 会 话 和 眼 运 动 的 不 协 调 检 查 有 小 脑 萎 缩 临 床 相 当 常 见 3. 疾 病 的 分 于 病 理 改 变 该 类 疾 病 遗 传 异 质 性 很 强, 相 关 致 病 基 因 广 泛 分 布 于 基 因 组 内, 其 中 SCA1 定 位 于 6p23, SCA2 定 位 于 12q24, SCA3 定 位 于 14q21, SCA6 定 位 于 19p13, SCA7 定 位 于 3p21 这 类 疾 病 都 是 各 自 基 因 编 码 区 CAG 三 核 昔 酸 重 复 异 常 扩 展 引 起, 是 动 态 突 变 疾 病 因 为 CAG 编 码 谷 氨 酸, 因 此 这 些 疾 病 又 称 为 多 聚 谷 氨 酸 病 基 因 诊 断 可 对 SCA1, 2, 3, 6, 7 等 基 因 作 出 准 确 检 测 4. 基 因 诊 断 基 本 策 略 针 对 SCA 基 因 三 核 昔 酸 重 复 区 设 计 引 物 进 行 常 规 PCR 扩 增, 通 过 与 相 对 分 于 质 量 标 记 的 比 较 确 定 扩 增 带 大 小 是 否 超 过 正 常 临 界 值, 进 而 判 断 SCA 基 因 CAG 的 重 复 情 况, 作 出 明 确 的 直 接 基 因 诊 断 5. 基 因 诊 断 万 法 其 基 因 诊 断 万 法 采 用 常 规 PCR 聚 丙 烯 酌 肢 凝 胶 电 泳 银 染 6. 寻 物 的 选 用 引 物 的 选 用 参 见 表 表 6-12 SCA 引 物 表 基 因 位 点 引 物 名 称 引 物 序 列 (5' 3') SCA1 Rep-2 CAACATGGGCAGTCTGAG Rep-1 AACTGGAAATGTGGACGTAC SCA2 SCA2- A GGGCCCCTCACCATGTGC SCA2- B CGGGCTTGCGGACATTGG SCA3 M]D52 CCAGTGACTACTTTGATTCG M] D25 TGGCCTTTCACATGGATGTGAA SCA6 S- 5 - F1 CACGTGTCCTATTCCCCTGTGATCC S R1 TGGGTACCTCCGAGGGCCGCTGGTG SCA7 4U1 024 TGTTACATTGTAGGAGCGGAA 4U716 CACGACTGTCCCAGCATCACTT 7. 实 验 参 数 实 验 参 数 详 见 表 因 位 - A1 A 2 A A3 A6 7 乍 L--ccccc 主 - Q U Q U Q U Q U Q U 占 川 表 6-13 SCA 实 验 参 数 引 物 名 称 PCR 产 物 正 常 长 度 (bp) Rep - 2 / Rep - 1 SCA2 - A / SCA2 - B M]D5 2 / M]D25 S F1 / S R1 4U1 024 /4U716 <237 < 151 <280 < 160 <330 PCR 产 物 异 常 长 度 (bp) >240 >169 >340 >163 > 常 规 PCR 体 系 常 规 PCR 体 系 详 见 表 表 6-14 SCA PCR 反 应 体 系 组 成 PCR 组 分 耐 热 Taq DNA 聚 合 酶 寡 核 背 酸 引 物 脱 氧 核 背 三 磷 酸 终 浓 度 1. 0U 每 条 O. 5μmol/L 每 种 dntp 200μmol/ L. 86.

91 ( 续 表 6-14) PCR 组 分 模 板 DNA 10 x PCR 缓 冲 液 10 x PCR 增 强 剂 去 离 子 水 终 浓 度 1μg~lμE 1. 0 x PCR 缓 冲 液 1. 0 x PCR 增 强 剂 补 足 25μl 体 积 9. PCR 的 反 应 条 件 PCR 的 反 应 条 件 详 见 表 表 6-15 SCA PCR 扩 增 条 件 基 因 位 点 变 性 温 度 复 性 温 度 延 伸 温 度 循 环 数 SCA1 94 c, 30 s 57 c, 30 s 72 c, 30 s 25 SCA2 94 c, 30 s 57 c, 30 s 72 c, 30 s 25 SCA3 94 c, 30 s 57 c, 30 s 72 c, 30 s 24 SCA6 94 c, 30 s 57 c, 30 s 72 c, 30 s 27 SCA7 94 c, 30 s 55 c, 30 s 72 c, 30 s 电 泳 检 测 条 件 电 泳 检 测 条 件 详 见 表 表 6-16 SCA 电 泳 条 件 电 泳 方 法 i 疑 胶 浓 度 电 泳 缓 冲 液 相 对 分 子 质 量 标 记 检 测 方 法 聚 丙 烯 肮 胶 凝 胶 电 泳 80 gil (29 I 1) 1. 0 x TBE 10 bp~ 100 bp Ladder 银 染 显 色 11. 正 常 电 泳 图 举 例 详 见 图 No. 1 No. 2 No bp 200 bp 图 个 标 本 的 SCA3 基 因 扩 增 图 谱 12. 检 测 结 果 的 判 断 具 备 以 下 条 件 的 基 因 异 常 扩 增 结 果 可 被 判 断 为 有 效 :1 内 对 照 基 因 被 扩 增 ;2 阴 性 对 照 无 扩 增 ;3 两 次 以 上 的 检 测 均 提 示 某 一 基 因 位 点 CAG 的 异 常 扩 增,E\l(; 家 系 中 两 个 以 上 患 者 均 发 生 相 同 的 基 因 异 常 须 注 意 : SCA3 的 异 常 率 最 高 13. 基 因 诊 断 的 临 床 意 义 SCA 基 因 诊 断 的 临 床 意 义 在 于. 遗 传 性 共 济 失 调 的 临 床 确 诊 分 型 ; 遗 传 性 共 济 失 调 的 基 因 鉴 别 诊 断 ; 遗 传 性 共 济 失 调 的 症 状 前 诊 断. 87.

92 14. 基 因 诊 断 的 有 效 范 围 与 局 限 遗 传 性 共 济 失 调 所 涉 及 的 基 因 较 多, 因 此 上 述 基 因 诊 断 仅 能 检 出 约 50% 的 常 染 色 体 显 性 共 济 失 调 的 患 者 在 出 示 基 因 诊 断 报 告 时 必 须 客 观 陈 述, 不 能 简 单 地 下 一 个 否 定 的 结 论 另 外, 由 于 每 个 患 者 均 有 两 个 等 位 基 因, 因 此 当 结 果 只 显 示 一 条 PCR 扩 增 带 时, 应 考 虑 到 两 种 可 能 :1 患 者 两 个 等 位 基 因 是 纯 合 的, 不 影 响 结 果 判 断 ;2 由 于 一 个 等 位 基 因 大 量 的 异 常 扩 展, 使 扩 增 片 段 过 长, 常 规 PCR 无 法 扩 增 此 时, 可 采 取 3 种 万 法 鉴 别 :1 结 合 患 者 父 母 的 SCA 基 因 扩 增 结 果 判 断 ;2 采 用 长 PCR 万 法 扩 增 该 位 点 ;3 进 行 杂 交 检 测 ( 三 ) 例 三 1. 疾 病 名 称 男 性 原 发 无 精 / 寡 精 症 2. 疾 病 临 床 简 介 不 育 是 一 个 世 界 性 的 问 题 据 WHO 报 道, 世 界 范 围 内 不 育 症 的 发 病 率 高 达 15%, 其 中 男 性 因 素 引 起 的 约 占 一 半 在 我 国, 文 献 报 道 不 育 症 的 发 病 率 为 12.5%, 男 性 不 育 发 病 率 为 5%~6% 男 性 不 育 是 一 类 复 杂 疾 病, 在 排 除 环 境 因 素 后, 尚 有 部 分 患 者 的 病 因 不 明, 称 为 原 发 不 育 据 WHO 统 计, 为 原 发 不 育, 最 常 见 的 症 状 是 无 精 症 和 少 精 症 % 的 男 性 不 育 近 年 来 的 研 究 表 明, 男 性 不 育 与 遗 传 因 素 有 关, 尤 其 与 Y 染 色 体 微 缺 失 密 切 相 关 在 细 胞 遗 传 学 层 面, 众 所 周 知, Y 染 色 体 是 男 性 所 特 有 的 性 染 色 体, 决 定 着 性 别 分 化, 而 且 越 来 越 多 的 实 验 证 实 与 男 性 生 精 过 程 有 关 1976 年, Tiepolo 等 在 无 精 症 患 者 中 证 实 Yqll 区 域 的 缺 失, 进 而 首 先 提 出 无 精 症 因 于 (azoospermia factor, AZF) 随 后 的 研 究 进 一 步 发 现 Yqll 与 常 染 色 体 易 位 后 导 致 无 精 症 1992 年, Vogt 等 在 对 无 精 症 的 研 究 中 更 进 一 步 将 AZF 定 位 于 Yql 1. 22~ 由 于 患 者 的 染 色 体 核 型 正 常, 因 此 这 种 缺 失 称 为 微 缺 失 ( microdeletio 川 随 着 研 究 深 入 到 分 于 领 域, 更 多 的 研 究 证 实 原 发 无 精 患 者 有 7% ~15% 有 Y 染 色 体 微 缺 失, 远 高 于 正 常 对 照 组, 并 证 实 Y 染 色 体 微 缺 失 还 与 少 精 症 相 关 目 前, 欧 洲 国 家 己 开 展 对 Y 染 色 体 微 缺 失 的 实 验 室 筛 查, 并 形 成 一 个 比 较 标 准 的 程 序 美 国 等 己 开 发 出 商 品 化 的 Y 染 色 体 微 缺 失 基 因 诊 断 试 剂 盒 在 我 国, 通 过 Y 染 色 体 微 缺 失 分 于 流 行 病 学 调 查, 确 定 中 国 人 缺 失 的 区 域 和 特 点 将 有 助 于 开 展 该 项 检 查 Y 染 色 体 微 缺 失 的 基 因 诊 断 在 医 学 领 域 的 应 用 包 括 :1 通 过 对 男 性 不 育 患 者 的 遗 传 缺 陷 筛 查, 对 患 者 的 临 床 诊 断 及 治 疗 措 施 的 选 择 有 很 强 的 指 导 意 义 ;2 随 着 出 生 缺 陷 工 程 的 启 动 和 辅 助 生 殖 ( 如 人 工 受 精 试 管 婴 儿 等 ) 工 作 规 模 的 不 断 扩 大, 考 虑 到 Y 染 色 体 做 缺 失 可 造 成 遗 传 性 不 育, 因 此 无 精 / 寡 精 患 者 在 进 行 细 胞 质 内 体 外 受 精 前 均 应 常 规 筛 查 Y 染 色 体 微 缺 失 3. 疾 病 的 分 于 病 理 改 变 由 于 男 性 生 精 过 程 的 极 端 复 杂 性, 运 今 为 止, 尚 未 确 定 任 何 与 原 发 性 无 精 / 寡 精 症 发 生 相 关 的 致 病 基 因 Y 染 色 体 微 缺 失 与 原 发 性 无 精 / 寡 精 症 的 关 联 是 以 大 规 模 分 于 流 行 病 学 调 查 结 果 为 基 础 的 由 于 可 能 发 生 微 缺 失 的 染 色 体 区 域 较 大, 包 含 的 基 因 较 多, 这 些 基 因 与 该 病 的 关 系 并 未 得 到 最 后 确 定, 但 其 中 DAZ 基 因 在 患 者 中 缺 失 发 生 率 最 高, 是 原 发 性 无 精 / 寡 精 症 最 重 要 的 候 选 基 因 4. 基 因 诊 断 基 本 策 略 设 计 引 物 对 AZF3 个 区 域 进 行 缺 失 筛 查, 每 个 区 域 选 择 88

93 2 个 ~3 个 位 点 进 行 多 重 PCR 扩 增 一 旦 发 现 缺 失, 单 独 扩 增 缺 失 点 确 认 5. 基 因 诊 断 万 法 其 基 因 诊 断 万 法 采 用 多 重 PCR 高 分 辨 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 澳 化 乙 陡 染 色 或 多 重 PCR 聚 丙 烯 酌 肢 凝 胶 电 泳 银 染 6. 寻 物 的 选 用 引 物 的 选 用 参 见 表 表 6-17 AZF 微 缺 失 筛 查 引 物 表 引 物 名 称 引 物 序 列 (5' 3') 片 段 大 小 (bp) 第 一 组 sy86 - F sy86 - R sy127 - F sy127 - R sy254-f sy254-r 第 二 组 sy84 - F sy84 - R sy134 - F sy134 - R sy255 - F sy255 - R 内 对 照 SRY-F SRY-R ZFY-F ZFY-R GTGACACACAGACTATGCTTC ACACACAGAGGGACAACCCT GGCTCACAAACGAAAAGAAA CTGCAGGCAGTAATAAGGGA GGGTGTTACCAGAAGGCAAA GAACCGTATCTACCAAAGCAG AGAAGGGTCTGAAAGCAGGT GCCTACTACCTGGAGGCTTC GTCTGCCTCACCATAAAACG ACCACTGCCAAAACTTTCAA GTTACAGGATTCGGCGTGAT CTCGTCATGTGCAGCCAC GAATATTCCCGCTCTCCGGA GCTGGTGCTCCATTCTTGAG ACCRCTGTACTGACTGTGATTACAC CTCGTCATGTGCAGCCAC 常 规 PCR 体 系 常 规 PCR 体 系 详 见 表 表 6-18 AZF 筛 查 per 体 系 组 成 PCR 组 分 耐 热 Taq DNA 聚 合 酶 寡 核 背 酸 引 物 脱 氧 核 背 三 磷 酸 模 板 DNA 10 x PCR 缓 冲 液 其 他 成 分 与 去 离 子 水 LOU 终 浓 度 每 条 O. 5μmol/ L 每 种 dntp 200μmol/ L 0.1μg~1μE 1. 6 x PCR 缓 冲 液 补 足 25μl 体 积 8. PCR 的 反 应 条 件 PCR 的 反 应 条 件 详 见 表

94 表 6-19 AZF 筛 查 per 条 件 步 骤 温 度 持 续 时 间 预 变 性 变 性 0A H 体 J A 4 叫 E,J F F 3 min 30 s 复 性 延 伸 35 个 循 环 飞 U / h u 飞 U F 3 30 s 4 min 9. 电 泳 检 测 条 件 电 泳 检 测 条 件 详 见 表 表 6-20 AZF 筛 查 电 泳 条 件 电 泳 方 法 i 疑 胶 浓 度 电 泳 缓 冲 液 相 对 分 子 质 量 标 记 检 测 方 法 琼 月 旨 糖 i 疑 胶 电 泳 4.5% 高 分 辨 胶.5 x TBE 100 bp Ladder 滨 化 乙 院 染 色 聚 丙 烯 眈 胶 凝 胶 电 泳 80 gil (29 : 1) 1. a x TBE 100 bp Ladder 银 染 显 色 10. 电 泳 图 举 例 详 见 图 M N F Ml M2 M3 M N F 岛 1.l M2 M3 图 6-4 AZF 筛 查 电 泳 图 ( 摘 自 EMQN) M: DNA marker N: 阴 性 对 照 F 正 常 女 性 M1: 正 常 男 性 M2: sy127 与 sy134 缺 失 M3: sy254 与 sy255 缺 失 七 主 要 的 临 床 聚 合 酶 链 反 应 相 关 技 术 以 PCR 基 本 原 理 为 基 础 的 常 规 PCR 技 术 出 现 后 许 多 研 究 者 根 据 自 身 的 工 作 需 要, 对 PCR 技 术 进 行 了 一 些 改 进, 先 后 发 展 出 一 些 新 的 PCR 技 术 下 面 简 要 介 绍 几 种 常 用 的 PCR 相 关 技 术 90

95 (-) 多 重 PCR E 如 前 面 介 绍 的 DMD 直 接 基 因 诊 断, 多 重 PCR (multi - PCR) 在 临 床 中 也 被 广 泛 应 用 其 基 本 原 理 是 在 一 个 PCR 体 系 中, 有 两 对 E\l(; 两 对 以 上 的 寻 物, 共 用 相 同 的 模 板 DNA, 分 别 扩 增 模 板 DNA 上 不 同 的 基 因 位 点 由 于 扩 增 的 基 因 片 段 长 度 上 有 差 异, 因 此 常 规 用 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 可 将 其 不 同 片 段 分 离 多 重 PCR 的 最 大 优 点 是 简 并 性 和 较 高 的 检 测 通 量, 与 常 规 PCR 相 比 也 更 加 经 济 但 有 更 高 的 技 术 要 求, 尤 其 是 引 物 设 计 0 多 重 PCR 的 困 难 之 处 在 于 如 何 控 制 各 对 引 物 在 相 同 的 条 件 下 均 有 较 好 的 扩 增 效 率, 而 且 非 特 异 扩 增 必 须 控 制 在 最 低 程 度 因 此, 对 其 操 作 需 要 较 专 业 的 实 验 室 或 较 现 成 的 试 剂 盒 与 常 规 PCR 相 比, 多 重 PCR 扩 增 的 各 成 分 做 如 下 调 整 : 引 物 长 度 在 25 个 ~35 个 碱 基, 以 增 加 引 物 与 模 板 结 合 的 稳 定 性 和 扩 增 的 特 异 性, 避 免 非 特 异 扩 增 影 响 结 果 判 读 ; 寻 物 用 量 适 当 提 高 ; 各 寻 物 的 L 值 接 近, 以 便 于 在 相 同 扩 增 条 件 下 进 行 反 应 ; 寻 物 之 间 的 相 互 作 用 应 降 低 到 最 小 程 度, 避 免 过 多 的 寻 物 聚 合 体 形 成 ; 反 应 体 系 中 dntp 与 旗 高 于 浓 度 适 当 提 高, 避 免 竞 争 抑 制 发 生 ; 反 应 体 系 中 缓 冲 液 有 两 个 选 择, 一 是 提 高 缓 冲 液 终 浓 度, 如 采 用 (1. 6~2) X 缓 冲 液, 二 是 采 用 多 重 PCR 专 用 缓 冲 液, 其 组 成 (5 x): 83 mmol/l (NH4)2S04, 335 mmol/l Tris - HCl (ph 8.8), 33.5 mmol/l MgCb, 50 mmol/l Mercapthoethanol, 34 mmol/l EDTA; Taq DNA 聚 合 酶 的 用 量 可 适 度 增 加 其 他 条 件 与 常 规 PCR 基 本 一 致 在 实 际 应 用 中, 考 虑 到 许 多 非 确 定 因 素 的 影 响, 多 重 PCR 扩 增 结 果, 尤 其 是 当 发 现 某 对 寻 物 无 扩 增 时, 必 须 单 独 重 复 扩 增 以 验 证 多 重 PCR 在 临 床 检 测 中 应 用 较 多, 尤 其 在 对 一 个 基 因 或 区 域 多 个 位 点 进 行 筛 查 时, 如 DMD 基 因 缺 失 诊 断 男 性 原 发 无 精 / 寡 精 Y 染 色 体 AZF 区 域 微 缺 失 诊 断 地 中 海 贫 血 特 异 性 寡 核 昔 酸 探 针 基 因 突 变 筛 查 等 多 重 PCR 如 图 6-5 所 示 ( 二 ) 巢 式 PCR 巢 式 PCR (nested - PCR) 又 称 套 式 PCR, 其 基 本 原 理 是 设 计 一 对 外 侧 寻 物 与 一 对 内 侧 寻 物 依 次 扩 增 同 一 个 基 因 位 点, 最 后 对 内 侧 引 物 扩 增 的 PCR 产 物 进 行 检 测 巢 式 PCR 的 最 大 优 点 是 能 对 极 低 浓 度 的 模 板 DNA 进 行 高 灵 敏 度 检 测 但 它 也 存 在 对 PCR 产 物 进 行 操 作 时 易 发 生 实 验 室 污 染 的 问 题 在 巢 式 PCR 的 操 作 中, 特 别 应 注 意 防 止 PCR 产 物 的 污 染 用 内 侧 引 物 做 第 二 次 PCR 扩 增 时, 应 控 制 模 板 体 积 在 实 际 应 用 中, 巢 式 PCR 扩 增 必 须 有 阴 性 对 照 巢 式 PCR 在 临 床 上 可 用 于 扩 增 一 些 拷 贝 数 极 低 的 病 原 体 标 本 巢 式 PCR 图 例 如 图 6-6 所 示 ( 三 ) 长 PCR 长 PCR (10 日 g- PCR) 是 一 种 能 扩 增 5 kb 以 上 基 因 片 段 的 万 法 与 常 规 PCR 相 比, 其 对 扩 增 区 域 变 化 的 适 应 性 强, 在 临 床 中 尤 其 适 合 于 动 态 突 变 疾 病 基 因 序 列 重 复 异 常 扩 展 等 位 基 因 的 基 因 诊 断 在 长 PCR 的 操 作 中, 有 与 常 规 PCR 不 同 的 地 万 首 先 是 长 PCR 扩 增 对 模 板 DNA 91

96 PI2 P22 P32 P42 - 一 一.. pa - 一 一 -. P21 一 一 一 一 -+ P31 一 一 一 一 ' P41 一 - 图 6-5 多 重 PCR 电 泳 图 P12! 卢 并 11 一 一 一 ~ jp21 图 6-6 巢 式 PCR 图 例 的 要 求 远 远 高 于 常 规 PCR, 必 须 提 取 高 质 量 的 DNA, 才 能 提 供 扩 增 所 需 的 完 整 模 板 就 基 因 组 模 板 DNA 的 浓 度 而 言, 其 最 小 用 量 应 在 25 ng 以 上 长 PCR 的 引 物 设 计 和 使 用 浓 度 与 常 规 PCR 差 别 不 大, 但 要 注 意 避 免 引 物 之 间 了 端 的 互 补 和 3' 端 的 二 级 结 构, 以 免 产 生 非 特 异 扩 增 而 抑 制 降 低 靶 序 列 的 产 量 其 三, 用 于 长 PCR 的 DNA 聚 合 酶 必. 92

97 须 是 高 忠 实 性 的, 只 具 有 5' 3' 端 核 酸 外 切 酶 活 性 的 聚 合 酶 优 于 有 了 5' 端 核 酸 外 切 酶 活 性 的 聚 合 酶, 将 活 性 不 同 的 热 稳 定 性 DNA 聚 合 酶 联 合 使 用, 将 更 有 利 于 长 片 段 的 扩 增 长 PCR 缓 冲 液 组 成 以 rtth DNA 聚 合 酶 为 例, 有 如 下 成 分 : 5% 甘 油, 25 mmol/l Tris- HCl (ph 8.9), 100 mmol/l KCl, 0.75 mmol/l EGTA, 0.05% 聚 山 梨 醋 20, 2. 5 mmol/l MgCb, O. 01 % 明 胶 长 PCR 扩 增 幅 环 条 件 : 95 'c 10 s 58 'c 30 s 72 'c 3 min 10 个 帽 环 95 'c 10 s 58 'c 30 s 72'C 3r 丑 1 日 每 个 帽 环 自 动 增 加 30 s 20 个 帽 环 长 PCR 操 作 的 难 度 较 大, 在 专 业 实 验 室 可 自 行 完 成 但 在 经 验 缺 乏 的 实 验 室 成 功 率 较 低, 因 此 可 购 买 一 些 公 司 的 成 熟 产 品 ( 四 ) 逆 转 录 PCR 逆 转 录 PCR (RT-PCR) 是 由 逆 转 录 和 PCR 两 部 分 组 成, 其 中 逆 转 录 的 目 的 是 将 标 本 中 的 基 因 表 达 产 物 mrna 通 过 逆 转 录 酶 的 作 用 生 成 edna, PCR 就 是 对 edna 模 板 的 扩 增 因 此, RT-PCR 实 际 上 是 一 种 检 测 基 因 表 达 产 物 的 万 法 RT-PCR 万 法 使 mrna 的 体 外 高 灵 敏 度 检 测 成 为 可 能, 尤 其 是 一 步 法 RT-PCR 将 逆 转 录 酶 与 DNA 聚 合 酶 放 在 一 个 反 应 体 系 中, 可 使 RT-PCR 连 续 进 行 而 中 途 勿 需 开 管 添 加 任 何 试 剂, 使 操 作 更 加 万 便 快 速 同 时, 使 edna 得 到 充 分 利 用, 扩 增 成 功 率 大 大 提 高, 对 低 丰 度 mrna 的 检 出 能 力 大 为 增 强 目 前 大 多 数 分 于 生 物 学 试 剂 公 司 有 成 熟 的 一 步 法 RT-PCR 试 剂 盒, 应 用 非 常 万 便 在 临 床 应 用 中, 白 血 病 特 异 性 融 合 基 因 mrna 的 检 测 是 一 个 典 型 的 例 于 直 接 检 测 引 发 肿 瘤 的 各 种 特 异 性 融 合 基 因 的 表 达 产 物, 如 慢 性 粒 细 胞 性 白 血 病 (CML) 的 BCR-ABL 急 性 早 幼 粒 白 血 病 (ALL) 的 PML-RARA 等, 其 敏 感 性 可 达 到 每 10 6 个 正 常 细 胞 中 检 出 1 个 白 血 病 细 胞, 大 约 是 细 胞 遗 传 学 检 测 的 倍 在 融 合 基 因 的 转 录 产 物 检 测 中 10 个 ~100 个 mrna 分 于 即 能 被 检 测 到, 其 检 测 灵 敏 度 极 高 尤 其 是 结 合 荧 光 定 量 技 术, 使 基 因 表 达 的 精 确 定 量 成 为 可 能 在 白 血 病 的 临 床 分 型 诊 断 个 体 化 治 疗 万 案 的 制 定 治 疗 效 果 监 测 缓 解 后 复 发 风 险 的 估 计 和 预 防 干 细 胞 移 植 后 残 留 病 的 检 测 和 提 示 早 期 干 预 治 疗 等 万 面 具 有 重 要 的 指 导 意 义 ( 五 ) 定 量 PCR 技 术 20 世 纪 90 年 代 中 期, 出 现 了 一 种 以 实 时 检 测 PCR 为 核 心 的 起 始 DNA 模 板 定 量 技 术, 使 PCR 技 术 的 定 量 分 析 成 为 可 能, 极 大 地 提 升 了 其 临 床 的 实 用 性 定 量 PCR 技 术 (quant 山 eatlo 日 PCR) 将 PCR 与 荧 光 实 时 检 测 结 合 在 一 起, 实 现 了 PCR 的 全 过 程 监 测, 能 够 准 确 地 判 断 PCR 进 入 指 数 增 长 期 的 时 刻 根 据 这 一 时 间 点 与 模 板 DNA 起 始 拷 贝 93

98 数 的 函 数 关 系, 以 标 准 品 建 立 的 校 正 曲 线 为 依 据, 可 以 精 确 地 计 算 出 标 本 的 模 板 DNA 的 起 始 拷 贝 数 定 量 PCR 技 术 是 目 前 最 为 准 确 的 检 测 万 法 定 量 PCR 技 术 在 临 床 上 可 被 用 于 病 原 体 的 定 量 检 测 以 检 测 病 情 和 疗 效 观 察 同 时 在 白 血 病 特 异 性 融 合 基 因 表 达 产 物 的 定 量 检 测 上 也 具 有 独 特 的 优 势 对 于 定 量 PCR 技 术, 在 以 后 的 章 节 中 将 详 细 介 绍 ( 六 ) 原 值 PCR 技 术 原 位 PCR 是 Hasse 等 1990 年 建 立 的 分 于 细 胞 生 物 学 领 域 里 的 一 项 新 技 术 原 位 PCR 技 术 (in - situ PCR) 主 要 是 指 在 组 织 细 胞 里 进 行 聚 合 酶 链 反 应, 在 不 改 变 靶 基 因 在 基 因 组 中 的 位 置 的 前 提 下 进 行 体 外 基 因 扩 增 它 同 时 具 备 原 位 杂 交 的 定 位 能 力 PCR 和 技 术 的 高 敏 感 性 的 优 点 其 特 异 性 和 敏 感 性 高 于 常 规 PCR 在 临 床 中 有 较 高 的 应 用 价 值 原 位 PCR 技 术 有 其 独 到 的 特 点, 一 万 面 能 检 测 确 定 带 有 靶 基 因 序 列 的 细 胞, 另 一 万 面 又 能 明 确 靶 基 因 序 列 在 细 胞 内 的 位 置 因 此, 它 对 分 于 细 胞 水 平 上 进 行 临 床 检 测 有 重 大 的 实 用 价 值 原 位 PCR 实 验 用 的 标 本 来 源 可 以 多 种 多 样 如 新 鲜 组 织 石 蜡 包 埋 组 织 等 其 基 本 程 序 如 下 :1 固 定 组 织 : 将 组 织 固 定 于 预 先 用 四 氟 乙 烯 包 被 的 玻 片 上, 并 用 多 聚 处 理, 再 灭 活 除 去 细 胞 内 源 性 过 氧 化 物 酶 ;2 蛋 白 酶 K 消 化 : 用 60 mg/l 的 蛋 白 酶 K 将 固 定 好 的 组 织 细 胞 片 在 55 'c 消 化 处 理 2 h. 96'C 经 2 mi 日 灭 活 蛋 白 酶 K; 3 PCR 扩 增 : 在 组 织 片 上, 加 PCR 反 应 液, 覆 盖 并 加 液 体 石 蜡 后, 直 接 放 在 原 位 扩 增 仪 上, 进 行 PCRt 盾 环 扩 增 ;4 杂 交 : PCR 扩 增 结 束 后, 用 荧 光 等 标 记 的 寡 核 昔 酸 探 针 进 行 原 位 杂 交 ;5 显 微 镜 观 察 结 果 原 位 PCR 技 术 与 荧 光 原 位 杂 交 (FISH) 有 相 似 之 处, 都 是 很 有 潜 力 的 万 法 (t) 酶 联 免 疫 PCR 将 免 疫 检 测 技 术 与 核 酸 检 测 技 术 相 结 合 是 近 年 来 发 展 起 来 的 新 核 酸 检 测 技 术 根 据 采 用 的 免 疫 万 法 的 微 小 差 异, 己 派 生 出 较 多 的 酶 联 免 疫 PCR (ELISA - PCR) 万 法 这 些 万 法 的 共 同 特 点 是 将 PCR 技 术 的 高 灵 敏 度 与 酶 联 免 疫 的 高 特 异 性 相 结 合, 以 进 一 步 提 高 临 床 检 测 的 可 靠 性 目 前 比 较 成 熟 的 酶 联 免 疫 PCR 技 术 是 PCR 微 孔 板 核 酸 杂 交 ELISA 技 术 该 技 术 将 基 因 扩 增 核 酸 杂 交 与 酶 联 显 色 等 技 术 融 为 一 体 其 具 体 的 原 理 是 合 成 一 对 特 异 性 寻 物, 通 过 常 规 PCR 反 应 获 得 靶 基 因 片 段, 高 温 变 性 获 得 较 多 的 单 链 DNA 由 于 其 一 端 序 列 与 微 孔 板 上 固 定 的 捕 捉 探 针 游 离 端 互 补 因 此 当 变 性 后 的 PCR 单 链 产 物 被 加 入 微 孔 板 后, 部 分 会 与 捕 捉 探 针 发 生 核 酸 杂 交 另 外, 杂 交 体 系 中 还 加 入 了 生 物 素 标 记 的 显 色 探 针, 其 部 分 序 列 与 PCR 产 物 另 一 端 碱 基 序 列 互 补, 因 此 同 时 也 发 生 二 者 的 杂 交 反 应 故 这 时 在 微 孔 板 中 会 出 现 较 多 的 杂 交 三 联 体 并 通 过 捕 捉 探 针 固 定 在 微 孔 板 中 这 时 通 过 洗 涤, 可 以 将 未 发 生 杂 交 的 PCR 产 物 与 显 色 探 针 去 掉, 留 在 微 孔 板 中 的 仅 是 杂 交 三 联 体 再 在 微 孔 板 中 依 次 加 入 酶 标 记 物 和 显 色 底 物 通 过 微 孔 板 颜 色 变 化 可 以 作 出 判 断 ( 图 6-7) 上 述 万 法 的 最 大 优 点 是 进 一 步 提 高 了 核 酸 检 测 的 特 异 性 并 且 不 需 要 昂 贵 的 硬 件 设 94

99 per 扩 增 靶 基 因 片 段 主 工 口 且... 单 旺 DNA 与 做 孔 中 固 定 的 捕 捉 酣 和 显 色 楠 杂 交 杂 交 气 联 休 与 酣 司 在 d1 却 形 成 抗 原 - 抗 悻 复 合 物 如 入 底 物, 发 生 匾 色 的 反 应 u 飞 底 物 显 色 的 反 应 图 6-7 per 微 孔 板 核 酸 杂 交 ELISA 检 测 原 理 示 意 备, 在 一 般 的 医 疗 机 构 中 即 可 使 用 操 作 但 我 们 应 看 到, i 亥 万 法 的 缺 点 也 比 较 明 显, 即 操 作 程 序 较 复 杂, 从 理 论 上 并 非 所 有 的 PCR 产 物 能 被 用 于 检 测, 因 此 其 灵 敏 度 受 限 ; 另 外, 对 PCR 产 物 的 操 作 程 序 较 多 使 实 验 室 污 染 的 可 能 被 大 大 提 高 当 然 目 前 采 用 UNG- dutp 系 统 可 以 在 一 定 程 度 上 避 免 PCR 产 物 的 实 验 室 污 染 但 该 技 术 对 实 验 空 间 的 使 用 要 求 也 明 显 高 于 其 他 万 法, 操 作 人 员 必 须 有 强 烈 的 防 污 染 意 识, 这 些 都 对 该 技 术 的 应 用 带 来 限 制 上 面 介 绍 了 一 些 目 前 在 临 床 上 己 有 应 用 的 PCR 衍 生 技 术, 这 些 技 术 的 出 现 和 发 展 不 是 偶 然 的, 而 是 解 决 PCR 技 术 临 床 应 用 所 存 在 问 题 的 必 然 反 应 因 此, 这 些 技 术 都 有 其 不 尽 相 同 的 技 术 特 点 和 应 用 范 围 其 他 尚 有 一 些 技 术, 如 反 向 PCR 不 对 称 PCR 简 并 寻 物 PCR 锚 定 PCR 膜 结 合 PCR 臆 断 PCR 等, 比 较 多 地 应 用 于 科 学 研 究 实 验 这 些 PCR 派 生 的 技 术 都 具 有 解 决 实 际 工 作 中 某 一 万 面 问 题 的 能 力, 而 且 它 们 的 联 合 应 用 也 发 挥 着 更 巨 大 的 技 术 优 势 第 二 节 连 接 酶 链 反 应 在 基 因 体 外 扩 增 技 术 中, 连 接 酶 链 反 应 (ligase chain reactio 日, LCR) 是 又 一 种 重 要 的 分 子 生 物 学 技 术 1989 年, Wu 等 发 明 了 一 种 称 为 连 接 酶 扩 增 反 应 (LAR) 的 技 术, 可 以 说 是 LCR 的 雏 形 1991 年 Barany 等 报 道 了 LCR 技 术, 与 LAR 相 比 具 有 更 高 的 检 测 灵 敏 度 和 特 异 性 1997 年 Backman 为 检 出 靶 基 因 序 列 中 的 点 突 变 而 设 计 发. 95.

100 明, 并 申 报 了 专 利 其 后, 随 着 热 稳 定 性 连 接 酶 的 使 用 和 商 业 化, LCR 技 术 开 始 在 分 于 生 物 学 各 领 域 得 到 广 泛 应 用 它 与 PCR 技 术 相 结 合 成 为 极 具 前 途 的 诊 断 技 术 严 格 意 义 上 说, LCR 技 术 不 是 一 种 基 因 体 外 扩 增 技 术, 而 是 以 基 因 片 段 为 模 板 的 寡 核 昔 酸 探 针 连 接 扩 增 技 术 因 此, 反 应 产 物 并 非 基 因 片 段, 而 是 大 量 被 连 接 的 寡 核 昔 酸 探 针 由 于 寡 核 昔 酸 探 针 的 连 接 是 严 格 以 DNA 为 模 板 的 因 此 连 接 产 物 也 代 表 了 需 要 检 测 的 靶 基 因 这 是 与 PCR 反 应 最 大 的 区 别 也 是 从 另 一 角 度 检 测 靶 基 因 的 典 型 例 于 LCR 检 测 的 灵 敏 度 不 及 PCR 万 法 但 其 检 测 的 特 异 性 很 高 这 是 基 于 连 接 酶 连 接 DNA 片 段 的 高 度 序 列 特 异 性 决 定 的 即 连 接 反 应 的 发 生 必 然 在 两 个 连 接 片 段 的 5' 端 与 3'~ 自 完 全 与 模 板 DNA 互 补 的 前 提 下 进 行 其 次 由 于 连 接 反 应 的 温 度 接 近 引 物 的 熔 点 温 度, 因 此 识 别 单 核 昔 酸 错 配 的 能 力 极 强, 容 错 性 远 远 低 于 PCR 反 应 因 此, 主 要 用 在 基 因 突 变 筛 查 等 特 异 性 要 求 很 高 的 实 验 中 LCR 被 一 连 接 酶 链 反 应 技 术 的 基 本 原 理 与 特 点 LCR 与 PCR 技 术 在 原 理 上 有 相 似 的 地 万 即 反 应 产 物 的 出 现 都 必 须 是 以 存 在 DNA 模 板 为 前 提 条 件, 都 是 依 赖 于 模 板 的 基 因 扩 增 技 术 但 是 它 们 又 有 很 大 的 差 别, 在 LCR 中, 在 DNA 变 性 后, 随 着 温 度 降 低, DNA 复 性, 两 条 紧 邻 的 寡 核 昔 酸 引 物 结 合 到 单 链 DNA 模 板 上 形 成 杂 合 链, LCR 利 用 连 接 酶 的 DNA 连 接 作 用, 将 引 物 连 接 处 完 全 与 靶 基 因 片 段 配 对 的 引 物 连 接 起 来, 形 成 新 的 DNA 单 链 与 此 同 时, 在 反 应 体 系 中 还 有 另 两 条 紧 邻 的 寡 核 昔 酸 引 物, 其 序 列 与 第 一 对 引 物 完 全 互 补, 尤 其 是 其 上 游 引 物 3'~ 自 碱 基 与 另 一 上 游 引 物 3' 端 互 补 用 于 连 接 后 形 成 另 一 条 新 的 DNA 互 补 链 由 于 两 条 新 的 DNA 单 链 完 全 互 补, 因 此 一 个 连 接 反 应 后, 体 系 中 出 现 了 新 的 DNA 双 链, 它 们 又 可 以 作 为 下 一 次 连 接 反 应 的 模 板 经 过 30 次 的 帽 环, 新 的 DNA 双 链 可 以 达 到 10 5 个 拷 贝 以 上 最 后 检 测 反 应 体 系 中 由 4 条 引 物 连 接 而 成 的 DNA 双 链 ( 图 6-8) LCR 技 术 以 检 测 的 特 异 性 见 长 相 邻 DNA 片 段 的 连 接 端 严 格 的 碱 基 互 补 是 发 生 连 接 反 应 的 先 决 条 件, 这 是 由 连 接 酶 连 接 特 异 性 决 定 的 因 此, LCR 技 术 在 临 床 中 可 用 于 己 知 基 因 突 变 基 因 组 多 态 及 病 原 体 检 测 等 但 是 LCR 技 术 的 检 测 灵 敏 度 却 一 直 是 限 制 其 临 床 应 用 的 瓶 颈 问 题 这 种 状 况 与 连 接 酶 的 连 接 效 率 无 直 接 关 系, 而 主 要 是 连 接 酶 在 无 模 板 情 况 下 仍 能 催 化 双 链 连 接 反 应, 使 双 链 探 针 被 连 接 起 来 这 样 为 随 后 的 扩 增 提 供 了 非 检 测 的 DNA 模 板, 使 反 应 体 系 中 出 现 两 种 引 物 扩 增, 一 是 依 赖 于 靶 基 因 片 段 的 寻 物 连 接, 二 是 依 赖 于 被 连 接 的 双 链 探 针 的 引 物 连 接 二 者 显 然 会 形 成 竞 争 性 抑 制, 并 且 由 于 后 者 产 物 的 增 加 而 使 LCR 电 泳 背 景 提 高, 不 利 于 产 物 检 测 而 减 低 检 测 的 灵 敏 度 LCR 技 术 的 另 一 个 比 较 突 出 的 优 点 是 既 往 LCR 产 物 污 染 的 可 能 性 较 小, 这 与 LCR 的 扩 增 程 度 较 低 有 关 这 有 利 于 LCR 技 术 临 床 应 用 的 质 量 控 制 同 时 也 使 LCR 技 术 在 灵 敏 度 要 求 较 高 的 检 测 中 的 应 用 受 到 限 制 LCR 技 术 相 对 较 复 杂 的 操 作 也 是 其 临 床 应 用 受 限 的 原 因 之 一. 96.

101 5 J 3' 3' 5' {5 3' 3' 5' A LCR 反 应 的 第 1 个 5.-J 3' 飞 单 链 模 板 DNA T AA 温 度 循 环 与 LCR 探 针 复 性 AA 飞 A 3' 5' T 相 邻 探 针 连 接 5' L.e 3' AA 飞 飞 AA 主 二 3 5' 次 循 环 5' AA 飞 AA 飞.-J.----J 飞 AA 飞 AA 飞 AA 3 AA 飞 r-e 3' 5 图 6-8 LCR 原 理 示 意 连 接 酶 链 反 应 的 基 本 条 件 (-) LCR 体 系 的 组 成 1. 耐 热 Taq DNA 连 接 酶 在 LCR 中 通 常 使 用 NAD 依 赖 性 耐 热 连 接 酶, 使 用 终 浓 度 为 1. 5 X 10 6 U/L, 即 每 25μl 反 应 体 积 37.5 U 市 售 耐 热 Taq DNA 连 接 酶 多 为 37.5 X 10 6 U/L,. 97.

102 因 此 在 一 个 连 接 反 应 中 加 入 1 ILl 的 连 接 酶 和 2μI NAD (12.5 mmol/ L) 2. 寡 核 昔 酸 引 物 在 LCR 中, 寻 物 的 终 浓 度 在 O. 5 nmo l/ L~5 日 mo l/ L 之 间 寻 物 的 设 计 和 标 记 是 LCR 的 一 个 特 点, 在 该 技 术 中 显 得 尤 为 重 要 LCR 中 引 物 的 连 接 可 出 现 两 种 情 况, 即 依 赖 于 模 板 DNA 的 特 异 性 连 接 和 不 依 赖 于 模 板 的 连 接 如 何 尽 量 降 低 后 一 种 情 况 的 发 生 和 产 量 始 终 是 决 定 LCR 特 异 性 和 灵 敏 度 的 关 键 因 此, 除 对 反 应 条 件 的 优 化 外, 两 对 引 物 的 设 计 至 关 重 要 应 注 意 以 下 问 题 : (1) 为 减 少 不 依 赖 于 靶 序 列 的 非 特 异 连 接, LCR 引 物 通 常 避 免 平 端 引 物 的 使 用, 而 采 用 单 碱 基 对 突 出 的 办 法 (2) 两 对 引 物 的 L 值 应 相 似 或 接 近, 且 一 般 在 68 'c ~72 'c, 以 保 证 在 较 高 温 度 条 件 下 连 接, 尽 量 避 免 非 特 异 产 物 出 现 (3) 在 两 对 引 物 的 5'~ 自 添 加 多 个 非 互 补 的 核 昔 酸, 以 加 大 引 物 问 连 接 的 难 度 (4) 各 条 引 物 本 身 及 其 两 对 寻 物 间 应 尽 量 避 免 出 现 搭 桥 现 象 (5) 连 接 引 物 3'~ 自 碱 基 种 类 非 常 重 要, 直 接 关 系 到 杂 交 分 于 的 稳 定 性, 进 而 影 响 识 别 性 寻 物 的 连 接 效 率 和 连 接 产 物 的 量 实 验 显 示 3' 端 为 G-C 配 对 比 A-T 配 对 连 接 产 物 量 更 大 (6) 当 出 现 较 多 的 非 配 对 引 物 连 接 时, 会 产 生 较 高 的 噪 声 信 号, 影 响 结 果 判 读 因 此, 在 寻 物 设 计 时 注 意 当 引 物 的 靶 分 于 碱 基 为 T-T/A-A 与 G-A/C-T 时, 不 配 对 寻 物 的 连 接 产 物 与 配 对 引 物 连 接 产 物 的 比 值 最 低, 即 假 性 连 接 率 最 低 LCR 产 物 检 测 与 PCR 不 同, 需 要 通 过 对 两 条 上 游 寻 物 进 行 标 记 来 提 供 连 接 反 应 所 需 的 磷 酸 基 团 和 检 测 产 物, 因 此 寻 物 标 i 己 是 又 一 个 重 要 的 万 面 目 前 引 物 主 要 有 几 种 标 记 万 式, 如 放 射 性 核 素 标 记 生 物 素 标 记 荧 光 标 记 等 其 中, 放 射 性 核 素 标 记 由 于 容 易 对 环 境 造 成 污 染, 对 人 体 造 成 损 害, 在 临 床 常 规 检 测 中 基 本 未 使 用 目 前 使 用 较 多 的 是 荧 光 标 记 万 法, 利 用 荧 光 检 测 仪 对 产 物 进 行 测 定 3. LCR 缓 冲 液 及 其 他 10 x LCR 缓 冲 液 由 如 下 成 分 组 成 : 50mmol/LTris-HCI (ph8.2), 1mol/L KCI, 100 mmol/l MgCb, 10 mmol/l EDTA, 100 mmol/l DTT, 0.1% 聚 乙 二 醇 辛 基 苯 基 醋 其 中 聚 乙 二 醇 辛 基 苯 基 酷 的 作 用 是 增 加 连 接 产 物 量 在 LCR 体 系 中 常 常 加 入 佳 精 DNA, 其 作 用 是 降 低 检 测 背 景 终 浓 度 一 般 是 0.4 gil 4. 常 见 的 LCR 体 系 组 成 常 见 的 LCR 体 系 组 成 详 见 表 表 6-21 LCR 反 应 体 系 组 成 反 应 成 分 10 x LCR 缓 冲 液 NAD 蛙 精 DNA 每 种 引 物 Taq DNA 连 接 酶 模 板 DNA 去 离 子 水 终 浓 度 1 x LCR 缓 冲 液 1 mmol/l.4 gil 1 nmol/l 1. 5 X 10 6 U/L lμ1~5μl 补 足 25 1'

103 ( 二 ) LCR 的 循 环 条 件 LCR 的 帽 环 条 件 详 见 表 表 6-22 LCR 的 循 环 条 件 步 骤 温 度 时 间 循 环 数 l 丑 变 性 94 C 且 复 性 与 连 接 65 C 4 min 10~30 或 60 C 8 min 30 - 固 连 接 酶 链 反 应 产 物 的 分 析 当 使 用 放 射 性 核 素 标 记 引 物 时, 产 物 需 要 经 变 性 凝 胶 电 泳, 分 离 产 物 片 段 与 引 物, 利 用 放 射 自 显 影 检 测 产 物 ; 荧 光 标 记 寻 物 时, 产 物 需 经 过 荧 光 检 测 仪 检 测, 由 于 目 前 荧 光 检 测 仪 普 及 较 快, 因 此 较 多 的 临 床 检 测 试 剂 采 用 荧 光 标 记 引 物 的 万 法 ; 生 物 素 / 地 高 辛 标 记 引 物 需 电 泳 后 用 DNA 杂 交 检 测 产 物 四 连 接 酶 链 反 应 的 常 见 问 题 在 LCR 检 测 中 可 能 出 现 两 个 比 较 典 型 的 问 题 一 是 在 模 板 DNA 存 在 情 况 下, 无 LCR 产 物 形 成 导 致 假 阴 性 较 常 见 的 原 因 是 寻 物 标 记 磷 酸 化 效 率 较 低, 其 次 是 引 物 设 计 不 当, 导 致 连 接 效 率 低 下 二 是 无 模 板 存 在 时 有 连 接 产 物 出 现 导 致 假 阳 性 原 因 可 能 是 连 接 酶 促 进 的 非 特 异 连 接 反 应, 或 4 条 引 物 之 间 相 互 交 错 复 性 形 成 搭 桥 现 象, 为 连 接 反 应 提 供 了 非 特 异 的 模 板 DNA 要 解 决 上 述 问 题, 首 先 必 须 强 调 提 高 寻 物 标 记 的 效 率, 其 次 是 寻 物 的 设 计 应 遵 桶 前 面 所 述 的 原 则 在 实 际 临 床 工 作 中,LCR 检 测 试 剂 一 般 是 以 商 品 化 试 剂 盒 的 形 式 出 现, 一 旦 发 现 上 述 问 题, 自 行 解 决 的 可 能 性 很 小, 因 此 应 及 时 调 换 试 剂 以 避 免 实 验 差 错 五 连 接 酶 链 反 应 技 术 的 应 用 范 围 LCR 技 术 的 检 测 灵 敏 度 比 PCR 技 术 低, 因 此 在 实 际 应 用 中 常 常 与 PCR 技 术 结 合 使 用 一 万 面 提 高 了 检 测 的 灵 敏 度, 另 一 万 面 最 大 限 度 利 用 了 LCR 技 术 检 测 的 高 特 异 性 LCR 技 术 的 特 点 奠 定 了 其 在 单 碱 基 突 变 或 多 态 检 测 中 的 优 势 LCR 技 术 可 用 于 以 下 几 个 大 的 万 面 : 特 定 疾 病 人 群 中 基 因 单 碱 基 多 态 性 (SNP) 筛 查 ; 16 S rrna 检 测 进 行 细 菌 种 别 鉴 定 ; 病 原 体 耐 药 基 因 点 突 变 检 测 ; 单 基 因 遗 传 病 己 知 基 因 突 变 的 检 测 等 六 主 要 的 连 接 酶 链 反 应 相 关 技 术 以 LCR 技 术 为 核 心 又 衍 生 出 一 些 相 关 的 检 测 技 术, 其 中 比 较 典 型 的 有 PCR- LCR 技 术 和 G-LCR 技 术 如 前 所 述, PCR-LCR 即 首 先 进 行 模 板 的 PCR 扩 增, 以 获 得 尽 可 能 多 的 靶 基 因 片 段, 然 后 直 接 对 PCR 产 物 进 行 LCR 反 应, 以 区 别 PCR 反 应 产 物 中 特 异 的 待 检 靶 基 因 片 段 目 前 PCR 反 应 产 物 己 勿 需 进 行 纯 化, 可 以 直 接 加 入 LCR 反 应 体 系 中 检 测, 因 此 非 常 万 便 但 这 种 检 测 的 缺 点 是 仍 然 无 法 完 全 避 免 PCR 产 物 的 实 验. 99.

104 室 污 染 G-PCR 是 一 种 缺 口 LCR 技 术, 其 基 本 原 理 是 在 引 物 设 计 时, 将 结 合 在 同 一 模 板 链 上 的 两 条 引 物 之 间 保 留 1 个 ~3 个 碱 基 的 距 离, 然 后 利 用 反 应 体 系 中 Taq DNA 聚 合 酶 和 所 需 的 dntps 对 上 游 寻 物 3'~ 自 进 行 延 伸, 直 至 与 下 游 引 物 的 5'~ 自 紧 邻, 这 时 Taq DNA 连 接 酶 发 挥 作 用 将 缺 口 连 接 在 一 起 这 种 万 法 由 于 有 依 赖 于 模 板 DNA 的 延 伸 步 骤, 因 此 产 生 假 阳 性 的 可 能 性 很 小 其 选 用 与 否 取 决 于 模 板 DNA 的 特 性 与 组 成 目 前 在 DNA 的 聚 合 反 应 中 采 用 了 Taq DNA 聚 合 酶 的 Stoffel 片 段, 避 免 了 Taq DNA 聚 合 酶 的 核 酸 外 切 酶 活 性 对 下 游 寻 物 5'~ 白 的 碱 基 水 解, 使 其 应 用 性 更 强 第 二 节 其 他 体 外 基 因 扩 增 技 术 目 前 基 因 体 外 扩 增 技 术 大 致 分 为 4 类 第 一 类 是 以 PCR 技 术 为 核 心 的 DNA 扩 增 技 术, 这 类 技 术 在 临 床 核 酸 检 测 上 应 用 最 广 泛, 技 术 成 熟 度 也 较 高, 如 常 规 PCR 多 重 PCR 及 RT-PCR 等 第 二 类 是 以 模 板 DNA 为 基 础 的 探 针 扩 增 技 术, 这 类 技 术 主 要 应 用 于 对 检 测 特 异 性 要 求 很 高 的 实 验, 如 基 因 突 变 检 测 等, 以 LCR G- LCR 等 技 术 为 代 表 第 三 类 技 术 是 依 赖 于 转 录 的 基 因 扩 增 技 术, 主 要 是 对 RNA 的 扩 增, 如 NAS BA TAS 及 TMA 等 第 四 类 技 术 则 是 信 号 扩 增 技 术, 并 不 进 行 PCR EjJ(; LCR 扩 增, 而 是 通 过 增 强 杂 交 探 针 本 身 信 号 而 提 高 检 测 的 灵 敏 度, 以 bdna 技 术 为 代 表 本 节 简 要 介 绍 后 两 类 技 术 及 其 临 床 应 用 情 况 一 核 酸 序 列 扩 增 法 ( 一 ) 核 酸 序 列 扩 增 法 的 基 本 原 理 核 酸 序 列 扩 增 法 (nucleic acids sequences - based amplification, NASBA) 与 TMA 基 本 原 理 相 似 利 用 逆 转 录 酶 和 5'~ 击 含 有 T7 RNA 聚 合 酶 特 异 性 启 动 于 序 列 的 下 游 寻 物, 对 含 有 RNA 的 标 本 进 行 逆 转 录 反 应, 合 成 RNA - cdna 杂 交 体, 再 利 用 反 应 体 系 中 RnaseH 阵 解 RNA 链, 然 后 以 体 系 中 逆 转 录 酶 和 下 游 引 物 合 成 cdna 第 二 链, 再 由 T7 RNA 聚 合 酶 发 挥 依 赖 于 DNA 的 RNA 的 聚 合 作 用, 合 成 新 的 RNA 单 链, 从 而 完 成 第 一 个 帽 环 由 于 从 一 条 cdna 双 链 中 间 体 可 合 成 100 条 ~ 条 单 链 RNA, 因 此 标 本 中 的 RNA 拷 贝 数 得 到 指 数 扩 增 ( 图 6-9) ( 二 ) 核 酸 序 列 扩 增 法 的 特 点 与 应 用 i 亥 技 术 的 最 大 特 点 是 等 温 扩 增 由 于 RNA 酶 的 使 用, 消 除 了 热 变 性 过 程 所 需 要 的 温 度 变 化, 使 整 个 反 应 在 同 一 温 度 下 进 行, 从 而 使 该 技 术 容 易 发 展 为 自 动 化 检 测 手 段 第 二 个 特 点 是 可 进 行 定 量 检 测 通 过 设 置 内 标 准, 其 定 量 范 围 广, 精 确 度 和 准 确 度 都 相 当 高 目 前 NASBA 在 RNA 的 扩 增 检 测 上 优 于 其 他 万 法, 在 临 床 HlV - 1 RNA HCV-RNA 等 定 量 检 测 上 得 到 应 用 该 技 术 尽 管 有 其 独 特 的 优 势, 但 由 于 操 作 相 对 较 复 杂, 目 前 在 国 内 仍 未 在 临 床 上 广 泛 使 用. 100.

105 RNA 靶 分 子 5/ RNA-DNA 杂 交 体 I:I:I:J, 3' ED 二 c...: 气 古 下 启 动 于 逆 转 录 酶 阳 aseh 序 列 的 反 转 录 引 物 A B 巳 口 立, 同 飞 :r:::::r::::r:: I::I::I I:::I:::, cdna 双 链 m A 聚 3' 5' 酶 B :::C:I:I: 事 逆 转 录 酶 反 义 RNA RNA-DNA 杂 交 体 RNaseH 与 DNAXX 链 合 成 飞 A 图 6-9 NASBA 原 理 示 意 二 分 支 探 针 DNA 测 定 ( ) 分 支 探 针 DNA 测 定 的 基 本 原 理 分 支 探 针 DNA 测 定 (branched probes, bdna) 是 一 种 核 酸 固 相 杂 交 和 分 支 探 针 酶 标 进 行 化 学 发 光 检 测 的 万 法 其 基 本 原 理 是 在 固 相 载 体 上 固 定 一 条 与 靶 片 段 序 列 互 补 的 DNA 片 段, 用 以 捕 捉 反 应 体 系 中 的 靶 DNA Ejj(; RNA 分 于 在 二 者 形 成 稳 定 杂 交 体 的 同 时, 体 系 中 另 一 种 游 离 的 杂 交 探 针 与 靶 DNA Ejj(; RNA 分 于 其 他 单 链 部 位 形 成 又 一 次 局 部 杂 交, 这 样 固 定 探 针 靶 DNA Ejj(; RNA 分 于 与 游 离 探 针 通 过 碱 基 互 补 被 连 接 在 一 起 与 此 同 时, 体 系 中 酶 标 i 己 的 分 支 探 针 主 干 一 端 碱 基 与 杂 交 体 中 的 游 离 探 针 的 游 离 端 互 补 结 合, 形 成 新 的 杂 交 四 联 体 由 于 靶 DNA Ejj(; RNA 分 于 有 一 定 长 度, 因 此 通 过 设 计 靶 分 于 不 同 结 合 位 点 的 游 离 探 针, 可 使 一 条 靶 分 于 上 形 成 多 个 稳 定 的 杂 交 四 联 体, 从 而 也 使 一 条 靶 分 于 上 相 应 地 结 合 了 多 个 酶 标 记 的 分 支 探 针 同 时, 由 于 一 个 分 支 探 针 上 又 可 以 结 合 许 多 的 酶 标 记 探 针, 因 此 各 种 因 素 的 结 合 使 一 条 靶 分 于 上 可 以 杂 交 结 合 多 达 3000 个 酶 标 记 分 于 这 样 通 过 化 学 发 光 检 测 使 bdna 检 测 的 灵 敏 度 非 常 高 ( 图 6 10) 101.

106 m 剧 AA 双 键 模 极 戚 ; 模 板 单 髓 DN AlRNA 单 髓 与 国 相 辑 体 t 捕 捉 探 针 杂 交 ~~~~.-,.,. 一 马 -E 杂 主 体 与 靶 捞 针 杂 交 JJ,r 月 ' 一 电 一 一 / -JF 杂 交 三 耳 其 体 与 bdna 杂 交 /f 一 司 ---~ 一 一 二 7 杂 交 四 联 悻 与 酶 扣 ~i[l 探 计 杂 交 加 入 鹿 楠, 化 学 发 克 拉 圳 /f 图 6-10 bdna 扩 增 原 理 示 意 102.

107 ( 二 ) 分 支 探 针 DNA 测 定 的 特 点 与 应 用 i 亥 技 术 最 大 的 特 点 是 不 经 过 靶 序 列 的 大 量 扩 增, 而 是 直 接 对 标 本 中 的 靶 序 列 进 行 检 测, 避 免 了 任 何 其 他 定 量 检 测 扩 增 反 应 中 都 存 在 的 不 确 定 因 素 和 复 杂 的 相 互 关 系, 其 定 量 检 测 的 可 靠 性 很 高 其 次, 由 于 游 离 探 针 的 序 列 多 样 化, 避 免 了 单 一 序 列 检 测 由 于 序 列 变 异 而 导 致 的 假 阴 性, 提 高 了 靶 片 段 的 检 出 率 再 次, 由 于 整 个 反 应 包 含 了 固 定 探 针 和 游 离 探 针 与 靶 序 列 的 两 次 杂 交, 因 此 其 检 测 的 特 异 性 得 到 极 大 的 提 高, 检 测 结 果 也 非 常 可 靠 目 前 bdna 技 术 在 国 外 己 经 应 用 于 各 种 病 原 体 的 核 酸 分 于 检 测 上, 如 HBV, Hev, HIV 等, 更 由 于 其 较 为 准 确 的 定 量 能 力, 被 用 来 进 行 感 染 性 疾 病 连 续 动 态 观 察 ( 杨 元 张 朝 明 ) 参 考 文 献 1 Erlich HA, Gelfand DH, Saiki RK. Specific DNA amplification. Nature, 1988, 331: Kwok S, Higuchi R. Avioding false positives with PCR. Nature, 1989, 339: Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase - catalyzed chain reaction. Methods Enzymo!, 1987, 155: Mullis KB, Faloona FA, Scharf S, et a1. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: The polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symp. Quant Bio!, 1986, 51: Oste C. Polymerase chain reaction. BioTechniques, 1988, 6: RK Saiki, Gelfand DH, Stoffel S, et a1. Primer - directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 1988, 239: Aaij C, Borst P. The gel electrophoresis of DNA. Biochim Biophys Acta, 1972, 269: Bensaude O. Ethidium bromide and safety - Readers suggest alternative solutions. Letter to editor. Trends Genet, 1988, 4: 89 9 Lumpkin OJ, Zimm BH. Mobility of DNA in gel electrophoresis. Communications to the editor Biopolymers, 1982, 21: Chamberlain J S, Gibbs RA, Ranier JE, et a1. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. N uc1. Acids Res, 1988, 23: Beggs AH, Koenig M, Boyce FM, et a1. Detection of 98 % of DMD / BMD gene deletions by polymerase chain reaction. Hum Genet, 1990, 86: Clemens PR, Fenwick RG, Chamberlain JS, et a1. Carrier detection and prenatal diagnosis in Duchenne and Becker muscular dystrophy families using dinucleotide repeat polymorphisms. Am J Hum Genet, 1991, 49: Van Essen AJ, Kneppers ALJ, Ginjaar HB, et a1. The clinical and molecular genetic approach to Duchenne and Becker muscular dystrophy. An updated protocol. J Med Genet, Orr HT, Chung M, Banfi S, et a1. Expansion of an unstable trinucleotide CAG repeat in spinocerebellar ataxia type 1. Nature Genetics, 1993, 4: Pulst SM, Nechiporuk A, Nechiporuk T, et a1. Moderate expansion of a normally biallelic trinucleotide repeat in spinocerebellar ataxia type 2. Nature Genetics, 1996, 14: Zhuchenko 0, Bailey J, Bonnen P, et a1. Autosomal dominant cerebellar ataxia (SCA6) associ ated with small polyglutamine expansions in the ala - voltage - dependent calcium channel. Nature Ge. 103.

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110 第 七 章 核 酸 杂 交 检 测 技 术 核 酸 分 于 杂 交 是 依 据 核 酸 变 性 和 复 性 原 理 建 立 的 实 验 技 术 其 原 理 是 两 条 不 同 来 源 但 碱 基 互 补 的 单 链 核 酸, 在 一 定 的 条 件 下, 可 以 结 合 形 成 双 链 的 杂 交 复 合 体, 若 以 标 记 的 己 知 核 酸 片 段 为 探 针, 与 持 测 核 酸 标 本 进 行 杂 交, 通 过 检 测 探 针 的 杂 交 信 号, 即 可 了 解 样 本 中 有 无 相 应 的 核 酸 片 段 该 技 术 是 分 子 生 物 学 中 最 基 本 的 技 术 之 一, 为 检 测 特 异 基 因 和 分 析 基 因 功 能 提 供 了 有 效 手 段, 广 泛 用 于 病 毒 细 菌 和 寄 生 虫 感 染 的 诊 断 人 类 遗 传 病 和 癌 症 的 检 测 以 及 法 医 学 上 的 案 例 分 析 等 领 域 核 酸 分 于 杂 交 技 术 基 本 上 是 从 Hall 和 Spiegelman 等 1961 年 的 工 作 开 始 的 最 初 采 用 探 针 与 靶 序 列 在 溶 液 中 杂 交, 通 过 平 衡 密 度 梯 度 离 心 分 离 杂 交 体 这 种 万 法 费 时 费 力 且 不 准 确 Bolton 等 1962 年 建 立 了 一 种 简 单 的 固 相 杂 交 万 法, 即 DNA 琼 脂 技 术 变 性 的 DNA 固 定 在 琼 脂 中, DNA 不 能 复 性, 1 且 能 与 其 他 互 补 核 酸 序 列 杂 交 另 一 种 早 期 的 努 力 是 Br 旧 时 1 等 分 析 涉 及 溶 液 中 DNA 再 结 合 研 究 的 细 胞 基 因 组, 以 比 较 不 同 来 源 核 酸 的 复 杂 性 这 种 研 究 能 够 比 较 不 同 来 源 DNA 的 再 结 合 速 率, 并 且 建 立 序 列 复 杂 性 和 动 力 学 复 杂 性 之 间 的 关 系 1964 年 Nygaard 等 的 不 同 研 究 为 应 用 标 记 DNA Ejj(; RNA 探 针 检 测 固 定 在 硝 酸 纤 维 素 膜 上 的 DNA 序 列 奠 定 了 基 础 例 如 Brown 等 因 此 确 定 了 爪 蠕 rrna 的 基 因 拷 贝 数 由 于 当 时 缺 乏 特 异 的 探 针, 有 些 基 因 的 表 达 不 能 用 此 法 研 究, 但 这 些 早 期 的 探 针 膜 杂 交 试 验 导 致 了 现 代 膜 杂 交 实 验 的 出 现 此 后, 随 着 分 于 生 物 学 研 究 的 不 断 发 展, 限 制 性 核 酸 内 切 酶 分 于 克 隆 基 因 组 DNA 文 库 Souther 口 印 迹 和 高 比 活 性 放 射 性 标 记 等 相 关 技 术 相 继 发 展 由 于 固 相 化 学 技 术 和 核 酸 自 动 合 成 仪 的 出 现, 常 规 制 备 18 个 ~100 个 碱 基 的 大 量 寡 核 昔 酸 探 针 成 为 可 能 利 用 限 制 酶 和 Southern 印 迹 技 术 可 分 析 数 微 克 DNA 中 的 特 异 基 因 特 殊 DNA Ejj(; mrna 序 列 的 量 和 大 小 都 可 用 Southern 或 Northern 印 迹 法 进 行 检 测 这 些 大 大 提 高 了 杂 交 水 平 和 可 信 度 另 外, 测 序 技 术 的 进 步 意 味 着 可 分 析 探 针 的 每 个 碱 基, 以 更 好 地 确 定 探 针 序 列 随 着 人 类 基 因 研 究 的 发 展, 非 放 射 性 核 酸 标 记 技 术 的 不 断 成 熟, 核 酸 杂 交 技 术 正 在 得 到 越 来 越 广 泛 地 利 用 第 一 节 样 本 的 制 备 目 前, 提 取 核 酸 的 万 法 较 多, 其 主 要 过 程 是 使 细 胞 破 裂, 释 放 DNA Ejj(; RNA, 再 经 过 处 理 去 除 蛋 白 质 RNA Ejj(; DNA o 核 酸 分 于 杂 交 所 用 的 核 酸 可 以 从 各 种 生 物 学 标 本 如 血 液 唾 液 尿 液 粪 便 鼻 咽 分 泌 物 组 织 及 其 他 来 源 获 取, 1 旦 样 品 制 备 必 须 与 所 选 杂 交 万 法 相 一 致 在 许 多 情 况 下, 斑 点 杂 交 采 用 粗 提 核 酸 样 品 的 制 备 万 法 就 足 够 了 ; 若 用 放 射 性 标 记 探 针 进 行 初 筛, 可 以 使 用 含 蛋 白 质 和 其 他 污 染 物 的 粗 制 样 品 ; 而 用 于 逆 转 录 反 应 106. per 或 非 放 射 性 标 记 探 针, 则 需 要 较 纯 的 核 酸 应 用 纯 核 酸 样 品 也 会 增 加

111 检 测 的 敏 感 性 总 之, 核 酸 样 品 的 制 备 是 核 酸 杂 交 技 术 应 用 过 程 的 第 一 步, 对 检 测 成 功 起 着 很 大 的 影 响 实 验 室 常 用 的 提 取 万 法 详 见 相 关 章 节 这 里 特 别 要 提 出 的 是 进 行 RNA 操 作 时, 应 注 意 的 主 要 问 题 是 RNA 酶 的 污 染 RNA 酶 很 稳 定, 一 般 而 言, 不 需 辅 助 因 于, 因 而 RNA 制 剂 中 只 要 存 在 少 量 RNA 酶 就 会 引 起 严 重 的 后 果 为 了 避 免 RNA 酶 的 污 染, 实 验 中 所 用 的 全 部 溶 液 器 皿 及 塑 料 制 品 都 需 要 处 理 由 于 于 是 RNA 酶 污 染 的 主 要 来 源 之 一, 所 以, 在 整 个 RNA 酶 的 制 配 操 作 过 程 中 必 须 戴 手 套 实 验 用 的 溶 液 均 需 用 DEPC 处 理 以 使 RNA 酶 失 i 舌 但 由 于 DEPC 会 与 Tris 发 生 化 学 反 应, 配 制 含 Tris 溶 液 时, 溶 液 应 用 DEPC 处 理 的 水 配 制 玻 璃 器 皿 必 须 在 250 'c 下 烤 4 h, 灭 菌 的 一 次 性 塑 料 器 具 直 接 开 封 使 用 可 以 认 为 无 RNA 酶, 新 的 未 灭 菌 的 塑 料 器 具 应 用 氯 仿 冲 洗 处 理 第 二 节 探 针 标 记 基 因 探 针 是 指 经 放 射 性 核 素 或 非 放 射 性 核 素 标 记, 用 以 检 测 某 一 特 定 核 昔 酸 序 列 的 DNA Ejj(; RNA 片 段 这 种 片 段 可 以 是 合 成 的 寡 核 昔 酸, edna, RNA, 酶 切 DNA 片 段 及 克 隆 质 粒 等 基 因 探 针 至 少 要 满 足 以 下 两 个 条 件 1 必 须 是 单 链 若 为 双 链, 杂 交 之 前 必 须 变 性 处 理 为 单 链 2 必 须 带 有 容 易 被 追 踪 及 检 测 出 来 的 标 记 基 因 探 针 的 标 记 分 为 放 射 性 核 素 标 记 与 非 放 射 性 标 记 两 种 类 型 一 放 射 性 核 素 标 记 法 ( ) 缺 口 平 移 标 记 法 缺 口 平 移 是 一 种 快 速 简 便 的 均 一 标 记 万 法, 可 产 生 高 比 活 性 的 DNA 探 针 1. 亥 万 法 是 由 两 类 酶 协 同 完 成 的, 包 括 DNase I 和 大 肠 杆 菌 DNA 聚 合 酶 I 的 5' 3' 聚 合 作 用 及 5' 3' 外 切 作 用 其 机 制 是 : 双 链 DNA 分 于 在 极 微 量 的 DNase I 的 作 用 下, 在 双 链 DNA 的 1 条 链 上 随 机 切 开 若 干 个 切 口, 但 并 不 是 切 断 双 链 DNA Ejj(; 将 其 阵 解 然 后, 由 于 大 肠 杆 菌 DNA 聚 合 酶 I 具 有 5' 3' 外 切 核 酸 的 特 ' 生, 它 切 除 缺 口 5' 端 1 个 或 多 个 核 昔 酸 同 时, 由 于 该 酶 具 有 5' 3' 聚 合 作 用, 在 缺 口 的 3' 端 逐 个 加 入 新 的 核 昔 酸 这 样 5' 端 核 昔 酸 的 切 除 和 3' 端 核 昔 酸 的 加 入 同 时 进 行, 导 致 切 口 沿 着 DNA 链 移 动, 新 的 核 昔 酸 合 成 是 以 另 一 互 补 链 为 模 板, 按 碱 基 互 补 的 原 则 合 成, 所 以 新 旧 链 的 核 昔 酸 顺 序 完 全 相 同 由 于 反 应 体 系 中 含 有 一 种 或 两 种 放 射 性 核 素 标 i 己 的 单 核 昔 酸, 使 新 合 成 链 带 有 放 射 性 核 素 标 记, 所 以, 缺 口 平 移 实 际 上 是 放 射 性 核 素 标 记 的 核 昔 酸 取 代 了 原 DNA 链 中 不 带 放 射 性 核 素 的 同 种 核 昔 酸 DNase I 是 在 两 条 链 的 不 同 部 位 随 机 打 开 缺 口, 因 而 使 两 条 链 都 被 均 匀 地 标 记 上 放 射 性 核 素, 使 得 标 i 己 的 DNA 有 较 高 的 放 射 比 活 性 缺 口 平 移 可 快 速 有 效 地 标 记 环 状 Ejj(; 线 状 的 双 链 DNA 模 板, 单 链 DNA 不 能 用 这 种 万 法 标 记 其 具 体 操 作 步 骤 如 下 1. 在 冰 浴 中 依 次 加 入 下 列 试 剂 ( 标 记 0.25μg DNA 的 反 应 体 系 为 25μ 1): 水 (20 x- Y)μ1, 10 X 缺 口 平 移 缓 冲 液 2. 5μ1, 10 mmol/l dntp O. 5μ1, 10-4 gil DNase 107

112 I 1 vi, 大 肠 杆 菌 DNA 聚 合 酶 I 1 vi, DNA (0.25 Vg) XvI, α 32 P dctp Y vi 在 加 入 DNA 之 后 立 即 加 入 放 射 性 核 素 并 迅 速 泪 匀 2. 立 即 保 温 于 14'C ~16 'c 水 浴 中 约 45 mi 日, 反 应 时 间 取 决 于 每 Itt DNase I 的 活 性 曲 线 3. 反 应 完 毕 后, 加 入 1μl 终 止 液 4. 加 入 0.4 倍 体 积 的 5 mol/ L 乙 酸 按 5. 加 入 2 倍 体 积 冰 冷 的 无 水 乙 醇, 沉 淀 15 mi 日, 4'C 离 心 15 min a 6. 用 70% 乙 醇 沉 淀 2 次, 无 水 乙 醇 沉 淀 1 次, 每 次 于 4 'c 离 心 10 min a 7. 空 中 干 燥 沉 淀, 溶 于 水 Ejj(; TE 中 要 获 得 放 射 比 活 性 较 高 的 探 针, DNase I 的 用 量 和 反 应 时 间 是 非 常 重 要 的 DNase I 用 量 太 小 或 反 应 时 间 太 短, 标 记 将 不 充 分 ; 如 果 DNase I 用 量 太 大 或 反 应 时 间 过 长, 将 导 致 DNA 阵 解 因 此, 对 每 一 批 配 制 的 DNase I, 都 要 进 行 活 性 测 定, 以 决 定 最 合 适 的 DNase I 的 用 量 和 反 应 时 间 一 般 说 来, 用 1 vi O. 1 mg/l DNase I 反 应 时 间 为 15 min~45 mi 日 时, 可 达 到 30% ~40% 的 放 射 性 核 素 掺 入 如 用 来 标 i 己 的 DNA 片 段 较 小 «500 bp) 应 多 加 一 些 DNase I, 以 保 证 每 个 DNA 分 于 上 起 码 产 生 一 个 缺 口 ( 二 ) 随 机 ~I 韧 标 记 法 随 机 引 物 标 记 法 由 Feinberg 等 首 先 提 出, 是 使 用 寡 核 昔 酸 引 物 和 大 肠 杆 菌 DNA 聚 合 酶 I 的 Klenow 片 段 来 标 记 DNA 其 原 理 是 : 单 链 Ejj(; 双 链 探 针 DNA 片 段 经 煮 沸 变 性 形 成 单 链 DNA 分 于 后, 六 聚 核 昔 酸 引 物 随 机 结 合 在 单 链 DNA 分 于 上 然 后, 在 反 应 体 系 中 加 入 DNA 聚 合 酶 I Klenow 片 段, 此 酶 能 从 六 聚 核 昔 酸 引 物 的 3' 端 开 始, 按 照 5' 3' 万 向, 遵 f 盾 碱 基 互 补 的 原 理 合 成 一 新 的 DNA 链, 其 核 昔 酸 顺 序 与 模 板 DNA 完 全 互 补 另 一 单 链 DNA 模 板 分 于, 同 样 合 成 一 条 新 的 完 全 互 补 的 DNA 链 由 于 反 应 体 系 中 的 4 种 单 核 昔 酸 有 一 种 带 有 放 射 性 核 素 标 记, 在 合 成 反 应 中 掺 入 到 新 合 成 的 DNA 分 于, 使 合 成 的 DNA 带 有 放 射 性 核 素 1. 试 剂 (1) 溶 液 1: mol/l Tris - HCI (ph 8. 的, O. 125 mol/l MgCb a (2) 溶 液 2 溶 液 1 1 ml, BSH 18μ1, 0.5 mmol/l dntps ( 无 dctp) 1 vi, H via (3) 溶 液 3: 2 mol/l Hepes (ph 6.6) (4) 溶 液 4: 900 DPd (N)6 1 ml a (5) 溶 液 5 按 <j; ( 溶 液 2: 溶 液 3: 溶 液 的 二 10 : 25 : 15 配 制 (6) 10 gil BSA a (7) DNA 聚 合 酶 Klenow 片 段 (8) 0.5 mol/l EDTA 2. 操 作 步 骤 (1) 变 性 探 针 DNA 片 段 : 取 探 针 DNA 片 段 约 50 ng~100 日 g, 力 口 水 至 20μ1, 煮 3 mt 日 后, 冰 浴 中 迅 速 冷 却 (2) 标 记 探 针 DNA 片 段 : 在 冰 浴 中 依 次 向 10μl 溶 液 5 中 加 入 10 gil BSA, 热 变 108

113 性 探 针 DNA20μl α 32p dctp 2μ1~3 vi, 加 H 2 0 至 50 vi, DNA 聚 合 酶 Klenaw 片 段 1μ1, 混 合 后 短 暂 离 心, 使 液 体 聚 于 管 底 室 温 下 (20 'c 左 右 ) 反 应 2 h~3 h o (3) 用. 5 mal/l EDTA 10μl 终 止 反 应 (4) 加 入 0.4 倍 体 积 的 5 ma l/ L 乙 酸 按 (5) 加 入 2 倍 体 积 冰 冷 的 无 水 乙 醇, 沉 淀 15 mi 日, 4'C 离 心 15 mino (6) 用 70% 乙 醇 沉 淀 2 次, 无 水 乙 醇 沉 淀 1 次, 每 次 4 'c 离 心 10 mi 日 (7) 空 中 干 燥 沉 淀, 溶 于 水 E!lG TE 中 在 此 法 中, 由 于 DNA 聚 合 酶 Klenaw 片 段 缺 乏 5' 3' 外 切 核 酸 的 活 性, 故 它 在 寻 物 延 伸 过 程 中 的 应 用 可 避 免 己 掺 入 标 记 物 的 丢 失 使 用 ph 值 为 6.6 的 缓 冲 液 可 大 大 降 低 5' 3' 外 切 核 酸 的 活 ' 生, 从 而 保 证 高 质 量 标 记 探 针 的 合 成 使 用 这 种 万 法, 60% 以 上 的 放 射 性 标 记 核 昔 酸 被 掺 入 到 DNA 上, 产 生 比 活 性 超 过 10 9 cpm/μg 的 DNA 探 针 DNA 片 段 大 小 不 影 响 标 记 的 结 果, 不 需 要 进 行 DNA 酶 I 的 活 性 标 定, 因 而 利 用 各 种 模 板 都 能 产 生 比 较 一 致 的 探 针 另 外, 反 应 过 程 中 加 入 的 DNA 不 被 阵 解, 使 得 加 入 的 DNA 可 以 少 于 200 吨 这 种 标 记 万 法 的 主 要 缺 点 是 产 生 的 标 记 探 针 量 比 缺 口 平 移 的 量 要 少 些, 环 状 的 DNA 分 于 用 酶 切 断 成 线 性 分 于 E!lG 碱 法 E!lG DNA 酶 I 产 生 缺 口, 才 能 有 效 地 标 记 ( 三 ) 单 链 RNA 探 针 的 标 记 高 比 活 性 的 放 射 性 标 记 RNA 探 针 可 以 克 隆 到 一 种 商 品 化 转 录 载 体 DNA 序 列 来 制 备, 若 使 ds-dna 5' 端 带 上 有 针 对 毛, T6 或 SP 6 RNA 聚 合 酶 的 RNA 启 动 位 点, 这 样 在 聚 合 酶 { 崔 化 作 用 下 就 可 制 备 到 大 量 的 带 有 某 种 放 射 性 核 素 标 i 己 的 单 链 RNA 探 针 其 具 体 操 作 步 骤 如 下 1. 用 适 宜 的 限 制 性 内 切 酶 在 插 入 片 段 的 下 游 切 断 重 组 DNA 分 于, 形 成 一 个 人 为 的 RNA 合 成 终 点 2. 灭 活 内 切 酶, 纯 化 DNA o 3. 在 冰 浴 中 依 次 加 入 下 列 试 剂 : H 2 0 (20 - X- Y) vi, 10 x 缓 冲 液 2. 5 vi, 0.5 m mal/l dntp s ( 无 ATP) 2μ1, DNA (0.1μg) Xμ1, T 7 RAN 聚 合 酶 (5 U) 1 μ1, α32p datp Y Vlo 4. 1 昆 匀, 37'C 保 温 30 mino 5. 加 入 2μ10.5 mal/l EDTA E!lG 75'C 加 热 10 mi 日 终 止 反 应 使 用 标 记 RNA 探 针 进 行 杂 交 的 优 点 是 : RNA: RNA 和 RNA: DNA 杂 交 体 比 DNA: DNA 杂 交 体 更 稳 定, 使 杂 交 效 率 增 加, 信 号 加 强 ; 合 成 的 RNA 探 针 为 纯 一 的 单 链, 不 会 自 身 退 火, 探 针 杂 交 不 需 变 性, 而 且 所 有 探 针 都 可 用 于 杂 交 ; 杂 交 完 成 后, 可 利 用 RNA 酶 去 除 未 杂 交 的 探 针, 降 低 本 底 其 缺 点 是 : 必 须 保 证 无 RNA 酶 污 染 ; 模 板 首 先 要 经 线 性 化 处 理 由 于 此 法 合 成 的 RNA 探 针 为 纯 一 的 单 链, 在 常 规 分 于 杂 交 条 件 下, 杂 交 效 率 增 加, 信 号 较 强 ( 四 ) PCR) 去 在 PCR 反 应 液 中 加 入 32p 或 35 S 标 i 己 的 dctp 使 DNA 扩 增 产 物 标 记 上 放 射 性 核 素 109

114 该 法 简 便 快 速 起 始 模 板 需 要 量 小, 可 省 去 事 先 制 备 DNA 片 段 的 复 杂 步 骤 ( 五 ) 单 链 DNA 探 针 的 标 记 将 基 因 组 DNA Ejj(; edna 片 段 克 隆 到 M13 噬 菌 体 载 体 中, 则 此 类 噬 菌 体 可 产 生 大 量 单 链 环 状 重 组 DNA 以 SS-DNA 为 模 板, 配 合 上 一 个 位 于 插 入 DNA 片 段 3' 端 的 寻 物, 就 可 以 在 DNA 聚 合 酶 大 片 段 催 化 作 用 下 制 备 到 放 射 性 核 素 标 记 的 SS-DNA 探 针 ( 六 ) 5' 末 踹 标 记 ; 去 此 法 通 常 用 于 寡 核 昔 酸 探 针, 反 应 效 率 很 高 5' 末 端 标 记 法 是 利 用 多 聚 核 昔 酸 激 酶 的 活 力 将 γ 32p ATP 的 γ 位 的 32p 转 移 到 寡 核 昔 酸 链 5' 末 端 起 基 的 位 置 上 去 其 操 作 步 骤 如 下 1. 向 0.5 m1 反 应 管 中 依 次 加 入 下 列 试 剂 : H 20 (12 - X)μ1, 10 X 缓 冲 液 2. 5μ1, 寡 核 昔 酸 (20 日 g~200 日 g) 10μ1, γ 32PATP (0.74MBq~3.7MBq) Xμ1, T4 多 聚 核 昔 酸 激 酶 (5 U) 1μ1 j 昆 匀, 离 心 2. 37'C 反 应 1 h~2 h o 3. 75'C 加 热 10 mi 日 终 止 反 应 0 4. 分 离 除 去 游 离 核 昔 酸 二 非 放 射 性 标 记 法 目 前 发 展 的 非 放 射 性 标 记 核 酸 的 万 法 很 多 主 要 可 以 分 为 两 大 类, 第 一 类 是 酶 促 标 记 法, 第 二 类 是 化 学 标 记 法 酶 促 标 记 法 常 比 化 学 标 记 法 灵 敏 度 高, 缺 点 是 较 复 杂 重 复 性 费 用 高, 难 于 按 比 例 增 加 标 记 物 化 学 标 记 法 则 经 济 简 单 有 些 化 学 标 记 体 系 己 应 用 较 广 泛, 用 同 种 基 本 化 学 万 法 可 以 在 DNA 上 标 记 不 同 的 检 测 基 因 在 此 主 要 介 绍 最 常 用 的 标 记 DNA 和 寡 核 昔 酸 的 万 法 ( 一 ) 修 饰 核 自 酸 酶 促 标 记 DNA 1. 缺 口 平 移 法 DNA 缺 口 平 移 主 要 利 用 适 当 浓 度 的 脱 氧 核 糖 核 酸 酶 I 的 作 用, 在 双 链 DNA 上 造 成 缺 口, 然 后 在 DNA 聚 合 酶 I 的 催 化 下 发 生 外 切 与 聚 合 反 应, 从 而 使 修 饰 核 昔 酸 代 替 底 物 掺 入 到 DNA 分 于 去 除 小 分 于 后 得 生 物 素 标 记 物 由 于 修 饰 核 昔 酸 分 子 比 核 昔 酸 分 于 大, 将 标 记 中 的 缺 口 反 应 与 聚 合 反 应 分 开 进 行, 增 加 聚 合 时 间, 以 提 高 掺 入 率, 使 探 针 灵 敏 度 和 杂 交 灵 敏 度 提 高 (1) 试 剂 : 1) 10 X 缺 口 平 移 缓 冲 液 : 500 mmol/l Tris (ph 7.5), 100 mmol/1 MgCb, 80 mmol/l ~ 琉 基 乙 醇, 500 mg/l BSA o 2) 1 gil DNase I 3) 5 mmol/l dntps o 的 10 gil 酵 母 trna 水 溶 液 5) 生 物 素 dutp, 生 物 素 datp, 地 高 辛 dutp o 6) DNA 聚 合 酶 I 的 K1enow 片 段 (2) 操 作 步 骤 : 1) 冰 浴 中, 于 硅 化 的 试 管 中 加 入 持 标 记 DNA 0.5μg~lμg 10 X 缺 口 平 移 缓 冲 液 110

115 5μ1, 1 : 稀 释 的 DNase I 水 溶 液 1 vi, 3 种 无 标 i 己 的 dntps 各 1 vi, 修 饰 的 dntp 终 浓 度 200 vmo l/ L~ 500 vmo l/ L, 加 水 至 40 Vlo 2) 加 1μ1 DNA 聚 合 酶 I 的 Klenow 片 段 (5μ1~10μ1), 15'C 反 应 1 ho 3) 加 4 vi o. 25 mol/l EDTA, 2 Vl lo gil 酵 母 trna 水 溶 液 和 150 Vl10 mmol/l Tris (ph7.5) 终 止 反 应 2. 随 机 引 物 延 伸 法 以 随 机 六 聚 体 作 引 物, 被 标 记 的 DNA 变 性 后 与 引 物 退 火, 在 DNA 聚 合 酶 I Klenow 片 段 的 催 化 下, 以 单 链 DNA 为 模 板 进 行 延 伸 反 应, 在 延 伸 反 应 中 将 修 饰 核 昔 酸 掺 入 到 新 合 成 的 DNA 链 中 (1) 试 剂 : 1) 10 X 随 机 引 物 标 记 缓 冲 液 : 500 mmol/l Tris (ph 6. 6), 100 mmol/l MgCb, 80 mmol/l ~ 琉 基 乙 醇, 500 mg/l BSAo 2) 0.5 mol/l EDTAo 3) 5 mmol/l dntpo 的 10 gil 酵 母 trna 水 溶 液 5) 修 饰 的 dntp: 生 物 素 dutp, 生 物 素 datp, 地 高 辛 dutpo 6) DNA 聚 合 酶 I 的 Klenow 片 段 7) 随 机 六 核 昔 酸 引 物 (2) 操 作 步 骤 : 1) 取 待 标 记 DNA 1μg 加 于 O. 5μ1 Ep 管 中, 再 加 5μg 随 机 引 物 密 封 后 煮 沸 3 日 uno 2) 放 在 冰 浴 上 5 mino 3) 在 冰 浴 上 加 入 10 X 随 机 引 物 标 记 缓 冲 液 5μ1, 3 种 dntps 各 1μ1, Xμl 修 饰 的 dntp ( 终 浓 度 为 100 vmo l/ L) 加 水 至 48 vi, 2 vi DNA 聚 合 酶 I 的 Klenow 片 段 的 37 'c 2 h 后 室 温 放 置 过 夜 5) 加 终 止 液 2μ mol/l EDTA, 2μ1 10 gil 酵 母 trna 水 溶 液 和 150μl 10 mmol/l Tris (ph 7.5) 3. 加 尾 法 (1) 试 剂 : 1) 末 端 转 移 酶 0 2) 5 X 加 尾 缓 冲 液 ( 末 端 转 移 酶 通 常 配 有 )0 3) 5 mmol/l dctp 0 的 修 饰 的 dntp: 生 物 素 dutp, 生 物 素 datp, 地 高 辛 dutp, AH datp 5) 5 mo l/ L 乙 酸 按 0 6) 异 丙 醇 7) 冷 无 水 乙 醇 和 70% 乙 醇 0 8) 100 mmol/l MgCbo 9) 0.05 mg IL DNase I. 111.

116 (2) 操 作 步 骤 : 1) 产 生 缺 口 DNA: 含 1μg 待 标 记 的 DNA 溶 液 中 加 入 100 mmol/l MgCb ( 终 浓 度 为 2 mmol/ L), 并 加 入 2. 4 U mg/l DNA 酶 I 溶 液, 于 16 'c 放 置 1 mi 日 ~5 1 丑 1 日, 然 后, 60'C 加 热 10 mi 日 以 使 酶 夫 活 2) 1μg 缺 口 DNA 中 直 接 加 入 如 下 试 剂 : 5 x 力 日 尾 缓 冲 液 20 vi, 修 饰 的 dntp 使 终 浓 度 为 100μmo l/ L, 5 mmol/l dctp 4μl 使 终 浓 度 为 200 vmol/ L, 加 水 至 100μ1, 混 合 后 加 末 端 转 移 酶 50 U o 3) 37'C 保 温 10 mi 日, 加 入 40 vi 乙 酸 按 和 300 vi 异 丙 醇 沉 淀 加 尾 DNA, 冰 浴 15 r 丑 1 日, 离 心 的 沉 淀 物 分 别 用 冷 70% 乙 醇 和 无 水 乙 醇 洗 后 晾 干, 再 放 入 150 vi 水 中 如 果 是 生 物 素 dutp, 生 物 素 datp, 地 高 辛 dutp 标 i 己 的 探 针, 可 以 直 接 使 用 ; 如 果 使 用 的 是 AH - datp, 沉 淀 应 该 溶 解 在 150μlpH 值 为 9.0 的 0.1 mol/l NaHC0 3 溶 液 中, 并 按 以 下 万 法 加 一 个 检 测 基 团 4. AH-dATP 修 饰 DNA 的 标 记 (1) 所 需 试 剂 : 1) 1 mol/l NaHC0 30 2) DMSO o 3) 活 性 检 测 基 团 :N 起 基 丁 二 酌 肢 生 物 素 (NHS 生 物 素 ), N 起 基 丁 二 酌 肢 二 硝 基 苯 (NHS- DNP), 二 硝 基 氟 苯 (2) 操 作 步 骤 : 1) 取 1 mg 检 测 基 团 化 合 物 溶 于 100μ1 DMSO 中, 短 暂 离 心, 沉 淀 不 溶 物 2) 在 10μg AH- datp 修 饰 DNA 中 加 入 100μ1 DMSO, 50 vi 10 g/l 活 化 检 测 基 团 洁 液 于 室 温 暗 处 放 置 1 h o 3) 加 100μg trna, 140μ15 mo l/ L 乙 酸 按, 980μl 异 丙 醇 冰 浴 15 mi 日, 离 心 10 mi 日 的 用 无 水 乙 醇 洗 沉 淀 物, 晾 干, 重 溶 于 100 vi 水 中 5) 用 10μ14 mo l/ L 乙 酸 铀 和 250μl 乙 醇 再 进 行 沉 淀, 用 70% 乙 醇 和 无 水 乙 醇 洗 沉 淀, 干 燥, 重 溶 于 200μl 水 中 ( 二 ) 酶 促 标 记 寡 核 自 酸 1. 酶 促 生 物 素 标 记 寡 核 昔 酸 该 技 术 是 用 末 端 转 移 酶 (TdT) 将 生 物 素 底 物 直 接 联 到 寡 核 昔 酸 的 3' 起 基 末 端 其 操 作 步 骤 如 下 (1) 3' OH 寡 核 昔 酸 20 日 g~50 日 g, O. 5 mmol/l Bio dutp 2 vi, TdT (2 X 10 6 U/L)2μ1, 2 x TdT 缓 冲 液 10 vi, 力 口 水 至 20 vi, 1 昆 匀 (2) 37'C 保 温 州 mln o (3) 加 0.5 mmol/l EDTA (ph 8.0) 2μ1, TE 78μl 终 止 反 应 (4) 分 离 标 记 探 针 2. 酶 促 地 高 辛 标 记 寡 核 昔 酸 异 起 基 洋 地 黄 昔 (digoxigenin) 简 称 地 高 辛, 是 一 112.

117 种 苗 族 化 合 物, 自 然 界 存 在 于 毛 地 黄 植 物 中 Dig -11- dutp 是 核 昔 酸 的 类 似 物, 在 一 定 条 件 下 与 靶 DNA 特 异 性 结 合 此 万 法 是 在 TdT 的 作 用 下 把 Dig -11- dutp 连 接 于 寡 核 昔 酸 3' 末 端 其 操 作 步 骤 如 下 (1) 寡 核 昔 酸 30 pmol, 10 x TdT 缓 冲 液 2. 5μ1, 1 mmol/l dig dutp 2. 5 μ1, 加 三 蒸 水 至 22 via (2) 再 加 入 1μ11 mmol/l DTT 和 2μ1 TdT (10 7 U/L), 37'C 温 育 2 h a (3) Dig 标 记 的 寡 核 昔 酸 探 针 于 20 'c 保 存 ( 三 ) 化 学 法 标 记 DNA 1. 生 物 素 化 学 标 记 DNA 1985 年 Forster 等 发 展 的 用 光 生 物 化 学 修 饰 DNA 是 最 简 单 适 用 的 化 学 标 记 万 法 在 可 见 光 下, 光 生 物 素 连 接 的 芳 基 叠 氨 物 转 化 为 具 有 活 性 的 芳 基 叠 烯 物, 与 DNA 或 RNA 反 应, 此 反 应 对 腺 嘿 岭 相 对 专 一 (1) 试 剂 : 1) 光 敏 生 物 素 2) 1mol/LTris-HCl (ph8.0)a 3) 仲 丁 醇 的 4 mol/ L 乙 酸 纳 5) 无 水 乙 醇 和 70% 乙 醇 (2) 操 作 步 骤 : 1) 质 粒 DNA 必 须 用 酶 消 化 成 线 性 或 碱 处 理 打 开 缺 口 M13 DNA 和 分 离 的 片 段 标 记 前 不 需 处 理 为 了 有 效 地 标 记, 所 有 的 DNA 标 本 都 必 须 溶 解 在 水 中 2) 反 应 前 应 在 暗 光 或 避 光 条 件 下, 按 1 gil 将 光 敏 生 物 素 溶 解 于 水 中, -20'C 避 光 保 存 3) 1. 5 ml 离 心 管 中 加 入 缺 口 DNA 10 Vg, 1 gil 光 敏 生 物 素 20 vi 加 水 至 50 VIa 4) 震 动 泪 匀 放 置 冰 浴 中, 在 GE 日 光 灯 10 em 下, 光 照 10 mi 日 5) 加 100μ1 o. 1 mol/l Tris (ph 8. 的, 用 100μl 仲 丁 醇 抽 提 2 次, 加 75μl 水, 10μ1 4 mo l/ L 乙 酸 纳, 250μl 乙 醇 冰 浴 中 放 置 15 r 丑 1 日, 离 心 6) 用 500μ1 70% 乙 醇 和 无 水 乙 醇 各 洗 沉 淀 1 次, 晾 干 用 200 vi 水 重 新 溶 解 至 50 mglla 2. 半 抗 原 化 学 标 记 DNA (1) 试 剂 : 1) 光 敏 DNP: 约 5 gil 溶 于 DMSO 中 0 2) 1 mol/l Tris- HCl (ph 8.0) 3) 异 丙 醇 0 4) 4 mo l/ L 乙 酸 纳 5) 冷 无 水 乙 醇 和 70% 的 乙 醇 (2) 操 作 步 骤 : 1) 质 粒 DNA 必 须 用 酶 消 化 成 线 性 或 碱 处 理 打 开 缺 口 M13 DNA 和 分 离 的 片 段 标 113

118 记 前 不 需 处 理 为 了 有 效 地 标 记, 所 有 的 DNA 标 本 都 必 须 溶 解 在 水 中 2) 缺 口 DNA (2μg~10μg) 10μ1, DMSO 25μ1 ( 终 浓 度 大 于 70% ), 每 微 克 探 针 DNA 加 入 光 敏 DNP 2μgo 3) 振 荡 泪 匀, 置 于 冰 浴 中, 在 高 能 日 光 灯 下 照 1 mino 的 加 入 165μl 水, 20μ1 4 mo l/ L 乙 酸 纳, 500 vi 异 丙 醇 沉 淀 标 记 DNA o 5) 用 70% 的 乙 醇 和 冷 无 水 乙 醇 洗 沉 淀 DNA 各 1 次, 晾 干 再 溶 于 200μl 水 中 ( 四 ) 化 学 法 标 记 寡 核 自 酸 1. 化 学 法 生 物 素 标 记 寡 核 昔 酸 在 5' 磷 酸 化 的 寡 核 昔 酸 上 加 上 氨 基 基 团, 然 后 与 NHS 生 物 素 相 作 用, 将 生 物 素 标 记 在 寡 核 昔 酸 的 5' 端 (1) 试 剂 : 1) 10 X ClP 缓 冲 液 : O. 5 mol/l Tris - HCl (ph 9. 0), 10 mmol/l MgCb, 1 mmol/l ZnCb, 10 mmo l/ L 亚 精 肢 2) 0.1 mmol/l ATP - Nao 3) T4 多 核 昔 酸 激 酶 的 眯 哩.1 mol/l (ph 6.0)0 5) EDC 0.1 mol/la 6) 乙 二 肢.25 mol/l (ph 7.8) 7) 磷 酸 饵 缓 冲 液.1 mol/l (ph 7.5) 8) NHS 生 物 素 溶 于 二 甲 基 甲 酌 肢 40 mmol/la 9) 饱 和 酣 10) 氯 仿 11) 95 % 乙 醇 (2) 操 作 步 骤 : 1) 混 合 10 X ClP 缓 冲 液 10 vi, 5'OH 寡 核 昔 酸 10μg, ATP 1μ1, T4 核 昔 酸 激 酶 10 U~20 U 加 水 至 100 V10 2) 37'C 保 温 10 min o 加 2μl 的 0.5 mol/l EDTA (ph 8.0), 力 口 等 体 积 混 合 的 饱 和 酌 / 氯 仿 100 V10 ~ 昆 匀, 1 r 丑 1 日 后, r/ mi 日 离 心 20 mino 3) 取 上 清 液, 加 1/10 体 积 3 mo l/ L 乙 酸 铀 (ph 4. 6), 2.5 倍 体 积 乙 醇, 沉 淀 以 70% 乙 醇 洗 1 次, 真 空 干 燥 4) 将 5' 磷 酸 寡 核 昔 酸 溶 于 眯 日 坐 EDC 100μ1, 在 20 'c 反 应 90 mi 日, 加 入 2. 5 倍 体 积 的 95% 乙 醇 回 收 沉 淀 物 5) 将 沉 淀 溶 于 200μl 乙 二 肢 中, 在 50 'c 中 保 温 60 mi 日, 用 95% 乙 醇 回 收 沉 淀 物 6) 将 5' 氨 ; 院 基 磷 酌 肢 基 寡 核 昔 酸 沉 淀 物 溶 于 磷 酸 饵 缓 冲 液 50μl 中, 加 入 NHS 生 物 素 50μ1, j 昆 匀, 于 20 'c 反 应 20 ho 7) 以 乙 醇 沉 淀 法 回 收 生 物 素 标 记 的 寡 核 昔 酸, 溶 于 200μl 水 中, 于 20 'c 存 放 2. 酶 标 寡 核 昔 酸 用 酶 ( 主 要 是 碱 性 磷 酸 酶 AP 或 辣 根 过 氧 化 物 酶 HRP) 直 接 标 记 在 寡 核 昔 酸 的 5' 末 端 或 内 部 此 类 探 针 的 优 点 是 直 接 检 测, 手 续 简 化, 非 特 异 杂 交 或 吸 附 低, 而 灵 敏 度 较 高, 可 达 0.25 凶, 1 旦 标 记 万 法 较 为 复 杂 其 原 理 是 在 DNA 合 114

119 成 仪 上 将 特 定 的 寡 核 昔 酸 合 成 后 再 加 上 一 个 C 6 SH 基 修 饰 物 于 其 5'OH 基 上 ( 亦 可 接 NH 2 修 饰 物, 称 为 TFA 氨 基 连 接 物 ) 保 留 三 苯 甲 基 在 合 成 物 上 去 掉 保 护 基 后 在 寡 核 昔 酸 的 5'~ 自 产 生 一 个 活 泼 的 SH, 然 后 与 活 化 的 HRP 反 应 其 操 作 步 骤 如 下 (1) 将 C 6 ~ 在 基 修 饰 物 约 15 mg, 溶 于 0.21 ml 乙 睛 中, 在 DNA 合 成 仪 上, 以 Tritylon 程 序 加 C6 - ~ 在 基 修 饰 物 于 寡 核 昔 酸 的 5' 端 (2) 以 NH 4 0H 脱 保 护 基 于 55 'c 放 置 6 h 以 上, 然 后 真 空 干 燥 (3) 以 200μI o. 1 mo l/ L 的 三 乙 肢 乙 酸 盐 (ph7.0) 溶 解 r 卖 A 260 值 测 定 寡 核 昔 酸 的 浓 度 和 总 量 (4) 将 寡 核 昔 酸 以 0.1 mo l/ L 三 乙 肢 乙 酸 盐 (ph7.0) 稀 释 25 倍 (5) 取 200μl 寡 核 昔 酸 液 加 30μI 1 mo l/ L 的 硝 酸 银 液, ; 昆 匀, 室 温 放 置 30 min, 去 Trityl 基 (6) 加 40μI 1 mg/l DTT, 1 昆 匀 室 温 放 置 15 mi 日, 去 AgN030 (7) 在 Ep 离 心 机 上 离 心 15 mi 日, 留 上 i 青 液 沉 淀 以 100μI o. 1 mo l/ L 的 三 乙 肢 乙 酸 盐 (ph7.0) 洗 1 次, 再 离 心 5 mi 日 合 并 两 次 上 清 液 (8) 取 Sephadex G25 小 柱, 以 水 平 衡, 加 5 fl g 的 去 Trityl 的 寡 核 昔 酸 (50 fll) 离 心 去 除 DTT o (9) 将 50μl 脱 盐 的 寡 核 昔 酸 加 入 活 化 的 HRP 管 中, ; 昆 匀, 短 暂 离 心, 于 室 温 下 放 置 1 h o (1 0) 加 0.1 mo l/ L 磷 酸 铀 缓 冲 液 (ph7.0) 至 总 体 积 为 250 fl I, 力 口 等 体 积 的 去 离 于 甘 油, 泪 匀, -20'C 保 存 第 二 节 Southern 印 迹 杂 交 Southern 印 迹 杂 交 是 经 电 泳 分 离 的 DNA 片 段 与 核 酸 探 针 杂 交 的 一 种 实 验 技 术 其 原 理 是 基 因 组 DNA 经 限 制 性 内 切 酶 酶 解, 再 经 适 当 浓 度 的 凝 胶 电 泳 分 离, 然 后 将 I~ 是 胶 先 后 用 NaOH 溶 液 及 Tris 溶 液 处 理, 使 DNA 变 性 再 使 SS-DNA 转 移 到 硝 酸 纤 维 素 膜 E\l(; 尼 龙 膜 上, 通 过 处 理 滤 膜, 使 DNA 牢 牢 固 定 在 膜 上, 用 适 当 的 探 针 与 固 定 在 膜 上 的 SS-DNA 杂 交, 经 放 射 自 显 影 或 显 色 后, 观 察 结 果 这 项 技 术 是 Southern 等 于 1975 年 首 先 报 道 的, 其 原 理 和 操 作 并 不 复 杂, 是 基 因 分 析 中 必 不 可 少 的 手 段 Southern 印 迹 杂 交 己 广 泛 应 用 于 组 建 DNA 物 理 图 谱, 研 究 基 因 重 组 变 异 基 因 的 限 制 性 内 切 酶 酶 切 片 段 长 度 多 态 性 分 析 (RFLP), 以 及 疾 病 的 基 因 诊 断 基 本 程 序 是 : 限 制 性 内 切 酶 消 化 DNA 凝 胶 电 泳 分 离 DNA 片 段 变 性 并 转 移 到 膜 上 固 定 杂 交 放 射 自 显 影 或 显 色 i 卖 片, 分 析 结 果 一 限 制 性 内 切 酶 消 化 DNA 进 行 限 制 性 内 切 酶 切 割 反 应 只 需 简 单 地 将 酶 和 DNA 样 品 放 在 合 适 的 反 应 缓 冲 液 中 温 育, 其 中 DNA 和 酶 的 量, 缓 冲 液 的 高 于 强 度, 温 育 温 度 和 时 间 都 依 具 体 的 反 应 而 改 115.

120 变 现 以 Hind 田 为 例, 说 明 其 操 作 过 程 ( 一 ) 试 剂 和 材 料 1. 限 制 性 内 切 酶 Hind 囚 2. 限 制 性 内 切 酶 消 化 缓 冲 液 3. DNA 样 品 mol/l EDTA (ph 8.0)0 5. 超 纯 水 或 重 蒸 水 ( 二 ) 操 作 步 骤 1. 按 要 求 确 定 反 应 体 积 (10μI~100μ1) 2. 反 应 体 积 以 20μl 为 例 在 微 量 离 心 管 中 加 入 下 列 试 剂 : 超 纯 水 7μ1, 10 X buffer 2μ1, DNA 样 品 (0.5 g/l)10μ1, Hind 田 1 VIo 3. 1 昆 匀 后 可 加 样 电 泳 ( 三 ) 注 意 事 顶 1. 不 同 的 限 制 性 内 切 酶 生 产 厂 家 往 往 推 荐 使 用 不 同 的 反 应 条 件, 甚 至 对 同 一 种 酶 也 是 如 此 所 以 应 尽 可 能 使 用 厂 家 提 供 的 缓 冲 液 并 遵 帽 说 明 书 进 行 操 作 2. 由 于 反 应 体 积 较 小, 在 加 完 各 反 应 成 分 后, 应 短 暂 离 心 并 充 分 泪 匀 3. 用 1 种 以 上 的 内 切 酶 来 消 化 DNA 时, 如 果 所 需 的 反 应 条 件 相 差 太 大, 可 以 首 先 加 入 需 要 低 浓 度 NaCI 的 酶 消 化 DNA, 反 应 后 再 加 入 NaCI 和 另 一 种 酶 进 行 反 应 ( 四 ) 影 响 限 制 性 核 酸 内 切 酶 洁 性 的 常 见 因 素 1. DNA 样 本 不 纯 提 取 到 DNA 后, 应 该 用 70% 乙 醇 多 洗 DNA 沉 淀 几 次, 洗 掉 样 品 中 的 盐 及 残 存 的 回 升 氯 仿 EDTA SDS 等 杂 质 因 为 这 些 物 质 的 存 在 均 可 抑 制 限 制 性 核 酸 内 切 酶 的 活 性, 最 后 残 存 的 乙 醇 要 抽 干 或 使 其 挥 发 以 防 影 响 酶 活 性 2. DNA 样 品 溶 解 不 好 DNA 太 浓, 粘 度 大, 形 成 网 状 结 构 使 限 制 性 核 酸 内 切 酶 不 能 发 挥 作 用 3. 甘 油 浓 度 过 高 一 般 多 加 些 限 制 酶 可 加 速 E\l(; 保 证 完 全 消 化 DNA, 但 需 要 注 意 体 系 中 甘 油 对 酶 活 性 的 影 响 反 应 体 系 中 甘 油 的 体 积 分 数 应 少 于 5%, 所 有 商 品 的 限 制 酶 均 存 于 50% 的 甘 油 中, 故 力 口 的 酶 的 体 积 不 应 超 过 总 反 应 体 积 的 1 / DNA 甲 基 化 的 影 响 限 制 酶 识 别 序 列 中 的 碱 基 A T 被 甲 基 化 后, 会 阻 碍 限 制 酶 的 消 化 活 性 受 甲 基 化 影 响 的 酶 在 产 品 说 明 书 中 都 会 有 标 示 5. 底 物 不 同 一 些 限 制 酶 对 线 ' 生 DNA 和 超 螺 旋 DNA 底 物 的 活 性 有 所 不 同, 如 EcoRI 泊 ' 化 超 螺 旋 pbr322 DNA 时 的 用 量 比 消 化 同 样 量 ADNA 的 用 量 至 少 需 要 增 加 5 倍, 由 于 限 制 性 酶 活 性 单 位 一 般 是 用 ADNA 为 底 物 确 定 的 因 此, 对 非 ADNA 底 物 进 行 消 化 时, 最 好 作 些 预 实 验, 以 寻 找 最 适 酶 用 量 的 条 件 6. 底 物 位 点 优 势 一 些 酶 对 同 一 DNA 底 物 上 的 不 同 酶 切 位 点 的 消 化 速 率 也 有 差 异, 称 为 底 物 位 点 优 势 此 效 应 于 1975 年 被 发 现, 但 其 机 制 还 未 完 全 阐 明, 可 能 与 识 别 位 点 周 围 序 列 及 自 身 形 成 的 空 间 结 构 或 化 学 修 饰 有 关 7. 星 号 活 性 酶 的 特 异 性 降 低 或 酶 的 特 异 性 发 生 改 变 不 能 识 别 其 特 异 性 识 别 位 点, 而 在 新 的 识 别 位 点 上 消 化 DNA 星 号 活 性 的 产 生 原 因 有 甘 油 浓 度 和 酶 单 位 数 /DNA 比 116

121 值 过 高, 离 于 强 度 或 ph 值 的 改 变 太 大, 有 些 有 机 溶 剂 如 乙 醇 二 甲 亚 lyx\ 等 的 存 在 二 凝 胶 电 泳 电 泳 技 术 是 核 酸 分 离 及 分 析 鉴 定 的 主 要 手 段 以 琼 脂 糖 或 聚 丙 烯 酌 肢 I~ 是 胶 为 支 持 物 的 I~ 是 胶 电 泳 具 有 分 离 范 围 广 操 作 简 便 快 速 等 优 点 根 据 需 要 分 离 的 DNA 片 段 的 大 小 选 择 合 适 的 凝 胶 浓 度, 使 迁 移 率 在 要 求 的 范 围 内 与 相 对 分 于 质 量 大 小 成 线 性 关 系, 以 便 能 较 准 确 地 测 定 核 酸 相 对 分 于 质 量 并 达 到 理 想 的 分 离 效 果 琼 脂 糖 I~ 是 胶 一 般 用 于 分 离 500 bp~25 kb 的 DNA 片 段 较 好, 聚 丙 烯 酌 肢 I~ 是 胶 往 往 用 于 分 离 500 bp 以 下 的 DNA 片 段, 500 bp~l kb 之 间 的 片 段 可 根 据 需 要 用 琼 脂 糖 凝 胶 或 低 浓 度 的 聚 丙 烯 酌 肢 或 琼 脂 糖 和 聚 丙 烯 酌 肢 混 合 凝 胶 来 分 离 具 有 DNA 片 段 最 大 分 离 度 的 聚 丙 烯 酌 肢 和 琼 脂 糖 质 量 浓 质 详 见 表 7-1, 2 0 表 7-1 具 有 DNA 片 段 最 大 分 离 度 的 聚 丙 烯 酷 肢 质 量 浓 度 聚 丙 烯 肮 胶 质 量 浓 度 (g/l) 分 离 片 段 的 大 小 (bp) 滇 西 方 蓝 指 示 剂 的 迁 移 (bp) ~ ~ ~ ~ ~ 表 7-2 具 有 DNA 片 段 最 大 分 离 度 的 琼 脂 糖 质 量 浓 度 琼 月 旨 糖 质 量 浓 度 (g/l) 线 性 DNA 片 段 的 有 效 分 离 (kb) 5 25~1 7 12~ ~0. 5 7~0. 4 3~ ( ) 琼 脂 糖 凝 胶 的 操 作 步 骤 1. 制 备 I~ 是 胶, 将 电 泳 缓 冲 液 和 琼 脂 糖 在 微 波 士 户 中 或 高 压 熔 化, 1 昆 匀, 冷 却 至 55 'C, 倒 入 己 封 好 的 凝 胶 灌 制 平 台 上, 插 上 样 品 梳 0 2. 胶 凝 固 后, 拔 出 梳 于, 除 去 封 带, 加 入 电 泳 缓 冲 液 高 出 凝 胶 表 面 约 1 mm 时 止 3. 用 适 量 的 10 x 加 样 缓 冲 液 制 备 DNA 样 品, 然 后 用 移 液 器 加 入 样 品 孔 中, 一 定 要 包 括 合 适 的 DNA 分 于 量 标 准 物 4. 接 通 电 极, 使 DNA 向 阴 极 移 动, 每 厘 米 凝 胶 在 1 V~10 V 的 电 压 下 进 行 电 泳 5. 当 加 样 缓 冲 液 中 的 澳 酣 蓝 ( 澳 酣 蓝 的 迁 移 速 度 约 与 0.5 kb 的 片 段 相 同 ) 迁 移 至 足 够 分 离 DNA 片 段 的 距 离 时 关 闭 电 源 6. 1 巴 凝 胶 置 于 澳 乙 皖 (0.5 gil) 中 染 色 10 mm~30 mr 丑, 在 水 中 脱 色 列 mt 日 ( 也 可 以 把 澳 乙 皖 直 接 加 入 溶 化 后 的 凝 胶 中, 不 必 进 行 此 步 操 作 ). 117.

122 7. IEI~ 是 胶 置 于 紫 外 透 射 仪 或 凝 胶 成 像 系 统 中, 并 在 I~ 是 胶 一 侧 放 ~1 巴 直 尺 进 行 照 相 ( 二 ) 菲 变 性 聚 丙 l 扁 酌 服 服 胶 电 泳 操 作 步 骤 1. 装 好 灌 制 I~ 是 胶 用 的 玻 璃 极 及 垫 片 2. 根 据 一 定 的 丙 烯 酌 肢 浓 度, 加 入 丙 烯 酌 肢 / 亚 甲 双 丙 烯 酌 胶 10 X TEE 水 TEMED 及 10% 的 过 硫 酸 肢 泪 匀 3. 将 I~ 是 胶 混 合 物 倒 入 玻 璃 板 夹 层, 插 入 梳 于, 让 I~ 是 胶 在 室 温 下 聚 合 不 少 于 30 min o 4. 将 玻 璃 板 固 定 在 下 槽 盛 有 1 X TEE 缓 冲 液 的 电 泳 槽 中, 用 带 弯 曲 针 头 的 注 射 器 除 去 胶 底 板 间 的 气 泡 5. 往 上 槽 中 注 入 足 以 覆 盖 样 品 孔 的 电 泳 缓 冲 液, 拔 去 梳 于, 用 注 射 器 洗 涤 加 样 孔 两 次 6. 加 10 X 加 样 缓 冲 液 至 DNA 样 品 和 分 于 量 标 准 物 中, 使 之 达 到 IX 终 浓 度 7. 每 厘 米 凝 胶 于 5V 电 压 下 电 泳 直 到 获 得 所 需 要 的 分 离 度 8. 拆 开 玻 璃 平 板 凝 胶 在 0.5 mg/l 澳 乙 皖 中 染 色 10 mm~30 mm, 置 于 紫 外 透 射 仪 或 成 像 系 统 上 观 察, 并 在 I~ 是 胶 一 侧 放 1 把 直 尺 进 行 照 相 制 备 不 同 质 量 浓 度 的 聚 丙 烯 酌 肢 凝 胶 所 用 试 剂 的 体 积 详 见 表 表 7-3 制 备 聚 丙 烯 酷 肢 凝 胶 所 用 试 剂 的 体 积 质 量 浓 度 (g/l) 试 剂 gil 丙 烯 眈 胶 (29 : 1) m! 16.6 m! 26.6 m! 40.0 m! 66.6 m! 水 67.7 m! 62.7 m! 52.7 m! 39.3 m! 12.7 m! 5X TBE 20.0 m! 20.0 m! 20.0 m! 20.0 m! 20.0 m! 10% 过 硫 酸 胶 7 m! 7 m! 7 m! 7 m! 0.7 m! 三 Southern 印 迹 法 Southern 印 迹 法 是 将 DNA 片 段 从 电 泳 凝 胶 中 转 移 至 膜 支 持 物 上 使 DNA 片 段 固 定 的 万 法 有 3 种, 即 毛 细 管 虹 吸 转 移 法 真 空 转 移 法 和 电 转 移 法 ( 一 ) 毛 细 琶 虹 眼 转 移 法 1. 高 盐 缓 冲 液 在 膜 上 进 行 Southern 印 迹 其 具 体 操 作 步 骤 如 下 (1) 电 泳 后 的 凝 胶 置 于 0.25 mol/l HCl 液 中, 浸 泡 30 min o (2) 凝 胶 用 蒸 馆 水 漂 洗 2 次 后, 浸 于 1. 5 mol/l NaCl, 0.5 mol/l NaOH 变 性 液 中 20 min~30 mi 日, 时 间 长 短 视 凝 胶 厚 度 而 定 (3) 漂 洗 2 次 后, 置 于 1. 5 mol/l NaCl, 0.5 mol/l Tris- HCl (ph 2. 0) 的 中 和 液 中 20 mi 日 ~30 mi 日 (4) 更 换 新 的 中 和 液 后, 再 浸 泡 20 min o (5) 裁 1 张 与 I~ 是 胶 同 样 大 小 的 硝 酸 纤 维 素 膜 或 尼 龙 膜, 在 茶 馆 水 中 平 衡 ( 硝 酸 纤 维 膜 需 再 在 20 X SSC 中 平 衡 10 mi 日 ) (6) 安 装 转 移 叠 层 系 统, 其 各 层 依 次 为 : 固 体 支 持 物 置 于 一 个 盛 有 足 以 浸 没 支 持 物 一 半 高 度 的 20 X SSC 的 平 皿 中, 1 张 Whatman 3 mm 滤 纸 桥 虹 吸 20 X ssc, Ie 疑 胶, 膜, 118

123 两 层 Whatman 3 mm 滤 纸 ( 每 加 一 层 均 将 用 20 X SSC 浸 湿, 并 用 一 根 吸 管 在 其 表 面 小 心 法 动 以 除 去 所 有 气 泡 ) 再 在 上 面 加 一 叠 吸 水 粗 滤 纸 (7) 将 1 块 玻 璃 平 板 放 置 于 叠 层 上 面, 其 上 加 一 重 o. 2 kg~o. 4 kg 的 重 物 以 使 各 层 固 定, 放 置 12 h~20 h o 取 出 杂 交 膜, 用 铅 笔 做 好 标 记 (8) 用 2 Xssc 1 票 洗 杂 交 膜 后, 放 于 Whatman 3 mm 滤 纸 上, 使 其 完 全 干 燥 (9) 将 尼 龙 膜 带 DNA 的 一 面 朝 下, 置 于 紫 外 线 下 进 行 照 射 ; 硝 酸 纤 维 素 膜 夹 于 2 张 Whatman 3 mm 滤 纸 之 间, 在 真 空 烤 箱 中 75 'c ~80 'c 烘 烤 2 h, E\X; 普 通 烤 箱 中 3 h ( 尼 龙 膜 也 可 用 此 法 ), 使 DNA 固 定 在 膜 上 (1 0) 将 膜 杂 交 或 干 燥 保 存 2. 碱 性 缓 冲 液 在 尼 龙 膜 上 进 行 Southern 印 迹 其 具 体 操 作 步 骤 如 下 (1) 前 两 个 步 骤 同 第 一 种 万 法, 用 水 漂 洗 2 次 后, 用.4 mol/l NaOH, 1. 5 moll L NaCl 变 性 液 浸 泡 带 电 荷 的 尼 龙 膜 缓 慢 摇 动 15 min ( 不 带 电 荷 的 膜 用.25 mol/l NaOH, 1. 5 mol/l NaCl 处 理 ), 更 换 变 性 液 后, 继 续 处 理 20 mi 日, 注 意 要 缓 慢 摇 动 (2) 用. 4 mol/l NaOH 作 为 转 移 液 进 行 转 印 除 了 带 正 电 荷 的 膜 不 必 进 行 烘 烤 或 紫 外 线 交 联 外, 其 余 步 骤 与 第 一 种 相 同 ( 二 ) 电 转 移 法 因 为 聚 丙 烯 酌 肢 凝 胶 的 孔 径 太 小, DNA 不 能 在 其 横 截 面 上 有 效 地 扩 散 ; 毛 细 管 转 移 法 不 适 宜 DNA 从 聚 丙 烯 酌 肢 凝 胶 的 转 移 ; 在 硝 酸 纤 维 素 膜 进 行 Southern 印 迹, 要 求 缓 冲 液 的 高 于 强 度 要 高 而 电 转 移 可 以 在 低 离 于 强 度 下 实 现 DNA 从 聚 丙 烯 酌 肢 凝 胶 转 到 尼 龙 膜 上 其 具 体 操 作 步 骤 如 下 1. 取 1 张 大 小 足 以 覆 盖 凝 胶 的 尼 龙 膜 在 茶 馆 水 中 浸 泡 5 min o 2. 在 凝 胶 表 面 铺 1 张 Whatman 3 mm 滤 纸, 排 去 其 间 的 所 有 气 泡 3. 将 两 块 Scotch - Brite 垫 浸 泡 于 0.5 X TBE 电 泳 缓 冲 液 中, 反 复 摇 匀 和 振 动 除 去 气 泡 裁 7 张 与 凝 胶 大 小 相 等 的 Whatman 3 mm 滤 纸, 浸 于 0.5 X TBE 电 泳 缓 冲 液 中 15 mi 日 ~30 min o 4. 将 一 块 饱 和 过 的 Scotch - Br 山 垫 置 于 凝 胶 容 器 中 灰 色 嵌 板 的 内 表 面, 将 3 张 浸 湿 的 滤 纸 置 于 其 上, 1 次 放 1 张, 排 出 其 间 的 气 泡 5. 将 贴 着 I~ 是 胶 的 滤 纸 用.5 X TBE 浸 没, 置 于 上 述 滤 纸 层 上, 将 凝 胶 的 表 面 用.5 X TBE 浸 没, 将 预 先 浸 湿 的 膜 置 于 凝 胶 之 上 6. 在 0.5 X TBE 浸 没 膜 的 表 面, 将 剩 余 的 4 张 饱 和 过 的 Whatman 3 mm 滤 纸 置 于 其 上, 随 后 再 加 上 另 一 块 饱 和 过 的 Scotch - Brite 垫, 关 上 凝 胶 容 器 7. 用.5 X TBE 半 充 满 Trans - Blot 电 转 印 室, 打 开 冷 却 装 置, 在 30 V ( 约 125 rna) 下 进 行 电 转 印, 在 厂 家 推 荐 的 条 件 下 运 行 4 h; 取 下 膜, 用 铅 笔 做 好 标 记 0 8. 从 非 变 性 I~ 是 胶 转 印 的 膜 要 进 行 变 性 DNA 面 朝 上, Ie 疑 胶 在 3 张 用.4 mol/l NaOH 浸 泡 过 的 Whatman 3 mm 滤 纸 上 放 置 10 mi 日 9. 用 2X SSC 漂 洗 膜, 晾 干, 固 定 其 DNA 将 膜 在 室 温 下 保 存. 119.

124 ( 三 ) 真 空 转 移 法 这 是 一 种 快 捷 有 效 定 量 的 转 移 万 法 在 转 膜 时 进 行 DNA 的 变 性 和 中 和, 整 个 转 移 过 程 为 30 mi 日 ~1 h, DNA 即 可 从 凝 胶 中 定 量 地 转 移 如 果 操 作 小 心, 真 空 转 移 可 以 便 经 Southern 转 移 获 得 的 杂 交 信 号 增 强 1 倍 ~2 倍 此 万 法 中 要 注 意 不 能 使 凝 胶 上 的 加 样 孔 破 裂, 如 果 破 裂, 就 应 于 转 移 前 将 其 修 去 另 外, 转 移 中 所 采 用 的 真 空 度 不 宜 过 高, 如 果 超 过 5.88 kpa (600 mmh 2 0), 凝 胶 将 被 压 缩 变 紧, 转 移 效 率 会 下 降 其 操 作 步 骤 如 下 1. 电 泳 后, 可 预 先 脱 口 票 岭 碱 变 性, 也 可 直 接 转 移 2. 在 真 空 转 移 仪 的 真 空 密 封 膜 上 剪 一 个 与 凝 胶 相 同 大 小 或 稍 小 的 窗 3. 在 窗 上 先 后 盖 1 张 湿 润 的 Whatman 3 mm 滤 纸 和 尼 龙 膜 或 硝 酸 纤 维 素 膜, 排 出 两 层 之 间 的 气 泡 4. 放 上 I~ 是 胶, 排 除 气 泡 5. 将 真 空 转 移 仪 和 凝 胶 周 围 密 封, 使 之 不 会 漏 气 6. 接 通 真 空 泵, 真 空 压 约 为 5.88 kpa (600 mmh 2 0), 用 变 性 液 覆 盖 凝 胶, 抽 气 约 15 min, 随 时 添 加 变 性 缓 冲 液 7. 换 用 中 和 液, 继 续 抽 气 约 15 min a 8. 转 移 完 毕, 用 去 离 于 水 漂 洗 9. 固 定 第 四 节 斑 点 印 迹 将 持 测 的 DNA Ejj(; RNA 液 点 在 尼 龙 膜 上 Ejj(; 硝 酸 纤 维 素 膜 上, 变 性 中 和 后, 用 放 射 性 或 非 放 射 性 标 记 的 与 核 酸 内 部 或 全 长 核 昔 酸 序 列 互 补 的 探 针 进 行 杂 交, 然 后 进 行 检 测 的 技 术, 称 为 斑 点 印 迹 包 括 把 标 本 如 血 清 直 接 点 在 膜 上 的 称 spot; 将 DNA 直 接 点 在 膜 上 称 为 dot; 将 这 两 种 标 本 通 过 狭 缝 抽 滤 到 膜 上 称 slota 斑 点 杂 交 的 点 样 物 可 以 是 DNA Ejj(; RNA, 也 可 以 是 未 经 分 离 培 养 或 提 取 的 标 本 如 血 洁 斑 点 印 迹 较 其 他 万 法 简 便 快 速 特 异 操 作 时, 若 用 己 生 日 含 量 的 核 酸 绘 制 杂 交 斑 点 的 光 吸 收 校 正 曲 线, 还 可 以 对 检 测 的 核 酸 含 量 进 行 定 量 分 析 另 外, 临 床 标 本 Ejj(; 现 场 标 本 直 接 点 膜 后, 可 由 基 层 实 验 室 或 边 远 地 区 邮 递 到 中 心 实 验 室 进 行 检 测, 也 可 保 存 留 作 以 后 使 用 同 样, 基 层 或 边 远 地 区 医 学 单 位 也 可 建 立 斑 点 杂 交 技 术 或 利 用 诊 断 盒 对 某 一 特 殊 疾 病 就 地 进 行 检 测, 还 可 以 进 行 大 量 标 本 的 筛 选 随 着 分 子 生 物 学 的 发 展, 斑 点 杂 交 很 快 应 用 于 传 染 性 疾 病 癌 症 和 遗 传 性 疾 病 的 基 因 分 析 和 诊 断 特 别 是 用 于 具 有 遗 传 异 质 性 的 遗 传 病 的 产 前 诊 断, 这 样 可 以 减 少 痴 呆 和 低 能 儿 的 出 生 这 不 但 减 轻 了 国 家 和 家 庭 的 巨 大 经 济 负 担 和 沉 重 的 精 神 压 力, 而 且 对 计 划 生 育 国 策 和 优 生 优 育 政 策 的 贯 彻 落 实, 对 提 高 我 国 全 民 族 人 口 素 质 将 有 重 要 意 义 随 着 各 种 移 植 病 例 的 不 断 成 功, 斑 点 杂 交 在 自 细 胞 表 面 抗 原 基 因 的 多 态 性 进 行 组 织 型 和 配 型 万 面 己 得 到 充 分 应 用 ( ) 斑 点 印 边 的 主 要 用 途 1. 检 测 杂 交 探 针 的 灵 敏 度 120.

125 2. 检 测 标 本 中 目 的 基 因 的 有 无 和 数 量 3. 检 测 细 胞 RNA, 研 究 基 因 的 表 达 4. 用 生 物 素 ( 地 高 辛 ) 标 记 寡 核 昔 酸, 分 析 基 因 的 放 大 产 物 ( 二 ) 斑 点 印 边 的 操 作 万 法 在 斑 点 印 迹 的 点 膜 过 程 中, 待 测 DNA Ejj(; RNA 的 变 性, 可 以 在 点 膜 前 Ejj(; 点 膜 后 用 碱 变 性 (0.4 mol/l, NaOH, 室 温 5 mi 日 ), 也 可 以 点 膜 前 用 热 变 性 点 膜 可 以 手 工 点 膜, 每 点 1μ1~3μ1, 也 可 以 用 点 样 器 点 膜 1. 操 作 万 法 一 (1) 裁 取 1 条 所 需 大 小 的 尼 龙 膜 或 硝 酸 纤 维 素 膜, 标 记 万 向 (2) 以 无 菌 水 浸 泡 15 mi 日 两 次, 再 以 6X SSC 浸 泡, 同 时 浸 泡 数 张 滤 纸 (3) 将 滤 纸 和 膜 放 于 点 样 器 上, 膜 在 滤 纸 上 面, 以 塑 料 膜 封 闭 多 余 的 点 样 孔 (4) 将 DNA Ejj(; RNA 样 品 液 ( 此 前 可 以 用 碱 变 性 或 热 变 性 处 理 ) 点 到 膜 上, 注 意 不 要 产 生 气 泡 阻 塞 点 样 孔 (5) 负 压 抽 干 (6) 每 孔 用 100μ1 TE 缓 冲 液 洗 涤 负 压 抽 干 (7) 室 温 晾 干 后, 滤 膜 于 离 紫 外 灯 10 em 处 照 射 3 min 或 80 'c 烤 2h 可 立 即 使 用 或 封 存 备 用 2. 操 作 万 法 二 ( 以 检 测 血 清 中 HBV DNA 为 例 ) (1) 取 持 检 血 清 40μ1, 加 0.2 mol Tris - HCl 缓 冲 液 40μ1, 加 马 抗 HBV 血 清 40μ1, 于 37 'c 保 温 60 min o (2) 抽 滤 到 硝 酸 纤 维 素 膜 上 (3) 将 点 样 后 的 膜 置 于 0.5 mol/l NaOH 溶 液 中 渗 透 变 性 10 mi 日, 抽 干 水 分 后 放 同 一 浓 度 的 NaOH 溶 液 内 泡 10 r 丑 1 日 (4) 取 出 硝 酸 纤 维 素 膜 分 别 用 3 mol/l NaOH mol/l Tris (ph 7.5) 浸 泡 15 mt 日, 1 mol/l Tris mol/l NaOH, 0.5 mol/l Tris mol/l NaOH 溶 液 浸 泡 20 mi 日, 0.2 mol/l Tris mol/l EDTA 2 X SSC 浸 泡 5 min o (5) 于 80 'c 干 燥 5 mi 日, 用 氯 仿 浸 泡 20 r 丑 1 日 (6) 于 80 'c 干 燥 2 h 即 可 使 用 或 封 存 备 用 第 五 节 Northern 印 迹 RNA Ejj(; mrna, 经 变 性 电 泳 分 离, 再 转 移 到 硝 酸 纤 维 膜 或 尼 龙 膜 上, 与 探 针 杂 交 的 技 术, 称 为 Northern 印 迹 杂 交 该 技 术 主 要 用 于 检 测 各 种 基 因 转 录 产 物 的 大 小 转 录 量, 以 及 转 录 产 物 的 特 性 Northern 印 迹 杂 交 的 主 要 步 骤 与 Southern 印 迹 杂 交 相 似, 但 由 于 RNA 的 特 殊 性, 二 者 也 有 不 同 之 处 需 要 注 意 例 如 电 泳 之 前 上 标 RNA 的 变 性 不 能 用 NaOH, 因 为 NaOH 能 水 解 RNA2' 位 起 基 基 团, 且 可 以 打 断 RNA 链, 而 必 须 用 起 甲 基 隶 戊 甲 自 主 变 性 RNA 虽 一 般 为 单 链, 1 且 变 性 能 促 进 转 移 过 程 中 RNA 与 硝 酸 纤 维 膜 的 结 合 RNA 在 高 盐 溶 液 中 转 移 完 成 后, 不 要 用 低 盐 缓 冲 液 冲 洗 硝 121

126 1 h o 3. 在 冰 上 冷 却 样 品, 每 份 样 品 加 入 12 fl. l 戊 二 百 至 加 样 缓 冲 液 在 1 对 加 样 孔 中 分 酸 纤 维 素 膜, 必 须 直 接 烤 干 固 定 因 为 RNA 在 固 定 之 前 易 被 低 盐 溶 液 从 硝 酸 纤 维 素 膜 上 洗 掉 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 之 后, 应 将 含 RNA 相 对 分 于 质 量 长 度 标 准 物 的 凝 胶 先 行 切 下, 单 独 进 行 EB 染 色, 照 相 样 品 RNA 不 宜 用 EB 染 色, EB 会 干 扰 RNA 与 硝 酸 纤 维 素 膜 的 结 合 此 外, RNase 能 阵 解 RNA, 并 且 RNase 酶 活 力 异 常 顽 强, 采 用 一 般 的 使 酶 夫 活 的 万 法 不 能 破 坏 它 的 活 力, 加 之 RNase 的 存 在 相 当 广 泛, 因 此 在 RNA 样 品 的 制 备 电 泳 转 移 等 操 作 中, 必 须 十 分 小 心, 防 止 RNA 被 阵 解 RNA 在 行 琼 脂 糖 I~ 是 胶 电 泳 之 前 应 变 性, 使 用 起 甲 基 京 变 性 虽 然 可 以 保 证 能 分 离 到 功 能 完 整 的 mrna, 但 由 于 起 甲 基 隶 的 强 毒 ' 生, 近 年 来 甲 醒 和 戊 是 人 们 更 喜 欢 采 用 的 变 性 剂 一 RNA 的 电 泳 分 离 ( ) 申 眶 琼 脂 * 唐 凝 胶 电 泳 分 离 RNA 1. 用 72 ml 水 溶 解 1 g 琼 脂 糖, 在 水 浴 中 冷 却 至 60 'c 时, 加 入 10 X MOPS 即 3-(N 吗 琳 代 ) 丙 磺 酸 电 泳 缓 冲 液 和 18 ml (12.3 mol/ L) 甲 醒 2. 铺 制 I~ 是 胶 并 使 之 凝 固, 将 凝 胶 放 入 电 泳 池 加 入 足 够 的 1 X MOPS 电 泳 缓 冲 液 使 之 能 高 出 凝 胶 1 mm o 3. 将 每 份 RNA 样 品 的 体 积 用 水 调 整 至 11μ1, 然 后 加 入 5μ1 10 X MOPS, 9μl 12.3 mol/ L 甲 醒, 25μl 甲 酌 肢 振 荡 泪 匀, 短 暂 离 心 后 于 55 'c 保 温 15 min o 4. 加 入 10μl 缓 冲 液, 振 荡 离 心 每 份 样 品 在 一 对 加 样 孔 中 分 别 加 入 o. 5 fl.g ~10μg RNA 样 品, 以 便 可 取 半 片 I~ 是 胶 进 行 染 色 显 迹, 每 厘 米 凝 胶 在 5V 电 压 下 电 泳 至 澳 酣 蓝 泳 动 了 I~ 是 胶 长 度 的 一 半 或 三 分 之 二 5. 用 澳 乙 皖 染 色, 取 出 凝 胶, 切 下 需 要 染 色 的 泳 通, 放 置 于 无 RNA 酶 的 玻 璃 平 皿 加 入 足 够 量 的 0.5 mo l/ L 乙 酸 按 覆 盖, 浸 泡 20 min o 换 液 再 泡 20 mi 日 以 除 去 甲 醒 倾 去 液 体, 加 入 含 0.5 mg/l 澳 乙 链 和 0.5 mo l/ L 乙 酸 按, 染 色 40 mi 日 必 要 时 以 0.5 mol/ L 乙 酸 按 脱 色 2 h o 6. 在 紫 外 线 透 射 仪 Ell(; I~ 是 胶 成 像 系 统 中 使 I~ 是 胶 中 的 RNA 显 迹, 沿 I~ 是 胶 放 ~1 巴 尺 于 拍 照, 以 便 随 后 能 确 定 膜 中 的 条 带 ( 二 )06 二 眶 / 二 日 基 E 嗣 I 剧 旨 * 唐 电 泳 分 离 RNA 1. 制 备 适 当 浓 度 的 琼 脂 糖 凝 胶, 并 置 于 电 泳 槽 中 加 入 10 mmol/l (ph 7.0) 磷 酸 盐 缓 冲 液, 使 之 高 出 I~ 是 胶 1 mm 为 止 2. 用 水 将 每 份 RNA 样 品 的 体 积 调 至 11μ1, 然 后 加 入 4. 5μ1 100 mmo l/ L 磷 酸 盐 缓 冲 液, 22.5μ1 DMSO, 6.6μ16 mo l/ L 戊 二 醒 振 荡 泪 匀, 短 暂 离 心, 于 50 'c 温 育 别 加 入 样 品 (0. 5 fl. g~10 μg RNA), 以 便 可 取 半 片 凝 胶 进 行 染 色 显 迹 电 泳 进 行 时 应 帽 环 两 电 极 间 的 缓 冲 液, 以 防 止 形 成 H+ 梯 度 其 余 步 骤 同 甲 醒 琼 脂 糖 电 泳 分 离 RNA o 二 Northern 印 迹 法 Northern 印 迹 法 与 Southern 印 迹 法 基 本 一 致, 但 仍 有 下 列 不 同 之 处 122.

127 1. 用 甲 醒 的 凝 胶 必 须 用 经 DEPC 处 理 的 水 漂 洗 几 次 以 除 去 甲 醒 如 果 琼 脂 糖 浓 度 大 于 1 % Ejj(; I 疑 胶 厚 度 大 于 0.5 em Ejj(; 待 分 析 的 RNA 大 于 2.5 kb, 需 用.05 mol/l NaOH 浸 泡 凝 胶 20 mi 日, 以 部 分 水 解 RNA 并 提 高 转 移 效 率 浸 泡 后 用 无 RNA 酶 的 水 漂 洗 凝 胶, 并 用 20 x SSC 浸 泡 凝 胶 45 mi 日, 然 后 在 凝 胶 上 放 置 硝 酸 纤 维 素 膜 或 尼 龙 膜 进 行 印 迹 2. 由 于 带 正 电 的 尼 龙 膜 在 碱 性 溶 液 中 具 有 固 定 核 酸 的 能 力, 故 需 用 7.5 mmol/l NaOH 溶 液 洗 脱 琼 脂 糖 中 的 乙 醒 目 先 RNA 此 步 骤 可 以 部 分 水 解 RNA 并 增 加 长 RNA 分 于 的 转 移 速 度 和 效 率 此 外, 碱 还 可 以 除 去 RNA 分 于 的 乙 加 合 物, 免 去 固 定 后 洗 脱 的 步 骤 RNA 在 碱 性 转 移 缓 冲 液 中 固 着 至 带 电 荷 的 尼 龙 膜 为 一 不 可 逆 过 程, 因 此 不 需 要 干 烤 滤 膜 或 在 杂 交 前 将 滤 膜 置 于 紫 外 线 下 照 射 3. 滤 膜 上 含 有 乙 醒 目 先 RNA 时, 杂 交 前 需 要 用 20 mmol/l Tris - HCl (ph 8.0) 于 65 'c 洗 膜, 除 去 RNA 上 的 乙 二 醒 分 于 4. 乙 醒 目 先 RNA 在 碱 性 条 件 下 转 移 至 带 电 荷 尼 龙 膜 上 时, 转 移 缓 冲 液 为 7. 5 mmol/l NaOH 溶 液 转 移 结 束 后 (4.5h~6h) 尼 龙 膜 需 要 用 2X SSC 和 0.1 %SDS j 票 洗 片 刻, 于 室 温 晾 干 5. 用 中 性 缓 冲 液 进 行 RNA 转 移 后, 必 须 处 理 尼 龙 膜 以 固 定 核 酸 分 于 将 晾 干 的 尼 龙 膜 放 在 两 张 Whatman 3 mm 滤 纸 中 间, 于 80 'c 烘 烤 O. 5 h~2 h Ejj(; 用 254 日 m 波 长 的 紫 外 线 照 射 尼 龙 膜 带 RNA 的 一 面 第 六 节 杂 交 和 漂 洗 斑 点 杂 交 Southern 杂 交 Northern 杂 交 的 杂 交 万 法 基 本 一 致 先 用 不 含 探 针 的 杂 交 液 做 预 杂 交, 用 载 体 DNA 和 合 成 聚 合 物 将 膜 上 非 特 异 DNA 结 合 位 点 封 闭, 再 换 成 带 有 标 记 探 针 的 杂 交 液 进 行 杂 交, 使 探 针 与 被 检 核 酸 结 合 膜 上 的 核 昔 酸, 在 一 定 的 条 件 下, 可 与 液 体 中 互 补 的 探 针 杂 交 越 是 同 源 性 高 的, 形 成 的 杂 交 分 于 越 稳 定, 而 同 源 性 较 差 的 杂 交 分 于 或 非 特 异 性 吸 附 在 一 定 的 洗 脱 条 件 下, 探 针 将 被 除 去 对 于 寡 核 昔 酸 探 针, 由 于 严 格 控 制 洗 脱 条 件, 仅 一 个 碱 基 错 配 都 不 稳 定 不 同 的 膜 类 型 和 不 同 类 型 的 探 针, 要 求 不 同 的 杂 交 液 组 成 杂 交 温 度 和 洗 脱 条 件 下 面 介 绍 几 种 较 为 常 用 的 万 法 杂 交 液 可 反 复 使 用 放 射 性 核 素 标 记 的 探 针 受 其 半 衰 期 的 限 制, 一 个 半 衰 期 之 后, 由 于 信 号 减 弱, 需 要 延 长 曝 光 时 间 PCR 扩 增 产 物 的 杂 交, 由 于 目 标 片 段 拷 贝 数 很 高, 探 针 可 用 到 3 个 半 衰 期 之 后 而 非 放 射 性 核 素 标 记 的 探 针 则 不 受 时 间 的 限 制, 只 要 保 管 得 当, 可 长 时 间 内 反 复 使 用 影 响 杂 交 的 因 素 很 多, 最 主 要 的 是 杂 交 温 度 和 漂 洗 的 严 格 与 否 一 般 而 言, 杂 交 温 度 提 高 时, 非 同 源 片 段 不 易 杂 交, 背 景 也 低 ; 如 果 所 有 探 针 与 检 测 片 段 不 完 全 同 源, 杂 交 温 度 降 低, 背 景 可 能 会 升 高 漂 洗 时, ) 票 洗 液 离 于 强 度 越 低, j 票 洗 能 力 越 大. 123.

128 放 射 性 标 记 探 针 杂 交 ( ) 词 刑 1. 杂 交 缓 冲 液 : 50% 去 离 于 甲 酌 肢, 5 x sse, 1 x Denhardt's 液, 31 mmol/l KH 2 P 仙, 0.25 %SDS, 30 m l/ L 切 断 变 性 的 挂 鱼 精 DNA, 5% 硫 酸 葡 聚 糖 2. 载 体 DNA: 100 ml O. 4 mol/l NaOH 中 加 入 1 g 蛙 鱼 精 DNA 室 温 搅 拌 过 夜, 煮 沸 剪 切 45 min o 置 冰 浴 中 冷 却 后, 用 冰 乙 酸 中 和, 离 心 去 沉 渣 在 上 清 液 中 加 入 2 倍 体 积 乙 醇, 冷 却, 离 心 用 70% 乙 醇 和 无 水 乙 醇 沉 淀 后, 溶 于 50 ml TE 中, 稀 释 至 10 gil, - 20 'e 保 存 x sse o 4. 10%SDS ( 二 ) 操 作 步 骤 1. 将 带 有 被 检 测 的 干 燥 膜 放 入 热 封 口 袋 中, 用 少 量 2x sse 浸 湿, 1iu 出 多 余 液 体 2. 分 别 分 装 足 够 杂 交 缓 冲 液 供 预 杂 交 和 杂 交 用 加 热 缓 冲 液 至 42 'e 以 溶 解 SDS 在 一 小 离 心 管 中 加 足 够 载 体 DNA, 以 保 证 载 体 DNA 的 质 量 浓 度 在 预 杂 交 中 达 到 100 mg/l 煮 沸 5 mi 日, 并 在 冰 水 中 骤 冷 10 mi 日 3. 将 变 性 载 体 DNA 加 到 预 杂 交 的 杂 交 液 中, 混 合 后 倒 入 杂 交 袋 中 (l 张 11 em X 14 em 膜 约 需 15 ml ), 排 气 封 口, 振 荡, 于 42 'e 温 育 2 h o 4. 变 性 放 射 性 标 记 DNA 探 针 : 煮 沸 5 min 水 中 冷 却 10 mi 日 每 毫 升 杂 交 液 中 至 少 要 用 1 X 10 6 epm 的 32p 标 记 探 针, 探 针 比 活 性 至 少 为 1 X 10 8 epmlvgo 5. 将 变 性 探 针 加 到 另 一 份 杂 交 缓 冲 液 中 并 泪 匀, 将 袋 切 掉 一 角 并 吸 出 预 杂 交 缓 冲 液 将 探 针 的 杂 交 缓 冲 液 加 到 袋 中, 排 除 气 泡 并 封 口, 振 荡, 于 42 'e 温 育 过 夜 6. 剪 掉 袋 的 一 角, 1iU 出 杂 交 液, 加 入 少 量 2 x sse I 0.1 % SDS 液, 短 暂 漂 洗 一 下, 倒 出 7. 剪 开 袋, 取 出 杂 交 膜, 放 进 有 200 ml 2 x sse I 0.1 % SDS 液 的 盘 中, 室 温 下, 振 荡 洗 膜 15 min o 8. 漂 洗 (1) 高 强 度 洗 膜 : 1) 室 温 下, 用 2 x sse I O. 1 % SDS 液 洗 两 次, 每 次 15 mi 日 0 2) 室 温 下, 用.1 x sse I O. 1 % SDS 液 洗 两 次, 每 次 15 mi 日 3) 在 55 'e, 用. 1 x sse I O. 1 % SDS 液 洗 两 次, 每 次 30 mi 日 (2) 低 强 度 洗 膜 : 1) 室 温 下, 用 6 x sse I O. 1 % SDS 液 洗 两 次, 每 次 15 mi 日 0 2) 室 温 下, 用 2 x sse I O. 1 % SDS 液 洗 两 次, 每 次 15 mi 日 0 3) 在 50'e, 用 1 x sse I O. 1 % SDS 液 洗 两 次, 每 次 15 mi 日. 124.

129 非 放 射 性 标 记 探 针 杂 交 ( ) 词 刑 x FPC: 10 gil 葡 聚 糖 400 ml, 1 % 聚 乙 烯 口 比 咯 炕 酣 360 ml, 1 % 甘 氨 酸 240 ml 过 滤 灭 菌, -20'C 保 存 2. 1 mol/l KH 2 P04 (ph 7.0)0 3. 去 离 于 甲 酌 肢 4. 2 x ssc I O. 1 % SDS 5. O. 1 x ssc I O. 1 %SDS o 6. 50% 硫 酸 葡 聚 糖 7. 杂 交 缓 冲 液 : 去 离 于 甲 酌 肢 2. 5 ml (50 % ), 20 x SSC ml (5 x ), 50 x FPC 100μI (1 x ), 1 mol/l KH 2 P04 125μI (25 mmol/l), 10 %SDS 100μI (0.2%), 载 体 DNA (1 0 gil) 12.5 vi (25 mg/l), 50% 硫 酸 葡 聚 糖 500μI (5%), 水 313 vi 总 体 积 为 4.9 ml o ( 二 ) 操 作 步 骤 1. 在 不 带 探 针 的 杂 交 液 中 于 42 'c 预 杂 交 2 h o 2. 将 20 vi 探 针 (50 mg/l) 和 320μl 无 菌 水 混 合 煮 沸 5mi 口 后 立 即 置 于 冰 浴 中 10 日 H 口 3. 加 入 预 杂 交 液 中, 使 探 针 终 浓 度 为 200 Vg/L 并 于 42 'c 振 荡 杂 交 18 h o 4. 室 温 下, 在 20 ml 2 x ssc I o. 1 % SDS 中 振 荡 洗 膜 2 次, 每 次 5 mi 日 0 5. 将 膜 放 入 密 封 袋 中, 在 O. 1 x ssc I O. 1 % SDS 中 于 55 'C~65'C ( 依 需 要 而 定 ) 洗 3 次, 每 次 15 mi 日 6. 室 温 下, 在 20 ml 2 x SSC 的 盘 中 洗 膜 5 r 丑 1 日 三 寡 核 昔 酸 探 针 杂 交 寡 核 昔 酸 探 针 杂 交 的 具 体 操 作 步 骤 如 下 1. 将 点 样 后 的 膜 用 2X SSC 和 0.1 %SDS 浸 湿 2. 在 杂 交 袋 中, 加 5 ml 杂 交 液 (6 x SSPE, 5 x Denhardt's, O. 5 % SDS) 42 'c, 预 杂 交 15 min o 3. 加 入 标 记 好 的 ASO 探 针 ( 如 用 己 配 好 的 杂 交 液, 则 将 膜 从 预 杂 交 袋 中 取 出, 放 入 杂 交 袋 中 ) 杂 交 1 h o 4. 洗 膜 : 在 2 x SSPE EjJ(; O. 1 % SDS 中, 室 温 下 洗 膜 各 两 次, 每 次 5 min o 5. 室 温 下, 用 TMAC 液 [50 mmol/l Tris - HCI (ph 8.0), 3 mol/l (CH 3 )4NCI, 2 mmol/l EDTA, 0.1 %SDS] 洗 膜 10 mi 日 6. 在 56 'c 条 件 下 用 TMAC 洗 膜 两 次, 每 次 15 mi 日 0 7. 在 室 温 条 件 下 用 2 x SSPE 洗 膜 两 次, 每 次 10 min o 此 万 法 中 L 二 (C+C)X4+(A+T)X2 一 般 情 况 下, 杂 交 温 度 比 Tm 1 民 10 'c 左 右, 而 洗 膜 温 度 应 比 Tm 1 民 5 'c 左 右 加 入 TMAC 洗 膜 时, Tm 温 度 只 与 寡 核 昔 酸 长 125

130 度 有 关 等 长 的 寡 核 昔 酸 可 以 在 同 一 温 度 下 洗 膜 因 此, 可 以 消 除 由 于 洗 膜 所 造 成 的 假 阳 ( 阴 ) 性 结 果 以 尼 龙 膜 点 膜 时, 洗 膜 条 件 要 比 硝 酸 纤 维 素 膜 强 些 杂 交 液 中 可 提 高 SDS 的 浓 度 至 1%, 不 必 加 Denhardt 液, 后 者 会 降 低 探 针 的 结 合 可 加 入 0.5% 脱 脂 奶 粉, 以 降 低 背 景 着 色 第 七 节 放 射 自 显 影 和 显 色 反 应 一 放 射 自 显 影 放 射 自 显 影 操 作 步 骤 如 下 1. 将 杂 交 后 的 膜 片 装 入 塑 料 袋 中 2. 在 H 音 室 中 安 全 灯 下 按 下 列 顺 序 包 片 : 增 感 屏 X 线 片 膜 X 线 片 增 感 屏 0 3. 将 暗 盒 置 70 'c 曝 光 数 小 时 (ASO 杂 交 ) 至 数 日 ( 基 因 组 DNA 杂 交 ) 4. 冲 洗 X 线 片, 室 温 中 晾 干 5. i 卖 片, 检 测 结 果 放 两 张 X 线 片 的 目 的 是 为 了 避 免 曝 光 过 度 或 曝 光 不 足, 尤 其 是 曝 光 不 足 如 果 第 一 张 X 线 片 曝 光 不 足 可 以 让 第 二 张 曝 光 更 长 时 间 如 果 第 一 张 曝 光 或 显 影 过 度, 可 当 时 取 出 第 二 张 片, 用 较 短 的 时 间 显 影 以 获 得 满 意 的 效 果 二 非 放 射 性 核 酸 标 记 物 的 显 示 由 于 非 放 射 性 探 针 的 标 记 不 同, 其 显 示 体 系 和 万 法 也 不 同 其 基 本 原 理 与 酶 联 免 疫 反 应 的 显 示 基 本 一 致 非 放 射 性 核 酸 标 记 物 主 要 有 下 列 显 示 体 系 ( 一 ) 生 物 秦 抗 生 物 秦 蛋 白 HRP 显 示 体 系 以 生 物 素 标 记 的 DNA Ejj(; 寡 核 昔 酸, 杂 交 前 Ejj(; 杂 交 时 都 可 以 经 过 抗 生 物 素 蛋 白 HRP 复 合 物 与 生 物 素 结 合, 从 而 将 HRP 连 接 在 此 类 探 针 上, 而 后 对 探 针 结 合 的 HRP 进 行 显 影 或 发 光 检 测 现 以 四 甲 基 联 苯 肢 (TMB) 显 色 法 为 例 1. 试 剂 岛 19Cbo 岛 19Cbo (1) 溶 液 I: o. 1 mol/l Tris - HCI (ph 7.5), 1 mol/l NaCI, 2 mmol/l, (2) 溶 液 II: O. 1 mol/l Tris - HCI (ph 9.5), 1 mol/l NaCI, 10 mmol/l (3) 聚 山 梨 醋 20 0 (4) 聚 乙 二 醇 辛 基 苯 基 醋 (5) A - HRPo (6) BSA (7) 拧 棱 酸 铀 溶 液 : 10 mmol/l (ph 5.0) (8) 显 色 液 I : 2 gil TMB, 无 水 乙 醇 0.5 ml 加 入 10 mmol/ L 拧 棱 酸 铀 至 10 ml o (9) 显 色 液 II: 0.14%H 操 作 步 骤 126

131 (1) 在 装 有 生 物 素 探 针 膜 的 塑 料 袋 中 加 入 溶 液 I, 0.5% 聚 山 梨 醋 20, 0.05% 聚 乙 二 醇 辛 基 苯 基 膛, 3%BSA 液 室 温 下 放 置 1 h o (2) 吸 出 袋 中 的 溶 液, 加 入 A-HRP 液, 室 温 下 放 置 1 h, 不 时 轻 摇 (3) 吸 出 A-HRP 液 (4) 加 溶 液 I, 0.05% 聚 乙 二 醇 辛 基 苯 基 膛, 0.05% 聚 山 梨 醋 20 于 膜 上, 至 少 2 ml/em 2 0 室 温 下 洗 5 次, 每 次 5 mi 日 (5) 再 以 溶 液 H 洗 两 次, 每 次 10 mi 日 (6) 将 膜 浸 于 拧 棱 酸 铀 溶 液 中, 至 少 2 m l/ em 2, 室 温 下 10 mi 日 2 次 (7) 将 膜 装 入 试 管 中, 按 O. 125 ml/em 2 加 入 显 色 液 1, 将 膜 浸 透 轻 摇 (8) 加 入 显 色 液 I 体 积 1 / 100 的 显 色 液 II, 立 即 泪 匀, 封 口 (9) 放 于 避 光 纸 袋 中, 室 温 下 放 置 30 min~2 h, 观 察 显 色 结 果 (1 0) 用 拧 橡 酸 铀 溶 液 洗 膜 4 次, 每 次 30 mi 日, 晾 干 保 存 ( 二 ) 生 物 秦 链 抗 生 物 秦 蛋 白 碱 性 磷 酸 酶 显 色 体 系 DNA 探 针 上 接 入 的 生 物 素 与 链 抗 生 物 蛋 白 (SA) 结 合, 后 者 再 与 生 物 素 化 的 碱 性 磷 酸 酶 (BAP) 结 合 AP 催 化 底 物 BCIP (5 澳 4 氨 3 日 朵 酣 磷 酸 4 甲 苯 肢 盐 ) 结 合 可 生 成 蓝 紫 色 沉 淀 1. 试 剂 (1) 溶 液 I: 1 mal/l NaCI, 0.1 mal/l Tris - HCI (ph 7.5) (2) 溶 液 II: 由 溶 液 I 配 制 的 3%BSA 溶 液 (3) 10 X NBT 浓 缩 液 (600 ml): 60 ml 二 甲 基 甲 酌 肢 和 24 ml 水 混 合 后, 加 2 g NBT, 再 加 水 516 ml o (4) 10XBCIP 浓 缩 液 (500 ml): 1 g BCIP 溶 于 100 ml 二 甲 基 甲 酌 肢 中, 缓 慢 加 水 400 ml o (5) 10 X 碱 性 磷 酸 酶 底 物 缓 冲 液 (500 ml): Tris 60.5 g, NaCI g, MgCb 5. 1 g, 力 口 水 至 400 ml 调 ph 值 至 9.0, 再 加 水 至 500 ml 于 4 'c 保 存 (6) 碱 性 磷 酸 酶 底 物 溶 液 : 按 <jj (1 X 碱 性 磷 酸 酶 底 物 缓 冲 液 : 10 X NBT 浓 缩 液 10 X BCIP 浓 缩 液 ) 二 8 : 1 : 1 混 合, 避 光 保 存 (7) 链 抗 生 物 素 蛋 白 2. 操 作 步 骤 (1) 将 杂 交 膜 放 入 培 养 皿 中, 加 20 ml ~30 ml 溶 液 I 浸 泡 5 mi 日 ~1O min o (2) 把 膜 条 取 出, 以 吸 水 纸 吸 去 多 余 液 体, 小 心 放 入 试 管 中, 力 日 溶 液 II, 于 42'C, 30 mi 日 (3) 用 溶 液 I 20 ml~30 ml 洗 膜 3 次, 每 次 3 r 丑 1 日 (4) 把 膜 条 放 入 SA 液 (0.07 ml/em 勺, 37'C 下 放 置 20 min o (5) 重 复 第 3 步 (6) 将 膜 置 于 稀 释 的 生 物 素 化 的 AP 液 中 (0.07 ml/em 勺, 37'C 下 放 置 20 min o (7) 重 复 第 3 步, 然 后 用 IX 碱 性 磷 酸 酶 底 物 缓 冲 液 洗 膜 两 次, 每 次 3 min o (8) 将 膜 放 入 新 的 干 净 试 管 中, 加 入 碱 性 磷 酸 酶 底 物 溶 液 避 光 显 色. 127.

132 (9) O. 5 h~4 h 后, 观 察 结 果 ( 三 ) 地 高 辛 抗 体 碱 性 磷 酸 酶 显 色 体 系 1. 试 剂 岛 19Cba (1) 溶 液 I: 100 mmol/l Tris - HCI (ph 7.5), 150 mmol/l NaCl a (2) 溶 液 II: 0.5% 脱 脂 奶 粉 加 入 缓 冲 液 I (3) 溶 液 田 : 100 mmol/l Tris - HCI (ph 9.5), 100 mmol/l NaCI, 50 mmol/l (4) 溶 液 N: 10 mmol/l Tris - HCI (ph 8. 的, 1 mmol/l EDTA (ph 8.0) (5) 抗 地 高 辛 抗 体 AP 复 合 物 (6) 10XNBT 浓 缩 液 (600 ml): 60 ml 二 甲 基 甲 酌 肢 和 24 ml 水 混 合 后, 加 2 g NBT, 再 加 水 516 ml a 水 400 (7) 10XBCIP 浓 缩 液 (500 ml): 1 g BCIP 溶 于 100 ml 二 甲 基 甲 酌 肢 中, 缓 慢 加 ml a (8) lox 碱 性 磷 酸 酶 底 物 缓 冲 液 (500 ml): Tris 60.5 g, NaCI g, MgCb 5. 1 g, 力 口 水 至 400 ml 调 ph 值 至 9.0, 再 加 水 至 500 ml 于 4 'c 保 存 (9) 碱 性 磷 酸 酶 底 物 溶 液 : 按 <jj (1 X 碱 性 磷 酸 酶 底 物 缓 冲 液 : 10 X NBT 浓 缩 液 10 XBCIP 浓 缩 液 ) 二 8 : 1 : 1 混 合, 避 光 保 存 2. 操 作 步 骤 动 (1) 用 溶 液 I 室 温 下 洗 膜 1 min a (2) 用 溶 液 H 室 温 下 洗 膜 30 min a (3) 重 复 第 一 步 (4) 用 溶 液 I 稀 释 抗 体 Dig- AP 至 150 U/ La (5) 取 20 ml 稀 释 抗 体 液 于 室 温 浸 泡 膜 30 min a (6) 用 溶 液 I 100 ml 洗 膜 15 mi 日 两 次 (7) 用 溶 液 II 20 ml 平 衡 膜 2 r 丑 1 日 (8) 用 10 ml 碱 性 磷 酸 酶 底 物 溶 液 封 膜 避 光 数 分 钟 至 1 天, 当 出 现 颜 色 时 不 要 晃 (9) 当 出 现 斑 点 时, 用 50 ml 溶 液 N 洗 膜 5 r 丑 1 日, 终 止 反 应 (1 0) 观 察 记 录 结 果 ( 四 ) 半 抗 原 标 记 探 针 的 检 测 半 抗 原 标 记 探 针 一 般 通 过 与 抗 半 抗 原 的 第 一 抗 体 温 育, 再 用 酶 联 种 属 特 异 的 第 二 抗 体 来 检 测 每 种 抗 体 温 育 的 时 间 是 30 min ~ 60 min a 抗 半 抗 原 抗 体 有 商 品 供 应, 其 检 测 过 程 中 抗 体 的 最 适 浓 度 必 须 由 经 验 来 确 定 最 适 的 条 件 是 产 生 最 强 信 号 的 最 低 浓 度 1. 试 剂 (1) 20 X 冲 洗 缓 冲 液 : 1 mol/l Tris 10 ml, 4 mol/l NaCI 30 m!, 6% 聚 山 梨 醋 r 址, 0.2% 乙 京 硫 代 水 杨 酸 纳 2 g, 用 浓 HCI 调 ph 值 至 7. 斗, 稀 释 到 1 La 于 4 'c 保 存 (2) 1 X 冲 洗 缓 冲 液 : 25 ml 20 X 冲 洗 缓 冲 液 加 475 ml 去 离 于 水 (3) 封 闭 缓 冲 液 : 脱 脂 奶 粉 2g 加 IX 冲 洗 缓 冲 液 至 20 ml a 128

133 (4) 第 一 抗 体 溶 液 (5) 酶 标 第 二 抗 体 溶 液 (6) 10XNBT 浓 缩 液 (600 ml): 60 ml 二 甲 基 甲 酌 肢 和 24 ml 水 混 合 后, 加 2 g NBT, 再 加 水 516 ml o (7) 10XBCIP 浓 缩 液 (500 ml): 1 g BCIP 溶 于 100 ml 二 甲 基 甲 酌 肢 中, 缓 慢 加 水 400 ml o (8) lox 碱 性 磷 酸 酶 底 物 缓 冲 液 (500 ml): Tris 60.5 g, NaCI g, MgCb 5. 1 g, 力 口 水 至 400 ml 调 ph 值 至 9.0, 再 加 水 至 500 ml 于 4 'c 保 存 (9) 碱 性 磷 酸 酶 底 物 溶 液 : 按 <jj (l X 碱 性 磷 酸 酶 底 物 缓 冲 液 :10 X NBT 浓 缩 液 : 10 X BCIP 浓 缩 液 ) 二 8 : 1 : 1 混 合, 避 光 保 存 2. 操 作 步 骤 (1) 膜 杂 交 后, 以 所 需 强 度 冲 洗 缓 冲 液 冲 洗, 置 于 2X SSC 中 (2) 取 膜 于 10 ml 封 闭 缓 冲 液 中 15 mi 日 (3) 取 膜 于 5 ml 第 一 抗 体 溶 液 中 保 温 30 min o (4) 置 于 5 ml 酶 标 第 二 抗 体 溶 液 中, 保 温 30 r 丑 1 日 (5) 用 IX 冲 洗 缓 冲 液 洗 膜 3 次, 每 次 5 mi 日 (6) 加 5 ml NBT / BCIP 底 物 溶 液 于 一 新 封 口 袋 中, 将 膜 置 于 其 中 ( 如 溶 液 变 色, 需 更 换 溶 液 ), 暗 处 显 色 15 mi 日 ~2 h o (7) 去 离 于 水 洗 膜 以 终 止 显 色, 将 膜 放 在 滤 纸 上 暗 处 干 燥, 或 置 于 80 'c 真 空 烤 箱 中 干 燥 5 mi 日 第 八 节 探 针 杂 交 诊 断 的 发 展 和 应 用 目 前, 随 着 分 子 生 物 学 的 深 入 发 展, 探 针 杂 交 诊 断 在 灵 敏 度 特 异 性 和 应 用 领 域 上 不 断 提 高 和 扩 大, 杂 交 类 型 和 检 测 万 法 不 断 发 展, 以 反 向 斑 点 杂 交 (reverse dot blot, RDB) 为 代 表 在 分 析 基 因 突 变 及 基 因 多 态 性 时, 多 采 用 特 异 性 寡 核 昔 酸 探 针 与 DNA 的 放 大 产 物 进 行 斑 点 杂 交 的 万 法 这 样 需 要 多 种 类 型 寡 核 昔 酸 探 针 分 别 与 放 大 产 物 杂 交, 特 别 是 在 个 体 多 态 性 研 究 中 这 个 问 题 更 加 突 出 而 由 Ssiki 等 首 先 提 出 的 反 向 斑 点 杂 交 技 术, 1 次 即 可 筛 查 样 品 中 的 多 种 突 变, 并 确 定 其 基 因 型, 从 而 大 大 简 化 了 实 验 步 骤 其 原 理 是 : 将 不 同 的 连 有 多 聚 物 的 寡 核 昔 酸 固 定 于 尼 龙 膜 E\l(; 硝 酸 纤 维 膜 上 引 物 先 经 生 物 素 化 后 进 行 待 检 DNA 的 基 因 扩 增, 从 而 得 到 生 物 素 化 的 DNA 放 大 产 物 在 严 格 的 条 件 下, 产 物 与 膜 上 寡 核 昔 酸 进 行 杂 交, 然 后 进 行 显 色 此 万 法 可 以 用 待 检 测 个 体 的 放 大 产 物 1 次 检 测 不 同 的 基 因 型 RDB 检 测 仍 遵 if 昌 等 位 基 因 特 异 性 寡 核 昔 酸 杂 交 (allele - specific olignucleotide hy bridizatio 日, ASO) 法 的 原 理, 但 它 以 膜 上 固 定 ASO 取 代 固 定 靶 DNA 这 种 固 定 探 针 与 液 相 中 靶 序 列 问 结 合 的 新 模 式 更 适 于 杂 交 由 于 各 种 ASO 的 碱 基 组 成 和 结 构 有 别, 很 难 使 每 个 ASO 在 同 一 体 系 中 均 达 到 最 适 杂 交 条 件, 故 1 条 膜 上 的 各 个 杂 交 点 的 显 色 129.

134 强 度 会 有 差 别, 但 这 并 不 影 响 阴 阳 性 结 果 的 判 断 RDB 的 靶 序 列 通 过 PCR 扩 增 获 得, PCR 产 物 足 够 的 拷 贝 数 为 非 放 射 性 检 测 提 供 了 保 证 将 用 于 检 测 的 生 物 素 直 接 连 在 寻 物 5' 端, 省 去 了 标 记 探 针 的 复 杂 操 作 多 种 ASO 同 时 参 与 检 测 样 品 DNA 而 又 互 不 干 扰, 能 1 次 性 筛 查 多 种 突 变, 而 不 像 传 统 的 ASO 杂 交 和 等 位 基 因 特 异 性 PCR (AS PCR) 等 万 法 那 样 1 次 只 能 检 测 1 种 突 变, 且 未 知 样 品 的 诊 断 需 逐 一 " 过 筛 " 各 种 突 变 才 能 完 成 因 而 大 大 提 高 了 基 因 诊 断 的 效 率 采 用 RDB 分 析 未 知 样 品, 能 迅 速 确 定 样 品 的 基 因 型 结 合 快 速 DNA 提 取 技 术, 通 常 在 1 d 内 可 获 得 结 果 目 标 基 因 DNA 序 列 的 阐 明 是 应 用 RDB 进 行 基 因 诊 断 的 前 提, i 亥 万 法 特 别 适 用 于 那 些 由 点 突 变 引 起 且 异 质 性 大 的 遗 传 病 的 基 因 检 测 目 前 RDB 除 应 用 于 人 类 遗 传 病 的 基 因 诊 断, 还 被 用 于 进 行 HLA 的 组 织 配 型 癌 基 因 点 突 变 分 析 病 原 体 细 菌 的 检 测 和 微 生 物 株 的 鉴 定 等 随 着 人 类 基 因 组 计 划 的 不 断 进 展 和 更 多 人 们 感 兴 趣 的 基 因 序 列 的 阐 明, 展 RDB 望 会 在 更 广 泛 的 领 域 中 得 到 应 用 和 发 展 现 以 自 地 中 海 贫 血 为 例, 说 明 RDB 的 操 作 步 骤 ( 一 ) ASO 探 针 的 设 计 和 合 成 ASO 探 针 共 计 8 对 16 个, 每 对 针 对 一 种 突 变, 包 括 正 常 和 突 变 序 列 的 寡 核 昔 酸 各 1 个 其 碱 基 序 列 分 别 相 应 于 在 我 国 人 群 中 发 现 的 主 要 的 8 种 自 地 中 海 贫 血 的 突 变 寡 核 昔 酸 序 列, 长 度 在 14 旧 ~26 日 t 之 间 为 使 固 定 在 同 一 条 膜 上 的 多 个 ASO 在 相 同 杂 交 和 洗 膜 条 件 下 能 区 别 各 自 的 正 常 和 突 变 等 位 基 因, 探 针 长 度 的 选 择 参 考 了 其 碱 基 组 成 以 同 一 条 膜 上 的 ASO 的 融 解 温 度 尽 可 能 接 近 为 原 则, 用 TdT 酶 使 寡 核 昔 酸 3' 端 加 上 多 聚 dt 尾 目 地 中 海 贫 血 ASO 探 针 序 列 详 见 表 表 7-4 日 地 中 海 贫 血 ASO 探 针 序 列 位 置 突 变 基 因 型 探 针 序 列 ~28 A G normal 5'GGCTGGGCATAAAAGTCAGG3' 口 lutant 5' TGCCCTGACTTCTATGCCCAG 3' codon 17 A T normal 5' GGGCAAGGTGAACGTGGAC3' 口 lutant 5' 1CTGTGGGGCTAGGTGAAC 3' codon 26 G T normal 5' AGGGCCTCACCACCAACCC3' 口 lutant 5' 1GTTGGTGGTAAGGCCCTG 3' codon 27~28 +C normal 5' AGGGCCTCACCACCAACCC3' 口 lutant 5' 1TGAGGCCCCTGGGCAG 3' codon 41~42 TTCT normal 5' CAAAGGACTCAAAGAACCTCTG 3' 口 lutant 5' GGACTCAACCTCTGGGTCC3' codon 43 G T normal 5' CAAAGGACTCAAAGAACCTCTG 3' 口 lutant 5' CCCAGAGGTTCTTTTAGTC3' codon 71 ~72 +A normal 5' GTGCCTTTAGTGATGGCCTG 3' 口 lutant 5' CCATCACTTAAAGGCACCG 3' IVSII C T normal 5' CTGGGTTAAGGCAATAGCAATCC3' 口 lutant 5' TTGCTATTACCTTAACCCAGAAATCC3' ( 二 ) 结 合 ASO 探 针 的 膜 条 制 备 将 加 尾 后 的 ASO 用 点 样 器 点 于 尼 龙 膜 上, 每 孔 点 探 针 1 pmal, 于 波 长 为 254 日 m 的 紫 外 线 下 照 射 5 min, 80'C 烤 膜 30 min, 再 于 5 X SSPE 0.1 %SDS 洗 脱 液 中 漂 洗

135 min, 以 洗 去 未 与 膜 固 定 的 探 针 ( 三 ) PCR 扩 增 双 重 PCR 扩 增 目 地 中 海 贫 血 基 因 的 寻 物 分 别 为 : C1 5'biotin - AACTCCTAAGCCAGTGCCAGAAGA - 3' C2 5'biotin - TCATTCGTCTGTTTCCCATTCTAAAC - 3' C3 5'biotin - T ATCATGCCTCTTTGCACCATTCT - 3' C4 5'biotin - TGATACTTGTGGGCCAGGGCATTA - 3' 在 100 vi 反 应 体 系 中 含 有 : 8.3 mmol/l (NH 4 )2S 仙, 33.5 mmol/l Tris - HCI, 3.3 mmol/l MgCb, 2.5 mmol/l ~ 琉 基 乙 醇, 8.4 vmol/l Na2EDTA, 400 vmol/l dntp, 0.2 vmol/ L 各 引 物 和 4 U Taq DNA 酶 反 应 条 件 为 : 95'C 5 mi 日, 35 个 帽 环 (95 'c 30 s, 60'C 30 s, 72'C 30 叶, 75'C 5 mino PCR 扩 增 产 物 用 琼 脂 糖 检 测, 产 物 长 度 分 别 为 774 bp 和 378 bpo ( 四 ) 杂 交 和 显 色 1. 杂 交 膜 置 于 3 ml 4 X SSPE, 0.5%SDS 杂 交 液 中 2. PCR 产 物 20μl 中 加 入 400 mmol/l NaOH 和 10 mmol/l EDTA, 变 ' 生 1 mi 日 ~ 5 r 丑 1 日 3. 变 性 PCR 产 物 加 入 杂 交 液 中 于 55 'C, 轻 摇 30 mino 4. 膜 条 取 出 后 在 1 X SSPE, 0.2%SDS 室 温 下 和 2 X SSPE, O. 2 % SDS, 55'C 各 漂 洗 10 mino 5. 膜 条 用 生 物 素 抗 生 物 素 蛋 白 HRP 显 示 体 系 显 色 探 针 杂 交 己 广 泛 应 用 于 科 学 研 究 和 临 床 的 分 子 生 物 学 诊 断 中 随 着 人 类 基 因 组 计 划 的 完 成, 大 量 的 基 因 有 持 克 隆, 人 类 的 DNA 序 列 有 待 详 尽 地 分 析 当 前 的 研 究 热 点 癌 基 因 和 衰 老 有 关 问 题 的 研 究 以 及 其 他 植 物 动 物 的 基 因 组 研 究, 核 酸 探 针 杂 交 技 术 是 进 行 这 些 研 究 不 可 缺 少 的 探 针 杂 交 技 术 对 某 些 人 类 遗 传 病 进 行 诊 断, 具 有 简 单 快 速 可 靠 等 优 点, 特 别 是 应 用 于 产 前 诊 断, 可 提 高 人 口 素 质, 减 轻 社 会 和 家 庭 负 担 该 技 术 亦 应 用 于 对 细 菌 抗 药 性 进 行 快 速 敏 感 的 试 验 测 定 探 针 杂 交 技 术 可 对 病 毒 细 菌 寄 生 虫 和 原 生 动 物 等 所 致 疾 病 的 病 原 作 出 快 速 准 确 的 诊 断, 除 用 于 诊 断 急 性 病 人 外, 还 可 用 于 检 测 带 菌 者, 并 且 可 在 泪 有 大 量 杂 菌 的 标 本 中 直 接 检 出 致 病 菌, 包 括 不 能 培 养 和 难 培 养 的 细 菌 病 毒 和 死 菌 此 外, 核 酸 探 针 杂 交 可 用 于 法 医 (DNA 指 纹 图 ) 兽 医 食 品 卫 生 检 测 等 领 域 ( 吴 韶 ; 青 黄 文 方 ) 第 九 节 荧 光 原 位 杂 交 自 1969 年 报 道 采 用 放 射 性 核 素 标 记 的 探 针 进 行 核 酸 序 列 原 位 杂 交 以 来, 该 技 术 很 快 被 广 泛 应 用 而 荧 光 原 位 杂 交 (fl uorescence in situ hybridizatio 日, FISH) 是 原 位 杂 交 技 术 大 家 族 中 的 一 员, 它 通 常 是 用 生 物 素 或 地 高 辛 标 记 探 针, 通 过 荧 光 染 料 结 合 的 检 131

136 测 试 剂 如 抗 体 进 行 检 测 ; 也 可 将 荧 光 染 料 直 接 标 记 的 核 酸 探 针 用 于 检 测 大 的 靶 序 列, 这 种 操 作 所 需 时 间 少, 背 景 染 色 低 该 万 法 在 20 世 纪 80 年 代 末 被 建 立, 现 己 从 科 研 实 验 室 逐 步 进 入 临 床 实 验 诊 断 领 域 一 荧 光 原 位 杂 交 的 原 理 与 方 法 ( ) FISH 的 基 本 原 理 荧 光 原 位 杂 交 的 基 本 原 理 是 荧 光 标 记 的 核 酸 探 针 在 变 性 后 与 己 变 性 的 靶 核 酸 在 退 火 温 度 下 复 性 ; 通 过 荧 光 显 微 镜 观 察 荧 光 信 号, 可 在 不 改 变 被 分 析 对 象 ( 即 维 持 其 原 位 ) 的 前 提 下 对 靶 核 酸 进 行 分 析 ( 图 7-1, 见 插 页 )0 DNA 荧 光 标 记 探 针 是 其 中 最 常 用 的 一 类 核 酸 探 针, 利 用 此 探 针 可 对 组 织 细 胞 E\l(; 染 色 体 中 的 DNA 进 行 染 色 体 及 基 因 水 平 的 分 忻 荧 光 标 记 探 针 不 对 环 境 构 成 污 染, 灵 敏 度 能 得 到 保 障, 可 进 行 多 色 观 察 分 析, 因 而 可 同 时 使 用 多 个 探 针, 缩 短 因 单 个 探 针 分 开 使 用 导 致 的 周 期 过 长 和 技 术 障 碍 ( 二 ) FISH 的 基 本 仪 器 与 试 剂 1. 仪 器 FISH 技 术 对 仪 器 的 要 求 不 高, 普 通 实 验 室 的 常 规 设 备 如 : 离 心 机 水 浴 缸 ( 或 锅 ) 恒 温 培 养 箱 等 都 可 使 用, 荧 光 显 微 镜 也 是 许 多 实 验 室 都 有 的 2. 试 剂 荧 光 探 针 的 制 备 标 记 包 括 如 下 两 万 面 (1) 探 针 的 来 源 : 用 作 FISH 探 针 的 DNA 可 以 来 自 质 粒 噬 菌 体 站 粒 BAC 或 YAC 等 多 种 载 体, 原 则 上 大 于 1 kb 即 可, 但 最 好 大 于 10 kb, 以 便 于 杂 交 和 在 荧 光 显 微 镜 下 辨 认 DNA 的 质 量 直 接 影 响 探 针 标 i 己 的 效 率, 1 旦 按 常 规 万 法 抽 提 的 DNA, 其 质 量 己 足 以 用 于 探 针 标 记, 不 需 进 行 特 殊 处 理 (2) 探 针 标 记 万 法 : 缺 口 翻 译 法 (nick translatio 川 和 随 机 引 物 法 (random prim er) 均 可, 而 且 可 购 买 到 商 品 化 的 试 剂 盒 按 标 记 物 不 同 又 可 分 为 直 接 法 和 间 接 法 : 用 生 物 素 (biotin) 或 地 高 辛 (digoxingeni 川 标 记 称 为 间 接 标 记, 杂 交 后 需 要 通 过 免 疫 荧 光 抗 体 检 测 万 能 看 到 荧 光 信 号, 因 而 步 骤 较 多 操 作 麻 烦, 其 优 点 是 在 信 号 较 弱 或 较 小 时 可 经 抗 原 抗 体 反 应 扩 大 ; 直 接 用 荧 光 素 标 记 DNA 的 万 法 称 直 接 标 记 由 于 直 接 标 i 己 的 探 针 杂 交 后 能 马 上 观 察 到 荧 光 信 号, 省 去 了 烦 琐 的 免 疫 荧 光 反 应, 不 再 需 要 购 买 荧 光 抗 体 也 由 于 近 年 来 荧 光 素 的 亮 度 和 抗 碎 火 的 不 断 改 进 和 提 高, 直 接 标 记 的 荧 光 探 针 越 来 越 成 为 首 选 如 Vysis 公 司 的 FISH 探 针 均 采 用 直 接 荧 光 标 记, 并 采 用 多 种 不 同 颜 色 的 荧 光, 万 便 了 在 同 一 标 本 上 同 时 检 测 多 种 异 常 其 荧 光 强 度 和 信 号 大 小 都 易 于 在 普 通 荧 光 显 微 镜 下 观 察, 操 作 过 程 中 也 不 需 要 严 格 避 光, 使 FISH 过 程 变 得 简 便 而 易 于 操 作 3. 工 作 液 的 配 制 (1) 20 X SSC: 氧 化 纳 175 g, 拧 1 蒙 酸 三 号 内 88.2 g, 加 三 蒸 水 到 ml o (2) 变 性 液 (40 ml): 甲 酌 肢 28 r 址, 20 X SSC 4 r 址, 蒸 f 留 水 8 ml, 充 分 泪 匀, 调 整 ph 值 至 7. 0~8. 0, 密 封 保 存 于 4 'C~8'C 每 次 使 用 前 均 需 测 定 ph 值 (3) 洗 脱 液 (40 ml): 甲 酌 肢 20 ml, 20 X SSC 4 ml, 茶 馆 水 16 ml, j 昆 匀 (4) SSCT (l 000 ml): 20 X SSC 100 r 址, 聚 山 梨 醋 r 址, 加 重 蒸 水 至 ml o 132.

137 ( 三 ) FISH 的 操 作 步 骤 不 同 厂 家 的 产 品 或 不 同 实 验 室 的 操 作 步 骤 都 不 完 全 相 同 每 个 实 验 室 最 好 有 自 己 的 操 作 程 序, 也 可 按 照 商 品 试 剂 盒 的 使 用 说 明 书 操 作 其 大 致 操 作 步 骤 如 下 第 一 天 1. 按 标 准 细 胞 遗 传 学 万 法 制 备 中 期 染 色 体 或 问 期 核 标 本, 标 本 置 56 'c ~60 'c 烤 箱 中 过 夜 ( 最 好 使 用 新 鲜 制 备 的 标 本 ) 2. 非 培 养 羊 水 细 胞 标 本 制 备 万 法 (1) 取 羊 水 5 ml~6 r 址, 于 r/ mi 日 离 心 10 mi 日, 去 上 清 液, 注 意 沉 淀 中 应 无 血 细 胞 污 染 (2) 加 3 ml O. 25 % trypsin ( 溶 于 无 CaCb 的 Hanks 液 ), 于 37 'c 消 化 30 mi 日 (3) r/min 离 心 10 mi 日, 去 上 清 液 (4) 加 4 ml ~ 5 ml 0.75 mal/l KCI, 于 3 7'C 孵 育 30 r 丑 1 日 (5) 加 1 ml 固 定 液 [ <j; ( 甲 醇 : 冰 乙 酸 ) 二 3 : 1], 轻 轻 泪 匀, r/ mi 日 离 心 10 mi 日 (6) 去 上 清 液, 加 5 ml 固 定 液, 轻 轻 泪 匀, 2000 r/ mi 日 离 心 10 mi 日 (7) 重 复 步 骤 (6)0 (8) 去 上 清 液, 力 口 适 量 固 定 液, 滴 片 第 二 天 3. 将 ph 值 为 7. 0~7. 5 的 变 性 液 (70% 甲 酌 肢 / 2 X SSC) 放 入 水 浴 中 预 热 至 74'C, 将 1 支 干 净 的 温 度 计 插 入 变 性 液 中 以 确 认 温 度 达 到 了 74 'c 注 意 冷 玻 片 插 入 变 性 液 中 将 降 低 变 性 液 的 温 度 4. 将 玻 片 插 入 预 热 的 变 性 液 中 3 min~4 mi 日, 不 要 摇 动, 然 后 迅 速 将 玻 片 插 入 预 冷 至 20 'c 的 酒 精 中, 依 次 从 70% 90% 到 100% 酒 精 中 各 脱 水 2 mi 日 5. 将 探 针 于 37 'c 保 温 5 min, 轻 轻 振 动 后 短 暂 离 心 收 集 液 体 于 管 底 ( 不 要 变 性 探 针 ) 6. 用 刻 于 笔 将 标 本 周 围 划 线, 加 上 10 vi 探 针 盖 上 盖 玻 片, 在 盖 玻 片 周 围 封 1 层 rubber cement 将 玻 片 置 于 湿 盒 中 于 37 'c 杂 交 过 夜, 也 可 放 在 杂 交 仪 中 于 37 'c 过 夜 第 三 天 7. 在 水 浴 中 预 热 40 ml 洗 脱 液 (50% 甲 酌 肢 / 2 X SSC) 至 43 'c 将 1 支 干 净 的 温 度 计 插 入 洗 脱 液 中 证 实 温 度 达 到 43 'c 8. 用 镖 于 小 心 地 除 去 rubber cement, 小 心 揭 开 盖 玻 片, 将 玻 片 插 入 洗 脱 液 中 洗 脱 10 r 丑 1 日, 然 后 再 重 复 1 次 洗 脱 液 的 温 度 对 于 信 号 强 度 与 特 异 性 非 常 关 键, 洗 脱 液 温 度 不 能 低 于 43 'c 以 免 由 于 交 叉 杂 交 产 生 背 景 9. 将 玻 片 在 37 'c 的 2X SSC 中 洗 脱 2 次, 每 次 4 min o 10. 将 玻 片 置 于 室 温 SSCT 液 中 洗 脱 2 mi 日 11. 将 玻 片 取 出, 用 纸 巾 从 玻 片 边 沿 吸 过 量 的 SSCT 不 要 让 玻 片 干 燥, 以 免 由 于 检 测 试 剂 的 非 特 异 性 结 合 导 致 高 背 景 荧 光. 133.

138 12. 在 每 块 玻 片 上 加 上 30μ1 avidin - F lt C, 盖 上 盖 玻 片, 37'C 孵 育 20 mi 日 小 心 去 除 盖 玻 片, 将 玻 片 在 室 温 SSCT 中 洗 脱 3 次, 每 次 2 min o 14. 用 纸 巾 从 玻 片 边 沿 吸 过 量 的 SSCT, 加 上 30 ml Anti - avidi 日 于 标 本 上, 盖 上 盖 玻 片, 于 37 'c 孵 育 20 mi 日 15. 小 心 去 除 盖 玻 片, 在 室 温 SSCT 中 洗 脱 3 次, 每 次 2 min o 16. 在 每 块 玻 片 上 加 上 30μ1 avidin - F lt C, 盖 上 盖 玻 片, 37'C 孵 育 20 min o 17. 小 心 去 除 盖 玻 片, 在 室 温 SSCT 中 洗 脱 3 次, 每 次 2 mi 日 用 纸 巾 从 玻 片 边 沿 吸 过 量 的 SSCT, 加 上 10μ1 DAPl, 盖 上 18 mm X 18 mm 盖 玻 片, 用 1 块 纸 巾 盖 上 盖 玻 片, 小 心 挤 压 纸 巾 以 吸 去 多 余 的 DAPl, 注 意 不 要 移 动 盖 玻 片 19. 在 荧 光 显 微 镜 下 观 察 结 果 ( 图 7-2, 见 插 页 ) ( 四 ) 多 重 荧 光 原 值 杂 交 (M - FISH) 操 作 步 骤 1. 试 剂 (1) 无 水 乙 醇 (2) 去 离 于 水 (3) 去 离 于 甲 酌 肢 (4) 20 X SSC (5) NP-40 o 2. 用 品 用 品 包 括 : 加 样 器 (1 0 vi), 吸 嘴 (1 0μ1), 0.5ml 离 心 管, 管 架, 染 缸 或 烧 杯 ( 洁 净 ) 5 个, 水 浴 锅 1 个 调 到 73 'C, 酒 精 灯 1 个, 摄 于 1 把 3. 实 验 准 备 (1) 盖 玻 片 的 处 理 : 取 盖 玻 片 10 mm X 10 mm, 用 酸 浸 泡 片 刻, 然 后 取 出 用 自 来 水 冲 洗 干 净, 再 用 茶 馆 水 冲 洗, 最 后 用 无 水 乙 醇 洗 2 次 ~3 次 (2) 载 玻 片 的 处 理 : 用 硫 酸 洗 液 浸 泡 后, 取 出 用 蒸 情 水 冲 洗 干 净 将 处 理 好 的 细 胞 悬 液 滴 片, 不 用 烤, 晾 干 备 用 4. 操 作 步 骤 (1) 将 用 无 水 乙 醇 浸 泡 的 盖 玻 片 在 酒 精 灯 焰 上 干 燥 (2) 配 制 70%, 85%, 100% 的 乙 醇 液, 然 后 将 标 本 片 分 别 置 入 3 个 不 同 浓 度 的 乙 醇 液 中, 在 每 个 浓 度 的 乙 醇 液 中 处 理 2 mi 日, 取 出 晾 干 (3) 加 10μ1 M - FISH 探 针 ( 己 加 有 杂 交 液 ) 用 盖 玻 片 盖 好, 盖 片 的 四 周 用 Rubber cement 封 固 (4) 置 Hybrite 杂 交 仪 中 70 'c 3 mi 日 ; 37'C 16 h 杂 交 (5) 配 制 50 ml 20 X SSC 液 (ph5.3); 配 制 100 ml 2 X ssc / o. 1 % NP - 40 ( 取 10 ml 20 X SSC + 100μ1 NP - 40, ph 7. 0) ; 配 制 100 ml 0.4 X SSC / 0.3% NP - 40 ( 取 2 m120 X SSC+ 300μ1 NP - 40, ph 7. 0~7. 5) 73 'c (6) 将 O. 4 X ssc / O. 3 % NP - 40 液 放 到 73 'c 水 浴 中 平 衡 温 度, 使 内 外 温 度 达 到 (7) 将 2 X ssc / O. 1%NP - 40 置 室 温 134.

139 (8) 将 杂 交 仪 里 的 片 于 取 出, 去 掉 Rubber cement, 然 后 将 玻 片 放 入 73 'e 的 0.4 x sse / O. 3%NP-40 液 中 1 mi 日, 取 出 后 立 即 放 入 置 室 温 的 2 x sse / O. 1 % NP - 40 中 1 r 丑 1 日 (9) 让 玻 片 自 然 晾 干, 然 后 加 10 vi DAPI 田 在 标 本 上, 盖 上 盖 玻 片 ( 盖 片 最 好 用 重 新 处 理 的 新 盖 片, 使 用 前 仍 然 在 无 水 乙 醇 中 处 理, 然 后 在 酒 精 灯 上 烧 一 下 ) (1 0) 在 荧 光 显 微 镜 下 观 察 二 荧 光 原 位 杂 交 在 临 床 诊 断 中 的 应 用 FISH 诊 断 技 术 是 一 种 分 于 生 物 学 技 术 与 细 胞 遗 传 学 技 术 相 结 合 的 实 验 诊 断 技 术 它 集 分 子 生 物 学 技 术 与 细 胞 遗 传 学 技 术 于 一 体, 具 有 结 果 稳 定 直 观 明 确 重 复 性 好 分 析 趋 于 自 动 化 等 优 点, 因 而 其 应 用 范 围 十 分 广 泛 ( ) 产 前 诊 断 产 前 诊 断 是 搞 好 优 生, 提 高 人 口 素 质 的 重 要 措 施 近 年 来 遗 传 性 疾 病 的 产 前 诊 断 越 来 越 升 起 人 们 的 普 遍 关 注 就 染 色 体 病 而 言, 其 发 病 率 高, 但 经 典 细 胞 遗 传 学 万 法 不 能 满 足 快 速 诊 断 及 病 例 大 量 增 加 的 需 要, 而 荧 光 原 位 杂 交 可 弥 补 上 述 不 足 主 要 原 因 是 FISH 可 对 问 期 细 胞 染 色 体 作 遗 传 分 析, 对 于 采 获 的 胎 儿 细 胞 ( 如 羊 水 绒 毛 脐 带 血 皮 肤 细 胞 等 ) 可 不 经 培 养 即 可 提 供 准 确 的 染 色 体 信 息, 缩 短 周 期, 减 少 因 培 养 失 败 而 带 来 的 麻 烦 就 人 群 中 染 色 体 病 而 言, 13, 18, 21, X, Y 染 色 体 数 目 异 常 占 95%, 因 此 如 同 时 运 用 此 5 个 探 针, 可 检 出 95% 的 染 色 体 病 例 这 些 探 针 较 容 易 获 得, 当 然 对 于 开 展 唐 氏 筛 查 的 实 验 室, 也 可 单 独 运 用 21 号 染 色 体 专 一 探 针 作 出 胎 儿 是 否 为 21 三 体 综 合 征 的 诊 断 同 样, 对 于 染 色 体 水 平 的 结 构 畸 变, 如 缺 失 或 重 复, 及 基 因 水 平 的 缺 失 或 重 复, 利 用 FISH 技 术 也 可 对 问 期 细 胞 进 行 诊 断 有 些 染 色 体 畸 变 比 如 易 位 缺 失 和 重 复 等 往 往 在 常 规 染 色 体 分 析 中 不 能 明 确 诊 断, 若 运 用 FISH 技 术 使 用 区 域 专 一 性 探 针 或 染 色 体 涂 染 探 针 可 很 快 地 作 出 明 确 诊 断 ( 二 ) 产 后 诊 断 对 于 大 量 产 前 遗 漏 的 疑 难 染 色 体 病 或 基 因 病, 如 染 色 体 易 位 重 复 和 缺 失 等, 可 在 产 后 通 过 FISH 技 术 进 行 诊 断, 一 万 面 可 明 确 诊 断, 更 重 要 的 是 为 其 后 代 产 前 诊 断 提 供 有 力 依 据 ( 三 ) 植 入 前 遗 传 学 诊 断 对 于 不 孕 症 患 者 来 说, 昂 贵 的 费 用 使 得 他 们 对 来 之 不 易 的 饪 据 特 别 珍 惜 因 此, 在 胚 胎 植 入 母 体 于 宫 之 前 有 针 对 性 地 进 行 遗 传 病 的 诊 断, 可 杜 绝 不 良 胚 胎 的 植 入, 减 少 畸 形 胎 儿 的 发 生 率, 为 " 试 管 婴 儿 " 及 其 父 母 带 来 更 大 好 处 但 植 入 前 胚 胎 能 奉 献 出 细 胞 用 于 遗 传 分 析 的 数 量 有 限 ( 为 1 个 ~2 个 细 胞 ) 且 为 问 期 细 胞, 因 此 惟 有 用 FISH Ejj(; PRINS 技 术 万 能 从 染 色 体 水 平 对 胚 胎 进 行 诊 断, 当 然 也 可 从 基 因 水 平 对 某 些 基 因 病 进 行 诊 断 ( 四 ) 肿 瘤 诊 断 肿 瘤 现 己 成 为 危 害 人 类 健 康 的 一 大 公 害, 几 乎 人 的 每 一 个 器 官 都 可 能 发 生 肿 瘤 虽 然 肿 瘤 的 种 类 繁 多, 涉 及 的 器 官 也 不 相 同, 但 从 发 病 机 制 角 度 看, 不 外 乎 包 括 基 因 水 平 135

140 和 染 色 体 水 平 的 原 因 明 确 诊 断 是 进 行 治 疗 选 择 治 疗 万 案 及 有 效 治 疗 的 前 提 许 多 公 司 都 可 提 供 一 些 肿 瘤 诊 断 的 探 针, 包 括 基 因 水 平 的, 也 有 染 色 体 水 平 的 可 使 用 的 标 本 有 新 鲜 的 组 织 标 本 石 蜡 包 埋 的 组 织 标 本 细 胞 涂 片 ( 如 外 周 血 细 胞 ) 培 养 细 胞 ( 包 括 问 期 和 中 期 细 胞 ) 等 目 前, 采 用 FISH 技 术 对 某 些 白 血 病 进 行 诊 断 或 早 期 诊 断 是 白 血 病 诊 断 的 一 个 重 要 手 段 总 之 FISH 技 术 在 临 床 诊 断 中 的 应 用 范 围 十 分 广 泛, 在 具 体 运 用 过 程 中 应 依 不 同 病 种 选 择 相 应 探 针, 即 可 达 到 较 好 的 效 果 ( 丁 显 平 顾 华 强 ) 第 十 节 比 较 基 因 组 杂 交 比 较 基 因 组 杂 交 (comparative genomic hybridizatio 日, CGH) 技 术 是 在 荧 光 原 位 杂 交 (FISH) 基 础 上, 结 合 消 减 杂 交 技 术, 于 20 世 纪 90 年 代 发 展 起 来 的 一 种 新 的 分 于 细 胞 遗 传 学 技 术 它 使 问 期 基 因 组 快 捷 可 靠 的 检 测 成 为 可 能 该 技 术 与 传 统 细 胞 遗 传 学 技 术 和 FISH 技 术 不 同 不 需 预 先 知 道 受 影 响 的 部 位 一 次 实 验 就 可 检 出 待 测 标 本 整 个 基 因 组 拷 贝 数 的 增 减, 也 可 在 物 种 间 进 行 染 色 体 同 源 性 比 较 一 比 较 基 因 组 杂 交 的 原 理 与 方 法 ( ) CGH 的 原 理 以 不 同 荧 光 标 记 待 测 和 参 照 细 胞 群 的 等 量 基 因 组 DNA, 并 用 过 量 的 未 标 记 Cot -1 DNA 抑 制 散 在 重 复 序 列 (interspersed repetitive sequence, IRS) 不 同 标 记 的 DNA 同 时 与 正 常 中 期 染 色 体 杂 交, 结 果 正 常 染 色 体 每 个 位 点 上 的 两 种 荧 光 强 度 之 比 反 映 待 测 与 参 照 基 因 组 DNA 序 列 的 拷 贝 数 之 比 ( 二 ) CGH 的 操 作 75 法 CGH 操 作 过 程 与 FISH 的 操 作 过 程 十 分 相 似, 1 旦 有 几 点 需 要 特 别 注 意 1. 染 色 体 涂 片 的 制 备 CGH 实 验, 对 中 期 细 胞 的 染 色 体 涂 片 质 量 要 求 很 高 最 好 是 涂 片 上 无 残 余 的 细 胞 浆, 染 色 体 几 乎 无 重 叠, 中 期 细 胞 和 问 期 核 间 要 充 分 分 开 因 此, 按 照 标 准 的 细 胞 遗 传 学 万 法 采 用 外 周 血 培 养 制 备 染 色 体 标 本 时, 可 适 当 增 加 固 定 次 数 延 长 固 定 时 间, 在 滴 片 时 先 将 载 玻 片 在 乙 醇 中 洗 涤, 然 后 用 水 冲 洗 2. DNA 的 制 备 从 待 测 细 胞 中 提 取 高 质 量 的 DNA 至 关 重 要 如 检 测 肿 瘤, 所 取 标 本 需 具 代 表 性, 所 含 肿 瘤 细 胞 比 例 要 高, 且 尽 量 不 含 污 染 的 坏 死 物 质 从 血 液 或 实 体 组 织 提 取 基 因 组 DNA, 可 参 阅 本 书 有 关 章 节 现 介 绍 从 石 蜡 包 埋 组 织 中 提 取 DNA 的 过 程 (1) 从 石 蜡 块 中 切 取 厚 度 约 5mm 的 切 片 50 片 左 右, 分 别 用 1 ml 二 甲 苯 和 1 ml 甲 醇 各 洗 涤 切 片 两 次, 以 去 除 石 蜡 (2) 在 1 mil mmol/ L 的 硫 氨 酸 铀 溶 液 中, 于 55 'c 过 夜 (3) 在 1 ml 抽 提 缓 冲 液 中, 于 55 'c 泊 ' 化 72 h, 每 24 h 加 0.2 mg 蛋 白 酶 K o (4) 采 用 酌 / 氯 仿 提 取 DNA ( 参 阅 本 书 有 关 章 节 ) 136.

141 (5) 加 1/20 倍 体 积 的 3 mo l/ L 乙 酸 铀 (ph 5) 和 2 倍 体 积 乙 醇, 置 80 'c 孵 育 30 min, 然 后 离 心 洗 涤 干 燥, DNA 悬 浮 在 TE 缓 冲 液 中 3. DNA 探 针 标 记 目 前 最 常 用 的 万 法 是 酶 介 导 的 缺 口 平 移 法 可 间 接 标 记 : 持 测 DNA 可 用 生 物 素 14 - dutp 标 记, 对 照 DNA 用 地 高 辛 11- dutp 标 记 也 可 直 接 标 记 : 用 连 接 有 荧 光 素 的 分 于 如 罗 丹 明 dutp 和 异 硫 氨 酸 醋 (FITC) - dutp 分 别 标 记 待 测 和 参 照 DNA, 直 接 检 测 杂 交 0 4. 原 位 杂 交 将 己 标 记 好 的 待 测 DNA 1μg 参 照 DNA 1μg 和 竞 争 DNA ( 人 类 Cot - 1 DNA) 100μg 混 合, 在 80 'c 放 置 30 mi 日, 使 DNA 沉 淀 然 后 离 心 洗 涤 干 燥, 置 入 杂 交 缓 冲 液, 变 性 ( 同 时 对 玻 片 上 的 染 色 体 DNA 进 行 变 性 ) 在 37 'c 孵 育 30 min, 以 抑 制 IRS 然 后 将 变 性 探 针 混 合 物 与 玻 片 上 变 性 的 中 期 染 色 体 杂 交, 严 格 冲 洗, 再 以 斗, 6 二 氨 基 2 苯 日 51 睐 (DAPI) 对 比 染 色 如 是 间 接 标 记 探 针, 则 用 连 有 不 同 荧 光 的 抗 体 与 不 同 标 记 的 半 抗 原 通 过 免 疫 组 化 染 色, 再 对 比 染 色 5. 检 测 选 择 至 少 5 个 杂 交 信 号 光 滑 背 景 较 低 着 丝 粒 和 异 染 色 质 区 域 标 记 探 针 结 合 较 少 以 及 DAPI 带 型 较 好 的 中 期 染 色 体 进 行 计 算 机 软 件 处 理, 分 析 每 一 染 色 体 上 的 平 均 荧 光 比, 即 可 制 作 CGH 拷 贝 数 核 型 模 式 图 ( 图 7-3, 见 插 页 ) 二 比 较 基 因 组 杂 交 的 应 用 CGH 己 被 广 泛 应 用 于 辅 助 核 型 分 析 血 液 系 统 疾 病 以 及 实 体 瘤 等 标 本 的 研 究 ( ) 辅 回 核 型 分 析 CGH 主 要 用 于 检 测 肿 瘤 细 胞 的 染 色 体 不 平 衡, 但 CGH 也 可 作 于 临 床 细 胞 遗 传 学 核 型 分 析 的 辅 助 手 段 CGH 可 代 替 需 特 殊 探 针 的 经 典 FISH 技 术, 用 于 检 测 染 色 体 异 常 作 快 速 产 前 诊 断 ( 二 ) 在 血 液 系 统 疾 病 研 究 中 的 应 用 近 年 来, CGH 结 合 传 统 核 型 分 析 FISH 等 分 于 细 胞 遗 传 学 技 术 广 泛 应 用 于 研 究 血 液 系 统 疾 病 有 核 血 细 胞 的 DNA 拷 贝 数 变 化 与 血 液 病 的 相 关 性 如 对 儿 童 急 性 原 始 淋 巴 细 胞 白 血 病 的 分 析 结 果 显 示 CGH 的 成 功 率 接 近 100%, 而 细 胞 遗 传 学 万 法 远 远 达 不 到 这 种 程 度 ( 三 ) 在 实 体 瘤 研 究 中 的 应 用 CGH 技 术 的 一 个 重 要 用 途 是 实 体 瘤 的 研 究, 这 也 是 该 技 术 应 用 最 早 的 领 域 它 可 以 显 示 实 体 瘤 中 染 色 体 DNA 拷 贝 数 的 增 加 或 减 少 一 些 拷 贝 数 的 变 化 与 肿 瘤 的 分 化 程 度 相 关, 并 能 通 过 CGH 结 果 提 示 一 些 疾 病 的 发 病 机 制 CGH 技 术 也 被 用 于 研 究 肿 瘤 耐 药 的 分 于 机 制 并 能 判 断 预 后 CGH 技 术 还 被 广 泛 用 于 揭 示 肿 瘤 恶 性 转 变 的 进 展 途 径, 分 析 原 发 癌 和 转 移 癌 之 间 以 及 不 同 部 位 转 移 癌 之 间 遗 传 物 质 差 异 ( 丁 显 平 ). 137.

142 第 十 一 节 光 谱 染 色 体 核 型 分 析 荧 光 原 位 杂 交 (FISH) 较 染 色 体 核 型 分 析 具 有 更 高 的 灵 敏 性 特 异 性 和 分 辨 率 但 因 光 谱 上 不 重 叠 的 荧 光 染 料 数 目 有 限, FISH 技 术 不 能 同 时 用 不 同 颜 色 分 辨 所 有 的 人 类 染 色 体, 并 且 该 技 术 只 能 对 实 际 上 己 经 定 位 的 染 色 体 进 行 分 析 Schrock 等 在 1996 年 介 绍 了 光 谱 染 色 体 核 型 (Spectral karyotypi 吨, SKY) 分 析 万 法, 1 次 杂 交 即 可 分 辨 24 条 人 类 染 色 体 该 万 法 是 通 过 傅 立 叶 光 学 显 微 镜, 将 光 学 显 微 镜 高 分 辨 率 成 像 和 荧 光 染 料 发 射 光 谱 的 测 定 结 合 起 来, 同 时 计 量 标 本 在 可 见 光 和 近 红 外 范 围 内 所 有 点 的 发 射 频 谱, 因 而 可 以 使 用 多 个 荧 光 染 料 光 谱 重 叠 的 探 针 一 光 谱 染 色 体 核 型 分 析 的 原 理 和 方 法 Speicher 等 在 1996 年 提 出 的 多 色 荧 光 原 位 杂 交 (mulitiplex - FISH) 也 可 以 提 供 全 部 24 条 染 色 体 的 多 色 核 型 分 析 图 谱, 与 之 相 比, SKY 在 滤 镜 的 设 置 和 软 件 中 涉 及 的 具 体 算 法 上 各 有 不 同 ( ) SKY 的 基 本 原 理 标 记 了 不 同 荧 光 染 料 的 染 色 体 涂 染 探 针 的 发 射 光 谱, 通 过 制 定 的 三 重 带 滤 镜 测 量, 在 经 过 一 个 干 涉 仪 后 使 染 色 体 涂 染 探 针 上 荧 光 基 团 发 射 出 的 光 产 生 光 程 差 这 些 荧 光 基 团 的 发 射 光 谱 在 通 过 干 涉 仪 后 产 生 了 细 微 的 区 别, 这 足 以 使 电 荷 偶 合 设 备 相 机 捕 获 其 特 异 光 谱 而 成 像 ( 图 7-4, 见 插 页 ) 从 发 射 光 谱 变 成 可 视 图 像 这 一 步 是 通 过 给 特 别 的 光 谱 范 围 分 配 蓝 绿 红 3 种 颜 色 完 成 的, 这 时 显 示 出 的 颜 色 称 为 显 示 色 获 得 的 显 示 色 上 的 色 差 类 似 于 传 统 单 色 荧 光 显 微 万 法 获 得 的 色 差, 所 以 频 语 重 叠 的 荧 光 染 料 其 各 自 的 显 示 色 也 会 看 起 来 较 相 近 这 时 不 同 的 染 色 体 在 颜 色 上 还 不 能 区 分 染 色 体 要 获 得 区 分, 还 需 要 分 配 一 种 与 显 示 色 一 一 对 应 的 区 分 色 区 分 色 通 过 计 量 每 一 个 像 素 上 的 频 语 并 通 过 傅 立 叶 变 换 得 来 因 此, 染 色 体 的 区 分 是 通 过 分 配 依 据 光 谱 的 区 分 色, 通 过 计 算 转 换 得 来 的 具 有 相 同 的 颇 谱 的 像 素 具 有 相 同 的 区 分 色 由 于 各 个 染 色 体 带 有 的 单 个 荧 光 染 料 不 同 或 荧 光 染 料 的 组 合 不 同, 也 就 不 会 有 频 谱 完 全 一 样 的 染 色 体 只 要 每 种 荧 光 染 料 的 发 射 光 谱 的 差 别 不 小 于 15 日 m, 就 可 利 用 上 述 万 法 获 得 满 意 的 区 分 色 其 结 果 使 染 色 体 得 到 区 分 ( 二 ) SKY 的 操 作 过 程 SKY 的 基 本 技 术 流 程 源 于 荧 光 原 位 杂 交, 制 备 带 有 荧 光 染 料 标 i 己 的 DNA 探 针, 与 中 期 染 色 体 杂 交, 再 通 过 荧 光 显 微 成 像 观 察 结 果 与 一 般 荧 光 原 位 杂 交 不 同 的 是 其 同 时 使 用 24 种 染 色 体 的 涂 染 探 针, 而 杂 交 的 靶 DNA 可 以 是 疾 病 标 本 或 细 胞 系 的 中 期 染 色 体 这 一 点 与 比 较 基 因 组 杂 交 (CGH) 使 用 正 常 外 周 血 淋 巴 细 胞 中 期 染 色 体 不 同 通 过 硬 件 与 软 件 的 改 进, SKY 同 时 用 不 同 颜 色 分 辨 所 有 的 人 类 染 色 体, 这 是 荧 光 原 位 杂 交 所 不 能 做 到 的 因 该 实 验 在 国 内 开 展 较 少, 下 面 介 绍 美 国 冷 泉 港 实 验 室 Spector 介 绍 的 万 法 1. PCR 法 扩 增 及 标 记 138

143 (1) 初 次 DOP PCR 用 于 流 式 细 胞 仪 分 类 的 染 色 体 扩 增 : 1) 制 备 PCR 反 应 混 合 物 (50μ 1): 无 菌 H μ1; DNA, 约 500 流 式 细 胞 仪 分 类 的 染 色 体 30 vi; PCR 缓 冲 液 10μ1; dntps 4 vi, 寻 物 6MW 1 vi, 15 X 10 6 U/L Taq DNA 聚 合 酶 o. 3 Vlo 2) 按 下 列 程 序 进 行 PCR: 1 起 始 变 性, 94'C 反 应 10 mino ( 94 'c 反 应 1 mi 日 ( 30 'c 反 应 1. 5 mino ( Ramp 30 'c ~70 'C3 mi 日 ( 72 'c 反 应 3 mi 日 6 重 复 步 骤 2~5, 4 次 ( 94 'c 反 应 1 mino ( 62 'c 反 应 1 mi 日 ( 72 'c 反 应 3 mi 日, 每 1 帽 环 加 1 So 10 重 复 步 骤 7~9, 34 次 10 最 后 延 伸, 72'C 反 应 10 mi 日 10 冷 却 至 4 'c (2) DOP- PCR 法 标 记 : 1) 制 备 PCR 反 应 混 合 物 (100μ1): 无 菌 H 2 059μ1; DNA, 400 日 g~600 日 g 染 色 体 特 异 扩 增 物 4μ1; 10 X PCR 缓 冲 液 II (PE) 10μ1; 25 mmol/l MgCb 8μ1; dntps 10 vi; 标 记 dutps ( 每 种 1 mmo l/ L), 生 物 素 16 - dutp, 地 高 辛 11- dutp, 罗 丹 明 dutp, 桶 红 光 谱 dutp 5μ1, Texas Red - dutp ( 分 于 探 针 ) ; 寻 物 6MW 2μ1, 5 X 10 6 U/L Taq DNA 聚 合 酶 2 Vlo 2) 按 下 列 程 序 进 行 PCR: ( 94 'c 反 应 1 mi 日 ( 56 'c 反 应 1 mino ( 72 'c 反 应 4 mino 4 重 复 步 骤 1~3, 24 次 5 最 后 延 伸, 72'C 反 应 20 mino 6 冷 却 至 4 'c 3) 扩 增 产 物 储 存 于 20 'c 0 2. 染 色 体 涂 片 的 预 处 理 (1) 按 CGH 的 万 法 制 备 染 色 体 涂 片, 参 照 本 书 有 关 章 节 进 行 (2) 室 温 下, 在 Coplin 瓶 中 简 单 平 衡 载 有 染 色 体 涂 片 的 载 玻 片 (3) 为 排 除 残 留 细 胞 RNA 的 干 扰, 在 载 玻 片 上 加 入 100μ1~200μ1 RNase 溶 液 (100 mg/ L RNaseA, 2 X SSC 配 制 ), 盖 上 24 mm X 60 mm 盖 玻 片, 37'C 湿 盒 内 孵 育 40 mi 日 ~60 mino (4) 去 除 盖 玻 片, 用 2X SSC 室 温 下 洗 涤 载 玻 片 3 次, 每 次 5 mino. 139.

144 (5 ) 载 玻 片 置 于 Coplin 瓶 内 的 胃 蛋 白 酶 溶 液 (10 mg/l ~ 50 mg/l 胃 蛋 白 酶, o. 01 mol/l HCI 配 制, ph2.0) 中, 于 37 'c 孵 育 5 mi 日 ~1O mi 日 以 去 除 残 留 细 胞 蛋 白 不 同 批 次 的 染 色 体 标 本 在 处 理 时 间 胃 蛋 白 酶 浓 度 上 有 变 化 处 理 过 度 将 损 害 染 色 体 形 态 结 构 ; 处 理 不 够, 则 降 低 杂 交 效 率, 产 生 胞 内 自 身 荧 光, 干 扰 探 针 荧 光 应 根 据 每 次 实 验 调 整 胃 蛋 白 酶 浓 度 及 孵 育 时 间 (6) 1 X PBS 室 温 下 洗 涤 载 玻 片 两 次, 每 次 5 mi 日 (7) 1 X PBS/50 mmol/l MgCb 再 次 洗 涤 载 玻 片 5 min o (8) 用 1% 甲 醒 / 1 X PBS / 50 mmol/l MgCb 室 温 下 固 定 染 色 体 10 mi 日 (9) 1 X PBS 室 温 下 洗 涤 载 玻 片 5 min o (1 0) 用 系 列 乙 醇 (70%, 90%, 100%) 对 载 玻 片 进 行 脱 水, 每 次 3 mi 日, 然 后 在 空 气 中 干 燥 ( 三 ) SKY) 去 中 的 杂 交 及 检 测 1. SKY 中 DNA 沉 淀 及 杂 交 (1) 在 3μl 每 种 染 色 体 染 色 探 针 中 加 入 50μl 人 Co t! DNA (1 gil, C lbco BRL) 及 1μl 蛙 精 测 试 DNA (9.7 gil, Sigma) (2) 加 入 1 / 10 体 积 的 3 mo l/ L 乙 酸 铀 溶 液 (3) 加 入 2. 5 倍 ~3 倍 体 积 的 无 水 乙 醇 (4) 振 荡, -20'C 过 夜, 或 80 'c 至 少 15 mi 日 ~30 mi 日 (5) 在 4 'c, r/ min 离 心 30 mi 日 沉 淀 DNAo (6) 弃 上 清 液, 在 Speed Vac 中 干 燥 沉 淀 5 min o (7) 加 入 5 ILl 去 离 于 甲 酌 肢 (ph7.5) 溶 解 沉 淀, 热 混 合 器 中 37 'c 孵 育 30 mi 日, 走 时 振 荡 (8) 加 入 5 ILl 母 液 (2 X SSC 配 制 的 硫 酸 葡 聚 糖, ph 7.0, 高 压 灭 菌, -20'C 冻 存 ), 振 荡, 简 短 离 心 (9) 在 80 'c 将 探 针 DNA 变 性 5 min o (1 0) 将 重 复 探 针 与 Co t! DNA 在 37 'c 退 火 1 h o (11) 载 玻 片 上 盖 上 24 mm X 60 mm 的 盖 玻 片, 置 于 100 ILl 70% 去 离 于 甲 酌 肢 / 2 X SSC 溶 液 中, 75'C 孵 育 1. 5 mi 日, 对 载 玻 片 进 行 变 性 (1 2) 轻 轻 去 掉 盖 玻 片, 立 即 放 置 在 新 鲜 配 制 的 冰 冷 的 70% 乙 醇 中 3 mi 日, 接 着 先 后 置 于 90% 和 100% 乙 醇 各 3 mi 日, 最 后 置 于 空 气 中 干 燥 (13 ) 将 从 步 骤 10 得 到 的 探 针 DNA 加 入 到 变 性 的 载 玻 片 上, 上 面 覆 盖 18 mm X 18 mm 盖 玻 片 并 用 橡 皮 泥 封 闭 之 (1 4) 在 暗 处, 于 37 'c 杂 交 至 少 15 h o 2. SKY 中 标 记 dutps 的 检 测 (1) 从 杂 交 过 的 载 玻 片 上 除 掉 橡 皮 泥 和 盖 玻 片 ( 应 尽 量 减 少 载 玻 片 曝 光 ) (2) 50% 去 离 于 甲 酌 肢 /2 X SSC 溶 液 (ph 7.0, 预 温 到 45 'C) 洗 涤 载 玻 片 3 次, 每 次 5 min, 振 荡 (3) 1 X SSC ( 预 温 到 45 'C) 洗 涤 载 玻 片 3 次, 每 次 5 mi 日, 振 荡 140

145 min o ) (8) 以 4 Xssc I O. 01 % 聚 山 梨 醋 20 ( 预 热 到 45 'C) 洗 涤 玻 片 3 次, 每 次 5 mi 日, 燥 (4) 将 载 玻 片 置 于 4 X ssc I O. 01 % 聚 山 梨 醋 20 内 整 个 过 程 不 能 让 载 玻 片 干 (5) 将 100μl 体 积 的 4 Xssc I O. 01 % 聚 山 梨 酸 20 I 3 %BSA (boehringer mannheim, BSA 组 分 V) 溶 液 加 到 载 玻 片 上, 在 24 mm X 60 mm 盖 玻 片 下, 避 光, 湿 盒 内 37 'c 孵 育 30 mi 日 (6) 将 载 玻 片 放 到 己 预 热 到 45 'c 的 4 Xssc I O. 01 % 聚 山 梨 醋 20 溶 液 内 (7) 加 入 100μl 的 抗 体 溶 液, 内 含 亲 和 素 Cy (amersham, 以 4 X ssc I o. 01 % 聚 山 梨 醋 20 I 1 %BSA 按 体 积 1 : 200 进 行 稀 释 ) 和 鼠 抗 地 高 辛 抗 体 ( sigma, 以 4X ssc % 聚 山 梨 醋 20 I 1 %BSA f 安 体 积 1 : 500 进 行 稀 释 ) 盖 上 24 mm X60 mm 盖 玻 片, 杂 交 盒 中 于 37 'c 孵 育 30 r 丑 1 日 ( 所 有 荧 光 染 料 在 使 用 前 以 r/ mi 日 离 心 3 洗 涤 时 振 荡 (9) 在 载 玻 片 上 加 入 100μI Cy 5.5 抗 鼠 抗 体 溶 液 ( amersham, 以 4 X ssc I 0.01 % 聚 山 梨 醋 20 I 1 %BSA 按 体 积 进 行 1 : 200 稀 释 ) 盖 上 24 mm X 60 mm 盖 玻 片, 杂 交 盒 中 于 37 'c 孵 育 30 min o (1 0) 以 4 X ssc I O. 01 % 聚 山 梨 醋 20 ( 预 热 到 45 'C) 洗 涤 玻 片 3 次, 每 次 5 min, 洗 涤 时 振 荡 (11) 将 载 玻 片 放 在 80μgiL DAPI 无 菌 水 的 Coplin 瓶 内 避 光 孵 育 10 mi 日 对 染 色 体 进 行 对 比 染 色 (1 2) 室 温 下 以 无 菌 水 洗 涤 3 mi 日 (13 ) 用 系 列 浓 度 递 增 的 乙 醇 溶 液 (70 %, 90 %, 100 % ) 对 载 玻 片 进 行 脱 水 处 理, 置 于 空 气 中 干 燥 为 避 免 荧 光 染 料 的 漂 白 作 用, 在 载 玻 片 加 入 30 ILl ~ 50 ILl 抗 褪 色 溶 液 (1 gil 1, 4 苯 二 肢, 80% 甘 油 配 制 ), 盖 上 24 mm X60 mm 盖 玻 片, 贮 存 在 避 光 处 二 光 谱 染 色 体 核 型 分 析 的 应 用 凡 是 FISH 技 术 应 用 的 范 围, SKY 技 术 均 可 适 用 但 SKY 技 术 在 以 下 两 万 面 更 为 有 效 ( 一 ) 在 淋 巴 造 皿 系 统 恶 性 疾 病 中 的 应 用 由 于 SKY 需 要 在 肿 瘤 的 中 期 染 色 体 片 进 行 分 析, 所 以 许 多 研 究 围 绕 淋 巴 造 血 系 统 肿 瘤 展 开 ( 得 益 于 其 相 对 容 易 获 得 的 中 期 染 色 体 片 ), 这 万 面 既 有 利 用 细 胞 系 也 有 利 用 临 床 活 检 标 本 例 如 : 对 患 有 意 性 淋 巴 细 胞 白 血 病 (ALL) 的 儿 童 进 行 SKY 分 析, 检 测 到 12 号 和 21 号 染 色 体 间 的 易 位 该 易 位 表 明 预 后 良 好 而 用 G - banding 万 法 检 测 不 到 12 号 和 21 号 染 色 体 间 的 易 位 ( 图 7-5, 见 插 页 ) ( 二 ) 在 实 体 瘤 中 的 应 用 Padilla 等 建 立 了 膀 肮 移 行 细 胞 癌 细 胞 系 BK -10, 这 是 一 个 近 4 倍 体 的, 具 有 2 个 亚 克 隆 的 细 胞 系 SKY 肯 定 了 12 个 过 去 G 显 带 描 述 过 的 标 记 染 色 体, 重 新 定 义 了 11 种 染 色 体 异 常, 并 发 现 了 4 种 隐 藏 的 染 色 体 重 排, 21 种 易 位 中 有 20 种 是 不 平 衡 易 位 141

146 结 合 传 统 G 显 带 FISH 和 SKY 技 术, 一 个 全 新 的 所 谓 "SKY 图 谱 " 充 分 展 示 了 膀 肮 移 行 细 胞 癌 细 胞 系 BK-10 既 结 构 复 杂 又 数 目 众 多 的 全 部 染 色 体 异 常 Macvillc 等 在 应 用 SKY, CGH, FISH 回 顾 性 研 究 宫 颈 癌 细 胞 系 HeLa 中 的 细 胞 遗 传 学 改 变 经 过 比 较, 过 去 G 显 带 发 现 的 18 个 标 记 染 色 体 经 SKY 重 新 鉴 定 后, 有 12 个 不 仅 校 正 了 畸 变 染 色 体 的 来 源, 而 且 确 定 了 CGH 所 提 示 的 具 有 拷 贝 数 改 变 的 染 色 体 的 断 裂 位 置 除 此 以 外, 经 SKY 万 法 分 析, 又 检 出 了 2 个 新 的 染 色 体 异 常 例 如 : 一 名 儿 童 被 诊 断 为 患 有 内 皮 性 骨 髓 瘤, 但 经 SKY 分 析 之 后, 发 现 了 x 染 色 体 和 18 号 染 色 体 之 间 有 易 位, 而 这 种 易 位 只 发 生 于 滑 野 性 肉 瘤, 于 是 医 生 根 据 SKY 的 分 析 结 果 相 应 改 变 了 治 疗 万 案 ( 图 7-6, 见 插 页 ) 总 之, 光 谱 染 色 体 核 型 分 析 技 术 只 需 1 次 杂 交 即 可 展 示 所 有 染 色 体 的 核 型 国 语, 其 与 传 统 显 带 技 术 和 荧 光 原 位 杂 交 比 较, 可 以 较 万 便 较 全 面 地 分 析 鉴 定 染 色 体 的 异 常 光 谱 染 色 体 核 型 分 析 技 术 作 为 传 统 细 胞 遗 传 学 万 法 的 补 充, 为 肿 瘤 细 胞 遗 传 学 资 料 的 积 累 发 病 机 制 的 探 讨 提 供 了 新 的 手 段 由 于 越 来 越 多 的 证 据 表 明, 肿 瘤 的 细 胞 遗 传 学 资 料 对 疾 病 的 分 类 及 预 后 的 判 断 可 以 提 供 帮 助, 我 们 相 信 SKY 结 合 染 色 体 显 带 技 术 及 其 他 分 子 细 胞 遗 传 学 技 术, 将 会 在 肿 瘤 的 研 究 和 临 床 工 作 中 发 挥 更 大 的 作 用 ( 丁 显 平 ) 第 十 二 节 引 物 介 导 的 原 位 DNA 合 成 技 术 寻 物 介 导 的 原 位 DNA 合 成 (primed in situ syntheses, PRINS) 技 术, 是 由 Koch 等 于 1989 年 建 立 的 DNA 分 析 新 技 术 此 后 该 技 术 己 在 可 靠 性 敏 感 性 和 分 辨 率 万 面 得 到 迅 速 的 改 进, 可 望 成 为 一 个 替 代 荧 光 原 位 杂 交 的 快 速 的 常 规 万 法 它 是 转 移 组 织 和 产 前 诊 断 中 鉴 定 非 整 倍 染 色 体 及 人 体 杂 交 细 胞 系 染 色 体 分 析 的 一 个 强 有 力 的 手 段 一 引 物 介 导 的 原 位 DNA 合 成 技 术 的 基 本 原 理 PRINS 技 术 是 在 复 性 温 度 下, 将 未 标 记 的 寡 核 昔 酸 DNA 引 物 与 事 先 制 备 在 载 玻 上 的 己 变 性 的 染 色 体 特 异 结 合, 用 掺 入 的 标 记 核 昔 酸 在 原 位 进 行 酶 促 延 长 并 进 行 检 测 的 染 色 体 标 记 技 术 据 此 可 检 测 出 引 物 结 合 在 染 色 体 上 的 具 体 位 置 二 引 物 介 导 的 原 位 DNA 合 成 技 术 的 操 作 过 程 下 面 以 诊 断 DOWN 综 合 征 为 例, 介 绍 PRINS 技 术 的 操 作 过 程 ( 一 ) 材 料 1. 载 玻 片 和 盖 玻 片 常 规 光 学 显 微 镜 载 玻 片 和 20 mm X 40 mm 盖 玻 片 X PRINS 缓 冲 液 500 mmol/l KCl, 100 mmol/l Tris - HCl (ph 8.3), 15 mmol/l MgCb, 0.1 %BSA o 3. datp, dctp 和 dgtp 100 mmol/ L 原 液, 用 无 菌 重 蒸 水 按 体 积 1 : 10 稀 释 4. dttp 100 mmol/ L 原 液, 用 无 菌 重 蒸 水 按 体 积 1 : 100 稀 释 142

147 5. 地 高 辛 11 三 磷 酸 脱 氧 尿 昔 (Dig dutp) 0 6. 终 止 缓 冲 液 500 mal/l NaCI, 50 mmal/l EDTAo 7. Taq DNA 聚 合 酶 8. 抗 地 高 辛 荧 光 素 (anti - Dig - F lt C) 9. DAPI 液 ( 斗, 6 - Diamidi 日 a - 2phenyIindaIe 2 HCI) 100 mg/l 10. 荧 光 显 微 镜 ( 二 ) 万 法 1. 标 本 来 源 抽 取 外 周 血 标 本, 分 裂 问 期 淋 巴 细 胞 按 常 规 细 胞 遗 传 学 万 法 制 备 2. 引 物 寻 物 选 自 21 号 染 色 体 的 α 卫 星 序 列, 即 : 5' TGATGTGTGTAC- CCAGCC3'o 3. 反 应 前 预 处 理 将 玻 片 浸 入 72 'c 70% 的 甲 酌 肢 (2 X SSC) 溶 液 中 2 min, 使 染 色 体 DNA 变 性, 然 后 迅 速 放 入 冰 预 冷 的 梯 度 乙 醇 (70 %, 90 %, 100 % ) 中 脱 水 固 定 各 2 r 丑 1 日, 取 出 玻 片 后 置 于 空 气 中 干 燥 4. PRINS 反 应 将 预 处 理 过 的 玻 片 60 'c 预 热, 加 入 PRINS 反 应 液 ( 每 1 份 样 品, 每 种 dntp 稀 释 液 1μ1, 加 1μl 标 记 的 Dig -11- dutp, 5μ1 10 X PRINS 缓 冲 液, 加 蒸 情 水 至 50μl 使 引 物 达 150 pmai, 加 1μ1 Taq DNA 聚 合 酶 ) 40μ1, 盖 上 盖 玻 片, 在 原 位 PCR 仪 上 按 照 : 93 'c 3 mi 日, 60'C 15 r 丑 1 日, 72'C 25 mi 日 的 程 序 进 行 PRINS 反 应 反 应 结 束 后 立 即 将 玻 片 移 入 70 'c 的 反 应 终 止 缓 冲 液 中 5 min, 最 后 将 玻 片 转 入 含 有 洗 涤 缓 冲 液 ( 4 X ssc / O. 2 % 聚 山 梨 醋 20) 室 温 下 洗 涤 5 mi 日 ~10 mino 5. 信 号 检 测 加 20 mg/l anti - Dig - FlTC 40μl 于 载 玻 片 上, 盖 上 盖 玻 片, 放 入 湿 盒, 37'C 孵 育 30 mi 日 o PBS / 0.05 聚 山 梨 醋 20 洗 3 次, 每 次 2 mi 日 然 后 用.06 mg/l 的 DAPI 液 在 37 'c 下 避 光 染 色 10 min 最 后 用 20μl 封 片 液 封 固, 在 荧 光 显 微 镜 下 观 察 荧 光 信 号 典 型 21 三 体 型 唐 氏 综 合 征 患 者 分 裂 问 期 淋 巴 细 胞 中 均 显 示 3 个 明 显 的 标 记 信 号, 正 常 人 外 周 血 分 裂 问 期 淋 巴 细 胞 中 显 示 两 个 明 显 的 标 记 信 号 ( 丁 显 平 ) 参 考 文 献 1 林 万 明. 临 床 基 因 探 针 诊 断 实 验 技 术 上 海 : 上 海 科 学 技 术 出 版 社, 王 申 五. 基 因 诊 断 技 术 北 京 : 北 京 医 科 大 学 中 国 协 和 医 科 大 学 联 合 出 版 社, 林 万 明. 核 酸 探 针 杂 交 实 验 技 术. 北 京. 中 国 科 学 技 术 出 版 社, 凯 勒, 马 纳 克 DNA 探 针 技 术. 北 京. 科 学 出 版 社, 曹 孟 德. HLA 分 子 生 物 学 及 临 床 应 用 河 南 : 河 南 医 科 大 学 出 版 社, 刘 锡 光. 病 毒 性 肝 炎 实 验 诊 断 学. 北 京 : 人 民 卫 生 出 版 社, 奥 斯 伯, 布 伦 特, 金 斯 顿 等. 精 编 分 子 生 物 学 实 验 指 南 北 京 : 科 学 出 版 社, 沈 克 慧. 尖 锐 湿 疵 新 鲜 组 织 HPV 的 聚 合 酶 链 反 应 检 测 与 斑 点 杂 交 比 较 的 研 究 中 华 皮 肤 科 杂 志, 1995, 28 (3): 杨 涛 非 放 射 性 核 素 逆 相 点 杂 交 方 法 检 测 苯 丙 酣 尿 症 突 变 基 因. 中 华 医 学 遗 传 学 杂 志, 1998, 15(5):

148 10 Saiki RK, coalshps, Levenson CH et a1. Genetic analysis of amplified DNA with immobiliced sequence - specific oligonucleotide probe. Proc Nat! Acad Sci USA, 1989, 86: Saiki RK, Bugawan TL, Horn GT et a1. Analysis of enzymatically amplified ~ - globin and HLA-DQαDNAwith allele- specific oligonucleotide probes. Nature, 1986, 324 (13): Hildebrandt F, Igarashi P. 分 子 医 学 技 术 北 京 : 科 学 出 版 社, David L, Spector, Robert D. 细 胞 实 验 指 南 北 京. 科 学 出 版 社, 孙 崇 秀, 宗 卉 比 较 基 因 组 杂 交 近 期 应 用 及 进 展 国 外 医 学 遗 传 学 分 册, 2001, 24 (2): Gosden J, Lawos D. Instant PRINS: a rapid method for chromosome identification by detecting repeated sequences in situ. Cytogenet Cell Genet, 1995, 68: 胡 福 泉 现 代 基 因 操 作 技 术 北 京 : 人 民 军 医 出 版 社,

149 第 八 章 基 因 突 变 分 析 技 术 基 因 突 变 是 指 遗 传 物 质 的 异 常 改 变, 其 中 以 单 碱 基 突 变 最 为 常 见 人 类 绝 大 多 数 遗 传 性 疾 病 都 不 同 程 度 地 与 相 关 基 因 突 变 有 关 通 过 临 床 分 子 生 物 学 实 验 确 定 基 因 突 变 的 位 置 和 性 质, 对 于 遗 传 病 的 临 床 诊 断 至 关 重 要 然 而, 基 因 突 变 往 往 仅 涉 及 一 个 或 少 数 碱 基 的 改 变, 并 不 引 起 基 因 片 段 的 丢 失 插 入 或 长 度 变 化 等, 检 测 起 来 比 较 困 难 近 10 年 来, 许 多 专 门 用 于 基 因 突 变 检 测 的 新 技 术 仍 然 取 得 了 显 著 的 进 步, 使 基 因 突 变 分 析 技 术 逐 渐 成 熟, 如 PCR - SSCP, DGGE PCR-HA 杂 交 探 针 技 术 及 高 效 液 相 层 析 等 这 些 技 术 中 部 分 可 用 于 己 知 突 变 的 检 测, 部 分 可 用 于 未 知 突 变 的 检 测 第 一 节 聚 合 酶 链 反 应 单 链 构 象 多 态 性 突 变 检 测 技 术 聚 合 酶 链 反 应 单 链 构 象 多 态 性 (PCR - single strand conformation polymorphisr 丑, PCR - SSCP) 是 近 10 余 年 发 展 起 来 的 一 种 最 常 用 的 未 知 基 因 突 变 分 析 技 术 该 技 术 于 20 世 纪 80 年 代 末 由 日 本 人 Orita 首 先 报 道, 1991 年 Hayashi 首 次 将 该 技 术 成 功 运 用 于 基 因 突 变 筛 查 PCR - SSCP 经 过 多 年 的 发 展 己 逐 渐 成 熟, 为 单 碱 基 量 异 常 所 致 的 基 因 突 变 检 测 提 供 了 快 速 有 效 的 手 段, 现 己 广 泛 应 用 于 临 床 基 因 突 变 分 析 中 一 基 本 原 理 双 链 DNA (ds DNA) 在 凝 胶 电 泳 中 的 迁 移 率 主 要 与 其 长 度 有 关 单 链 DNA (ss DNA) 在 非 变 性 聚 丙 烯 酌 肢 凝 胶 中 电 泳 时, 其 迁 移 率 不 仅 与 链 长 有 关, 还 与 单 DNA 链 的 空 间 构 象 有 关 而 空 间 构 象 主 要 由 单 链 DNA 的 碱 基 组 成 决 定, 因 此 单 链 DNA 的 迁 移 率 与 其 碱 基 组 成 相 关 将 双 链 DNA 部 分 变 性 后 在 非 变 性 聚 丙 烯 酌 肢 凝 胶 上 电 泳, 可 以 观 察 到 三 条 带 纹, 迁 移 最 快 的 一 条 是 未 变 性 的 双 链 DNA 片 段, 迁 移 较 慢 的 两 条 带 纹 是 己 变 性 的 单 链 DNA 由 于 碱 基 组 成 不 同, 尽 管 两 条 ssdna 完 全 互 补, 但 迁 移 率 仍 有 差 异 将 某 一 基 因 的 野 生 型 基 因 片 段 与 突 变 型 基 因 片 段 变 性 后 进 行 非 变 性 聚 丙 烯 酌 肢 凝 胶 电 泳 可 以 发 现, 尽 管 二 者 双 链 DNA 迁 移 率 完 全 一 致, 1 且 各 自 的 两 条 单 链 DNA 的 迁 移 率 却 有 差 异 因 此, 通 过 无 突 变 与 有 突 变 两 种 情 况 电 泳 条 带 的 迁 移 率 比 较, 能 比 较 容 易 地 区 分 出 靶 基 因 片 段 有 无 发 生 基 因 突 变 ( 如 图 8-1) 在 体 外 运 用 PCR 技 术 对 怀 疑 有 基 因 突 变 的 区 域 进 行 待 检 标 本 和 正 常 对 照 标 本 的 扩 增, 首 先 获 得 大 量 的 可 能 突 变 型 基 因 片 段 和 正 常 序 列 基 因 片 段, 然 后 进 SSCP 行 检 测 大 量 实 验 证 实 PCR- SSCP 是 一 种 简 便 快 速 的 突 变 筛 查 技 术, 当 待 检 PCR 片 段 在 300 以 下 时, 突 变 检 出 率 可 达 到 80% ; 片 段 小 于 200 bp 时, 检 出 率 可 高 达 90% 以 上 bp. 145.

150 5' 工 :OJ 3 per 扩 增 i 靶 其 [:J,j 3' 巳 工 工 获 得 大 ; 垦 双 链 靶 片 段 高 温 变 性 快 速 沐 浴 -N -1 1 凝 股 电 泳 N, IF 常 对 照 M, 突 变 基 因 dsdna 图 8-1 PCR - SSCP 原 理 示 意 二 基 本 方 法 PCR-SSCP 检 测 分 为 三 个 步 骤 :PCR 扩 增 双 链 DNA 变 性 电 泳 与 银 染 显 示 电 泳 结 果 ( ) 材 料 与 试 剂 准 备 1. 材 料 标 准 垂 直 电 泳 槽 高 压 电 泳 仪 与 实 验 室 耗 材 2. PCR 试 剂 Taq DNA 聚 合 酶 脱 氧 核 糖 核 昔 三 磷 酸 (dntp) 特 异 引 物, 30% 的 丙 烯 酌 肢 凝 胶 (49 : 1) 甘 油 10% 过 硫 酸 按 四 甲 基 乙 二 肢 (TEMED)o 3. 电 泳 缓 冲 液 10 x TEE 配 置 万 法 同 前 4. 变 性 加 样 液 澳 酣 蓝 5 mg 和 二 甲 苯 蓝 5 mg 加 入 0.5 r 丑 1 /L 乙 二 肢 四 乙 酸 (EDTA, ph8.0)0.4ml 与 甲 酌 肢 9.6 ml 中 5. 银 染 试 剂 包 括 体 积 分 数 分 别 为 10% 的 乙 醇 1% 的 硝 酸 10% 的 冰 乙 酸 和 质 量 分 数 分 别 为 0.2% 的 硝 酸 银 3% 碳 酸 纳 ( 二 ) 操 作 步 骤 1. PCR 扩 增 (1) 外 周 血 DNA 提 取, 万 法 同 前 ; (2) 靶 基 因 片 段 的 PCR 扩 增, 成 分 同 前 ( 表 8-1); (3) 转 移 5μlPCR 反 应 产 物, 加 入 等 体 积 变 性 加 样 液 146.

151 表 8-1 PCR 反 应 体 系 组 成 PCR 组 分 耐 热 Taq DNA 聚 合 酶 寡 核 背 酸 引 物 dntp 丰 莫 板 DNA 10 X PCR 缓 冲 液 其 他 成 分 与 去 离 子 水 终 浓 度 U/L 0.2 Villal ~ 5 Villal, 通 常 每 条 0.5 villal/l 200Villal O. 004 g/l ~O. 04 gil 1 XPCR 缓 冲 液 补 足 25 1' 1 2. PCR - SSCP 电 j 永 (1) 将 电 泳 玻 璃 板 洗 净, 用 亲 和 硅 ; 院 与 排 斥 硅 ; 院 分 别 硅 化 ( 步 骤 ) ; (2) 按 表 8-2 配 制 凝 胶 ; (3) 灌 胶, 静 置 1 h~2 h 得 凝 胶 完 全 聚 合 ; (4) 300 V 电 压 预 电 泳 1 h, 平 衡 凝 胶 温 度 ; (5) 将 PCR 反 应 混 合 液 ( 含 变 性 缓 冲 液 ) 于 94 'c 变 性 2 r 丑 1 日, 迅 速 置 于 冰 浴 中 骤 冷, 然 后 加 样 ; (6) 400 V 电 压 电 泳 2h~3h, 电 泳 时 间 根 据 靶 片 段 大 小 确 定 ; (7) 电 泳 结 束 后, 取 下 玻 璃 板, 将 有 凝 胶 附 着 的 玻 璃 板 用 重 蒸 水 浸 泡 冲 洗 1 次 表 8-2 SSCP 电 泳 凝 胶 成 分 试 剂 体 积 (illl) 30% 丙 烯 眈 胶 10 X TBE 10% 过 硫 酸 绞 TEMED 甘 泊 去 离 子 水 O 银 染 显 色 (1) 倒 去 重 蒸 水, 用 10% 的 乙 醇 固 定 10 mi 日 ; (2) 重 蒸 水 清 洗 1 次 后, 用 1% 的 硝 酸 浸 泡 10 mi 日 ; (3) 重 蒸 水 清 洗 1 次 后, 用.2% 的 硝 酸 银 浸 泡 30 mi 日 ; (4) 重 蒸 水 清 洗 1 次 后, 新 鲜 配 制 的 3% 碳 酸 铀 浸 泡, 直 至 DNA 条 带 显 影 ; (5) 用 10% 的 冰 乙 酸 浸 泡 定 影 ; (6) 在 白 光 台 上 观 察 电 泳 条 带 或 用 凝 胶 成 像 系 统 自 动 储 存 图 片 PCR - SSCP 电 泳 结 果 显 示 的 万 法 较 多, 传 统 的 PCR - SSCP 检 则 技 术 需 要 借 助 放 射 性 核 素 标 记, 万 法 复 杂, 限 制 其 推 广 近 年 来, 非 放 射 性 核 素 万 法 地 发 展 使 SSCP 技 术 得 以 广 泛 应 用, 与 放 射 性 核 素 标 记 相 比 较, 具 有 无 污 染 快 速 便 捷 和 经 济 等 优 点, 避 免 了 放 射 性 核 素 法 的 诸 多 不 便, 适 合 于 临 床 检 测 的 要 求 非 放 射 性 核 素 法 有 以 下 几 种 非 放 射 性 核 素 标 记 dntp: 可 将 生 物 素 或 地 高 辛 标 记 的 三 磷 酸 化 脱 氧 核 昔 酸 掺 入, 然 后 用 相 应 的 万 法 显 色 ; 但 该 万 法 操 作 复 杂, 所 需 试 剂 价 格 昂 贵 EB 染 色 : 万 法 简 单, 147.

152 f 旦 污 染 严 重, 对 操 作 人 员 危 害 较 大 SSCP 银 染 : 是 一 种 简 便 实 用 的 万 法, 经 济 快 速, 可 在 1 h~2 h 完 成, 尽 管 其 灵 敏 度 较 放 射 性 核 素 万 法 低, 1 且 可 完 全 满 足 检 测 要 求 荧 光 标 记 引 物 : 近 年 来, 随 着 荧 光 技 术 的 广 泛 应 用, 用 荧 光 标 记 引 物, 结 合 荧 光 检 测 仪 进 行 PCR - SSCP, 其 检 测 更 加 简 便 和 灵 敏 三 影 晌 因 素 1. PCR 扩 增 的 特 异 性 PCR 扩 增 要 求 靶 片 段 产 量 较 高, 非 特 异 条 带 少 或 浅 谈 电 泳 条 带 过 多 将 严 重 影 响 判 断 因 此, PCR 条 件 应 尽 量 优 化, 以 保 证 高 特 异 性 扩 增 2. 凝 胶 的 浓 度 用 聚 丙 烯 酌 肢 的 浓 度 来 判 断 凝 胶 孔 的 大 小 小 于 200 bp 的 片 段 可 用 质 量 分 数 10% 的 凝 胶, 大 于 200 bp 的 片 段 可 用 质 量 分 数 6% 的 凝 胶 凝 胶 浓 度 的 变 化 范 围 一 般 不 大, 但 要 得 到 较 好 的 电 泳 结 果, 可 以 对 其 进 行 适 当 调 整, 主 要 根 据 靶 片 段 的 大 小 来 决 定 3. 甘 油 I~ 是 胶 中 加 入 体 积 分 数 为 5%~ 1O% 的 甘 油 有 助 于 提 高 电 泳 检 测 的 敏 感 性, 这 可 能 与 甘 油 的 弱 变 性 作 用 有 关 ; 有 利 于 防 止 单 链 DNA 二 级 结 构 的 形 成, 增 大 其 迁 移 率 受 碱 基 组 成 差 异 影 响 的 程 度, 使 突 变 模 板 与 正 常 模 板 迁 移 率 的 差 异 得 到 更 好 的 体 现 4. 电 泳 温 度 与 电 压 电 泳 温 度 的 异 常 升 高 可 能 使 电 泳 条 带 发 生 变 形, 增 加 与 正 常 基 因 片 段 迁 移 率 进 行 比 较 的 难 度, 因 此 电 泳 时 最 好 有 帽 环 冷 却 水 电 泳 电 压 过 高 会 引 起 电 泳 温 度 的 升 高, 一 般 以 300V 左 右 为 宜 5. PCR 产 物 上 样 量 SSCP 电 泳 样 品 是 由 PCR 产 物 和 变 性 缓 冲 液 组 成 实 验 表 明, PCR 产 物 的 稀 释 程 度 较 低 时, 单 链 DNA 条 带 比 较 模 糊 ; 以 1 : 4 以 上 倍 数 稀 释 PCR 产 物, 产 生 的 单 链 DNA 条 带 最 为 清 楚 因 此 在 进 行 检 测 前, 应 根 据 情 况 摸 索 较 佳 的 稀 释 倍 数 四 可 能 出 现 的 问 题 与 解 决 办 法 1. 单 链 DNA 条 带 模 糊 (1) 可 能 的 原 因 : 非 特 异 ' 生 PCR 反 应 产 物 较 多, 电 泳 缓 冲 液 失 效, PCR 产 物 上 样 前 变 性 温 度 过 高, Ie 疑 胶 聚 合 欠 佳, PCR 产 物 上 样 前 变 性 不 彻 底, 变 性 缓 冲 液 成 分 有 误 等 (2) 解 决 办 法 : PCR - SSCP 检 测 前 常 规 电 泳 判 断 PCR 扩 增 是 否 特 异 或 有 较 多 非 特 异 扩 增 ; 不 使 用 有 沉 淀 的 电 泳 缓 冲 液 或 更 换 新 鲜 缓 冲 液 ; PCR 产 物 混 合 液 应 在 94 'c 变 性 2 mi 日, 勿 用 100 'c 变 性 ; 使 用 新 鲜 的 过 硫 酸 按, 以 保 证 凝 胶 的 充 分 聚 合 ; PCR 产 物 混 合 液 中 双 链 DNA 应 变 性 充 分 ; 使 用 正 确 的 变 性 缓 冲 液 2. 无 单 链 DNA 出 现 (1) 可 能 的 原 因 : PCR - SSCP 检 测 依 赖 于 基 于 碱 基 序 列 的 单 链 DNA 的 空 间 折 叠, 因 此 影 响 其 折 叠 的 各 种 实 验 参 数 都 会 对 结 果 产 生 影 响, 如 电 泳 电 压 I~ 是 胶 甘 油 质 量 分 数 及 电 泳 温 度 等 (2) 解 决 办 法 : 预 实 验 确 定 各 种 实 验 参 数, 寻 找 最 优 的 实 验 条 件 3. 电 泳 条 带 多 于 3 条 (1) 可 能 的 原 因 : 突 变 的 杂 合 于, 非 特 异 性 PCR 反 应 产 物 较 多, PCR 产 物 变 性 不 148.

153 彻 底 (2) 解 决 办 法 : 重 新 确 定 是 否 有 杂 合 现 象, PCR - SSCP 检 测 前 常 规 电 泳 判 断 PCR 扩 增 是 否 特 异 或 有 较 多 非 特 异 扩 增, PCR 产 物 混 合 液 中 双 链 DNA 应 变 性 充 分 4. 凝 胶 从 玻 璃 板 上 滑 落 或 凝 胶 破 裂 (1) 可 能 的 原 因 : 亲 和 硅 ; 院 失 效, 排 斥 硅 ; 院 失 效 (2) 解 决 办 法 : 重 新 硅 化 玻 璃 板 5. 电 泳 条 带 往 上 E\l(; 往 下 弯 曲 (1) 可 能 的 原 因 : 电 泳 电 压 过 高 温 度 过 高 E\l(; 电 泳 电 流 不 均 匀, I~ 是 胶 厚 薄 不 均 (2) 解 决 办 法 : 降 低 电 泳 电 压, 设 置 电 泳 馆 环 冷 却 水, 重 新 制 胶 五 II 备 床 应 用 与 局 限 与 其 他 突 变 检 测 技 术 相 比 较, PCR - SSCP 技 术 具 有 简 便 快 速 经 济 实 用 硬 件 要 求 低 和 检 出 率 高 等 显 著 优 点 尽 管 该 技 术 不 能 确 定 基 因 突 变 的 具 体 位 置 与 性 质, 1 旦 与 DNA 测 序 技 术 相 结 合, 在 遗 传 病 致 病 基 因 未 知 基 因 突 变 的 检 测 中 占 据 了 相 当 重 要 的 位 置, 己 经 成 为 临 床 基 因 突 变 筛 查 的 最 主 要 万 法 之 一 尤 其 是 非 放 射 性 核 素 电 泳 结 果 观 察 万 法 的 出 现, 使 i 亥 万 法 的 临 床 实 用 性 得 到 极 大 的 提 升, 扩 展 了 应 用 前 景 PCR - SSCP 技 术 在 应 用 上 有 两 个 主 要 的 缺 陷 其 一, 不 能 确 定 基 因 突 变 的 位 置 与 类 型, 需 要 结 合 其 他 技 术 如 DNA 测 序 等 才 能 解 决 根 本 问 题 其 二, PCR - SSCP 技 术 的 突 变 检 出 率 与 靶 基 因 片 段 大 小 密 切 相 关, 片 段 超 过 300 bp 者, 其 突 变 检 出 率 大 大 下 降, 这 就 限 制 了 一 次 检 测 的 筛 查 范 围 ; 或 PCR 扩 增 较 大 片 段, 进 行 处 理 后 再 电 泳, 增 加 了 实 验 的 难 度 六 PCR - SSCP 技 术 的 进 展 继 常 规 PCR - SSCP 技 术 的 出 现 和 应 用 后, 又 出 现 了 许 多 相 关 的 衍 生 技 术, 这 些 技 术 对 常 规 PCR - SSCP 进 行 了 改 进 和 发 展, 并 被 应 用 到 不 同 的 实 验 中 1. RNA - SSCP RNA 本 来 就 是 单 链 核 酸, 它 所 具 有 的 空 间 构 象 比 单 链 DNA 更 丰 富 和 稳 定 基 于 碱 基 序 列 改 变 而 影 响 RNA 空 间 构 象 同 样 可 以 造 成 其 电 泳 迁 移 率 的 变 化, 它 可 以 被 直 接 用 于 基 因 突 变 检 测 中, 其 检 测 的 灵 敏 度 高 于 DNA 检 测 然 而 RNA 检 测 必 须 防 止 其 阵 解, 且 检 测 成 本 较 高 等 问 题 限 制 其 广 泛 应 用 2. REF- SSCP 检 测 REF- SSCP 检 测 即 限 制 性 酶 切 单 链 构 象 多 态 性 检 测 它 是 将 PCR 获 得 的 较 大 片 段 DNA ( 如 bp) 先 进 行 多 酶 酶 切, 获 得 长 短 不 一 的 多 个 酶 切 片 段, 每 个 片 段 长 度 在 200 bp 左 右, 然 后 进 行 SSCP 检 测, 电 泳 得 到 由 许 多 条 带 组 成 的 一 个 指 纹 图 该 万 法 的 优 点 是 突 破 了 PCR - SSCP 检 测 只 能 进 行 短 片 段 检 测 的 局 限, 一 次 可 以 同 时 检 测 较 大 的 范 围, 通 过 比 较 指 纹 图 来 判 断 检 测 区 域 有 无 碱 基 突 变 存 在 但 该 万 法 局 限 性 仍 然 较 大, 需 要 在 突 变 检 测 范 围 内 同 时 具 有 多 个 问 距 较 小 ( 约 200 bp) 的 限 制 性 酶 切 位 点, 且 增 加 了 多 酶 切 的 实 验 步 骤, 因 此 推 广 使 用 比 较 困 难 3. MF - PCR - SSCP MF - PCR - SSCP 多 重 荧 光 标 记 的 PCR - SSCP 检 测 万 法, 是 使 用 多 种 荧 光 染 料 标 记 PCR 扩 增 产 物, 经 过 限 制 性 核 酸 内 切 酶 酶 切 再 进 行 PCR 149.

154 SSCP 检 测 该 万 法 能 同 时 进 行 较 大 片 段 的 基 因 突 变 筛 查, 且 灵 敏 度 很 高, 但 其 成 本 较 高 及 硬 件 要 求 高 等 问 题 限 制 其 临 床 使 用 第 二 节 双 荧 光 探 针 杂 交 突 变 检 测 技 术 双 荧 光 探 针 杂 交 突 变 检 测 是 20 世 纪 90 年 代 后 期 在 全 自 动 荧 光 检 测 系 统 的 基 础 上, 建 立 起 来 的 一 种 己 知 基 因 突 变 筛 查 的 新 万 法 该 万 法 将 PCR 扩 增 荧 光 实 时 检 测 荧 光 共 振 能 量 转 移 和 熔 点 曲 线 分 析 等 技 术 结 合 起 来, 通 过 检 测 系 统 自 动 收 集 储 存 和 分 析 荧 光 信 号, 可 高 通 量 快 速 灵 敏 和 便 捷 地 进 行 临 床 基 因 突 变 检 测, 正 在 得 到 越 来 越 多 的 应 用 一 基 本 原 理 在 PCR 反 应 体 系 中 含 有 一 对 特 异 性 PCR 引 物 和 设 计 合 成 的 两 条 杂 交 探 针 引 物 用 于 扩 增 可 能 含 有 己 知 突 变 的 靶 基 因 序 列 两 条 杂 交 探 针 序 列 与 野 生 型 靶 序 列 完 全 互 补, 位 于 寻 物 序 列 内 侧 其 中 上 游 探 针 覆 盖 己 生 口 的 突 变 点, 其 3' 端 与 下 游 探 针 5' 端 呈 首 尾 相 接, 其 间 仅 间 隔 1 bp~3 bpo 上 游 探 针 的 3' 端 和 下 游 探 针 的 5' 分 别 标 记 不 同 的 荧 光 染 料, 在 一 个 PCR 反 应 的 复 性 阶 段, 两 条 探 针 均 结 合 在 靶 基 因 上 时 两 个 荧 光 基 团 距 离 相 当 小 当 激 发 上 游 供 体 荧 光 素 发 光 时, 由 于 其 发 射 光 波 长 正 好 在 下 游 探 针 受 体 荧 光 素 基 团 的 激 发 光 波 长 范 围 内, 因 此 发 生 荧 光 能 量 共 振 转 移, 上 游 供 体 荧 光 素 的 激 发 光 被 下 游 受 体 荧 光 素 吸 收 而 使 下 游 受 体 荧 光 素 发 出 可 被 检 测 到 的 荧 光 但 在 DNA 变 性 过 程 中, 两 条 探 针 逐 渐 发 生 分 离, 两 个 荧 光 基 团 距 离 变 远, 这 时 收 集 到 的 下 游 荧 光 素 信 号 逐 渐 变 弱 在 进 行 PCR 反 应 时, 探 针 并 不 阻 滞 PCR 扩 增, 而 是 在 复 性 阶 段 不 断 与 引 物 一 道 结 合 到 靶 序 列 上 随 着 新 链 的 延 伸, Taq DNA 聚 合 酶 发 挥 5' - 3' 核 酸 外 切 酶 活 性 将 探 针 水 解 随 着 扩 增 的 进 行, 靶 序 列 呈 指 数 增 加, 每 次 反 应 能 结 合 到 靶 序 列 上 的 探 针 量 也 相 应 增 加, 复 性 阶 段 能 被 检 测 到 的 荧 光 强 度 也 不 断 提 高 因 此, 当 对 PCR 全 过 程 进 行 适 时 监 测 时, 可 以 根 据 荧 光 值 的 变 化 绘 制 出 一 个 完 整 的 标 准 的 PCR 曲 线 以 判 断 PCR 是 否 成 功 在 PCR 反 应 结 束 后, 再 进 行 一 次 温 度 逐 渐 升 高 的 变 性 过 程, 并 连 续 收 集 荧 光 信 号 当 体 系 中 有 大 量 的 突 变 型 靶 基 因 片 段 存 在 时, 由 于 这 些 突 变 片 段 与 上 游 探 针 在 突 变 点 处 碱 基 不 互 补, 因 此, 上 游 探 针 与 突 变 型 模 板 变 性 分 离 的 温 度 将 明 显 低 于 上 游 探 针 与 野 生 型 靶 序 列 变 性 分 离 温 度 这 样 在 较 低 的 温 度 时, 上 游 探 针 与 突 变 型 模 板 开 始 分 离, 荧 光 信 号 下 降 也 较 早 对 荧 光 信 号 变 化 与 温 度 进 行 拟 合, 计 算 出 L 值 可 以 发 现, 与 野 生 型 相 比, 二 者 L 值 差 异 明 显 通 过 熔 点 曲 线 分 析 L 值, 可 以 区 分 三 种 情 况 : 突 变 纯 合 于 突 变 杂 合 于 野 生 纯 合 型 ( 图 8-2) 二 基 本 方 法 实 验 操 作 可 以 分 为 三 个 步 骤, 即 杂 交 探 针 的 标 记 PCR 扩 增 和 熔 点 曲 线 分 析 150.

155 per 扩 增 l l llefej 乍 "T"T"T"T"1 = 立 工 口 壁 在 监 普 车 Ed 需 要 在 目 度 F 变 性, 其 E 值 较 低 3 / + 炜 点 曲 线 分 析 : 有 巨 常 模 板 lit 上 游 探 针 完 舍 互 补, 较 高 温 肢 F 变 性, 其 Tm 值 较 高 \/ -df/dt O O O. :5 O l:: 一 --=-- ~... 一 te 町 图 8-2 双 荧 光 探 针 杂 交 突 变 检 测 原 理 示 意 151.

156 ( ) 材 料 与 试 剂 准 备 1. 材 料 实 时 荧 光 检 测 热 帽 环 仪 与 实 验 室 耗 材 2. PCR 试 剂 Taq DNA 聚 合 酶 dntp 一 对 特 异 引 物 等 常 规 试 剂 3. 荧 光 标 记 探 针 上 游 探 针 3' 端 标 记 FAM, 下 游 探 针 5' 端 标 记 Red 640 或 Red 750, 3'~ 自 磷 酸 化 修 饰 ( 二 ) 操 作 步 骤 i 亥 实 验 在 荧 光 检 测 热 帽 环 仪 上 完 成, 自 动 化 程 度 高 下 面 以 Roche 公 司 LightCyder 荧 光 定 量 热 帽 环 仪 为 例 简 要 说 明 操 作 步 骤 1. PCR 扩 增 试 剂 混 合 液 准 备 PCR 扩 增 试 剂 混 合 液 准 备 参 见 表 表 8-3 杂 交 探 针 PCR 反 应 体 系 组 成 试 剂 成 分 体 积 (μi) 终 浓 度 去 离 子 水 14 引 物 与 探 针 混 合 液 (l OX) 2 1 X PCR 反 应 混 合 液 (l OX) 2 1 X 模 板 DNA 2 总 体 积 PCR t 盾 环 条 件 PCRt 盾 环 条 件 参 表 表 8-4 杂 交 探 针 PCR 反 应 条 件 步 骤 温 度 ec) 持 续 时 间 ( s) 预 变 性 变 性 l QF 飞 JU QF J 飞 U 30 复 性 ) 延 伸 / 45 个 循 环 气 u 7q ' 午 在 每 个 循 环 复 性 步 骤 单 点 收 集 荧 光 3. 熔 点 曲 线 条 件 熔 点 曲 线 检 测 条 件 参 加 表 8-50 表 8-5 熔 点 曲 线 检 测 条 件 步 骤 温 度 ec) 持 续 时 间 ( s) 变 性 复 性 95 C 45 C 上 升 到 75 C Os 60s Os 45 C 上 升 到 75 c 过 程 中 以 O. 1 c / s 的 速 度 升 温, 连 续 收 集 荧 光 4. 数 据 与 图 像 分 析 在 PCRt 盾 环 中, 每 个 帽 环 单 点 收 集 的 荧 光 值 可 以 组 成 一 个 标 准 的 PCR 曲 线, 而 阴 性 对 照 的 扩 增 无 任 何 荧 光 值 的 变 化, 提 示 对 模 板 DNA 的 扩 增 是 成 功 的 在 熔 点 曲 线 分 析 中, 连 续 收 集 的 荧 光 值 可 以 组 成 一 个 随 着 温 度 升 高 而 荧 光 值 下 降 的 152

157 曲 线 通 过 计 算 机 计 算 可 确 定 荧 光 值 的 最 大 变 化 程 度 的 温 度 区 域, 从 而 确 定 出 上 游 探 针 与 模 板 分 离 的 L 值 由 于 上 游 探 针 与 突 变 型 野 生 型 模 板 分 离 的 L 值 有 较 大 差 异, 因 此 可 以 比 较 容 易 地 判 断 标 本 是 突 变 纯 合 于 突 变 杂 合 于 或 野 生 纯 合 于 ( 图 8-2) 三 影 晌 因 素 i 亥 万 法 最 大 的 优 点 就 是 在 PCR 大 量 扩 增 靶 基 因 的 同 时 有 两 条 特 异 性 探 针 进 行 杂 交, 使 检 测 的 特 异 性 与 常 规 PCR 相 比 有 很 大 的 提 高, 加 之 荧 光 信 号 的 变 化 是 基 于 探 针 的 特 异 结 合 与 分 离, 体 系 中 影 响 荧 光 信 号 值 的 因 素 较 少 就 万 法 本 身 而 言, 用 于 基 因 突 变 筛 查 是 比 较 理 想 的 ; 但 同 时 应 看 到, i 亥 万 法 的 可 靠 性 在 很 大 程 度 上 依 赖 于 探 针 的 质 量 与 PCR 扩 增 的 有 效 性, 因 此 以 下 因 素 的 影 响 仍 不 可 忽 视 1. 荧 光 标 记 杂 交 探 针 该 探 针 的 质 量 与 检 测 灵 敏 度 密 切 相 关, 有 两 个 万 面 的 问 题 应 予 以 重 视 一 是 探 针 序 列 的 设 计 : 上 游 探 针 应 涵 盖 己 生 口 的 突 变 点, 并 尽 量 使 该 点 位 于 上 游 探 针 序 列 中 央, 这 样 在 完 全 配 对 与 不 完 全 配 对 两 种 情 况 下, 各 自 的 卫 I 值 差 异 可 以 达 到 最 大, 这 正 是 该 检 测 的 基 础 而 在 实 际 实 验 中 要 做 到 这 一 点 并 不 容 易, 因 为 上 游 探 针 的 设 计 不 仅 要 考 虑 到 突 变 点 两 侧 序 列 是 否 适 合 于 被 设 计 成 探 针, 还 要 考 虑 与 其 邻 接 的 下 游 序 列 是 否 适 合 于 设 计 下 游 探 针, 如 G/C 含 量 自 身 互 补 高 级 结 构 及 比 上 游 引 物 更 高 的 L 值 等 因 此 种 种 制 约 因 素 决 定 了 该 万 法 在 突 变 检 测 中 使 用 的 局 限 性, 一 旦 探 针 设 计 不 合 理, 其 突 变 检 出 率 将 会 下 降 二 是 探 针 的 标 记 : 标 记 探 针 的 效 率 和 纯 度 都 会 影 响 到 检 测 的 结 果, 较 好 的 荧 光 探 针 可 使 检 测 干 扰 因 素 减 少, 有 利 于 得 到 较 好 的 结 果 2. PCR 扩 增 体 系 该 检 测 首 先 要 求 高 效 的 靶 基 因 扩 增, 考 虑 到 杂 交 探 针 可 能 对 PCR 扩 增 产 生 不 同 程 度 的 影 响, PCR 反 应 体 系 的 各 种 成 分 应 尽 量 优 化 四 可 能 出 现 的 问 题 与 解 决 办 法 1. 检 测 不 到 扩 增 (1) 可 能 的 原 因 : 荧 光 收 集 通 道 选 择 错 误 ; 加 样 错 误 ; 荧 光 收 集 程 序 未 被 设 置 ; DNA 标 本 中 含 有 较 多 PCR 抑 制 剂, PCR 无 扩 增 (2) 解 决 办 法 : 检 查 程 序 中 荧 光 收 集 通 道 是 否 正 确, 检 查 加 样 有 无 遗 漏, 检 测 时 设 置 阳 性 对 照, 检 查 荧 光 收 集 程 序 是 否 被 正 确 设 置, 纯 化 DNA 模 板 2. 荧 光 值 过 高 (1) 可 能 的 原 因 : 灰 度 设 置 不 怡 当 (2) 解 决 办 法 : 在 每 次 实 验 前 检 查 灰 度 设 置 3. 荧 光 值 过 低 (1) 可 能 的 原 因 : 试 剂 储 存 不 当, 造 成 荧 光 染 料 阵 解 ; 起 始 模 板 拷 贝 数 过 低 (2) 解 决 办 法 : 试 剂 应 在 15 'c ~ - 20 'c 条 件 下 避 光 保 存, 避 免 反 复 解 冻 ; 增 加 模 板 使 用 量 4. 阴 性 对 照 出 现 阳 性 荧 光 信 号 (1) 可 能 的 原 因 : 实 验 室 PCR 产 物 污 染 (2) 解 决 办 法 : 更 换 所 有 试 剂, 改 变 加 样 操 作 台, 使 用 dutp- UNG 酶 系 统 阵 解 153

158 既 往 PCR 产 物, 试 剂 分 装 使 用 5. 荧 光 信 号 不 稳 定 (1) 可 能 的 原 因 : PCR 试 剂 混 合 液 未 被 完 全 离 心 到 管 底, 扩 增 管 内 有 气 泡 (2) 解 决 办 法 : 重 新 离 心 五 优 点 与 问 题 i 亥 技 术 的 优 点 明 显, 即 与 全 自 动 荧 光 检 测 仪 相 配 合, 实 现 了 操 作 过 程 的 自 动 化 ; 计 算 机 软 件 自 动 分 析 结 果, 最 大 限 度 排 除 了 人 为 因 素 的 影 响 ; 全 过 程 闭 管 检 测, 避 免 了 PCR 产 物 对 实 验 室 的 污 染 ; 针 对 己 知 突 变 的 检 测 检 出 率 高, 极 少 出 现 漏 检 ; 一 次 实 验 同 时 区 别 突 变 与 野 生 的 三 种 情 况, 实 验 效 率 极 高 应 该 说 该 技 术 依 赖 于 自 动 化 检 测 仪 器, 检 测 的 质 量 控 制 更 容 易 实 施, 代 表 了 未 来 临 床 分 子 生 物 学 检 测 的 发 展 万 向 但 是 我 们 同 时 也 看 到, 该 技 术 检 测 基 因 突 变 有 其 应 用 的 局 限 性 : 其 只 能 检 测 适 合 被 用 于 探 针 设 计 的 基 因 突 变 位 点 ; 探 针 设 计 合 成 与 荧 光 标 记 需 要 专 门 的 软 件 和 仪 器, 该 系 统 开 放 性 较 差 ; 必 须 在 全 自 动 荧 光 检 测 仪 上 完 成, 对 硬 件 要 求 高 这 些 问 题 都 使 其 临 床 应 用 受 到 较 大 的 限 制, 只 能 在 一 些 专 门 机 构 中 进 行 第 二 节 单 碱 基 延 伸 突 变 检 测 技 术 单 碱 基 延 伸 突 变 检 测 技 术 是 ABI 公 司 最 新 推 出 的 己 知 基 因 突 变 检 测 技 术, 它 本 来 被 应 用 于 SNP 的 高 通 量 检 测 中, 但 基 于 同 样 的 原 理 亦 可 在 基 因 突 变 检 测 中 得 到 应 用 与 杂 交 探 针 技 术 类 似, 该 技 术 的 应 用 也 必 须 结 合 全 自 动 测 序 仪 与 辅 助 软 件, 利 用 荧 光 检 测 技 术 获 得 荧 光 信 号 进 行 突 变 分 析 一 基 本 原 理 首 先 对 待 检 模 板 进 行 常 规 PCR 扩 增, 以 获 得 大 量 的 模 板 DNA, 然 后 对 PCR 产 物 进 行 纯 化, 去 除 其 中 的 dntp 等 原 料 以 纯 化 后 的 产 物 为 模 板, 利 用 一 条 3' 端 邻 近 己 生 日 突 变 点 的 寡 核 昔 酸 引 物 以 四 种 荧 光 标 i 己 的 四 种 双 脱 氧 单 核 昔 酸 为 原 料 再 进 行 一 次 PCR 反 应, i 亥 反 应 与 测 序 反 应 基 本 一 致, 即 仅 有 一 个 核 昔 酸 被 连 接 到 引 物 3' 端 由 于 突 变 模 板 和 野 生 型 模 板 碱 基 组 成 的 差 异, 引 物 3'~ 自 接 上 的 双 脱 氧 单 核 昔 酸 亦 不 同, 这 样 新 链 上 的 荧 光 相 应 出 现 差 异, 并 通 过 电 泳 可 被 检 测 到 ( 图 8-3) 二 基 本 方 法 ( ) 材 料 和 试 剂 准 备 1. 材 料 热 帽 环 仪 AB I3 100 等 系 列 仪 器 2. PCR 试 剂 Taq DNA 聚 合 酶 dntp 一 对 特 异 引 物 等 常 规 试 剂 以 及 PCR 产 物 纯 化 试 剂 盒 3. 单 碱 基 延 伸 试 剂 AmpliTaq FS 酶, dr6g 标 i 己 的 ddatp, dtamra 标 i 己 的 154.

159 一 PCR 扩 增 靶 片 段 二 平 且 口 主 主 主 回 收 纯 化 PCR 产 物 单 帧 主 击 延 伸 反 应 r ddgtp ddctp ddatp ddttp 牵 奇 异 藉 矗 ' I I I I I I I I~_ 'T G A 缸 I I I I I y' r 也 S I I I I I I I I:::: T 重 复 循 环 I l l - 毛 细 管 也 泳 - 荣 光 tdj v l 描 l 图 8-3 单 碱 基 延 伸 突 变 检 测 技 术 原 理 示 意 ddctp, drll0 标 记 的 ddgtp, drox 标 记 的 ddutp / ddttp, 3' 端 与 突 变 点 邻 近 的 寻 物 ( 二 ) 操 作 步 骤 1. 常 规 PCR 扩 增 扩 增 怀 疑 有 己 知 突 变 的 靶 基 因 片 段 2. 产 物 纯 化 纯 化 PCR 产 物, 去 除 残 留 的 dntp 等 原 料, 以 防 影 响 单 碱 基 延 伸 3. 单 碱 基 延 伸 混 合 单 碱 基 延 伸 试 剂 纯 化 后 的 模 板 DNA 和 单 寻 物, 利 用 变 性 与 复 性 延 伸 使 引 物 延 伸 4. 电 泳 与 荧 光 检 测 电 泳 时 根 据 双 链 末 端 的 荧 光 判 断 引 物 被 延 伸 的 碱 基 类 型, 以 获 得 等 位 基 因 状 况 的 信 息. 155.

160 i 亥 万 法 检 测 己 生 口 的 基 因 突 变 灵 敏 度 极 高, 是 一 种 非 常 可 靠 的 基 因 突 变 检 测 技 术, 但 同 样 存 在 硬 件 要 求 高 检 测 成 本 高 而 不 易 在 临 床 推 广 使 用 的 问 题 第 四 节 基 因 芯 片 突 变 检 测 技 术 基 因 芯 片 (genechips) 又 称 DNA 芯 片 (DNA chips) Ejj(; DNA 微 阵 列 (DNA mircoarray), 是 生 物 芯 片 (biochip) 的 一 种 它 是 将 大 量 可 寻 址 的 基 因 序 列 信 息, 即 DNA 序 列 有 序 地 固 定 在 固 体 递 质 上 而 成 基 因 芯 片 技 术 是 综 合 了 分 于 生 物 学 信 息 科 学 材 料 科 学 计 算 机 技 术 等 多 学 科 技 术 于 一 体 而 形 成 的 核 酸 固 相 杂 交 检 测 技 术, 实 现 了 在 微 芯 片 固 相 载 体 上 对 大 量 目 的 DNA / RNA 的 特 异 杂 交 检 测, 具 有 高 通 量 多 样 化 做 量 化 集 成 化 等 显 著 优 点, 在 医 学 领 域 具 有 十 分 广 泛 的 应 用 前 景 许 多 突 变 检 测 技 术, 如 PCR - RFLP PCR - SSCP HAD DGGE CFLP DH PLC 等 为 基 因 突 变 检 测 提 供 了 有 效 的 手 段, 但 这 些 万 法 在 突 变 筛 查 中 均 存 在 筛 查 范 围 局 限 突 变 位 置 不 确 定 操 作 比 较 复 杂 等 问 题 基 因 芯 片 则 为 解 决 上 述 问 题 提 供 了 一 种 选 择 目 前, 基 因 芯 片 己 成 功 地 应 用 于 囊 性 纤 维 化 基 因 p53 基 因 珠 蛋 白 基 因 酷 氨 酸 酶 基 因 HIV-1 蛋 白 酶 基 因 等 多 种 基 因 突 变 的 检 测 基 因 芯 片 技 术 检 测 基 因 突 变 的 原 理 并 不 复 杂, 类 似 于 一 个 经 典 的 反 向 斑 点 杂 交 该 技 术 最 大 的 优 势 在 高 通 量 集 成 化 检 测 上, 一 次 杂 交 可 检 测 成 千 上 万 的 基 因 位 点 我 们 知 道, 一 种 遗 传 病 的 致 病 基 因 往 往 存 在 较 多 不 同 类 型 的 基 因 突 变, 以 往 只 能 选 择 发 生 率 较 高 的 己 知 突 变 进 行 检 测, 不 可 避 免 地 发 生 漏 检 而 运 用 基 因 芯 片 技 术 可 以 将 一 种 遗 传 病 的 己 报 道 或 明 确 的 所 有 突 变 点 同 时 进 行 芯 片 杂 交 检 测, 极 大 地 提 高 了 突 变 的 检 出 率 和 检 测 的 效 率, 是 一 种 极 有 发 展 前 景 的 突 变 检 测 技 术 基 因 芯 片 检 测 突 变 的 万 法 主 要 是 先 对 怀 疑 突 变 的 靶 基 因 区 域 进 行 多 重 PCR 扩 增, 然 后 直 接 将 产 物 变 性 后 与 芯 片 上 固 定 的 突 变 型 或 野 生 型 DNA 探 针 进 行 杂 交, 通 过 洗 膜 去 除 未 杂 交 产 物 由 于 PCR 产 物 在 扩 增 时 己 被 荧 光 标 记, 因 此 产 物 如 与 固 定 探 针 发 生 杂 交, 则 会 通 过 荧 光 检 测 仪 观 察 到 杂 交 信 号 又 由 于 有 杂 交 信 号 的 杂 交 点 所 固 定 的 探 针 序 列 是 己 生 口 的, 如 固 定 的 突 变 探 针, 有 杂 交 信 号 则 说 明 标 本 中 有 突 变 的 等 位 基 因 ; 如 其 为 野 生 型 探 针, 有 杂 交 信 号 则 表 示 标 本 中 有 正 常 等 位 基 因 ; 以 次 类 推 ( 图 8-4) 尽 管 基 因 芯 片 技 术 发 展 迅 速, 并 己 取 得 一 些 成 果, 但 尚 未 形 成 大 规 模 的 临 床 应 用, 其 原 因 可 分 为 两 个 万 面 其 一, 费 用 高 : 从 芯 片 制 作 看, 需 要 较 多 价 格 昂 贵 的 仪 器, 如 用 于 原 位 合 成 寡 核 昔 酸 的 光 刻 机 器 和 合 成 仪 或 用 于 合 成 后 点 样 的 全 自 动 点 样 仪 ; 即 使 使 用 商 品 化 的 检 测 芯 片, 也 存 在 芯 片 杂 交 信 号 检 测 时 需 要 激 光 共 聚 焦 扫 描 仪 或 荧 光 显 微 镜 等 贵 重 设 备 的 问 题, 这 些 都 成 为 基 因 芯 片 检 测 成 本 居 高 不 下 的 重 要 原 因 其 二, 芯 片 技 术 本 身 还 存 在 一 定 的 问 题, 比 较 典 型 的 有 :1 现 阶 段 芯 片 检 测 的 灵 敏 度 决 定 了 需 要 首 先 扩 增 模 板, 一 般 采 用 PCR 万 法 进 行 这 一 步 骤, 不 可 避 免 地 带 来 PCR 所 具 有 的 局 限 ;2 目 前 广 泛 采 用 的 荧 光 标 记 万 法 存 在 检 出 灵 敏 度 较 低 的 问 题, 而 一 些 新 的 检 测 万 法 如 质 谱 法 化 学 发 光 法 光 导 纤 维 法 DNA 生 物 传 感 器 法 等 正 处 于 研 制 过 程 中 ;3 分 于 杂 交 步 骤 亦 存 在 一 些 有 待 解 决 的 问 题, 加 之 芯 片 杂 交 的 条 件 高 度 个 体 化, 难 以 形 成 比 较 统 一 156.

161 多 位 点 Jt 扩 增 主 主 主 2 持 / OJ Jdf2EE 羁 野 生 型 探 针 \ 突 变 型 探 针 \ w 阳 刊 占 主 申 过 军 ; Af rl 合 主 豆 子 厅 ' 带 U:J4 正 由 检 制 杂 交 信 号 /JL04/ 图 8-4 基 因 芯 片 突 变 检 测 原 理 示 意 规 范 的 杂 交 环 境, 给 应 用 带 来 障 碍 所 有 上 述 问 题 的 解 决 都 将 是 一 个 艰 巨 的 过 程 基 因 芯 片 的 研 究 和 应 用 虽 然 面 临 许 多 困 难,1 旦 前 景 是 光 明 的 芯 片 技 术 自 问 世 到 今 天, 短 短 几 年 时 间 己 获 得 了 飞 速 发 展 基 因 芯 片 技 术 的 进 步 必 将 更 加 依 赖 于 物 理 化 学 及 信 息 学 领 域 的 新 成 果, 随 着 新 技 术 的 应 用 和 越 来 越 多 的 学 科 融 合, 该 技 术 的 全 面 应 用 是 可 以 预 见 的 基 因 芯 片 技 术 作 为 一 个 技 术 平 台, 不 仅 在 突 变 检 测 万 面 有 巨 大 的 应 用 价 值, 而 且 在 基 因 测 序 多 态 分 析 基 因 表 达 研 究 克 隆 选 择 文 库 筛 选 病 原 诊 断 等 领 域 展 现 出 极 大 的 应 用 潜 力 2000 年 10 月 在 北 京 召 开 的 国 际 生 物 芯 片 大 会 举 世 瞩 目, 再 次 向 世 界 全 万 位 展 现 了 生 物 芯 片 技 术 的 丰 硕 成 果, 我 们 完 全 有 理 由 相 信,21 世 纪 将 是 生 物 芯 片 的 世 纪, 芯 片 将 给 人 类 带 来 巨 大 的 积 极 影 响 第 五 节 聚 合 酶 链 反 应 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 突 变 检 测 聚 合 酶 链 反 应 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 (per - RFLP) 技 术 是 检 测 基 因 突 变 的 一 种 经 典 万 法, 也 是 使 用 最 早 的 基 因 突 变 检 测 手 段 之 一 这 一 万 法 可 用 于 突 变 涉 及 限 制 性 酶 切 位 点 和 片 段 缺 失 的 检 测, 在 镰 形 细 胞 贫 血 地 中 海 贫 血 等 基 因 突 变 检 测 中 己 得 到 广 泛 应 用. 157.

162 基 本 原 理 分 子 生 物 学 实 验 中 有 一 组 重 要 的 工 具 酶, 即 限 制 性 核 酸 内 切 酶 这 种 酶 来 源 于 原 核 生 物, 能 特 异 性 识 别 基 因 组 中 特 定 的 碱 基 序 列, 并 水 解 DNA 磷 酸 二 醋 键, 使 DNA 双 链 在 酶 切 位 点 发 生 断 裂 限 制 性 核 酸 内 切 酶 种 类 很 多, 因 此 其 在 基 因 组 中 识 别 位 点 也 很 多, 一 种 酶 也 可 以 有 多 个 相 同 的 识 别 位 点 在 人 类 基 因 组 中, 凡 是 其 某 一 段 碱 基 序 列 能 被 限 制 性 核 酸 内 切 酶 识 别 并 发 生 切 割 的 位 点, 我 们 称 为 限 制 性 核 酸 内 切 酶 限 制 性 位 点 这 些 位 点 广 泛 分 布 于 基 因 组 中, 数 量 众 多, 是 一 种 非 常 有 用 的 基 因 组 路 标 同 时 我 们 知 道, 不 同 个 体 基 因 组 的 碱 基 序 列 并 不 是 完 全 一 致 的, 同 一 个 体 不 同 等 位 片 段 的 碱 基 序 列 也 不 是 完 全 相 同 的, 它 们 之 间 存 在 的 差 异 主 要 表 现 为 单 碱 基 的 差 异, 并 不 引 起 基 因 功 能 的 异 常, 是 一 种 基 因 组 的 多 态 现 象 然 而, 如 果 一 种 单 碱 基 差 异 发 生 在 一 个 限 制 性 核 酸 内 切 酶 限 制 性 位 点 上, 则 会 导 致 限 制 性 位 点 的 消 失 或 新 位 点 的 出 现, 使 用 限 制 性 核 酸 内 切 酶 切 割 后 电 泳 可 以 发 现, 不 同 个 体 或 同 一 个 体 两 个 等 位 基 因 的 限 制 性 酶 谱 存 在 差 异 同 样 道 理, 当 一 个 单 碱 基 突 变 发 生 在 一 个 限 制 性 位 点 上 时, 造 成 该 位 点 碱 基 序 列 发 生 改 变, 从 而 使 限 制 性 位 点 消 失 ; 反 之, 当 一 个 单 碱 基 突 变 发 生 时, 可 能 产 生 新 的 限 制 性 位 点 因 此, 当 怀 疑 某 个 基 因 位 点 发 生 一 种 己 知 突 变 影 响 到 限 制 性 位 点 的 改 变 时, 运 用 PCR 技 术 将 该 片 段 进 行 扩 增, 然 后 用 相 应 的 限 制 性 核 酸 内 切 酶 对 PCR 产 物 进 行 酶 切, 可 以 将 正 常 个 体 的 限 制 性 酶 语 与 怀 疑 突 变 个 体 进 行 比 较, 可 以 根 据 二 者 酶 谱 的 差 异 较 容 易 地 判 断 出 有 无 突 变 存 在 ( 图 8-5) 基 本 方 法 ( ) 材 料 与 试 剂 准 备 1. 材 料 热 帽 环 仪 电 泳 设 备 2. 试 剂 常 规 PCR 试 剂 特 异 性 引 物 和 限 制 性 核 酸 内 切 酶 ( 二 ) 操 作 步 骤 1. 常 规 PCR 扩 增 常 规 PCR 扩 增 参 见 表 表 8-6 per 反 应 体 系 组 成 PCR 组 分 耐 热 Taq DNA 聚 合 酶 寡 核 背 酸 引 物 dntp 模 板 DNA 10 X PCR 缓 冲 液 其 他 成 分 与 去 离 子 水 终 浓 度 U!L.2μmol~5μmol, 通 常 每 条 O. 5μmol 每 种 dntp 200μmol 2 mg/l~ 20 mg/l 1 X PCR 缓 冲 液 补 足 50μl 2. PCR 产 物 的 纯 化 与 回 收 PCR 反 应 体 系 的 缓 冲 环 境 一 般 与 限 制 性 核 酸 内 切 酶 酶 158.

163 野 生 型 含 限 制 性 酶 切 位 点 突 变 型 眼 制 性 酶 切 位 点 消 失 工 ::IIJ- 一 TTl ι 斗 :::r:rr; 限 制 性 栅 内 切 酶 酶 切 CJ 琼 脂 糖 电 泳 H, 突 变 杂 合 子 N, 野 生 型 14, 突 变 纯 合 子 图 8-5 per - RFLP 突 变 检 测 原 理 示 意 切 反 应 所 要 求 的 缓 冲 条 件 有 一 定 差 异, PCR 反 应 体 系 中 直 接 加 入 内 切 酶 不 能 完 全 发 挥 内 切 酶 的 活 性 因 此, 在 进 行 酶 切 前 最 好 先 回 收 纯 化 PCR 产 物, 去 除 其 中 的 各 种 高 于 短 链 DNA 剩 余 的 引 物 与 dntp 等, 然 后 使 用 内 切 酶 专 用 缓 冲 液 对 PCR 产 物 进 行 酶 切, 可 以 得 到 较 好 的 结 果 当 然, 为 操 作 万 便 和 降 低 成 本, 一 些 实 验 室 直 接 对 PCR 产 物 进 行 酶 切, 虽 然 效 果 欠 佳, 但 仍 足 以 对 结 果 进 行 判 断 3. PCR 产 物 酶 切 限 制 性 核 酸 内 切 酶 常 规 应 于 20 'c 保 存, 使 用 时 应 置 于 冰 上, 并 注 意 防 止 核 酸 酶 污 染 而 发 生 阵 解 (1) 混 合 酶 切 反 应 体 系 参 见 表 8-7;. 159.

164 表 8-7 限 制 性 酶 切 反 应 体 系 组 成 试 剂 名 称 数 量 限 制 性 核 酸 内 切 酶 3D 10 x 缓 冲 液 lμl per 产 物 lμe 去 离 子 水 补 足 10μl 在 一 些 酶 切 反 应 中 可 以 加 入 BSA 等 酶 保 护 剂, 以 提 高 反 应 效 率 (2) 37 'c 下 保 温 2 h~3 h; (3) 加 入 EDTA 至 终 浓 度 10 mmol/ L 终 止 酶 切 反 应 ; (4) 或 将 反 应 管 在 65 'c 下 保 温 10 mi 日 终 止 反 应 ; (5) 置 于 冰 上 冷 却 ; (6) 加 入 2 ILl 上 样 缓 冲 液, 振 荡 泪 匀 备 用 4. 酶 切 产 物 电 泳 分 析 根 据 预 计 酶 切 片 段 的 大 小 与 相 互 的 差 异 选 择 电 泳 万 式, 般 较 多 采 用 琼 脂 糖 电 泳, 澳 化 乙 皖 染 色, 紫 外 投 射 仪 观 察 电 泳 片 段 三 per - RFLP 的 临 床 应 用 i 亥 技 术 的 应 用 有 两 个 前 提 条 件, 即 基 因 突 变 是 己 生 口 的, 该 突 变 改 变 了 原 有 的 限 制 性 位 点 产 生 了 新 的 限 制 性 位 点, 因 此 应 用 受 到 较 大 限 制 但 由 于 其 结 果 明 确, 操 作 相 对 比 较 简 便, 目 前 仍 被 应 用 于 少 数 遗 传 病 基 因 诊 断 镰 形 细 胞 贫 血 是 最 早 利 用 基 因 检 测 成 功 诊 断 的 疾 病 之 一, 目 前 仍 以 PCR-RFLP 为 主 要 万 法 进 行 诊 断, 1 旦 使 用 的 限 制 性 核 酸 内 切 酶 却 不 尽 相 同 下 面 以 限 制 酶 Mst II 的 使 用 为 例 说 明 PCR - RELP 的 使 用 万 法 ( 一 ) 基 本 原 理 镰 形 细 胞 贫 血 是 自 珠 蛋 白 基 因 的 一 个 点 突 变 引 起, 即 GAG-GTG, 而 此 突 变 区 域 包 括 两 侧 序 列 CCTGAGG 怡 好 是 MstII 的 酶 切 位 点, 因 此 在 该 位 点 的 突 变 使 原 有 的 酶 切 位 点 序 列 改 变 成 CCTGTGG, MstII 无 法 识 别 该 位 点, 进 而 不 能 进 行 切 割 在 该 酶 切 位 点 两 侧 设 计 一 对 寻 物 扩 增 出 含 该 酶 切 位 点 的 PCR 片 段, 然 后 使 用 MstII 对 PCR 片 段 进 行 酶 切, 电 泳 结 果 会 出 现 三 种 情 况 : 所 有 产 物 被 切 成 两 个 片 段 部 分 产 物 被 切 成 两 个 片 段 所 有 产 物 均 未 被 切 割, 相 对 应 的 检 测 结 果 为 突 变 的 纯 合 于 突 变 的 杂 合 于 和 野 生 型 纯 合 于 ( 二 ) 基 本 万 法 1. 材 料 与 试 剂 准 备 (1) 材 料 : 热 f 盾 环 仪 和 电 泳 仪 (2) 试 剂 : 常 规 PCR 试 剂 限 制 性 核 酸 内 切 酶 Mst II ; 寻 物 序 列 : 上 游 引 物 5' ACACAACTGTGTTCACTAGC 了, 下 游 引 物 5' CAACTTCATCCACGTTCACC 3'; 扩 增 片 段 110 bpo 2. 操 作 步 骤 (1) 抽 取 患 者 外 周 血 5 ml, ACD 抗 凝, 盐 析 法 提 取 基 因 组 DNA; (2) 使 用 上 述 引 物 常 规 PCR 50μl 扩 增 突 变 区 域 ; 160

165 (3) 琼 脂 糖 电 泳 观 察 到 一 条 约 110 bp 的 片 段 ; (4) 将 剩 余 的 PCR 产 物 回 收 纯 化 ; (5) 纯 化 后 的 PCR 片 段 用 于 Mst II 酶 切 ; (6) 将 酶 切 产 物 进 行 琼 脂 糖 电 泳 ; (7) 结 果, 理 论 上 正 常 等 位 基 因 被 切 割 成 56 bp 与 54 bp 两 个 片 段 ( 表 8-8) 表 8-8 镰 形 细 胞 贫 血 Mst II 酶 切 片 段 分 析 标 本 电 泳 结 果 (bp) 正 常 基 因 纯 合 子 突 变 基 因 杂 合 子 突 变 基 因 纯 合 子 四 PCR - RFLP 的 优 点 与 应 用 局 限 性 i 亥 技 术 的 最 大 优 点 是 直 接 针 对 己 知 突 变 进 行 检 测, 结 果 直 观 明 确 易 于 判 断, 并 且 实 验 要 求 的 各 种 条 件 较 简 单 不 足 之 处 在 于 其 应 用 只 能 在 突 变 引 起 限 制 性 酶 切 位 点 改 变 的 情 况 下, 而 且 一 次 检 测 只 能 完 成 一 个 特 定 位 点 突 变 筛 查, 检 测 效 率 较 低, 仅 适 合 于 基 因 突 变 类 型 单 一 所 致 的 遗 传 病 诊 断 五 PCR - RFLP 可 能 出 现 的 问 题 与 解 决 办 法 1. 酶 切 效 果 不 理 想 原 因 可 能 有 限 制 性 核 酸 内 切 酶 保 存 和 使 用 不 当, 其 活 性 降 低 ; 核 酸 酶 污 染 ; PCR 产 物 浓 度 过 低 或 过 高 ; PCR 缓 冲 液 影 响 酶 切 ; 酶 切 体 系 各 成 分 浓 度 不 当 ; 酶 切 缓 冲 液 使 用 不 当 ; 酶 切 时 间 不 够 等 2. 解 决 办 法 限 制 性 核 酸 内 切 酶 必 须 保 存 于 20 'C, 使 用 时 置 于 冰 上 ; 使 用 时 应 采 用 一 次 性 的 高 温 处 理 的 耗 材 ; PCR 产 物 量 应 在 琼 脂 糖 电 泳 时 作 出 初 步 估 计, 以 免 酶 切 的 模 板 量 过 多 ; 对 PCR 产 物 进 行 纯 化 回 收 ; 酶 切 体 系 中 酶 的 用 量 应 遵 守 试 剂 盒 说 明 ; 选 用 酶 切 效 率 最 好 的 专 门 酶 切 缓 冲 液 ; 应 严 格 掌 握 酶 切 时 间, 过 短 可 引 起 酶 切 不 全, 过 长 则 会 导 致 电 泳 的 拖 尾 现 象 影 响 结 果 判 断 因 此 可 以 通 过 预 实 验 确 定 最 优 的 酶 切 条 件 第 六 节 等 位 基 因 特 异 性 per 检 测 突 变 技 术 等 位 基 因 特 异 性 PCR (allele specific PCR, ASPCR) 又 称 为 扩 增 阻 滞 突 变 检 测 体 系 (amplification refractory mutation system, ARMS) E!X; 3' 端 特 异 PCR, 是 一 种 检 测 己 知 基 因 突 变 的 万 法 该 万 法 原 理 简 单 操 作 容 易 结 果 明 确, 是 一 种 重 要 的 基 因 突 变 检 测 技 术, 在 临 床 中 被 广 泛 采 用 一 基 本 原 理 在 PCR 扩 增 中, 引 物 的 延 伸 万 向 是 从 5' 端 到 3' 端, 因 此 引 物 3' 端 的 碱 基 与 模 板 DNA 碱 基 互 补 至 关 重 要 尽 管 PCR 引 物 延 伸 有 一 定 的 容 错 性, 1 旦 3' 端 碱 基 的 非 互 利 会 161

166 造 成 PCR 扩 增 无 法 启 动 或 扩 增 效 率 及 其 低 下, 因 此 当 检 测 己 知 突 变 时, 应 根 据 突 变 碱 基 类 型 设 计 两 种 引 物 一 种 引 物 3' 端 与 野 生 型 模 板 完 全 互 补, 用 于 扩 增 正 常 的 等 位 基 因 由 于 这 种 3' 端 与 突 变 型 模 板 不 互 补, 因 此 不 能 扩 增 突 变 的 等 位 基 因 另 一 种 引 物 3' 端 与 突 变 型 模 板 完 全 互 补, 用 于 扩 增 突 变 的 等 位 基 因, 由 于 这 种 3' 端 与 野 生 型 模 板 不 互 补, 因 此 不 能 扩 增 正 常 的 等 位 基 因 在 检 测 时, 分 别 将 这 两 种 寻 物 进 行 PCR 扩 增, 电 泳 观 察 结 果, 会 出 现 表 8-9 所 示 的 情 况 表 8-9 AspeR 杂 交 结 果 判 断 标 本 正 常 引 物 扩 增 突 变 引 物 扩 增 无 扣 增 个 正 常 等 位 基 因 有 扩 增 有 扩 增 突 变 等 位 基 因 杂 合 子 有 扩 增 突 变 等 位 基 因 纯 合 子 无 扩 增 有 扩 增 由 于 ASPCR 检 测 技 术 一 次 检 测 仅 能 针 对 一 个 突 变 点, 检 测 效 率 较 低, 因 此 在 AS PCR 检 测 技 术 的 基 础 上 又 出 现 了 多 重 等 位 基 因 特 异 ' 生 PCR (MAS - PCR) 技 术 MAS RCR 技 术 基 本 原 理 与 ASPCR 检 测 技 术 相 似, 惟 一 的 区 别 是 在 两 次 PCR ( 分 别 应 用 正 常 寻 物 与 突 变 引 物 ) 中 同 时 对 多 个 突 变 点 序 列 进 行 共 扩 增, 根 据 正 常 与 异 常 扩 增 带 的 情 况 做 出 结 果 判 断 该 技 术 的 难 点 在 于 如 何 设 计 多 位 点 共 扩 增 的 引 物 与 条 件, 以 保 证 全 部 位 点 都 能 得 到 有 效 扩 增, 避 免 假 阴 性 或 假 阳 性 出 现 ( 图 8-6) 二 基 本 方 法 ( ) 材 料 与 试 剂 准 备 1. 材 料 : 热 if 昌 环 仪 电 泳 设 备 2. 试 剂 : PCR 试 剂 特 异 性 引 物 电 泳 试 剂 ( 二 ) 操 作 步 骤 1. 设 计 与 合 成 3' 端 特 异 的 正 常 与 突 变 型 引 物 和 内 对 照 引 物 2. 分 别 用 正 常 引 物 与 突 变 型 引 物 做 两 管 PCR 扩 增 3. 将 两 管 的 PCR 产 物 同 时 进 行 琼 脂 糖 电 泳, 观 察 结 果 4. 内 对 照 有 明 显 扩 增 的 条 件 下 判 断 结 果 参 见 其 原 理 5. 应 仔 细 观 察 结 果, 由 于 多 重 扩 增 可 能 造 成 较 强 的 非 特 异 扩 增, 影 响 到 结 果 判 断 在 一 般 情 况 下, 一 个 患 者 最 多 是 两 个 等 位 基 因 都 发 生 突 变, 如 发 现 两 个 以 上 的 可 疑 突 变 则 应 怀 疑 结 果 的 可 靠 性, 必 须 重 复 实 验 在 模 板 DNA 质 量 欠 佳 时, 可 能 出 现 上 述 现 象 或 甚 至 两 种 引 物 均 无 扩 增, 需 要 进 一 步 验 证 三 ASPCR 及 MAS-PCR 的 临 床 应 用 等 位 基 因 特 异 性 PCR 技 术 在 临 床 中 是 一 种 重 要 的 己 知 突 变 筛 查 万 法, 尤 其 是 MAS-PCR 技 术 的 出 现 使 突 变 检 测 更 加 简 便 快 速, 可 以 同 时 完 成 多 个 发 生 率 最 高 的 突 变 检 测, 节 约 了 检 测 时 间, 提 高 了 检 测 效 率 下 面 以 自 地 中 海 贫 血 基 因 诊 断 为 例 予 以 说 162

167 野 生 型 引 物 苦 LLl 4 下 TI 扩 增 NlI I I.. 阳 II i ;: 阳 iii: ~ 扩 增 正 常 片 段 Nt I 内 对 照 片 段 C 扩 增 正 常 片 段 N21 扩 增 正 常 片 段 N3 突 变 型 引 物 扩 增 ~ I I I.. I I I s iii: Ml M2 M3 咽 ILl ~JIJ 扩 增 突 变 片 段 Mt I 内 对 照 片 段 C 无 扩 增 扩 增 突 变 片 段 M3 正 常 组 突 变 组 C C Nl Ml N2 N3 盼 结 论 : M1/M3 的 基 因 突 变 图 8-6 MAS- per 检 测 突 变 原 理 示 意 明 ( ) 目 地 中 海 贫 血 的 基 本 II 自 床 表 现 与 类 型 自 地 中 海 贫 血 根 据 其 临 床 表 现 一 般 分 为 轻 中 重 三 型 轻 型 自 地 中 海 贫 血 无 任 何 临 床. 163.

168 症 状, 实 验 室 检 查 才 能 确 诊 尽 管 如 此, 如 两 个 轻 型 自 地 中 海 贫 血 个 体 娼 配, 有 1 / 斗 的 后 代 可 能 发 生 重 型 自 地 中 海 贫 血, 因 此 个 体 轻 型 自 地 中 海 贫 血 的 筛 查 对 于 防 止 重 型 患 儿 出 生 有 重 要 的 意 义 中 间 型 自 地 中 海 贫 血 临 床 症 状 较 轻, 无 特 殊 面 容 等 特 征 性 表 现, 但 可 见 脾 脏 肿 大 重 型 自 地 中 海 贫 血 有 进 行 性 加 重 的 贫 血 肝 脾 肿 大, 特 殊 的 地 中 海 面 容 及 骨 陆 异 常 改 变 等 典 型 表 现 ( 二 ) 目 地 中 海 贫 血 的 发 病 机 制 自 地 中 海 贫 血 的 发 生 主 要 是 自 珠 蛋 白 链 合 成 受 到 异 常 抑 制, 使 α 链 与 日 链 在 数 量 上 失 去 平 衡, 形 成 α 包 涵 体, 一 万 面 使 红 细 胞 膜 通 透 性 增 加, 加 速 发 生 溶 血 而 降 低 了 红 细 胞 的 寿 命 ; 另 一 万 面 α 包 涵 体 附 着 在 未 成 熟 的 红 细 胞 膜 上, 使 其 容 易 被 破 坏 而 抑 制 了 红 细 胞 的 成 熟 在 这 种 情 况 下, γ 珠 蛋 白 链 代 偿 性 增 加, 血 红 蛋 白 F 的 含 量 增 加 HbF 对 氧 的 亲 和 力 较 大, 在 组 织 中 不 易 释 放 氧, 造 成 组 织 缺 氧 和 红 细 胞 生 成 素 大 量 分 泌, 引 起 骨 酷 的 异 常 改 变 同 时, 贫 血 导 致 机 体 对 铁 的 吸 收 增 加, 铁 大 量 沉 积 于 各 主 要 的 实 质 性 器 官, 引 起 实 质 性 器 官 功 能 障 碍 ( 三 ) 目 地 中 海 贫 血 的 分 喜 病 理 每 个 正 常 个 体 有 两 个 自 珠 蛋 白 基 因, 当 其 中 一 个 或 两 个 基 因 发 生 异 常 时, 可 导 致 三 种 后 果 : 自 珠 蛋 白 合 成 的 完 全 停 止 或 严 重 下 降, 形 成 重 型 自 地 中 海 贫 血 ; 自 珠 蛋 白 合 成 下 降, 成 为 中 型 自 地 中 海 贫 血 ; 自 珠 蛋 白 合 成 轻 微 下 降, 临 床 表 现 不 明 显, 属 轻 型 自 地 中 海 贫 血 自 珠 蛋 白 基 因 的 异 常 主 要 由 不 同 类 型 的 基 因 突 变 引 起 经 过 长 期 的 分 于 流 行 病 学 调 查 发 现, 基 因 突 变 有 130 余 种, 其 中 在 我 国 发 现 近 30 种, 并 且 确 认 自 地 中 海 贫 血 基 因 突 变 类 型 与 分 布 有 明 显 的 种 族 和 地 域 差 异 在 我 国, 目 前 己 确 定 6 种 最 常 见 的 突 变 类 型, 约 占 我 国 目 地 中 海 贫 血 的 90% 以 上, 它 们 是 CD41~42 (-4bp) IVS~2 日 t.654 (C~T) CD17 (A~T) nt (A ~ G) CD71 ~72 (+ A) HbEa ( 四 ) 目 地 中 海 贫 血 的 基 因 诊 断 1. 基 本 原 理 采 用 MAS- PCR 技 术 对 5 种 最 常 见 的 基 因 突 变 同 时 进 行 筛 查 上 游 的 4 个 突 变 位 点 每 个 设 计 合 成 3 条 寻 物, 其 中 上 游 引 物 是 共 同 的, 下 游 引 物 分 为 正 常 引 物 与 突 变 引 物 ; 4 个 位 点 上 游 引 物 是 一 致 的, 以 保 证 4 个 位 点 的 扩 增 产 物 片 段 大 小 有 差 异, 在 琼 脂 糖 电 泳 时 可 以 万 便 分 离 ; 第 5 个 突 变 位 点 下 游 引 物 与 前 4 个 位 点 上 游 引 物 可 扩 增 一 条 最 大 的 内 对 照 片 段 ( 图 8-6) 利 用 PCR - RFLP 技 术 对 HbE 的 突 变 进 行 检 测, 通 过 对 突 变 点 区 域 的 PCR 扩 增, 获 得 大 量 含 突 变 点 的 靶 片 段, 利 用 限 制 酶 MnII 酶 切 PCR 产 物, 可 以 看 到 纯 合 正 常 等 位 基 因 有 3 个 酶 切 片 段, 而 纯 合 突 变 基 因 只 有 两 个 片 段, 突 变 杂 合 于 有 4 个 片 段 2. 材 料 与 试 剂 准 备 (1) 材 料 : 热 f 盾 环 仪 电 泳 设 备 ; (2) 试 剂 : PCR 试 剂 5 个 位 点 正 常 扩 增 引 物 与 各 自 的 突 变 寻 物 HbE 检 测 引 物 限 制 酶 Mn II PCR 产 物 回 收 试 剂 ( 表 8-10) 3. 操 作 步 骤 (1) 抽 取 患 者 外 周 血 5 mi, ACD 抗 J 疑, 盐 析 法 提 取 基 因 组 DNA; 164

169 (2) 用 5 对 正 常 引 物 对 自 珠 蛋 白 基 因 包 含 5 个 突 变 点 的 区 域 进 行 多 重 PCR 扩 增 ; (3) 用 5 对 突 变 引 物 对 自 珠 蛋 白 基 因 包 含 5 个 突 变 点 的 区 域 进 行 多 重 PCR 扩 增 ; (4) 琼 脂 糖 电 泳 检 测 PCR 产 物, 每 个 位 点 的 正 常 引 物 与 突 变 引 物 的 PCR 产 物 作 为 一 组 进 行 比 较 ; (5) 结 果 判 断 就 某 一 位 点 而 言, 正 常 寻 物 与 突 变 引 物 均 有 扩 增 可 判 断 为 突 变 杂 合 于, 仅 有 正 常 寻 物 扩 增 为 野 生 纯 合 于, 仅 有 突 变 引 物 扩 增 为 突 变 纯 合 于 ( 如 图 8-6); 表 8-10 日 地 中 海 贫 血 MAs-peR 引 物 表 突 变 类 型 引 物 序 列 (5' - 3') 扩 增 片 段 长 度 (bp) 且 t. -28 (A~G) C1 GTACGGCTGTCATCACTTAGACCT 121 CA N CATGGCTCTGCCCTGACTTT CD1 7 (A~T) f('!1 G 也 T ~ 毛 f ' 轩 丑 平 毛 主 {\;f 干 豆 GACCT 250 CA N ACTTCATCCACGTTCACCTT CD41~42 (-4bp) f('!1 A 旺 酶 也 E 钟 前 <ex 聆 主 恬 ~GACCT 463 CA N GAGTGGACAGATCCCCAAAGGACT CD71 ~72 (+ A) CAA~ 乎 A GTACGGCTGTCATCACTTAGACCT- 543 CA M GAGTGGACAGATCCCCAAAGGACT CAA 丙 C1GGTGAGCCAGGCCATCACTA IVS - 2nt. 654 (C~ T) 性 且 J:Rj 战 铛 Y 主 电 面 咽 气 白 白 吧 'AG 177 N M TGATAATTTCTGGGTTAAGGC AGTGATAATTTCTGGGTTCAGGT HbE 公 C3 GACTCCTGAGGAGAAGTCTGC C4 GGCCATCACTAAAGGCACCG 345 长 正 常 产 物 有 两 个 MnII 的 限 制 性 位 点, 酶 切 片 段 长 度 60bp+ 171bp+ 114bp; 突 变 产 物 只 有 一 个 MnII 的 限 制 性 位 点, 231bp+ 114bp (6) 用 HbE 的 引 物 扩 增 突 变 位 点 区 域 ; (7) 回 收 PCR 纯 化 产 物 或 直 接 用 于 MnII 酶 切 ; (8) 酶 切 产 物 琼 脂 糖 电 泳 确 定 酶 切 片 段 数 量 4. 注 意 事 项 应 注 意 的 是, 突 变 的 纯 合 于 并 不 代 表 两 个 突 变 是 发 生 在 同 一 位 点, 在 大 部 分 严 重 自 地 中 海 贫 血 患 者 的 检 测 中, 两 个 突 变 的 等 位 基 因 突 变 的 位 点 是 不 同 的 另 外, 一 个 患 者 同 时 检 出 三 个 突 变 的 可 能 性 很 小, 如 检 出 三 个 突 变 应 重 复 验 证, 以 排 除 实 验 误 差 严 重 自 地 中 海 贫 血 患 者 较 多 从 双 亲 处 获 得 一 个 或 两 个 突 变 的 等 位 基 因, 即 双 亲 之 一 或 两 人 都 是 自 地 中 海 贫 血 致 病 基 因 的 携 带 者, 因 此 为 获 得 更 确 切 的 实 验 诊 断 结 果, 尤 其 是 进 行 产 前 诊 断 时, 最 好 将 患 者 与 双 亲 一 起 进 行 检 测, 通 过 比 较 判 断 结 果 四 AspeR 技 术 的 优 点 与 应 用 局 限 ASPCR 技 术 与 PCR - RFLP 技 术 类 似, 在 己 知 基 因 突 变 检 测 中 有 较 好 的 应 用, 并 165.

170 体 现 出 简 便 快 速 经 济 安 全 等 优 势 尤 其 是 MAS-PCR 技 术 解 决 了 多 突 变 位 点 同 时 检 测 的 问 题, 节 约 了 检 测 时 间, 提 高 了 检 测 效 率, 保 持 了 检 测 的 可 靠 性 但 应 该 看 到, 该 技 术 使 用 时 引 物 设 计 优 劣 与 实 验 结 果 密 切 相 关, 一 万 面 各 条 引 物 之 间 碱 基 序 列 的 相 容 性 要 好, 另 一 万 面 应 尽 量 避 免 寻 物 延 伸 的 容 错 性 对 PCR 扩 增 可 能 带 来 的 影 响, 防 止 假 性 结 果 出 现 ; 而 这 项 工 作 使 一 般 检 测 机 构 难 以 完 成 的, 因 此 也 限 制 了 该 技 术 的 应 用 另 外 该 技 术 难 以 在 全 自 动 仪 器 上 一 步 完 成, 造 成 了 质 量 控 制 的 困 难 第 七 节 突 变 引 物 延 伸 扩 增 检 测 突 变 技 术 突 变 引 物 延 伸 扩 增 技 术 是 又 一 种 检 测 己 知 基 因 突 变 的 万 法, 与 ASPCR 技 术 相 比 较 略 有 不 同, 它 是 在 一 个 PCR 反 应 中 直 接 判 断 杂 合 于 与 纯 合 于 状 态 该 技 术 目 前 在 临 床 应 用 并 不 多, 下 面 简 要 介 绍 其 原 理 在 一 个 PCR 反 应 体 系 中, 用 一 对 正 常 序 列 引 物 扩 增 己 生 日 突 变 区 域, 同 时 在 体 系 中 还 有 一 条 突 变 引 物 位 于 两 条 正 常 序 列 引 物 内 侧, 可 与 突 变 模 板 完 全 互 补 当 模 板 DNA 不 含 突 变 时, 内 侧 突 变 引 物 不 能 与 模 板 互 补 退 火, PCR 仅 能 扩 增 出 一 条 长 的 正 常 片 段 ; 当 全 部 模 板 DNA 都 含 有 突 变 时, 突 变 引 物 与 模 板 退 火, 同 时 阻 碍 了 正 常 序 列 寻 物 的 扩 增, PCR 扩 增 出 一 条 短 的 片 段 ; 当 正 常 模 板 与 突 变 模 板 共 存 时, PCR 则 既 能 扩 增 出 长 片 段, 也 能 获 得 突 变 引 物 引 导 的 短 片 段, 从 而 直 接 通 过 一 次 PCR 反 应 区 分 出 野 生 纯 合 于 突 变 杂 合 于 与 突 变 纯 合 于 ( 图 8-7) 野 生 型 模 板 P2 2 二 突 变 型 模 板 叶, P2 山 r:r: r::i;""l: 口 E Pl PM Pl PM 野 It 纯 突 变 亲 突 变 纯 合 子 舍 子 AU 于 图 8-7 突 变 引 物 延 伸 扩 增 技 术 原 理 示 意 第 八 节 聚 合 酶 链 反 应 斑 点 杂 交 突 变 技 术 聚 合 酶 链 反 应 斑 点 杂 交 是 一 种 出 现 较 早, 且 现 在 仍 在 临 床 上 广 泛 使 用 的 己 知 突 变 检 测 技 术 由 于 该 技 术 将 PCR 技 术 的 高 灵 敏 度 与 核 酸 杂 交 检 测 的 高 特 异 性 相 结 合, 被 认 为 是 除 测 序 外 最 为 准 确 可 靠 的 突 变 检 测 手 段 之 一 166

171 基 本 原 理 目 前 聚 合 酶 链 反 应 斑 点 杂 交 技 术 有 两 种 基 本 万 法, 即 PCR 结 合 寡 核 昔 酸 探 针 斑 点 杂 交 (PCR - ASO) 与 PCR 反 向 斑 点 杂 交 (PCR - RDB), 以 PCR-RDB 使 用 较 多 PCR-ASO 的 基 本 原 理 是 针 对 一 个 基 因 突 变 位 点 设 计 合 成 两 条 覆 盖 突 变 点 的 寡 核 昔 酸 探 针, 其 中 一 条 正 常 野 生 型 探 针 与 正 常 等 位 基 因 发 生 稳 定 的 杂 交 反 应 ; 另 一 条 突 变 型 探 针 只 与 突 变 等 位 基 因 发 生 杂 交 反 应, 形 成 牢 固 的 杂 交 体 针 对 这 个 突 变 点 设 计 合 成 一 对 特 异 性 寻 物, 对 突 变 区 域 进 行 PCR 扩 增, 从 而 获 得 大 量 可 能 含 突 变 点 的 PCR 产 物 将 PCR 产 物 变 性 后 固 定 在 小 孔 径 硝 酸 纤 维 素 膜 或 尼 龙 膜 上, 然 后 用 放 射 性 核 素 或 非 放 射 性 核 素 标 记 的 探 针 对 其 进 行 杂 交 通 过 洗 膜, 在 一 定 条 件 下 可 以 去 掉 未 杂 交 探 针 和 不 完 全 杂 交 探 针, 最 后 通 过 对 杂 交 信 号 的 检 测 如 放 射 性 核 素 放 射 自 显 影 化 学 发 光 或 显 色 反 应 等, 对 突 变 情 况 进 行 检 测 如 与 正 常 野 生 型 探 针 和 突 变 型 探 针 杂 交 均 有 杂 交 信 号, 提 示 系 该 突 变 的 杂 合 于 ; 如 仅 有 正 常 探 针 杂 交 信 号, 则 为 该 位 点 的 野 生 型 纯 合 于 ; 如 仅 有 突 变 型 探 针 杂 交 信 号, 则 为 同 一 突 变 纯 合 于 ; 上 述 结 论 均 不 能 排 除 其 他 突 变 尽 管 PCR-ASO 技 术 万 法 灵 敏 可 靠 快 速, 但 一 次 只 能 检 测 一 个 突 变 ; 因 此, 如 要 检 测 多 个 突 变, 必 须 重 复 杂 交 实 验 多 次 才 能 确 定 一 个 未 知 标 本 的 基 因 型 我 们 知 道, 一 种 遗 传 病 致 病 基 因 往 往 不 只 涉 及 一 个 突 变 点, 而 是 有 较 多 的 突 变 共 同 组 成 其 突 变 谱, 在 这 种 情 况 下, PCR-ASO 技 术 己 不 完 全 适 合 于 多 突 变 可 能 性 的 检 测 1989 年, Saiki 等 根 据 上 述 问 题 提 出 了 PCR 反 向 斑 点 杂 交 技 术 PCR- RDB 是 根 据 待 检 基 因 的 突 变 i 晋 设 计 合 成 一 系 列 己 知 突 变 的 ASO 探 针, 并 将 其 固 定 于 杂 交 膜 上 该 技 术 将 可 能 的 突 变 杂 交 探 针 均 固 定 在 一 张 膜 上, 而 将 正 常 野 生 型 探 针 固 定 在 另 一 张 杂 交 膜 上, 然 后 用 标 i 己 的 PCR 产 物 进 行 杂 交 反 应, 根 据 多 种 探 针 正 常 野 生 型 与 突 变 型 杂 交 信 号, 可 以 一 次 杂 交 检 测 完 成 多 个 突 变 点 的 筛 查 由 于 PCR- RDB 是 将 探 针 固 定 在 杂 交 膜 上, 然 后 用 PCR 产 物 进 行 杂 交, 与 ASO 技 术 万 法 相 反, 因 此 称 为 反 向 杂 交 PCR-RDB 技 术 突 变 检 测 原 理 与 基 因 芯 片 检 测 相 似, 参 看 图 二 基 本 方 法 ( ) 材 料 与 试 剂 准 备 1. 材 料 热 帽 环 仪 紫 外 交 联 仪 杂 交 膜 杂 交 信 号 检 测 仪 恒 温 箱 2. 试 剂 PCR 试 剂 杂 交 探 针 杂 交 缓 冲 液 洗 涤 液 ( 二 ) 操 作 步 骤 1. PCR - ASO 技 术 (1) 设 计 合 成 扩 增 某 一 个 己 知 突 变 的 寻 物 ; (2) 设 计 合 成 放 射 性 核 素 或 非 放 射 性 核 素 标 记 的 野 生 型 探 针 与 突 变 探 针 ; (3) 引 物 扩 增 标 本 中 模 板 DNA; (4) 通 过 紫 外 交 联 将 变 性 后 的 PCR 产 物 固 定 到 杂 交 膜 上 ; (5) 用 两 种 探 针 分 别 杂 交 PCR 产 物, 调 整 杂 交 条 件, 使 洗 膜 时 能 将 不 完 全 杂 交 与 未 杂 交 的 探 针 洗 去 ;. 167.

172 (6) 放 射 自 显 影 或 其 他 杂 交 信 号 检 测 万 法 获 得 杂 交 结 果 ( 表 8-11) 表 8-11 PCR - ASO 技 术 杂 交 结 果 判 断 名 称 野 生 型 纯 合 子 野 生 型 探 针 杂 交 有 信 号 突 变 型 探 针 杂 交 无 信 号 突 变 杂 合 子 突 变 纯 合 子 有 信 号 无 信 号 有 信 号 有 信 号 2. PCR-DRB 技 术 (1) 设 计 合 成 扩 增 某 一 些 己 知 突 变 的 寻 物, 可 标 记 或 不 标 记 (2) 设 计 合 成 每 个 己 知 突 变 位 点 的 野 生 型 探 针 与 突 变 探 针 (3) 标 记 引 物 扩 增 这 些 突 变 位 点, 或 用 非 标 记 寻 物 掺 入 标 记 进 行 PCR 扩 增 (4) 将 探 针 固 定 在 杂 交 膜 上 固 定 的 基 本 万 法 : 一 是 利 用 探 针 3' 末 端 的 多 聚 脱 氧 胸 腺 唔 眩, 在 紫 外 线 照 射 下 可 与 杂 交 膜 上 氨 基 作 用 而 固 定 在 膜 上 ; 二 是 在 探 针 5' 末 端 用 氨 基 修 饰, 同 时 用 EDC 处 理 杂 交 膜, 使 探 针 氨 基 的 NH 2 与 膜 表 面 的 COOH 形 成 共 价 结 合 而 固 定 探 针 (5) 将 变 性 后 的 PCR 产 物 与 膜 上 探 针 进 行 杂 交 (6) 洗 去 未 杂 交 或 不 完 全 杂 交 的 PCR 产 物 等 (7) 放 射 自 显 影 或 其 他 杂 交 信 号 检 测 万 法 获 得 杂 交 结 果 单 一 突 变 的 结 果 判 断 与 PCR-ASO 丰 目 同 三 II 备 床 应 用 PCR-RDB 技 术 在 单 碱 基 突 变 的 遗 传 病, 尤 其 是 在 有 限 的 几 种 突 变 在 基 因 异 常 中 发 生 率 很 高 的 情 况 下 用 途 最 大 下 面 以 自 地 中 海 贫 血 为 例 介 绍 其 临 床 应 用 的 核 酸 材 料 ( ) 材 料 与 试 剂 准 备 1. 材 料 热 帽 环 仪 紫 外 高 联 仪 杂 交 膜 杂 交 信 号 检 测 仪 短 温 箱 2. 试 剂 PCR 试 剂 两 对 特 异 性 引 物 与 10 对 探 针 序 列 ( 表 8-12) 表 8-12 日 地 中 海 贫 血 PCR-RDB 探 针 序 歹 IJ 表 探 针 类 型 TATAnt. -29 (A-G) TATAnt. -28 (A-G) CD14-15 (+G) CD1 7 (A-T) IVS-lnt. l (G-T) IVS-lnt. 5 (G-C) 肌 1 N 肌 1 N 肌 1 N 肌 1 N M N M N 探 针 序 列 (5'- 3') CCCTGACTTTCATGCCCAG CTGGGCATAAAAGTCAGGG CCCTGACTTCTATGCCCAG CTGGGCATAAAAAGTCAGGG CTTGCCCCACCAGGGCAGT ACTGCCCTGTGGGGCAAGG CGTTCACCTAGCCCCACAG CTGTGGGGCAAGGTGAACG TGATACCAAACTGCCCAGG CCTGGGCAGGTTGGTATCA GGCAGGTTGCTATCCAAGGT ACCTTGAT ACCAACCTGCC. 168.

173 ( 续 表 8-12) 探 针 类 型 CD41-42 (-4 bp) CD43 (G- T) CD71-72 (+ A) IVS- 2nt. 654 (C- T) 引 物 序 列 l 引 物 序 列 2 M N M N M N M N Fl Rl 探 针 序 列 (5'- 3') CAGAGGTTGAGTCCTTTGG CAGAGGTTCTTTGAGTCCT CAAAGGACTAAAAGAACCT CAAAGGACTCAAAGAACCT GGTGCCTTTAAGTGATGGC GCCATCACTAAAGGCACCG A TTGCTA TTACCTTAACCC GGGTTAAGGCAATAGCAAT GTACGGCTGTCATCACTTAGACCTCA TGCAGCTTGTCACAGTGCAGCT CACT F2 GTGTACACATATTGACCAAA R2 AGCACACAGACCAGCACGTT ( 二 ) 操 作 步 骤 操 作 步 骤 基 本 同 前, 即 将 10 对 探 针 均 固 定 于 杂 交 膜 上, 利 用 引 物 1 进 行 PCR, 其 产 物 包 括 了 9 种 上 述 己 知 突 变 位 点, 寻 物 2 可 扩 增 第 10 种 突 变 点 PCR 产 物 变 性 后 杂 交, 可 同 时 检 测 10 个 己 知 的 突 变 点 的 基 因 型 四 II 备 床 应 用 优 势 与 局 限 PCR-ASO 与 PCR-RDB 技 术 的 优 势 在 于 核 酸 杂 交, 保 证 了 检 测 的 特 异 性, 结 果 非 常 可 靠 加 之 杂 交 信 号 检 测 万 法 的 日 益 增 多 和 成 熟, 对 操 作 者 存 在 较 大 危 害 的 放 射 性 核 素 己 基 本 棋 弃, 也 是 该 技 术 能 在 临 床 上 长 期 使 用 的 原 因 其 局 限 性 在 于 操 作 步 骤 略 显 复 杂, 杂 交 检 测 容 易 发 生 PCR 产 物 污 染 等 尽 管 如 此, 从 检 测 结 果 的 可 靠 性 上 看, 该 技 术 仍 具 有 不 可 替 代 的 优 势, 在 较 长 时 期 内 仍 将 作 为 临 床 基 因 突 变 筛 查 的 重 要 万 法 之 一 第 九 节 DNA 测 序 检 测 突 变 DNA 测 序 是 分 子 生 物 学 中 一 种 重 要 的 检 测 技 术, 是 确 定 己 生 日 或 未 知 基 因 突 变 最 直 接 可 靠 的 万 法 上 述 各 节 介 绍 的 所 有 万 法 的 诊 断 结 果 都 可 以 用 测 序 来 检 验 目 前 使 用 最 多 的 DNA 测 序 技 术 是 末 端 终 止 法, 其 原 理 比 较 简 单 第 一 步 是 获 得 数 量 较 多 的 DNA 测 序 模 板, 一 般 有 两 种 万 法 : 一 是 PCR 扩 增 产 物, 经 过 回 收 纯 化 直 接 作 为 测 序 模 板 ; 二 是 将 各 种 来 源 的 模 板 DNA 插 入 质 粒 等 载 体 进 行 克 隆, 分 离 纯 化 得 到 大 量 的 含 模 板 DNA 的 载 体 用 于 测 序 第 二 步 是 将 获 得 的 大 量 模 板 DNA 单 侧 引 物 和 四 种 双 脱 氧 单 核 昔 酸 和 脱 氧 核 昔 酸 用 于 测 序 反 应 该 反 应 类 似 于 PCR 反 应, 只 是 四 个 测 序 反 应 体 系 中 除 含 有 脱 氧 核 昔 酸 外, 还 分 别 加 入 了 一 种 双 脱 氧 核 昔 酸, dntp 如 和 ddatp Ejj(; dntp 和 ddttp Ejj(; dntp 和 ddctp Ejj(; dntp 和 ddgtp o 如 系 dntp 和 ddatp, 当 寻 物 延 伸 到 模 板 碱 基 T 时, 一 部 分 由 datp 连 接 上 去, 一 部 分 由 ddatp 连 169.

174 接 上 去 ; 而 后 者 无 法 再 连 接 单 核 昔 酸, 因 此 链 合 成 中 断, 其 他 链 继 续 合 成 ; 当 遇 到 下 一 个 T 时, 同 样 又 出 现 类 似 情 况 由 于 每 管 反 应 均 含 有 不 同 的 双 脱 氧 单 核 昔 酸, 因 此 四 管 反 应 将 共 同 获 得 相 互 只 差 一 个 碱 基 的 一 系 列 测 序 产 物, 通 过 电 泳, 可 以 根 据 片 段 电 泳 速 率 i 卖 出 碱 基 序 列 目 前 DNA 测 序 己 经 完 全 自 动 化, 荧 光 标 记 与 检 测 技 术 的 应 用 己 替 代 了 危 害 较 大 的 放 射 性 核 素 操 作 但 由 于 其 操 作 复 杂, 仪 器 试 剂 价 格 昂 贵, DNA 测 序 并 未 真 正 在 临 床 上 得 到 大 规 模 的 应 用 上 述 技 术 中 以 PCR - SSCP 发 现 未 知 突 变, 由 DNA 测 序 验 证 的 实 验 相 对 较 为 常 见 尽 管 如 此, DNA 测 序 作 为 基 因 突 变 的 终 极 检 测 万 法, 其 极 高 可 靠 性 和 完 全 的 确 定 性 决 定 了 它 在 基 因 突 变 检 测 中 的 核 心 地 位 随 着 自 动 化 仪 器 的 普 及 与 检 测 试 剂 价 格 的 下 降, 可 以 预 见, 在 未 来 5 年 DNA 测 序 技 术 将 在 临 床 获 得 更 多 更 广 泛 的 应 用 第 十 节 动 态 突 变 检 测 技 术 动 态 突 变 是 近 年 来 发 现 的 一 种 较 新 的 基 因 突 变 形 式 众 所 周 知, 经 典 的 基 因 突 变 一 般 主 要 指 致 病 基 因 的 单 碱 基 置 换 及 小 插 入 与 缺 失 等 情 况, 其 后 果 往 往 是 直 接 导 致 致 病 基 因 所 编 码 的 蛋 白 质 氨 基 酸 种 类 或 序 列 发 生 改 变, 通 过 影 响 其 功 能 而 发 病 这 类 突 变 系 自 然 突 变, 一 般 发 生 率 比 较 稳 定, 患 者 之 间 症 状 差 异 不 大 动 态 突 变 则 是 以 致 病 基 因 内 及 其 两 侧 序 列 中 一 些 三 核 昔 酸 重 复 序 列 重 复 次 数 异 常 增 加 为 表 现 形 式 这 些 重 复 位 点 在 传 代 的 过 程 中 呈 现 一 种 不 稳 定 的 状 况, 其 传 递 并 不 遵 帽 孟 德 尔 遗 传 万 式, 而 是 重 复 次 数 出 现 波 动 的 现 象, 这 种 波 动 一 旦 使 重 复 次 数 增 加 并 超 过 一 定 范 围 就 会 导 致 发 病 一 般 而 言, 重 复 次 数 超 过 正 常 范 围 越 多, 发 病 就 越 早, 病 情 也 越 严 重, 并 伴 随 遗 传 印 记 现 象 动 态 突 变 疾 病 是 一 类 以 致 病 基 因 及 其 两 侧 序 列 中 三 核 昔 酸 串 联 重 复 位 点 重 复 次 数 异 常 增 加 为 分 于 致 病 机 制 的 遗 传 性 疾 病 目 前, 该 类 疾 病 主 要 见 于 一 些 神 经 系 统 的 遗 传 病, 其 中 比 较 明 确 的 有 常 染 色 体 显 性 脊 髓 小 脑 性 共 济 失 调 (SCA1, 2, 3, 6, 7) 弗 里 德 赖 希 共 济 失 调 (FRDA) 亨 廷 顿 舞 蹈 征 (HD) 强 直 性 肌 营 养 不 良 (DM) 脊 髓 延 髓 性 肌 营 养 不 良 (SBMA) 脆 性 X 综 合 征 (FRAX) 等 对 动 态 突 变 疾 病 的 基 因 诊 断 是 一 个 较 新 的 领 域, 针 对 突 变 的 特 点, 目 前 主 要 有 两 种 万 法 进 行 检 测, 即 长 PCR 与 Southern 杂 交 这 里 以 强 直 性 肌 营 养 不 良 症 为 例 介 绍 动 态 突 变 疾 病 的 基 因 诊 断 一 疾 病 名 称 强 直 性 肌 营 养 不 良 (dystrophia myotoni 凶, DM; steinert disease) 0 二 疾 病 特 征 强 直 性 肌 营 养 不 良 是 一 种 多 系 统 疾 病, 可 累 及 骨 悟 月 几 ~ 心 脏 内 分 泌 系 统 及 中 枢 神 经 系 统 临 床 表 现 轻 重 不 一, 可 分 为 三 种 表 现 型, 即 轻 微 型 典 型 型 和 先 天 型 轻 微 型 以 自 内 障 和 肌 强 直 ( 收 缩 后 放 松 困 难 ) 为 特 点, 患 者 寿 命 正 常 典 型 型 DM 出 现 170

175 肌 无 力 肌 消 瘦 月 几 强 直 白 内 障 心 脏 传 导 异 常, 成 人 体 力 下 降, 寿 命 缩 短 先 天 型 DM 即 患 者 在 出 生 时 即 有 肌 张 力 减 退 严 重 普 遍 的 肌 无 力 和 智 力 发 育 迟 滞, 常 常 因 为 呼 吸 功 能 障 碍 而 早 亡 三 诊 断 与 检 测 DM 的 诊 断 通 常 以 肌 无 力 为 依 据, 基 因 诊 断 可 予 以 证 实 基 因 诊 断 主 要 是 通 过 检 测 强 直 性 肌 营 养 不 良 蛋 白 激 酶 (DMPK) 基 因 (l 9q13 ) 内 etc 重 复 次 数, 重 复 次 数 超 过 37 次 即 为 异 常 基 因 诊 断 灵 敏 度 可 达 100% 四 遗 传 咨 询 DM 是 常 染 色 体 显 性 遗 传 病, 患 病 个 体 后 代 有 50% 的 可 能 得 到 致 病 基 因 而 发 病 疾 病 相 关 的 等 位 基 因 在 配 于 形 成 中 其 三 核 昔 酸 重 复 次 数 可 能 发 生 扩 增, 这 是 某 些 个 体 发 病 早 于 其 患 病 双 亲 的 原 因 产 前 诊 断 是 可 行 的 五 基 因 诊 断 1. 先 证 者 与 前 突 变 的 基 因 诊 断 临 床 上 可 直 接 进 行 etc 重 复 次 数 分 析, 100% 的 DM 患 者 有 etc 重 复 单 位 的 扩 增 正 常 的 等 位 基 因 etc 重 复 次 数 5 次 ~37 次, 38 次 ~ 49 次 重 复 是 " 前 突 变 " 状 态 前 突 变 个 体 未 被 报 道 有 DM 的 典 型 症 状, 但 他 们 的 后 代 出 现 更 大 的 重 复 次 数 而 患 病 的 可 能 性 较 大 重 复 次 数 超 过 50 次 会 表 现 出 DM 症 状 ( 表 8 13) 表 8-13 DMPK 检 测 方 法 遗 传 机 制 患 者 比 例 检 测 方 法 DM 基 因 CTC 异 常 扩 展 100 % PCR / TP - PCR / southem blotti 吨 检 测 可 应 用 性 临 床 检 测 2. 产 前 基 因 诊 断 取 9~11 孕 周 的 绒 毛 组 织 或 16~18 孕 周 孕 妇 的 羊 水 对 有 50% 患 病 高 风 险 的 胎 儿 进 行 产 前 诊 断 必 须 注 意 检 测 结 果 若 结 果 显 示 异 DM 常 基 因 时, 不 能 根 据 etc 重 复 次 数 武 断 地 预 测 胎 儿 发 病 年 龄 和 严 重 程 度 ; 因 为 DM 先 天 型 的 etc 重 复 次 数 有 重 叠, 而 且 存 在 胎 儿 体 细 胞 有 丝 分 裂 引 起 etc 重 复 次 数 增 加 的 可 能 然 而 重 复 次 数 在 730 次 以 上 时 判 断 为 先 天 型 DM 的 把 握 性 较 大 对 低 风 险 的 胎 儿 进 行 产 前 诊 断 万 法 与 上 述 相 同,1 旦 结 果 判 断 应 更 加 谨 慎 可 以 结 合 第 6~9 个 月 的 超 声 检 查 以 判 断 有 无 胎 动 减 少 等 六 基 因 诊 断 技 术 ( ) 长 per 技 术 1. 基 本 原 理 基 本 原 理 参 见 第 二 章 基 因 体 外 扩 增 技 术 2. 基 本 万 法 (1) 材 料 : 热 f 盾 环 仪 电 泳 设 备 ; (2) 试 剂 准 备 : TthDNA 聚 合 酶 (AB!) 聚 合 酶 Vent DNA (New England Biolabs 171

176 公 司 ) 1.1 mmol ~ 1.3 mmol 的 Mg (OAC)20 (3) 特 异 性 引 物 设 计 基 本 要 求 1) 寻 物 长 度 在 20 bp~23 bp; 2) G + C 二 12 bp; 3) A+ T 二 8 bp~ l1 bp; 的 理 想 丑 二 60 'c ~68 'C; 5) 避 免 寻 物 发 夹 结 构 ; 6) 避 免 寻 物 3' 端 互 补 (4) DMPK 检 测 引 物 选 择 : DMPK 检 测 引 物 选 择 于 致 病 基 因 3 表 8-14 DM 检 测 引 物 引 物 名 称 DM.409 DM.410 DM.I0l DM.I02 DM.I0l DM.I02 引 物 序 列 GAAGGGTCCTTGTAGCCGGGAA AGAAAGAATGGTCTGTGATCCC CTTCCCAGGCCTGCAGTTTGCCCATC GAACGGGGCTCGAAGGGTCCTTGTAGC CTTCCCAGGCCTGCAGTTTGCCCATC GAACGGGGCTCGAAGGGTCCTTGTAGC (5) 10 x PCR 缓 冲 液 组 成 850 mmol KOAc; 250 mmol Tricine ph 值 8.7 ( 用 KOH 调 节 溶 液 ph 值 ) ; 体 积 分 数 为 80% 的 甘 油 ; lo %DMSO (l % ~4% 终 浓 度 ) ; 11 mmol~13 mmol Mg (OAC)20 (6) 操 作 步 骤 1) 长 PCR 反 应 体 系 设 置 : 长 PCR 反 应 体 系 设 置 参 见 表 表 8-15 长 per 反 应 体 系 组 成 名 称 Tth Vent dntp Mg (GAe), 引 物 模 板 总 体 积 浓 度 或 数 量 2 U~5 U 0.02 U 0.2 mmo! 20 pmo! ~ 40 pmo! 1. 1 mmo! ~ 1.3 mmo! 拷 贝 数 10~ 10 50μl 2) 长 PCRt 盾 环 条 件 : 长 PCRt 盾 环 条 件 参 见 表 ) 聚 丙 烯 酌 肢 I~ 是 胶 电 判 断 结 果 : 通 过 电 泳 银 染 显 色 获 得 PCR 扩 增 片 段, 利 用 合 适 的 DNA 相 对 7J 于 质 量 标 记 最 好 使 用 一 个 47 次 三 核 昔 酸 重 复 的 标 本 扩 增 作 为 对 照, 可 以 比 较 172

177 可 靠 地 确 定 片 段 长 度, 重 复 序 列 重 复 次 数 计 算 : ( 片 段 长 度 重 复 序 列 两 侧 碱 基 数 ) / 3 然 后 根 据 前 述 DMPK 基 因 正 常 重 复 范 围 和 异 常 判 断 标 准 做 出 基 因 诊 断 结 论 表 8-16 长 per 反 应 条 件 循 环 步 骤 循 环 温 度 ( C) 循 环 时 间 ( s) 预 变 性 94 10~ 15 变 性 复 性 与 延 伸 15 个 循 环 68 N 变 性 复 性 与 延 伸 15 个 循 环 68 几 f 60 s + (0.025 s/bp) x 扩 增 片 段 的 长 度 二 N, M 二 N+ 15 s 每 个 循 环 x ( 循 环 数 1) ( 二 ) Southern 杂 交 Southern 杂 交 目 前 仍 被 认 为 是 最 可 靠 的 检 测 三 核 昔 酸 异 常 扩 展 的 万 法 由 于 常 规 PCR 扩 增 的 片 段 长 度 相 对 较 小, 难 以 扩 增 出 大 量 重 复 时 的 片 段, 因 此 利 用 基 因 组 DNA 直 接 酶 切 后 Southern 杂 交 是 较 为 可 行 的 万 案 针 对 DMPK 的 检 测, 目 前 较 多 采 用 的 探 针 有 pm10m - 6 与 p25b 1. 4 两 种 其 具 体 操 作 步 骤 与 后 面 介 绍 的 Southern 杂 交 基 本 一 致 ( 二 ) TP - PCR (Triplet repeat PCR) 在 重 复 序 列 扩 增 中 发 现, 当 标 本 为 动 态 突 变 杂 合 于 时, 即 正 常 基 因 与 突 变 基 因 共 存 时, 正 常 基 因 更 容 易 得 到 扩 增, 而 异 常 扩 增 的 突 变 等 位 基 因 可 能 因 此 而 漏 检 ; 因 此,20 世 纪 90 年 代 中 期 有 作 者 提 出 一 种 新 的 检 测 万 法, 即 TP - PCR o TP - PCR 基 本 原 理 是 当 扩 增 动 态 突 变 位 点 时, 除 合 成 一 对 重 复 序 列 两 侧 的 引 物 外, 同 时 设 计 一 条 部 分 覆 盖 重 复 序 列 的 引 物, 寻 物 上 重 复 单 位 数 根 据 正 常 基 因 重 复 数 确 定, 这 样 在 PCR 反 应 中 同 时 存 在 三 条 引 物, 它 们 具 有 共 同 的 下 游 寻 物, 在 扩 增 中 由 于 含 重 复 序 列 的 寻 物 长 度 较 长, 更 容 易 扩 增 大 的 重 复 片 段, 缩 小 了 杂 合 状 态 下 的 等 位 基 因 扩 增 效 率 的 差 异 TP - PCR 技 术 对 动 态 突 变 疾 病 的 诊 断 能 取 得 较 好 的 结 果 七 II 备 床 基 因 诊 断 的 动 态 突 变 疾 病 目 前 可 进 行 临 床 基 因 诊 断 的 动 态 突 变 疾 病 见 表 表 8-17 部 分 可 进 行 基 因 诊 断 的 动 态 突 变 疾 病 疾 病 名 称 基 因 位 点 致 病 基 因 名 称 正 常 重 复 类 型 异 常 重 复 范 围 SCA1 6p23 SCA1 39~83 CAG~ 气 lil' ~36J5 ~ SCA2 12q24. 1 SCA2 34~400Q 31) CAG 1 (12 ~ SCA3 14q21 SCA3 55~86 40) SCA6 19p13. 1 ~ 13.2 CACNAIA 20~33 CAG 1 (4~ 16) SCA7 3p21. 1 ~ 12 SCA7 37~ >300 CAG 1 (4~ 19) DRPLA 12p CTG~B37 49~88 CAG 1 (3~36) FRDA 9q13~21 FRDA1 90~ GAA \l 峭 ~3 的 3~ HD 4p16.3 ITI5 >40 DM 19q13 DMPK 26) CTG 1<37 >37 173

178 ( 续 表 8-17) 疾 病 名 称 基 因 位 点 致 病 基 因 名 称 正 常 重 复 类 型 异 常 重 复 范 围 SBMA Xq (l 1~12) AR CAG / (9~34) >35 FX Xq27.3 F 肌 1Rl CGG/ (6~54) >200 ( 杨 元 ) 参 考 文 献 1 Bernard PS, Lay MJ, Wittwer CT. Integrated Amplification and Detection of the C677T Point Mutation in the Methyleneterahydrofolate Reductase Gene by Fluorescence Resonance Energy Transfer and Probe Melting Curves. Analytical Biochemistry, 1998, 255: Lay MJ, Wittwer CT. Real - time fluorescence genotyping of factor V Leiden during rapid - cy de PCR. Clinical Chemistry, 1997, 43: Schena M, Rrnu, A et a1. Microarrays: biotechnologys discovery platform for functional genomics. Tib, 1998, 16 4 Drobyshev A, Mologina N, Shik V et a1. Sequence analysis by hybridization with oligonudeotide microchip: identification of ~ - thalassemia mutation. Gene, 1997, 188: 45 5 曾 溢 涛. 遗 传 病 的 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗. 上 海 : 上 海 科 学 技 术 出 版 社, Eng B, Patterson M, Walker L, et a1. Detection of severe nondeletional alpha - thalassemia mutations using a single - tube multiplex ARMS assay. Genet Test, 2001, 5: Bravo M, Salazar R, Arends A, et a1. Detection of beta thalassemia by the technique of refracto ry amplification of mutation systems (ARMS - PCR). Invest Clin, 1999, 40: ACMG / ASHG Huntington Disease Genetic Testing Working Group Laboratory guidelines for Huntington disease genetic testing. Am J Hum Genet, 1998, 62: MacMillan JC, Davies P, Harper PS Molecular diagnostic analysis for Huntington' s disease: a prospective evaluation. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 1995, 58: Warner]. P. A General method for the detection of large CAG repeat expansions by PCR J Med Genet, 1996, 33: 1022 第 十 一 节 变 性 梯 度 凝 胶 电 泳 一 变 性 梯 度 凝 胶 电 泳 原 理 变 性 梯 度 凝 胶 电 泳 (denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) 的 原 理 : 碱 基 组 成 不 同 的 DNA 片 段 具 有 不 同 的 解 链 温 度 ( Tm ), 如 G, C 含 量 高 的 区 域 的 Tm 值 就 高, 而 相 邻 碱 基 间 的 堆 积 力 则 会 影 响 Tm 值 通 常 DNA 末 端 区 的 L 值 低, 称 作 低 温 解 链 区 (lower melting domain) ; 如 果 DNA 末 端 解 开, 那 么 其 余 的 未 解 链 部 分 就 维 持 DNA 双 螺 旋 结 构, 这 一 区 域 便 称 作 高 温 解 链 区 (high melting domai 日 ) 用 不 同 浓 度 的 化 学 变 性 剂, 如 体 积 分 数 为 0% -40% 的 甲 醒 溶 液 E\l(; 量 浓 度 (c) 为 o mol/ L~ 7 mo l/ L 的 尿 素 处 理 DNA 双 螺 旋 分 于, DNA 7J 于 就 会 解 链 Tm 值 低 的 DNA 片 段 在 低 浓 度 的 化 学 变 性 剂 处 理 下 会 174

179 发 生 解 链, 形 成 分 支 状 分 于, 随 着 变 性 剂 浓 度 的 增 加, Tm 值 高 的 区 域 也 会 逐 渐 熔 解 为 单 链 分 子 DNA 分 于 一 旦 解 链, 其 在 I~ 是 胶 中 的 电 泳 速 度 将 会 显 著 下 降 即 使 只 有 一 个 碱 基 之 差 的 DNA 片 段 也 会 有 不 同 的 Tm 值, 因 此 野 生 型 和 突 变 型 的 双 链 DNA 片 段 在 含 有 变 ' 生 剂 梯 度 的 聚 丙 烯 酌 肢 凝 胶 进 行 电 泳, 就 会 显 示 不 同 的 泳 动 率, 从 而 将 二 者 分 开 二 DGGE 突 变 检 测 应 注 意 的 问 题 1. DNA 片 段 的 大 小 200 bp ~ 700 bp 的 DNA 片 段 可 得 到 有 效 的 检 测 如 要 分 析 更 长 的 片 段, 应 该 进 行 数 次 PCR 扩 增, 然 后 分 别 对 扩 增 的 片 段 进 行 分 析 2. 梯 度 胶 的 制 备 一 般 先 准 备 一 个 不 含 变 性 剂 的 溶 液 和 一 个 浓 度 为 100% 的 变 性 剂 溶 液, 后 者 包 含 量 浓 度 为 7 ma l/ L 的 尿 素 和 质 量 浓 度 为 40% 的 甲 酌 肢, 然 后 通 过 梯 度 胶 制 备 仪 混 合 制 备 线 形 梯 度 I~ 是 胶 如 制 备 12.5 ml 的 变 性 梯 度 胶, 可 参 考 表 表 8-18 不 同 浓 度 梯 度 胶 制 备 各 组 分 浓 度 % 0% 变 性 剂 100% 变 性 剂 变 性 剂 材 料 (ml) 材 料 (ml) 20% % % % 为 了 提 高 DGGE 的 突 变 检 出 率, 可 将 一 段 长 为 30 bp ~ 50 bp, 富 含 GC 的 DNA ( 称 为 "GC 夹 ", GC clamp) 附 加 到 双 链 的 一 端 以 形 成 一 个 人 工 高 温 解 链 区 这 样, 片 段 的 其 他 部 分 就 处 在 低 温 解 链 区, 从 而 可 以 对 其 进 分 析 这 一 技 术 使 DGGE 法 对 突 变 的 检 测 率 大 大 增 加 三 DGGE 在 临 床 上 的 应 用 DGGE 技 术 除 了 用 于 癌 症 和 遗 传 病 的 筛 查 及 诊 断 外, 在 癌 症 ( 残 存 性 病 灶 突 变 图 语 研 究 等 ) 突 变 定 量 实 验 中 还 用 以 检 测 少 数 突 变 等 位 基 因 DGGE 新 近 的 主 要 应 用 见 表 表 8-19 DGGE 可 用 于 诊 断 的 疾 病 基 因 疾 病 方 法 研 究 者 线 粒 体 DNA 筛 查 Yoon 等 1991 年 因 子 VIII 基 因 血 友 病 A 筛 查 Higuchi 等 1991 年 APC FAP 筛 查 Fodde 等 1992 年 CFTR 胆 囊 纤 维 化 筛 查 Ferec 等 1992 年 PAH 苯 丙 酬 尿 症 筛 查 Guldberg 等 1993 年 c- Kiras 密 码 子 12 ( 鼠 ) 定 量 Sa man 和 Wogan1993 年 p53 急 性 白 血 病 筛 查 Pignon 等 1994 年 自 血 红 蛋 白 基 因 自 地 中 海 贫 血 诊 断 Dozy 和 Kan1994 年 RBI 成 人 视 网 膜 细 胞 瘤 筛 查 Blanquet 等 1995 年 175

180 四 DGGE 的 { 尤 缺 点 DGGE 的 优 点 :1 几 乎 可 以 检 出 所 有 突 变 点,2 可 将 突 变 分 于 完 好 无 损 地 同 野 生 型 分 子 分 开 用 于 进 一 步 的 分 析,3 无 需 标 记,4 可 用 于 未 经 扩 增 的 基 因 组 DNA 的 检 测,5 可 检 测 出 如 甲 基 化 之 类 的 DNA 修 饰 i 亥 万 法 的 缺 点 :1 需 要 专 门 的 设 备 制 备 变 性 梯 度,2 需 要 " GC 夹 板 ",3 无 法 确 定 突 变 在 DNA 片 段 中 位 置,4 需 要 用 含 有 毒 性 物 质 甲 酌 肢 的 梯 度 凝 胶,5 DNA 片 段 大 小 限 制 在 100 bp~500 bpo 第 十 二 节 异 源 双 链 分 析 一 异 源 双 链 分 析 原 理 异 源 双 链 分 析 (heteroduplex analysis, HA) 原 理 : 异 源 双 链 DNA 分 于 中 有 一 错 配 的 碱 基, 该 错 配 或 未 配 对 碱 基 使 DNA 双 链 发 生 曲 折 产 生 泡 状 结 构 或 突 起 ( 图 8-8) 这 种 具 有 异 常 构 象 的 DNA 在 非 变 性 凝 胶 中 电 泳 时, 比 同 源 双 链 DNA 分 于 移 动 得 慢, 从 而 将 突 变 检 出 正 常 突 变 体 曾 追 火 / 气 \/ /\ \~ 沪 扩 \ 图 8-8 异 源 双 链 分 析 法 的 原 理 示 意 HA 技 术 进 行 突 变 检 测 应 注 意 的 问 题 1. 凝 胶 的 选 择 不 同 凝 胶 的 分 辨 率 和 可 重 复 性 不 同 通 常 选 用 聚 丙 烯 酌 肢, 但 也. 176.

181 可 选 用 hydrolink D500 凝 胶 ( 一 种 丙 烯 酌 肢 衍 生 物 ) 和 hydrolink MDE ; 疑 胶 ( 突 变 检 测 增 强 凝 胶 ) 2. 制 I~ 是 胶 溶 液 的 选 择 Ganguly 等 建 议 使 用 含 体 积 分 数 为 10% 乙 二 醇 和 15% 甲 酌 肢 的 Tris 或 者 用 牛 磺 酸 缓 冲 液 体 积 质 量 分 数 为 6% 的 聚 丙 烯 酌 肢 凝 胶, 并 且 用 Bis 赈 臻 (BAP) 和 赈 臻 双 丙 烯 酌 肢 (PDA) 作 交 联 剂 (BAP 和 PDA 可 增 加 凝 胶 强 度, 增 加 胶 孔 尺 寸 ) 这 项 技 术 也 称 作 构 象 敏 感 凝 胶 电 泳 (co 日 formatio 日 sensitive gel electrophoresis, CSGE)o 3. 检 测 分 析 前 形 成 异 源 双 链 如 果 要 分 析 的 等 位 基 因 不 是 杂 合 状 态, 那 么 纯 合 的 突 变 等 位 基 因 就 要 与 野 生 型 的 纯 合 基 因 相 混 合, 以 便 在 检 测 分 析 之 前 形 成 异 源 双 链 三 HA 的 优 缺 点 1. 优 点 HA 万 法 简 便 步 骤 少, 无 需 复 杂 的 理 论, 无 特 殊 设 备 要 求, 突 变 条 带 与 野 生 型 条 带 分 离 后 易 于 进 行 其 他 分 析, 有 无 需 标 记 万 法 可 供 使 用, 结 SSCP 合 技 术 可 以 检 出 近 100% 的 突 变 2. 缺 点 突 变 的 位 置 未 知, 分 析 的 片 段 大 小 可 能 受 限, 依 赖 于 实 验 条 件, 可 能 会 漏 检 突 变, 较 少 用 于 序 列 未 知 的 DNA, 如 要 检 测 杂 合 于 必 须 先 形 成 异 源 双 链 分 于, 电 泳 结 果 可 能 会 难 以 解 释 四 主 要 应 用 缺 失 突 变 比 单 碱 基 改 变 易 于 检 测 (White 等 1992 年 ; Boyd 等 1993 年 ), 因 此, 具 有 高 比 例 小 规 模 缺 失 的 疾 病 最 适 于 用 此 万 法 进 行 检 测 主 要 的 应 用 如 表 8-20 所 示 表 8-20 异 源 双 链 分 析 (HA) 可 用 于 诊 断 的 疾 病 基 因 应 用 类 型 i 疑 胶 基 质 / 染 色 方 法 研 究 者 HLA 指 纹 法, 骨 髓 供 者 PAGE / E 视 紫 红 质 基 因 突 变 筛 查 hydroli 巳 k D5000, E Clay 等 1991 KIT 结 合 SSCA 进 行 突 变 筛 查 hydrolink D5000, A Inglehear 等 1992 NFl 突 变 筛 查 多 个 缺 失 hydroli 巳 k D5000, E Spritz 等 1992 ATIA 突 变 筛 查 hydroli 巳 k, E Shen 等 1993 HIVENV 遗 传 关 系 PAGE, E Chowchury 等 1993 COL 2Al VNTR 等 位 基 因 的 异 质 性 PAGE, E Delwart 等 1993 COL 7Al 突 变 筛 查 多 个 缺 失 hydroli 巳 k Wilkin 等 1993 APC 突 变 筛 查 多 个 缺 失 肌 1DE, E Christiano 等 1994 T 细 胞 受 体 γ T 细 胞 克 隆 性 检 测 DAGE, A Mandl 等 1994 PAGE, E Bottaro 等 1994 第 十 二 节 蛋 白 质 截 短 试 验 随 着 分 于 遗 传 学 的 发 展, 越 来 越 多 的 新 技 术 新 万 法 可 用 于 致 病 基 因 及 致 病 位 点 的 筛 查, 如 SSCP, HA, DGGE 等 这 些 万 法 通 过 识 别 单 链 或 双 链 DNA 的 构 象 而 检 测 177

182 DNA 的 碱 基 变 异 包 括 位 于 基 因 内 含 于 中 的 多 态 位 点, 外 显 于 中 的 同 义 错 义 以 及 无 义 突 变 近 10 年 来, 一 种 新 的 专 门 用 于 检 测 导 致 蛋 白 质 翻 译 提 前 终 止 的 无 义 突 变 技 术 蛋 白 质 截 短 试 验 (protein truncation test, PTT) 被 发 展 起 来 并 得 到 广 泛 应 用 PTT 试 验 所 检 测 的 突 变 包 括 无 义 突 变, 引 起 开 放 阅 读 框 (ORF) 提 前 终 止 的 碱 基 插 入 缺 失 等 变 异 一 PTT 试 验 的 原 理 PTT 试 验 是 应 用 体 外 蛋 白 质 从 头 合 成 技 术, 检 测 基 因 编 码 区 域 内 是 否 存 在 引 起 蛋 白 质 翻 译 提 前 终 止 的 突 变 PTT 试 验 总 体 上 可 概 括 为 三 步 :1 分 离 基 因 组 DNA, 应 用 PCR 技 术 扩 增 靶 基 因 的 编 码 序 列 或 直 接 分 离 RNA, 同 时 用 RT-PCR 技 术 扩 增 靶 基 因 ; 2 以 上 述 PCR 产 物 为 模 板, 经 体 外 转 录 合 成 mrna, 并 以 此 mrna 指 导 蛋 白 质 的 合 成 ;3 应 用 SDS- PAGE 技 术 检 测 体 外 合 成 的 蛋 白 质 二 PTT 试 验 中 的 引 物 设 计 因 为 PTT 试 验 的 核 心 是 要 检 测 体 外 翻 译 生 成 的 蛋 白 质, 所 以 用 于 PTT 试 验 的 引 物 就 具 有 十 分 重 要 的 意 义 它 不 仅 特 异 地 扩 增 靶 基 因, 还 要 行 使 体 外 转 录 与 翻 译 的 功 能, 因 此 PTT 引 物 应 包 括 3 个 特 异 的 区 域 :1 5'~ 自 指 导 RNA 转 录 的 T7, SP6 E!JG T3 等 启 动 于 序 列,2 真 核 细 胞 蛋 白 质 的 翻 译 启 始 序 列,3 3'~ 白 的 特 异 扩 增 靶 基 因 的 序 列 为 了 便 于 PCR 产 物 的 克 隆, 还 常 常 在 引 物 5' 端 寻 入 限 制 性 内 切 酶 的 识 别 序 列 ( 表 8-2 1) 表 8-21 PTT 试 验 的 引 物 设 计 限 制 住 点 次 序 Bacteriophage Promoter TAATACG~( 肿 't'}{~at Spacer Eukaryotic Translation Initiatio 巳 Sequence Target Sequence AGGG GGATCC AG CCACC ATG NNN NNN NNN NN TAATACGACTCACTAT GGATCC AG AA CCACC ATG G NNN NNN AGGG GGATCC CAG CCACC ATG NNN NNN NNN TAATACGACTCACTAT nn 巳 AACAG CCACC ATG G NN NNN NNN ιιc AATACGACTCACTATAGG 在 PTT 引 物 设 计 中 应 注 意 :1 正 向 寻 物 中 的 翻 译 启 始 密 码 于 ATG 一 定 要 处 于 靶 基 因 编 码 序 列 的 开 放 读 框 中, 否 则 蛋 白 质 的 体 外 翻 译 将 从 编 码 序 列 内 部 的 第 一 个 AUG 起 始, 结 果 人 为 造 成 蛋 白 质 截 短 ;2 反 向 引 物 应 距 离 开 放 读 框 远 一 些 ;3 正 向 引 物 应 设 计 在 标 记 氨 基 酸 掺 入 的 密 码 于 区 域 三 PTT 试 验 结 果 的 检 测 1. 突 变 检 测 在 PCR E!JG RT-PCR 检 测 后, 一 定 要 先 用 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 析 扩 增 产 物 的 产 量 及 大 小 通 常 10 mg/l~40 mg/l ILl 的 PCR 产 物 就 足 以 进 行 PTT 检 测 ; 如 扩 增 产 物 大 小 出 现 异 常, 表 明 基 因 中 存 在 剪 接 位 点 变 异 或 部 分 缺 失 或 部 分 扩 增 2. 蛋 白 质 检 测 PTT 试 验 中 常 用 放 射 自 显 影 或 非 放 射 性 检 测 技 术 鉴 定 蛋 白 质 产 178.

183 物 在 体 外 翻 译 过 程 中, 常 用 35 S 标 记 的 蛋 氨 酸 半 肮 氨 酸 以 及 3H 标 记 的 亮 氨 酸 来 标 记 蛋 白 质 产 物 在 非 放 射 性 检 测 中, 常 用 生 物 素 标 记 赖 氨 酸 无 论 那 种 检 测 技 术, 都 需 要 将 体 外 翻 译 生 成 的 蛋 白 质 进 行 SDS- PAGE 电 泳 SDS- PAGE 条 件 的 选 择 对 检 测 长 度 相 近 的 或 相 对 分 于 质 量 较 小 的 蛋 白 质 非 常 重 要, 通 常 使 用 15% 的 PAGE 可 检 测 (60~75) X 10 3 的 蛋 白 质 产 物 四 PTT 技 术 在 致 病 基 因 分 析 中 的 应 用 PTT 技 术 最 初 用 于 检 测 DMD 基 因 的 突 变 现 在, 该 技 术 己 被 广 泛 用 于 各 种 致 病 基 因 的 识 别 以 及 临 床 检 测 中, 见 表 表 8-22 PTT 技 术 应 用 于 多 种 致 病 基 因 的 识 另 IJ 以 及 临 床 检 测 疾 病 Familial Adenomatous Polyposis Hereditary desmoid disease A taxia telangiectasia Hereditary breast and ovaria 巳 cancer Cystic Fibrosis duchenne muscular Dystrophy emery - dreifus muscular dystrorhy Fanconi a 巳 aemla Hunter Syndrome % Truncating 肌 1utations 长 安 95% 100 % 90% 90% 90% 15 % 95% 80% 80% ~50% ~80% 基 因 APC APC ATM BRCAL BRCA2 CFTR DMD EMD FAA IDS HMSH2 Hereditary no 且 polyposis ~70% HMLH1 colorectal cancer 50% NFl Neurofibromatosis type1 Neurofibromatosis type2 PolycysticKidney Disease Rubinstein - Taybi Syndrome 65% 95% 10% NF2 PKD1 RTS ( 苏 智 广 ) 第 十 四 节 变 性 高 效 液 相 层 析 随 着 人 类 基 因 组 测 序 的 完 成, 研 究 与 遗 传 表 型 相 关 的 DNA 序 列 变 异 是 遗 传 学 研 究 的 一 个 主 题 人 类 基 因 序 列 的 变 异 大 多 数 是 遗 传 密 码 的 单 碱 基 变 异, 即 单 核 昔 酸 多 态 性 (single nucleotide polymorphisms, SNPs), 在 人 类 基 因 组 中 每 500 bp~ bp 中 出 现 一 次 SNP 在 不 同 人 群 中 频 率 分 布 的 差 异 性 可 能 代 表 某 一 种 族 或 人 群 间 的 遗 传 变 异, 对 它 们 的 研 究 有 助 于 解 释 个 体 的 表 型 差 异 ; 不 同 群 体 和 个 体 对 疾 病, 特 别 是 对 复 杂 疾 病 179

184 如 骨 质 疏 松 症 糖 尿 病 心 血 管 疾 病 精 神 性 紊 乱 肿 瘤 等 的 易 感 性, 对 各 种 药 物 的 耐 受 性 和 对 环 境 因 于 的 反 应 目 前, 人 类 基 因 组 计 划 产 生 了 大 量 的 遗 传 学 信 息, 分 于 遗 传 学 家 正 致 力 于 研 究 新 发 现 的 基 因 突 变 情 况 与 人 类 疾 病 的 相 关 性 以 进 一 步 理 解 人 类 遗 传 多 样 性 和 疾 病 发 生 发 展 的 分 于 机 制 ; 因 此, 发 展 高 精 度 的 快 速 自 动 化 分 于 遗 传 学 检 测 系 统 显 得 尤 其 重 要 传 统 筛 查 SNP 的 万 法 是 单 链 构 象 多 态 性 其 过 程 是 利 用 PCR 扩 增 包 含 有 SNP 的 DNA 片 段, 将 扩 增 产 物 变 性 后 在 非 变 性 的 聚 丙 烯 凝 胶 上 电 泳 其 原 理 是 变 性 产 生 的 单 链 DNA 根 据 自 身 的 序 列 形 成 特 定 的 二 级 结 构, 在 电 泳 过 程 中, 含 有 变 异 碱 基 的 DNA 片 段 就 会 表 现 出 与 其 他 DNA 片 段 不 同 的 迁 移 模 式, 最 后 通 过 测 序 分 析 可 确 定 导 致 电 泳 迁 移 模 式 不 同 的 碱 基 变 异 SSCP 技 术 操 作 简 单 应 用 较 广 泛 但 其 对 SNP 的 检 出 率 只 有 70% ~95% 虽 然 最 近 发 展 出 以 毛 细 管 电 泳 的 万 式 替 代 凝 胶 电 泳 来 完 成 SSCP, 但 这 种 万 法 相 对 还 是 比 较 耗 时, 且 产 率 不 高 目 前 己 发 展 出 很 多 检 测 SNP 的 万 法, 其 中 直 接 测 序 法 灵 敏 度 最 高, 1 旦 成 本 也 最 高 另 外 的 几 种 万 法 诸 如 变 性 梯 度 凝 胶 电 泳 和 蛋 白 截 短 测 试 等, 则 比 较 经 济, 可 是 由 于 它 们 比 较 依 赖 于 实 验 者 的 技 能, 最 多 也 只 能 达 到 90% 的 灵 敏 度 变 性 高 效 液 相 层 析 (dena turing high performance liquid chromatography, DHPLC) 则 是 一 项 在 SSCP 和 DGGE 基 础 上 发 展 起 来 的 新 的 杂 合 双 链 突 变 检 测 技 术 这 种 技 术 也 是 基 于 等 位 基 因 DNA 片 段 经 过 变 性 和 接 下 来 单 链 DNA 分 于 在 再 复 性 过 程 中 会 形 成 异 源 双 链 DNA, 然 后 根 据 它 们 在 柱 上 的 保 留 时 间 不 同 进 行 分 离 同 源 双 链 DNA 分 于 与 层 析 柱 的 亲 和 力 强 于 异 源 双 链 DNA 分 于 与 层 析 柱 的 亲 和 力, 所 以 在 梯 度 洗 脱 过 程 中, 后 者 较 前 者 先 被 洗 脱 下 来 HPLC 可 快 速 高 通 量 的 完 成 基 于 HA 的 SNP 筛 查 其 对 SNP 的 检 出 率 可 达 95% ~ 100% DHPLC 操 作 程 序 : PCR 产 物 直 接 用 于 DHPLC 检 测, 不 需 经 过 纯 化 处 理 DHPLC 在 自 动 HPLC 仪 (hewlett packard instrument) 上 进 行 DNA 分 析 柱 为 50 mm X 4. 6 mm Id 双 链 DNA 分 析 柱 (HP)o DHPLC 工 作 流 程 如 ( 图 8-9 所 示 ) 数 据 厦 曰 + 一 理 塞 回 一 -+I itft:m I 样 品 牟 匮 E...1 吁 请 柱 兰 兰 I ~lt f.'l ffiij I 泵 及 温 合 器 叫 一 缓 神 液 ~ I 缓 忡 液 B I 图 8-9 DHPLC 工 作 流 程 示 意. 180.

185 与 SSCP 相 比, DHPLC 筛 查 SNP 的 优 点 是 :1 效 率 高, Odonovan 等 采 用 双 盲 分 析 法 证 明 在 他 们 研 究 的 基 因 中, DHPLC 可 100% 地 筛 查 出 SNP; 2 检 测 的 DNA 片 段 大 小 范 围 较 宽, 我 们 采 用 DHPLC 筛 查 了 238 bp, 464 bp, 509 bp 等 大 小 的 DNA 片 段 ; 3 省 时, 可 自 动 化 操 作, 而 且 不 需 要 对 PCR 产 物 进 行 任 何 后 处 理, 可 直 接 将 其 进 样 检 测 ;4 重 现 性 好, 分 析 DNA 样 品 的 整 个 过 程 可 以 在 优 化 条 件 下 完 全 而 精 确 地 重 复 DHPLC 筛 查 SNP 的 关 键 因 素 是 分 离 柱 所 处 的 温 度, 即 杂 合 双 链 与 纯 合 双 链 得 以 分 离 的 温 度 的 确 定 是 整 个 万 法 的 核 心 所 在 选 择 合 适 温 度 的 过 程 也 是 DHPLC 中 最 费 时 的 步 骤, 利 用 软 件 http: / /insertion. stanford. edu/meltdoc. html 可 预 测 不 同 PCR 产 物 进 行 DHPLC 所 需 要 的 温 度 通 过 我 们 研 究 的 DNA 片 段 的 洗 脱 温 度 得 知 最 佳 温 度 较 预 测 值 浮 动 1 C~3 C. 181.

186 第 九 章 基 因 连 锁 分 析 技 术 基 因 连 锁 分 析 是 基 因 诊 断 的 一 个 重 要 手 段, 与 前 面 讲 到 的 基 因 突 变 分 析 不 同 基 因 连 锁 分 析 并 不 是 直 接 检 测 致 病 基 因 的 异 常, 而 是 利 用 与 致 病 基 因 紧 密 连 锁 和 共 同 传 递 的 一 系 列 基 因 组 遗 传 多 态 标 记, 通 过 检 测 家 系 先 证 者, 明 确 与 致 病 基 因 相 关 的 这 些 遗 传 标 记 的 特 点, 进 而 对 家 系 中 其 他 患 者 的 遗 传 标 记 进 行 检 测 做 出 诊 断 其 基 本 思 路 是 : 一 个 家 系 中 有 亲 缘 关 系 的 个 体 同 时 罹 患 一 种 遗 传 病, 其 基 因 异 常 是 共 同 的 ; 致 病 基 因 内 及 两 侧 遗 传 距 离 极 小 的 多 态 标 记 与 致 病 基 因 紧 密 连 锁, 共 同 传 递 ; 家 系 先 证 者 遗 传 标 记 的 特 点 可 被 确 定 ; 遗 传 标 记 的 特 点 在 群 体 中 呈 多 态 分 布 ; 检 测 家 系 待 检 者 遗 传 标 记 是 否 与 先 证 者 相 同, 进 而 间 接 判 断 其 是 否 携 带 致 病 基 因 我 们 知 道, 遗 传 的 多 态 性 是 广 泛 存 在 的 人 类 的 许 多 结 构 蛋 白 和 染 色 体 均 存 在 多 态 性, 而 最 重 要 的 是 遗 传 多 态 性 存 在 于 人 类 基 因 组 内 在 同 一 个 个 体, 其 遗 传 物 质 一 半 来 自 于 母 万, 一 半 来 自 于 父 万, 因 此 其 两 套 单 倍 体 存 在 碱 基 序 列 的 差 异 是 不 难 理 解 的, 这 种 差 异 并 不 引 起 疾 病, 故 称 之 为 多 态 同 样, 不 同 个 体 之 间 基 因 组 序 列 存 在 差 异 也 就 不 足 为 奇 了 人 类 基 因 组 的 多 态 现 象 是 在 长 期 的 进 化 过 程 中 碱 基 自 然 变 异 的 结 果 基 因 组 的 遗 传 多 态 标 记 在 遗 传 病 的 基 因 诊 断 中 有 着 重 要 的 作 用 有 人 会 认 为, 既 然 基 因 组 多 态 与 疾 病 无 关, 其 对 遗 传 病 的 诊 断 就 毫 无 价 值, 然 而 事 实 却 怡 好 相 反 由 于 这 种 遗 传 标 记 广 泛 存 在 于 基 因 组 内, 每 个 功 能 基 因 内 及 两 侧 都 有 为 数 众 多 的 标 记 位 点, 因 其 与 功 能 基 因 遗 传 距 离 小, 在 传 递 过 程 中 发 生 交 换 的 可 能 性 也 很 小, 所 以 可 以 认 为 这 些 位 点 总 是 与 功 能 基 因 一 起 传 递 的 ; 加 之 每 一 个 标 记 位 点 在 群 体 中 有 多 种 存 在 形 式, 如 一 个 四 核 昔 酸 重 复 位 点, 可 能 以 四 核 昔 酸 为 基 序 重 复 2 次 3 次 4 次 等, 故 而 具 有 不 同 的 特 点, 即 使 是 同 一 个 体 两 个 等 位 位 点 重 复 次 数 也 可 能 是 不 同 的 当 一 个 致 病 基 因 的 相 关 多 态 位 点 的 特 点 被 确 定 后, 我 们 认 为 找 到 了 该 致 病 基 因 的 标 记, 因 为 其 等 位 基 因 多 态 位 点 的 特 点 与 之 有 差 异 在 此 基 础 上, 家 系 中 其 他 个 体 凡 是 具 有 致 病 基 因 标 记 特 点 的, 被 认 为 是 致 病 基 因 的 携 带 者 或 患 者 这 是 基 因 连 锁 分 析 在 基 因 诊 断 应 用 中 的 理 论 基 础 在 人 类 基 因 组 中 存 在 着 各 种 各 样 的 遗 传 多 态 标 记 1978 年, 最 先 被 发 现 的 是 前 面 提 到 的 限 制 性 酶 切 片 段 长 度 多 态 性 它 实 际 是 一 种 基 因 组 的 单 碱 基 多 态 性, 这 种 位 点 的 碱 基 差 异 直 接 影 响 到 限 制 性 酶 切 位 点 的 出 现 或 消 失, 故 当 用 限 制 酶 酶 切 时 可 以 发 现, 不 同 个 体 限 制 性 酶 谱 均 有 较 大 的 差 异 1987 年, 研 究 者 们 完 成 了 以 RFLP 为 标 记 的 基 因 连 锁 国, 这 种 多 态 比 较 多 的 连 锁 因 被 应 用 于 Southern 杂 交 中 现 在 临 床 上 应 用 最 多 的 是 数 目 变 异 的 串 联 重 复 (VNTR) 中 的 微 卫 星 DNA, 其 基 本 序 列 为 1 bp ~ 8 bp, 如 (CA) 队 (CGG) 队 (ATCC)η 等, 重 复 次 数 高 度 变 异, 从 10~60 次 由 于 微 卫 星 DNA 的 检 测 比 较 容 易, 传 递 完 全 符 合 孟 德 尔 遗 传, 因 此 是 一 大 类 主 要 的 可 用 于 基 因 连 锁 分 析 的 标 记, 1992 年 完 成 以 短 串 联 重 复 序 列 (STR) 为 标 记 的 第 二 代 基 因 连 锁 国 近 年 来, 人 类 基 因 组 单 核 昔 酸 多 态 性 (SNP) 的 研 究 正 在 大 量 进 行, 作 为 最 新 一 代 的 基 因 组 多 182.

187 态, SNP 数 量 众 多, 据 估 计 约 有 300 万 个 SNP, 广 泛 分 布 在 基 因 组 内 由 于 SNP 系 二 态 标 记, 因 此 适 合 于 大 规 模 快 速 筛 查, 并 易 于 进 行 基 因 分 型, 在 药 物 基 因 组 学 疾 病 候 选 基 因 定 位 等 万 面 有 巨 大 的 应 用 潜 力, 但 目 前 较 少 用 于 临 床 基 因 诊 断 连 锁 分 析 是 一 种 间 接 判 断 是 否 存 在 致 病 基 因 的 万 法, 不 同 于 直 接 检 测 致 病 基 因 的 异 常 从 基 因 诊 断 发 展 历 程 看, 在 早 期 人 类 对 自 身 的 生 命 奥 秘 了 解 较 少 的 情 况 下, 许 多 遗 传 病 的 致 病 基 因 不 被 知 晓 数 目 有 限 的 基 因 组 多 态 位 点 犹 如 指 导 人 们 了 解 基 因 组 的 路 灯, 在 大 多 数 情 况 下 只 能 利 用 这 些 多 态 位 点 进 行 连 锁 分 析 以 获 得 有 限 的 检 测 结 果 随 着 对 人 类 基 因 组 了 解 的 深 入, 越 来 越 多 的 致 病 基 因 被 定 位 克 隆 并 测 序, 为 直 接 基 因 诊 断 提 供 了 条 件, 较 多 的 遗 传 病 开 始 应 用 各 种 技 术 进 行 直 接 基 因 诊 断, 并 获 得 了 比 第 一 阶 段 更 确 切 更 可 靠 的 检 测 结 果 然 而, 研 究 者 们 很 快 就 发 现, 直 接 基 因 诊 断 并 不 适 合 于 所 有 的 基 因 诊 断 其 一, 较 多 的 遗 传 病 仍 然 存 在 表 型 特 征 和 生 化 缺 陷 不 明 的 问 题 ; 其 二, 部 分 遗 传 病 致 病 基 因 很 大, 从 时 间 上 和 卫 生 经 济 学 上 看 难 以 直 接 筛 查 整 个 基 因 ; 其 三, 部 分 有 明 确 家 族 史 的 患 者, 利 用 PCR 微 卫 星 连 锁 分 析 能 更 快 地 确 定 其 遗 传 病 因 因 此, 在 基 因 诊 断 技 术 发 展 的 整 个 过 程 中, 以 基 因 连 锁 分 析 为 基 础 的 间 接 基 因 诊 断 万 法 始 终 占 有 相 当 重 要 的 地 位, 甚 至 随 着 各 种 遗 传 标 记 的 完 善, 间 接 诊 断 的 作 用 还 在 日 益 突 出 第 一 节 基 于 RFLP 的 基 因 连 锁 分 析 基 于 RFLP 的 基 因 连 锁 分 析 是 最 早 被 采 用 的 间 接 基 因 诊 断 的 重 要 万 法 之 一 尽 管 越 来 越 多 的 基 因 组 遗 传 标 记 被 确 定 和 应 用 但 直 到 目 前 仍 有 为 数 较 多 的 遗 传 病 使 用 RFLP 作 为 基 因 诊 断 的 材 料 尤 其 是 随 着 PCR 等 技 术 的 出 现 PCR - RFLP 使 实 验 操 作 大 大 简 化, 避 免 了 放 射 性 核 素 等 有 害 物 质 对 操 作 者 的 危 害, 使 该 技 术 再 次 获 得 了 重 视 正 如 前 面 所 介 绍 的, 人 类 由 于 长 期 的 进 化 过 程 中 中 性 突 变 而 导 致 个 体 之 间 基 因 组 碱 基 序 列 的 差 异, RFLP 正 是 一 种 限 制 性 核 酸 内 切 酶 酶 切 位 点 的 差 异 造 成 的 多 态 现 象, 这 种 多 态 直 接 表 现 为 限 制 性 核 酸 内 切 酶 酶 切 片 段 数 量 和 长 短 的 不 同 当 我 们 选 择 合 适 的 RFLP 位 点 进 行 家 系 分 析 时, 可 以 通 过 判 断 与 致 病 基 因 紧 密 连 锁 的 RFLP 而 确 定 出 待 检 者 是 否 为 风 险 染 色 体 的 携 带 者 或 患 者 RFLP 作 为 一 种 遗 传 标 记 在 20 世 纪 90 年 代 以 前 相 当 长 的 时 期 里 被 广 泛 用 于 各 种 遗 传 病 的 基 因 诊 断 中, 对 基 因 诊 断 的 发 展 做 出 了 巨 大 的 贡 献 一 基 本 原 理 针 对 某 种 遗 传 病 致 病 基 因, 在 基 因 内 或 两 侧 确 定 多 个 RFLP 位 点, 在 每 个 位 点 两 侧 设 计 扩 增 RFLP 区 域 的 引 物, 利 用 这 些 寻 物 对 正 常 人 群 的 这 些 RFLP 位 点 进 行 分 于 流 行 病 学 调 查, 获 得 每 个 位 点 两 种 基 因 型 的 杂 合 率, 进 而 选 择 杂 合 率 较 高 的 RFLP 位 点 作 为 连 锁 分 析 的 材 料 在 进 行 连 锁 分 析 时, 首 先 对 家 系 先 证 者 的 RFLP 位 点 进 行 PCR 扩 增, 然 后 将 PCR 产 物 进 行 限 制 酶 酶 切, 判 断 先 证 者 的 基 因 型 组 成 如 先 证 者 为 纯 合 型, 则 有 利 于 进 一 步 的 分 忻 ; 然 后 对 先 证 者 双 亲 进 行 RFLP 基 因 型 鉴 定, 如 双 亲 在 这 个 RFLP 位 点 为 杂 合 183

188 型, 则 诊 断 基 本 成 功, 可 以 比 较 容 易 地 确 定 出 与 致 病 基 因 紧 密 连 锁 的 RFLP 基 因 型, 进 而 通 过 对 待 检 者 RFLP 位 点 的 基 因 型 情 况 得 出 是 否 携 带 致 病 基 因 或 是 否 是 患 者 的 结 论 如 先 证 者 双 亲 的 RFLP 位 点 系 纯 合 于, 则 存 在 多 态 信 息 量 不 够 的 问 题, 需 要 再 选 用 第 二 个 RFLP 位 点 进 行 检 测 基 于 RFLP 的 基 因 连 锁 分 析 最 大 的 优 点 是 不 需 要 明 确 致 病 基 因 异 常 的 位 置 与 类 型, 可 以 较 快 地 得 到 明 确 的 检 测 结 果, 在 排 除 基 因 重 组 等 不 可 预 测 的 情 况 后, 其 结 果 是 可 靠 准 确 的 但 是 该 技 术 也 有 其 固 有 的 缺 陷 即 与 微 卫 星 DNA 相 比 RFLP 位 点 的 杂 合 度 较 低, 多 态 信 息 量 较 差, 有 时 不 得 不 选 用 较 多 的 RFLP 位 点 进 行 检 测 即 使 如 此, 基 于 RFLP 的 基 因 连 锁 分 析 可 能 得 到 三 种 结 果 即 完 全 诊 断 50% 诊 断 和 完 全 不 能 诊 断 下 面 以 图 9-1 常.. 染 色 体 隐 性 遗 传 病 为 例 解 释 该 技 术 的 具 体 原 理 阻 酶 切 位 点 无 RE 酶 切 位 点 ~ =""""=..γ---,-, TE{ 二 未 酶 切 片 段 - 先 证 者 之 父!!I_I!111_1 - 先 证 苔 ' 占 l...l... 先 证 者 之 母 持 检 者 T'""'T'""T 画 画 昌 "'T""T"""--& 一, 二 iii_ 先 证 苦 先 证 者 先 证 者 持 检 者 之 父 之 叮 - 图 9-1 per - RFLP 连 锁 分 析 原 理 示 意 从 图 9-1 可 以 看 出, 待 检 者 该 PFLP 位 点 基 因 型 与 先 证 者 完 全 不 同, 提 示 待 检 者 未 携 带 致 病 基 因. 184.

189 基 本 方 法 ( ) 材 料 与 试 剂 准 备 1. 材 料 热 帽 环 仪 水 平 电 泳 设 备 2. 试 剂 RFLP 扩 增 引 物 PCR 试 剂 电 泳 试 剂 ( 二 ) 操 作 步 骤 1. 对 家 系 先 证 者 致 病 基 因 相 关 RFLP 位 点 进 行 PCR 扩 增 2. 对 待 检 者 及 其 双 亲 同 胞 等 相 关 个 体 相 同 的 RFLP 位 点 进 行 PCR 扩 增 0 3. 对 PCR 扩 增 产 物 同 时 进 行 水 平 电 泳 4. 对 上 述 个 体 各 个 RFLP 位 点 的 情 况 逐 一 进 行 比 较, 通 过 先 证 者 及 其 双 亲 RFLP 位 点 基 因 型 判 断 待 检 者 是 否 获 得 了 风 险 染 色 体 三 II 备 床 应 用 临 床 应 用 以 血 友 病 A 的 产 前 诊 断 为 例 介 绍 如 下 ( ) 材 料 与 试 剂 1. 材 料 热 帽 环 仪 水 平 电 泳 设 备 ; 2. 试 剂 PCR 试 剂 RFLP 的 引 物 序 列 ( 表 9-1) 由 于 RFLP 位 点 均 与 凝 血 因 于 VIII 基 因 紧 密 连 锁, 具 有 较 高 的 多 态 信 息 量, 为 目 前 实 验 室 常 用 位 点 同 时 该 病 属 X 连 锁 隐 性 遗 传 病, 因 此 诊 断 相 对 比 常 染 色 体 遗 传 病 容 易 表 9-1 血 友 病 ARFLP 位 点 引 物 序 否 IJ RFLP 位 点 引 物 序 列 (5' - 3') Bel I ( 内 含 子 18) F: TAAAAGCTTTAAATGGTCTAGGC R, TTCGAATTCTGAAATTATCTTGTTC XbaI ( 内 含 子 22) F: CACGAGCTCTCCATCTGAACATG R, GGGCTGCAGGGGGGGGGGACAACAG SRY ( 性 别 决 定 基 因 ) F: GAAT A TTCCCGCTCTCCGGA R, GCTGGTGCTCCATTCTTGAG 片 段 长 度 (bp) 142 或 或 ( 二 ) 操 作 步 骤 具 体 操 作 步 骤 以 PCR / Bel I 为 例 1. 抽 取 孕 妇 羊 水 15 mi~20 mi, 提 取 羊 水 中 胎 儿 脱 落 细 胞 DNA o 2. 扩 增 胎 儿 SRY 基 因 以 判 断 性 别, 同 时 设 置 正 常 男 性 女 性 对 照 3. 胎 儿 为 男 性, PCR 扩 增 先 证 者 双 亲 及 胎 儿 Bel I 位 点 4. 使 用 限 制 酶 Bel I 酶 切 PCR 产 物, 万 法 另 有 介 绍 5. 琼 脂 糖 电 泳 分 离 酶 切 片 段 6. 判 断 先 证 者 双 亲 及 胎 儿 Bel I 位 点 酶 切 情 况, 做 出 诊 断 如 先 证 者 未 发 生 酶 切, 得 到 142 bp 的 片 段 ; 父 亲 发 生 酶 切, 得 到 99 与 43 bp 两 个 片 段 ; 母 亲 发 生 部 分 酶 切, 得 到 和 43 bp 三 个 片 段, 可 以 基 本 断 定 致 病 基 因 与 185

190 144 bp 的 酶 切 片 段 相 连 锁 因 此 如 胎 儿 得 到 142 bp 的 未 酶 切 片 段 则 可 认 为 是 血 友 病 A 的 患 者, 如 胎 儿 得 到 99 bp 与 43 bp 两 个 片 段, 则 为 正 常 胎 儿 以 此 类 推 四 RFLP 连 锁 分 析 中 应 注 意 的 问 题 在 应 用 RFLP 进 行 连 锁 分 析 时 应 注 意 以 下 问 题 1. 致 病 基 因 与 RFLP 位 点 的 重 组 交 换 这 是 进 行 连 锁 分 析 时 不 得 不 面 临 的 一 个 最 关 键 的 问 题 我 们 知 道, 连 锁 分 析 的 基 础 在 于 通 过 确 定 与 致 病 基 因 共 同 传 递 RFLP 的 位 点 及 其 特 点, 了 解 待 检 者 RFLP 位 点 的 特 点 间 接 推 断 待 检 者 是 否 携 带 致 病 基 因 如 果 RFLP 位 点 与 致 病 基 因 遗 传 距 离 较 远, 染 色 体 重 组 交 换 发 生 在 RFLP 位 点 与 致 病 基 因 之 间, 则 失 去 了 进 行 连 锁 分 析 的 基 础 因 此, 在 RFLP 的 选 择 上 应 尽 量 利 用 与 致 病 基 因 遗 传 距 离 近 或 在 致 病 基 因 内 部 的 位 点, 以 减 少 重 组 的 可 能 性, 提 高 检 测 的 可 靠 性 重 组 交 换 是 连 锁 分 析 发 生 误 差 的 最 大 原 因 2. RFLP 位 点 的 选 用 在 一 个 致 病 基 因 内 或 两 侧 一 般 会 有 较 多 的 RFLP 位 点, 但 并 不 是 所 有 RFLP 位 点 均 适 合 于 基 因 连 锁 分 析, 必 须 选 用 杂 合 度 较 高 的 RFLP 位 点, 这 些 位 点 在 人 群 中 杂 合 体 较 多, 连 锁 分 析 成 功 率 较 高 3. 优 先 选 用 STR 进 行 连 锁 分 析 与 基 因 组 STR 相 比, RFLP 的 多 态 信 息 量 明 显 较 低, 因 此 诊 断 成 功 率 远 低 于 STR 的 应 用, 加 之 STR 分 析 不 需 使 用 限 制 性 核 酸 内 切 酶, 实 验 更 加 简 单, 因 此 在 致 病 基 因 相 关 多 态 标 记 己 比 较 明 确 的 情 况 下, 基 STR 于 的 连 锁 分 析 应 为 首 选 第 二 节 基 于 STR 的 基 因 连 锁 分 析 在 人 类 基 因 组 中 存 在 着 小 卫 星 DNA 与 微 卫 星 DNA, 其 中 小 卫 星 DNA 是 15 bp~ 65 bp 的 串 联 重 复, 微 卫 星 DNA 是 2 bp~6 bp 的 串 联 重 复, 它 们 统 称 为 短 重 复 序 列 (short tandem repeat, STR) 这 些 重 复 序 列 一 般 都 有 较 多 的 等 位 基 因, 即 重 复 次 数 不 同 的 多 种 形 式 在 群 体 中 同 时 存 在, 因 此 有 较 高 的 信 息 量 (polymorphism information content, PIC), 尤 其 微 卫 星 DNA 是 一 种 非 常 有 用 的 遗 传 标 记 临 床 上 应 用 较 多 的 STR 有 二 核 昔 酸 重 复 三 核 昔 酸 重 复 及 四 核 昔 酸 重 复 位 点, 因 为 采 用 PCR 技 术 可 以 很 万 便 地 扩 增 出 含 有 该 种 位 点 的 基 因 区 域, 通 过 垂 直 电 泳 可 以 检 出 其 重 复 次 数 以 STR 为 基 础 的 基 因 连 锁 分 析 不 需 要 明 确 基 因 突 变 的 具 体 位 置 和 性 质, 也 不 需 要 设 计 合 成 探 针 进 行 杂 交, 是 目 前 针 对 单 基 因 病 临 床 诊 断 产 前 诊 断 及 症 状 前 诊 断 非 常 有 效 的 万 法 一 基 本 原 理 针 对 某 种 单 基 因 遗 传 病 致 病 基 因 E\l(; 候 选 基 因, 寻 找 其 两 侧 E\l(; 基 因 内 的 多 个 STR 位 点, 在 每 个 STR 位 点 两 侧 设 计 合 成 扩 增 该 序 列 的 寻 物, 利 用 这 些 引 物 对 正 常 人 群 的 这 些 STR 位 点 重 复 次 数 进 行 分 于 流 行 病 学 调 查, 获 得 每 个 位 点 重 复 次 数 的 类 型 及 其 分 布 频 率, 进 而 计 算 每 个 位 点 的 多 态 信 息 量, 然 后 选 择 PIC 较 高 的 多 个 STR 位 点 用 于 基 因 连 锁 分 析 常 染 色 体 上 STR 的 PIC 计 算 公 式 如 下 186.

191 其 中 :η 代 表 该 位 点 等 位 基 因 数 ; PIC 二 1- (2:, Pi)2-2:, 2:, 2 pi pi Pi 代 表 第 1 个 等 位 基 因 在 群 体 中 的 频 率 在 STR 位 点 选 定 后, 通 过 PCR 扩 增 STR 位 点 对 家 系 中 正 常 个 体 与 异 常 个 体 这 些 位 点 情 况 进 行 比 对, 进 而 确 定 异 常 个 体 每 个 STR 位 点 的 特 点, 用 扩 增 片 段 大 小 表 示 或 用 重 复 拷 贝 数 表 示 当 获 得 异 常 个 体 较 多 的 STR 位 点 的 特 点 后, 这 些 位 点 的 特 点 可 以 串 联 起 来 组 成 一 个 紧 密 连 锁 的 多 态 位 点 状 态 的 组 合, 称 之 为 单 倍 型 (haplotype) 在 基 因 连 锁 分 析 中, 主 要 依 靠 的 是 STR 组 成 的 单 倍 型 分 布 与 致 病 基 因 的 连 锁 关 系 在 常 染 色 体 遗 传 病 中, 由 于 同 源 染 色 体 等 位 基 因 位 点 的 存 在, 分 析 f 单 音 型 必 须 要 家 系 中 较 多 的 成 员 参 与, 并 通 过 计 算 获 得 在 X 连 锁 遗 传 病 中, 致 病 基 因 存 在 于 X 染 色 体 上, 而 男 性 仅 有 一 条 X 染 色 体, 为 单 f 音 型 分 布 的 确 定 提 供 了 得 天 独 厚 的 条 件, 通 过 检 测 可 以 直 接 判 定 男 性 的 STR 单 倍 型 组 成, 而 勿 需 做 过 多 的 家 系 个 体 和 计 算 分 析 在 诊 断 中 可 以 将 患 者 STR 单 倍 型 组 成 所 代 表 的 染 色 体 称 为 风 险 染 色 体 下 面 以 图 9-2--X 连 锁 隐 性 遗 传 病 的 (CA)η 短 重 复 序 列 为 例 介 绍 该 技 术 的 具 体 原 理, 群 体 中 存 在 面 ~ 六 料 ' 等 位 基 国 l PeR 扩 增 CA 重 复 区 :::::r:::::r::; 叶 下 一 下 丁 I 工 :::c::. 口 -=:C:I 先 证 者 先 证 者 之 父 先 证 者 之 母 待 检 者 I I 第 二 个 患 者 I:IJI 白.. 口 _'..'M',..., i 先 证 者 壳 iie 古 先 证 者 特 检 者 第 - 个 主 义 之 母 患 者 结 论 : 待 检 者 为 女 性 致 病 基 因 携 带 者 图 9-2 PCR- STR 连 锁 分 析 原 理 示 意. 187.

192 - 固 基 本 方 法 ( ) 材 料 与 试 剂 准 备 1. 材 料 : 热 帽 环 仪 垂 直 电 泳 设 备 2. 试 剂 : STR 扩 增 引 物 PCR 试 剂 电 泳 试 剂 银 染 试 剂 ( 二 ) 操 作 步 骤 1. 对 家 系 先 证 者 致 病 基 因 相 关 STR 位 点 进 行 PCR 扩 增 2. 对 患 者 及 其 双 亲 同 胞 等 相 关 个 体 STR 位 点 进 行 PCR 扩 增 0 3. 对 PCR 扩 增 产 物 同 时 进 行 垂 直 电 泳 4. I~ 是 胶 银 染 显 色 5. 对 上 述 个 体 各 个 STR 位 点 的 情 况 逐 一 进 行 比 较, 通 过 先 证 者 STR 位 点 单 倍 型 判 断 待 检 者 是 否 获 得 了 风 险 染 色 体 临 床 应 用 临 床 应 用 以 进 行 性 肌 营 养 不 良 症 的 产 前 诊 断 为 例 介 绍 如 下 ( 一 ) 材 料 与 试 剂 准 备 1. 材 料 热 帽 环 仪 垂 直 电 泳 设 备 2. 试 剂 PCR 试 剂 STR 引 物 序 列 ( 表 9-2) 由 于 STR 均 位 于 DMD 基 因 内 或 基 因 两 侧, 具 有 较 高 的 多 态 信 息 量, 为 目 前 实 验 室 常 用 位 点 同 时 由 于 该 病 属 X 连 锁 隐 性 遗 传 病, 需 同 时 判 断 胎 儿 性 别, 因 此 设 置 一 对 SRY 基 因 引 物 做 性 别 验 证 表 9-2 DMD / BMDSTR 位 点 引 物 序 列 引 物 名 称 引 物 序 列 (5' - 3') 片 段 大 小 (bp) 肌 1PIP- F AGAGTGAGTAATCGGTTGG 64~72 肌 1PIP- R CTAGCAGCAGGAAGCTGAATG 5'CA-F GAAACTATAAGGAATAACTCATTTAGC 180~200 5'CA- R ATATATAGGGATTATTTGTGTTTGTTATAC i44 - F TCCAACATTGGAAATCACATTTCA 174~204 i44 - R TCATCACAAATAGATGTTTCACAG i45 - F GAGGCTATAATTCTTTAACTTTGGC 156~ 184 i45 - R CTCTTTCCCTCTTTATTCATGTTAC i49 - F CGTTTACCAGCTCAAAATCTCAAC 227~257 i49 - R CATATGATACGATTCGTGTTTTGC i50 - F AAGGTTCCTCCAGTAACAGATTTGG 233~251 i50 - R TATGCTACATAGTATGTCCTCAGAC SRY-F GAATATTCCCGCTCTCCGGA 472 SRY-R GCTGGTGCTCCATTCTTGAG. 188.

193 ( 二 ) 操 作 步 骤 为 5'CA 1. 引 物 分 组 将 6 对 STR 引 物 分 成 三 组 :A 组 为 i44 i49, B 组 为 i45 i50, C 组 MPIP o 2. 模 板 DNA 提 取 分 别 抽 取 家 系 先 证 者 双 亲 抗 凝 外 周 血 5 r 址, 常 规 盐 析 法 提 取 DNA, 溶 于 TE; 抽 取 18~22 孕 周 羊 水 15 ml~20 ml, 收 集 羊 水 中 胎 儿 脱 落 细 胞, 用 盐 忻 法 提 取 基 因 组 DNA 备 用 3. SRY 基 因 扩 增 反 应 体 积 25μ1, 含 10 x 缓 冲 液 2. 5μl dntp 各 0.2 mmol MgCb 1. 5 mmol 引 物 各 0.5 Vmol 模 板 DNA O. 2 Vg~O. 5 Vg Taq 聚 合 酶 1U o 扩 增 条 件 : 94'C 预 变 性 5 min 35 个 帽 环 (93'C30s, 55'C30s, 72'C60s) 72 'c 延 伸 5 min 4 'c 保 温 同 时 设 置 正 常 男 性 对 照 正 常 女 性 和 阴 性 对 照 各 一 4. STR 位 点 扩 增 6 对 引 物 分 3 组 进 行 多 重 PCR 扩 增, 每 组 2 对 引 物 反 应 体 积 25μ 1, 含 lo x 缓 冲 液 2. 5 vi dntp 各 0.2 mmol MgCh 1. 5 mmol 引 物 各 0.5 Vmol 模 板 DNA 0.2μg~O. 5 Vg Taq 聚 合 酶 1U 扩 增 条 件 : 94'C 预 变 性 5 min 35 个 帽 环 (93 'c 30 s, 55'C 30 s, 72'C 60 s) 72 'c 延 伸 5 mi 日 4 'c 保 温 由 于 这 些 STR 位 点 均 系 (CA) 的 二 核 昔 酸 重 复, 因 此 可 能 出 现 主 带 上 下 的 影 于 带 而 影 响 判 断, 必 须 通 过 预 实 验 确 定 出 各 自 实 验 室 条 件 下 最 佳 的 PCR 扩 增 条 件, 同 时 注 意 模 板 DNA 的 质 量 也 与 扩 增 质 量 密 切 相 关 5. 电 泳 检 测 基 因 连 锁 分 析 PCR 产 物 用 8% 变 性 聚 丙 烯 酌 肢 凝 胶 电 泳, 100 bp DNA 相 对 分 于 质 量 标 记, 电 压 800 V2 h 银 染 检 测 结 果 见 图 结 果 判 断 SRY 基 因 检 测 结 果 判 断 必 须 以 各 对 照 结 果 完 全 正 常 为 前 提 ; DMD 基 因 连 锁 分 析 时 则 要 特 别 注 意 持 检 个 体 多 态 位 点 组 成 的 单 倍 型 的 异 同 ( 三 ) 背 景 材 料 假 肥 大 型 肌 营 养 不 良 症 的 产 前 诊 断 观 念 和 技 术 正 在 不 断 发 展 中 i 亥 病 属 X 连 锁 隐 性 遗 传 病, 大 多 数 地 区 计 划 生 育 部 门 以 孕 妇 B 超 检 查 胎 儿 性 别 作 为 能 否 再 生 的 依 据 然 而 B 超 判 断 性 别 存 在 较 大 的 误 差, 且 必 须 在 饪 撮 较 晚 期 才 能 得 到 较 确 定 的 结 果, 给 临 床 带 来 不 便 在 部 分 有 条 件 的 地 区 和 单 位, 通 过 对 培 养 的 羊 水 胎 儿 脱 落 细 胞 进 行 染 色 体 核 型 分 析 来 判 断 性 别, i 亥 万 法 更 为 早 期 可 靠, 1 旦 存 在 红 细 胞 污 染 羊 水 等 不 利 因 素 而 使 细 胞 培 养 失 败 的 可 能 随 着 性 别 决 定 基 因 SRY 的 应 用, 目 前 少 数 实 验 室 可 通 过 SRY 基 因 的 直 接 检 测 来 判 断 胎 儿 性 别, 较 以 前 检 测 更 加 快 速, 然 而 实 验 室 基 因 扩 增 却 面 临 较 严 重 的 污 染 威 胁, 假 阳 性 发 生 率 较 高 尽 管 性 别 选 择 可 避 免 患 儿 出 生, 但 不 可 否 认, 部 分 正 常 男 胎 亦 被 累 及, 因 此 DMD / BMD 产 前 诊 断 仅 仅 依 赖 性 别 鉴 定 的 结 果 是 不 妥 当 的 直 接 针 对 DMD/BMD 基 因 的 产 前 基 因 诊 断 技 术 正 日 渐 成 熟 随 着 该 病 遗 传 病 因 的 揭 示, 近 几 年 来 将 胎 儿 性 别 鉴 定 与 DMD / BMD 基 因 诊 断 相 结 合 进 行 产 前 诊 断, 己 逐 渐 成 为 DMD/BMD 产 前 基 因 诊 断 的 主 要 万 法 但 一 直 以 来, 各 实 验 室 的 基 因 检 测 范 围 步 骤 策 略 等 不 尽 相 同, 在 一 定 程 度 上 影 响 了 DMD 的 产 前 基 因 诊 断 工 作 的 规 范 进 行 建 立 一 个 完 整 准 确 可 行 的 DMD 产 前 基 因 诊 断 程 序 是 获 得 准 确 的 产 前 诊 断 结 果 189

194 的 前 提 条 件 首 先 对 先 证 者 进 行 基 因 缺 失 筛 查, 在 发 现 缺 失 情 况 下, 应 用 SRY 基 因 检 测 对 胎 儿 进 行 性 别 确 定 阳 性 者 进 行 DMD 基 因 缺 失 筛 查, 发 现 与 先 证 者 相 同 的 缺 失 即 为 男 性 患 儿 男 月 台 无 缺 失 发 现 时 必 须 进 行 基 因 连 锁 分 析 以 排 除 母 体 DNA 污 染 的 可 能, 并 以 此 为 基 础 判 断 为 正 常 男 性 SRY 基 因 检 测 阴 性 者 应 进 行 基 因 连 锁 分 析 以 判 断 是 否 是 女 性 致 病 基 因 携 带 者 对 先 证 者 未 发 现 基 因 缺 失 的, 在 判 断 胎 儿 性 别 后 应 进 行 基 因 连 锁 分 忻, 以 判 断 胎 儿 基 因 状 况 在 实 际 工 作 中, 一 些 实 际 问 题 必 须 加 以 注 意 首 先, 当 发 现 DMD 基 因 缺 失 时 必 须 进 行 单 个 位 点 检 测 以 确 认, 防 止 扩 增 失 败 导 致 的 错 误 结 果 ; 其 次, SRY 基 因 检 测 有 严 格 的 实 验 室 质 量 控 制, 防 止 污 染 引 起 假 阳 性, 解 决 万 法 之 一 是 由 女 性 人 员 操 作, 在 结 果 有 矛 盾 时 应 依 靠 微 卫 星 等 位 基 因 数 量 分 析 来 最 后 确 定 性 别 ; 再 次, 在 未 发 现 缺 失 的 家 系 中 通 过 微 卫 星 连 锁 分 析 进 行 产 前 诊 断, 原 则 上 应 在 家 系 中 至 少 有 两 个 患 者 出 现, 否 则 无 法 排 除 仅 仅 先 证 者 发 生 DMD 基 因 异 常 的 可 能, 如 贸 然 进 行 诊 断, 将 会 扼 杀 部 分 正 常 胎 儿 另 外, 由 于 DMD 基 因 较 大, 其 发 生 基 因 内 重 组 的 可 能 性 约 为 12%, 因 此 在 进 行 连 锁 分 忻 时 应 同 时 完 成 胎 儿 先 证 者 和 双 亲 的 比 较 检 测, 尽 可 能 避 免 基 因 重 组 导 致 的 结 果 误 差 最 后 需 要 提 醒 的 是 进 行 产 前 诊 断 的 孕 妇 多 有 出 生 DMD 患 儿 的 病 史, 普 遍 年 龄 较 大, 因 此 在 进 行 基 因 诊 断 时, 应 同 时 做 羊 水 细 胞 培 养 和 染 色 体 核 型 分 析, 以 避 免 出 生 其 他 遗 传 异 常 的 个 体, 如 21 三 体 等 鉴 于 该 病 较 高 的 发 病 率, 产 前 基 因 诊 断 的 准 确 性 己 成 为 需 首 要 解 决 的 问 题, 切 不 能 盲 目 强 调 实 验 的 快 速 简 便 而 忽 视 其 科 学 性, 亦 不 能 片 面 强 调 检 测 的 推 广 而 放 松 对 检 测 的 要 求 假 肥 大 型 月 几 营 养 不 良 症 的 产 前 基 因 诊 断 代 表 了 21 世 纪 分 于 产 前 诊 断 的 发 展 万 向, 随 着 荧 光 原 位 杂 交 技 术 DNA 测 序 技 术 和 无 创 性 产 前 诊 断 技 术 的 广 泛 应 用, 前 基 因 诊 断 将 更 加 安 全 准 确 可 靠 ( 四 ) 真 他 较 常 见 可 进 行 基 因 连 锁 分 析 的 疾 病 i 亥 病 的 产 其 他 如 血 友 病 A 基 因 1 日 tro 日 3 (CA)ηPIC64.55%; i 日 tron22 (CA)η, 苯 丙 酣 尿 症 致 病 基 因 intron3 锁 分 忻 (TCTA)ηPIC 69. 3% 及 成 人 型 多 囊 肾 病 等 均 可 利 用 STR 进 行 基 因 连 四 基 因 连 锁 分 析 中 STR 的 选 用 条 件 并 不 是 所 有 的 STR 都 适 合 于 基 因 连 锁 分 析 使 用, 它 必 须 具 备 以 下 基 本 条 件 1. STR 与 靶 基 因 紧 密 连 锁, 遗 传 距 离 尽 量 小, 以 免 交 换 重 组 率 较 高 而 影 响 到 检 测 的 可 靠 性, 最 好 在 靶 基 因 内 选 择 合 适 的 STR, 其 重 组 率 可 忽 略 不 计 2. STR 的 等 位 基 因 数 量 较 多, 各 等 位 基 因 分 布 频 率 接 近 一 致, 多 态 信 息 量 (PIC) 高 3. 在 实 际 操 作 中, 选 用 的 STR 应 在 双 亲 各 自 的 两 个 遗 传 标 记 均 呈 杂 合 状 态, 以 便 相 互 区 分 0 4. 所 采 用 的 STR 应 能 通 过 家 系 分 析 确 定 连 锁 相, 确 定 与 致 病 基 因 相 关 的 STR 单 倍 型 组 成 5. 尽 量 选 择 基 序 长 的 STR 以 便 于 检 测, 如 四 核 昔 酸 重 复 比 二 核 昔 酸 重 复 更 容 易 检 测. 190.

195 ( 杨 元 ) 参 考 文 献 1 Bowen DJ, Hampton K K. Analysis of the BglI restriction fragment length polymorphism in the human factor VIII gene using "virtual per" - - a novel approach employing the polymerase chain reac tion in the absence of sequence information for the locus. Hum Genet, 1996, 98: van Essen AJ, Kneppers ALJ, Ginjaar HB, et al. The clinical and molecular genetic approach to Duchenne and Becker muscular dystrophy. An updated protocol. J Med. Genet, 1997, 34: van Essen AJ, Kneppers A L, van der Hout AH, et al. The clinical and molecular genetic ap proach to Duchenne and Becker muscular dystrophy: an updated protocol. J Med Genet, 1997, 34:

196 第 十 章 核 酸 定 量 荧 光 实 时 检 测 技 术 核 酸 定 量 检 测 技 术 实 际 上 并 不 是 一 个 崭 新 的 概 念, 在 常 规 PCR 技 术 出 现 后, 就 有 研 究 者 提 出 在 定 性 的 基 础 上 发 展 核 酸 的 定 量 技 术 众 所 周 知, 常 规 PCR 技 术 只 是 一 个 基 因 体 外 扩 增 的 核 酸 定 性 检 测 技 术, 整 个 反 应 过 程 经 历 了 相 对 静 止 期 指 数 增 长 期 与 平 台 期 几 个 阶 段, 然 而, PCR 反 应 的 过 程 无 法 得 到 监 测, 当 PCR 终 止 在 某 个 帽 环 时, 不 知 其 具 体 处 于 哪 一 个 时 期, 因 此 PCR 终 末 点 产 物 量 与 标 本 中 起 始 模 板 量 之 间 缺 乏 明 确 的 函 数 关 系, 使 常 规 PCR 定 量 检 测 困 难 重 重 尽 管 如 此, 研 究 者 仍 努 力 建 立 了 多 种 定 量 PCR 万 法, 其 中 最 为 可 靠 的 是 " 竞 争 PCR" 竞 争 PCR 的 基 本 原 理 是 在 PCR 体 系 中, 除 待 检 的 靶 序 列 外, 还 含 有 固 定 量 的 竞 争 序 列 模 板, 这 种 模 板 可 以 是 质 粒 或 人 工 合 成 的 核 酸 片 段 竞 争 序 列 模 板 特 点 是 含 有 与 靶 序 列 共 同 的 寻 物 结 合 序 列, 这 样 当 PCR 进 行 时, 寻 物 会 同 时 杂 交 到 靶 序 列 和 竞 争 序 列 上, 由 于 引 物 相 同, 它 们 具 有 相 同 的 杂 交 效 率 和 延 伸 效 率, 并 同 时 获 得 两 个 扩 增 片 段 更 由 于 两 个 扩 增 片 段 的 长 短 不 一, 可 以 在 琼 脂 糖 凝 胶 上 万 便 地 将 其 分 离 当 我 们 使 用 N 个 浓 度 梯 度 的 竞 争 于 与 相 同 模 板 量 的 靶 序 列 分 别 共 同 扩 增 后, 可 以 得 到 N 管 产 物, 通 过 电 泳, N 管 PCR 产 物 中 的 两 个 片 段 被 分 离, 进 行 电 泳 条 带 的 辉 度 比 较, 找 到 竞 争 序 列 和 靶 序 列 扩 增 片 段 辉 度 最 为 接 近 的 一 管, 这 管 竞 争 序 列 的 起 始 拷 贝 数 与 靶 序 列 起 始 拷 贝 数 最 为 接 近 或 一 致 竞 争 PCR 万 法 进 行 靶 基 因 起 始 量 的 确 定, 一 直 以 来 被 认 为 是 最 为 准 确 的 核 酸 定 量 万 法, 然 而 它 也 具 有 如 下 难 以 克 服 的 缺 陷 (1) 理 想 的 竞 争 于 制 备 程 序 复 杂 : 该 技 术 的 基 础 是 获 得 理 想 的 竞 争 于 采 用 含 寻 物 序 列 的 质 粒 作 为 竞 争 于 是 一 个 较 常 用 的 万 法, 而 竞 争 片 段 的 获 得 插 入 质 粒 细 菌 中 复 制 与 质 粒 DNA 的 提 耳 又 是 一 个 繁 琐 的 工 作 采 用 PCR 产 物 直 接 作 为 竞 争 于 有 如 下 问 题, 一 是 难 以 确 定 竞 争 于 拷 贝 数, 二 是 容 易 发 生 实 验 室 污 染 这 导 致 必 须 由 专 业 的 实 验 室 花 费 较 多 的 时 间 才 能 获 得 理 想 的 竞 争 于 (2) 竞 争 于 的 针 对 性 太 强 : 一 个 靶 基 因 的 寻 物 必 须 有 一 个 相 应 的 竞 争 于, 使 实 验 的 开 放 性 受 到 限 制 (3) 定 量 检 测 只 是 相 对 的 : 通 过 竞 争 于 扩 增 片 段 的 辉 度 与 靶 基 因 扩 增 片 段 的 辉 度 比 较, 难 以 获 得 完 全 一 致 的 辉 度, 最 终 的 结 论 只 是 粗 略 的 相 对 的 (4) 定 量 PCR 操 作 复 杂 : 要 获 得 比 较 准 确 的 定 量 数 据, 通 常 不 得 不 设 置 较 多 的 不 同 浓 度 竞 争 于 的 PCR 反 应, 不 仅 增 加 了 操 作 的 复 杂 性, 也 增 加 了 操 作 中 各 种 不 确 定 因 素 影 响 结 果 的 机 会 (5) 实 验 控 制 复 杂 : i 亥 万 法 定 量 有 一 个 要 求, 就 是 PCR 反 应 应 终 止 在 PCR 指 数 增 长 期, 尽 可 能 避 免 PCR 平 台 期 时 不 同 起 始 拷 贝 数 的 标 本 获 得 相 似 的 PCR 产 物 否 则 其 辉 度 无 法 区 分, 实 验 失 败 和 重 复 的 可 能 性 较 大 192.

197 我 们 并 不 能 去 苛 求 解 决 竞 争 PCR 的 固 有 缺 陷, 1 且 随 着 核 酸 检 测 技 术 的 不 断 发 展, 利 用 更 先 进 更 可 靠 的 万 法 进 行 核 酸 定 量 己 成 为 可 能 20 世 纪 90 年 代 中 期, 随 着 各 种 自 动 化 核 酸 检 测 仪 投 入 使 用, 物 理 化 学 和 计 算 机 技 术 的 更 多 介 入, 先 后 出 现 了 多 种 较 为 准 确 的 核 酸 定 量 技 术, 使 核 酸 定 量 检 测 边 上 了 一 个 新 的 台 阶 这 些 技 术 中 比 较 典 型 的 有 杂 交 探 针 技 术 与 水 解 探 针 技 术, 它 们 有 一 个 共 同 的 特 点, 即 PCR 过 程 的 实 时 检 测 这 种 检 测 万 式 实 现 了 PCR 全 过 程 监 测, PCR 指 数 增 长 期 范 围 得 到 确 定, 为 根 据 指 数 增 长 期 产 物 量 直 接 进 行 标 本 起 始 模 板 量 计 算 奠 定 了 基 础 基 于 实 时 检 测 的 定 量 技 术 与 前 面 提 到 的 竞 争 PCR 完 全 不 同, PCR 体 系 中 无 任 何 竞 争 因 素, 不 影 响 PCR 扩 增 的 效 率 利 用 PCR 进 入 指 数 增 长 期 的 快 慢 与 其 起 始 模 板 量 之 间 的 严 格 函 数 关 系, 以 外 标 准 品 所 建 立 的 校 正 曲 线 为 尺 码, 针 对 待 检 标 本 的 直 接 定 量, 是 目 前 最 为 精 确 的 核 酸 定 量 技 术 之 一 这 类 技 术 的 另 一 个 突 出 的 优 点 在 于 利 用 了 荧 光 检 测 的 万 法 荧 光 能 量 共 振 转 移 技 术 使 PCR 反 应 体 系 中 的 可 检 测 荧 光 值 与 PCR 产 物 量 同 相 改 变, 即 检 测 到 的 荧 光 值 代 表 了 PCR 产 物 量, 实 现 了 PCR 过 程 的 闭 管 检 测, 最 大 限 度 地 避 免 了 实 验 室 污 染 全 自 动 化 的 核 酸 检 测 仪 和 成 套 商 品 化 检 测 试 剂 的 应 用, 简 化 了 临 床 实 验 的 步 骤, 规 范 了 实 验 程 序, 减 少 了 实 验 过 程 中 人 为 因 素 所 造 成 的 误 差, 使 检 测 结 果 更 为 稳 定 可 靠 与 临 床 其 他 实 验 诊 断 项 目 一 样, 全 自 动 化 检 测 是 其 发 展 的 万 向 因 此 自 动 化 荧 光 检 测 仪 的 出 现 不 仅 为 上 述 技 术 提 供 了 一 种 很 好 的 硬 件 平 台, 而 且 规 范 了 实 验 操 作, 有 利 于 实 验 室 的 检 测 质 量 控 制 下 面 分 别 介 绍 几 种 目 前 临 床 上 己 采 用 的 荧 光 检 测 技 术 第 一 节 水 解 探 针 技 术 水 解 探 针 技 术 是 目 前 临 床 应 用 最 广 泛 的 荧 光 核 酸 定 量 技 术 它 利 用 了 Taq DNA 聚 合 酶 的 5' - 3' 的 核 酸 外 切 酶 活 性, 将 PCR 技 术 与 核 酸 杂 交 检 测 技 术 结 合 在 一 起, 同 时 具 备 了 PCR 检 测 的 高 灵 敏 度 和 核 酸 杂 交 的 高 特 异 性, 是 一 种 极 有 前 途 的 核 酸 定 量 检 测 技 术 下 面 以 Taqman 技 术 为 例 介 绍 一 Taqman 技 术 的 基 本 原 理 在 PCR 反 应 体 系 中 除 特 异 性 引 物 外, 还 有 一 条 与 扩 增 靶 序 列 完 全 互 补 的 水 解 探 针, 其 5' 端 标 记 一 个 荧 光 素 靠 近 3' 端 标 记 一 个 荧 光 碎 灭 基 团 由 于 荧 光 素 与 荧 光 碎 灭 基 团 空 间 距 离 较 近, 当 外 界 一 个 激 发 光 激 发 荧 光 素 发 出 一 定 波 长 的 荧 光 后, 该 荧 光 被 荧 光 碎 灭 基 团 所 吸 收 而 无 法 被 有 效 检 测. 一 旦 探 针 被 水 解 荧 光 素 与 荧 光 碎 灭 基 团 空 间 距 离 加 大, 后 者 无 法 有 效 吸 收 被 激 发 的 荧 光, 这 时 荧 光 信 号 可 被 检 测 仪 检 测 在 PCR 反 应 的 复 性 阶 段, 当 温 度 降 低 时, 探 针 和 引 物 均 会 结 合 到 模 板 DNA 上, 随 着 寻 物 延 伸 到 探 针 处, Taq 聚 合 酶 发 挥 5' - 3' 的 核 酸 外 切 酶 活 性, 将 探 针 逐 一 水 解, 同 时 继 续 新 链 延 伸, 这 样 游 离 的 荧 光 素 发 射 光 能 被 有 效 检 测 ( 图 10-1) 随 着 PCR 反 应 的 进 行, 靶 序 列 不 断 增 加, 每 个 帽 环 结 束 时 被 水 解 的 探 针 也 随 之 增 加, 被 检 测 到 的 荧 光 值 不 断 增 强, 同 时 荧 光 信 号 的 强 度 和 DNA 的 产 量 成 正 比 通 过 每 193

198 个 帽 环 末 期 实 时 检 测 标 准 品 和 样 品 的 荧 光 值, 能 准 确 地 得 到 PCR 反 应 全 过 程 曲 线 ( 图 10-2) s 丰 注 'JI 且 PeR 引 物 延 伸... 飞 R 去 -- 飞 ~ ",. 向 JT: 据 针 - 曙 ~ h 喝 叮 ' -H M L Ad > 主 hl 曰 '<: 鳞 - ~ 嘻 坷 - 自 ;;: _._ t 叫 探 针 水 解 -... R,... 探 计 E 3 --<0 飞 \ 革 rr 链 合 成 -- R RQ报 碎 基 南 基 田 F 时 号 l 牧 I FH35 --' ' 5 --3' 一 探 针 ~------=--_'!'!!!:_ ~ 一 5' 图 10-1 Taqman 技 术 原 理 示 意 los nhnhvhhm 坦 剖 棋 e.o BDBBOD 00 才 0-' o 2 q 自 自 由 叩 lo II 扭 扭 扭 扭 扭 扭 咽 4z 'i«喃 喃 配 循 环 数 图 10-2 实 时 荧 光 定 量 per 曲 线 示 意 在 获 得 各 个 标 本 的 PCR 扩 增 曲 线 后, 计 算 机 软 件 自 动 确 定 用 于 定 量 分 析 的 扩 增 时 间 点 Cι 利 用 该 点 帽 环 数 与 标 本 起 始 模 板 量 的 函 数 关 系, 首 先 根 据 外 标 准 品 的 数 据 绘 制 作 出 校 正 曲 线 校 正 曲 线 以 数 值 为 横 坐 标 由 于 外 标 准 品 的 起 始 浓 度 己 知, 其 Ct 所 代 表 的 帽 环 数 为 纵 坐 标, 以 标 本 中 起 始 拷 贝 数 的 对 Ct 点 根 据 PCR 扩 增 曲 线 由 计 算 机 自 动 识 别, 因 此 三 个 以 上 的 外 标 准 品 可 以 做 出 一 条 回 归 系 数 达 到 1. 0 的 校 正 曲 线 得 到 一 条 可 靠 的 校 正 曲 线 后 ( 如 图 10-3), 计 算 机 自 动 根 据 待 检 标 本 的 扩 增 曲 线 所 确 定 的 194.

199 t 点 帽 环 数 计 算 出 其 模 板 的 起 始 拷 贝 数 ( 如 图 10-4, 见 插 页 ) 另 外, 将 热 帽 环 仪 与 荧 光 检 测 仪 联 合 使 用, 可 利 用 Taqman 技 术 进 行 定 性 核 酸 检 测 31-3~ 氟 川 理 需 坦 2 日 \\\\ J -4'to 1 月 u t A 号 崎 A U 2 川 A 崎 呻 ts AH A 峙 E 月 H 7 te AH A 吨 E,hvE t4 t7 tz,9 1 ' HJ 55 5 B HJ E 59 对 数 浓 度 EUD E 才 E2 E唱 " E4 B' 且 te E EU-J EB E 且 哼 d le 图 10-3 实 时 荧 光 定 量 per 校 正 曲 线 示 意 二 基 本 方 法 ( ) 材 料 与 词 刑 1. 材 料 全 自 动 热 帽 环 荧 光 检 测 一 体 机 或 热 帽 环 仪 与 荧 光 检 测 仪 2. 试 剂 Taqman 探 针 PCR 试 剂 ( 二 ) 操 作 步 骤 1. 提 取 DNA 用 各 种 万 法 提 取 标 本 中 DNA 2. 吸 取 DNA 吸 取 一 定 体 积 模 板 DNA 标 本 用 于 PCR 扩 增 ( 表 10-1, 2) 表 10-1 Taqman 反 应 体 系 组 成 PCR 组 分 10 x Taqman 缓 冲 液 肌 19Ch 脱 氧 核 昔 三 磷 酸 (dntp) AmpliTaq Gold AmpErase 寡 核 背 酸 引 物 Taqman 探 针 模 板 DNA 其 他 成 分 与 去 离 子 水 终 浓 度 1 x Taqman 缓 冲 液 2 mmol ~ 9 mmol dvtp 400 Vmol, 其 他 200 Vmol V!L (0.025 VIμI) V!L (0.01 VIμI).3μmol~lμmol, 通 常 每 条 0.5 Vmol 50 nmol ~ 250 nmol 4 mg/l~40 mg/l, 补 足 25μl 体 积. 195.

200 表 10-2 Taqman 反 应 条 件 步 骤 温 度 ee) 持 续 时 间 (min) 预 变 性 92~95 5~10 变 性 q 年 25 uζ 个 循 环 92~95 5~O.75 复 性 u 句 55~65 5~O.75 延 伸 72 75~ 1. 5 充 分 延 伸 实 验 数 据 分 析 全 自 动 热 帽 环 荧 光 检 测 一 体 机 步 骤 设 置 荧 光 分 析 本 底 ; 读 取 各 个 标 本 PCR 扩 增 Ct 值 ; 判 断 校 正 曲 线 回 归 系 数 是 否 接 近 1 ; 读 取 各 标 本 起 始 拷 贝 数 ; 热 帽 环 仪 与 荧 光 检 测 仪 步 骤 从 热 帽 环 仪 中 取 出 反 应 管 放 入 荧 光 检 测 仪 ; 读 取 各 个 标 本 荧 光 值 ; 与 阴 性 对 照 比 较, 确 定 其 阴 阳 性 三 Taqman 技 术 的 临 床 应 用 及 其 评 价 Taqman 技 术 目 前 被 广 泛 应 用 于 病 原 体 定 性 定 量 基 因 诊 断 遗 传 病 RNA / DNA 定 量 基 因 诊 断 等 主 要 的 硬 件 平 台 是 PE 公 司 的 PE , Roche 公 司 的 LightCyder, Bio - Rad 公 司 的 icyder 等 这 些 仪 器 能 全 自 动 监 测 PCR 过 程, 是 Taqman 技 术 迅 速 推 广 使 用 的 基 础 笔 者 所 在 实 验 室 对 Taqman 技 术 在 性 病 病 原 体 检 测 中 的 临 床 应 用 进 行 了 实 验 评 价, 结 果 证 实 该 技 术 检 测 的 灵 敏 度 特 异 性 均 明 显 高 于 常 规 PCR 和 培 养 法, 且 不 易 发 生 实 验 室 污 染, 不 失 为 一 种 较 好 的 实 验 室 检 测 技 术, 其 应 用 潜 力 巨 大 四 其 他 Taqman 相 关 技 术 Taqman 技 术 作 为 水 解 探 针 技 术 的 代 表, 其 作 用 在 临 床 实 践 中 己 得 到 肯 定 但 它 仍 然 有 一 些 缺 点, 其 中 最 突 出 的 是 :1 探 针 的 针 对 性 太 强, 每 种 靶 序 列 的 检 测 都 必 须 设 计 合 成 其 相 应 的 Taqman 探 针, 不 仅 设 计 质 量 得 不 到 始 终 如 一 的 保 证, 而 且 费 用 昂 贵 ;2 探 针 杂 交 区 域 局 限, 一 旦 该 区 域 发 生 断 裂 等 异 常 情 况, 检 测 结 果 会 受 到 较 大 影 响 ;3 无 法 同 时 进 行 多 位 点 检 测 针 对 这 些 问 题, 有 研 究 者 提 出 了 一 种 通 用 信 号 模 板 核 酸 检 测 技 术 (UT - PCR), 虽 然 其 本 质 仍 是 Taqman 技 术, 但 它 在 一 定 程 度 上 解 决 了 Taqman 技 术 的 一 些 缺 陷, 有 一 定 的 应 用 价 值 现 简 要 介 绍 如 下 ( ) UT- PCR 的 基 本 原 理 将 PCR 扩 增 引 物 分 为 两 个 组 成 部 分, 其 5' 端 部 分 为 特 异 的 碱 基 序 列 只 与 Taqman 探 针 互 补, 而 无 法 与 模 板 DNA 杂 交, 其 3' 端 碱 基 序 列 与 模 板 DNA 互 补, 从 而 定 义 被 扩 增 的 模 板 序 列 在 PCR 进 行 过 程 中, 引 物 一 万 面 与 模 板 DNA 发 生 部 分 杂 交, 另 一 万 面 与 Taqman 探 针 发 生 杂 交, 在 第 一 个 PCR t 盾 环 完 成 后, 形 成 了 新 的 模 板 DNA 双 链 新 模 板 上 含 有 模 板 的 被 扩 增 区 域 与 寻 物 全 序 列, 具 有 两 个 Taqman 探 针 结 合 位 点 在 随 后 的 PCR t 盾 环 中, 探 针 被 不 断 水 解, 产 生 的 荧 光 信 号 强 度 与 扩 增 产 物 量 成 正 比 ( 图 10-5). 196.

201 第 次 K 丁 R 循 环 主 ~ /R \E 第 2~35 次 -- 正 年 二 PCR 括 环 气 回 R 4 # ~~.~ A J矿 J A 骨 怦 雯 雯 ~. A L 帘 埠 工 向 那 联 口 图 10-5 UT-PCR 检 测 原 理 示 意 ( 二 ) UT- PCR 的 优 势 与 缺 陷 由 于 UT-PCR 扩 增 的 靶 分 于 序 列 较 短, 因 此 对 模 板 的 完 整 性 要 求 较 低 ; 该 万 法 采 用 通 用 Taqman 探 针, 对 同 一 靶 序 列 可 以 设 计 多 对 UT 引 物, 提 高 检 出 率, 同 时 不 同 靶 序 列 的 检 测 采 用 同 种 Taqman 探 针 也 降 低 了 检 测 的 成 本 ; 通 用 序 列 的 荧 光 探 针 与 部 分 序 列 相 同 的 引 物, 增 加 了 PCR 反 应 的 共 性, 便 不 同 靶 基 因 的 扩 增 条 件 保 持 一 致 UT PCR 的 优 势 也 决 定 了 其 固 有 的 缺 陷, 即 Taqman 探 针 杂 交 发 生 在 探 针 与 寻 物 之 间, 而 非 探 针 与 靶 基 因 之 间, 从 检 测 的 特 异 性 看, 理 论 上 似 不 及 常 规 的 Taqman 技 术 ; 另 外, Taqman 探 针 杂 交 的 通 用 序 列 在 寻 物 5' 端, 如 果 形 成 引 物 间 的 非 特 异 扩 增, 势 必 引 起 Taqman 探 针 的 水 解, 从 而 产 生 可 检 测 的 荧 光, 导 致 假 阳 性 结 果. 197.

202 第 二 节 杂 交 探 针 技 术 前 面 己 介 绍 了 水 解 荧 光 探 针 技 术 及 其 应 用, 这 里 简 要 叙 述 杂 交 探 针 技 术 进 行 定 量 核 酸 检 测 的 原 理 一 双 荧 光 探 针 杂 交 技 术 双 荧 光 探 针 杂 交 技 术 在 基 因 突 变 检 测 技 术 中 己 经 提 到, 现 主 要 介 绍 其 在 核 酸 定 量 检 测 中 的 应 用 ( ) 基 本 原 理 在 PCR 反 应 体 系 中, 除 一 对 常 规 PCR 引 物 外, 另 设 计 合 成 两 条 杂 交 探 针, 其 序 列 与 待 扩 增 的 靶 序 列 完 全 互 补, 并 且 两 探 针 序 列 呈 首 尾 相 接, 其 间 仅 间 隔 1 bp~3 bp 在 上 游 探 针 的 3'~ 击 和 下 游 探 针 的 5' 分 别 标 记 不 同 的 荧 光 染 料, 而 且 前 者 的 发 射 光 波 长 正 好 在 后 者 的 激 发 光 波 长 范 围 内 在 进 行 PCR 反 应 时, 探 针 并 不 影 响 扩 增, 而 是 在 复 性 阶 段 不 断 与 寻 物 一 样 结 合 到 靶 序 列 上 由 于 两 探 针 距 离 近, 因 此 给 予 激 发 光 激 发 上 游 引 物 3' 端 供 体 荧 光 染 料, 发 生 能 量 共 振 转 移, 其 发 射 光 能 量 转 移 到 紧 邻 的 下 游 引 物 5' 端 受 体 荧 光 染 料 上, 从 而 激 发 受 体 荧 光 染 料 发 出 可 检 测 的 荧 光 在 标 本 中 无 靶 基 因 时, 由 于 两 个 探 针 游 离 在 反 应 体 系 中, 空 间 距 离 较 远 而 无 法 发 生 共 振 能 量 转 移, 也 就 不 能 检 测 到 下 游 引 物 5' 端 受 体 荧 光 染 料 的 激 发 光 当 标 本 中 存 在 靶 基 因 时, 随 着 PCR 扩 增 的 进 行, 靶 序 列 呈 指 数 增 加, 每 次 反 应 能 结 合 到 靶 序 列 上 的 探 针 量 也 相 应 增 加, 随 之 每 个 帽 环 复 性 末 期 能 被 检 测 到 的 荧 光 信 号 强 度 也 不 断 提 高 因 此 当 对 PCR 全 过 程 进 行 实 时 监 测 时, 可 以 根 据 每 个 帽 环 检 测 到 的 荧 光 值 绘 制 出 一 个 完 整 标 准 的 PCR 曲 线 在 获 得 PCR 反 应 曲 线 后, 计 算 机 软 件 自 动 根 据 荧 光 本 底 确 定 每 个 标 本 用 于 定 量 计 算 的 值 和 外 标 准 品 的 校 正 曲 线, 进 而 根 据 每 个 待 检 标 本 的 值 计 算 出 持 检 标 本 的 起 始 拷 贝 数 ( 如 图 10-6) ( 二 ) 双 探 针 杂 交 技 术 的 II 自 床 应 用 与 自 限 双 探 针 杂 交 技 术 不 仅 能 应 用 于 基 因 突 变 检 测, 而 且 可 以 应 用 于 核 酸 定 量 检 测 其 显 著 的 优 势 在 于 两 条 探 针 杂 交, 使 PCR 扩 增 的 特 异 性 得 到 最 为 可 靠 的 保 证 ; 其 次, 该 技 术 所 获 得 的 荧 光 信 号 特 异 性 代 表 了 扩 增 产 物 数 量, 非 特 异 扩 增 不 会 产 生 可 收 集 的 荧 光 信 号, 因 此 其 根 据 荧 光 信 号 进 行 的 定 量 计 算 是 比 较 精 确 的 ; 其 三, 全 过 程 闭 管 操 作, 避 免 了 PCR 产 物 的 实 验 室 污 染 配 合 全 自 动 热 帽 环 荧 光 检 测 仪, i 亥 技 术 可 实 现 自 动 化 操 作, 成 为 一 种 极 有 应 用 前 景 的 核 酸 定 量 检 测 技 术 然 而, 该 技 术 同 样 存 在 探 针 设 计 技 术 要 求 高 试 剂 成 本 较 高 及 硬 件 设 备 价 格 昂 贵 等 问 题, 妨 碍 了 它 的 推 广 使 用 二 分 子 信 标 技 术 分 于 信 标 技 术 (molecular beacons) 也 是 荧 光 探 针 杂 交 技 术 之 一, 主 要 应 用 于 核 酸 198.

203 飞. per 扩 增 主 运 性 末 期 收 集 荧 光 I 哩, 随 着 棋 板 的 增 1Jl j, F2 值 不 断 增 皿 E 口 11.0 坦 荆 剧 协 1 口 D 一 go 一 g.o 一 J.CH 5.0- 叫 ' 且 因 i.o 叫 口 / 边 接 写 F A 乡 F /~ 在 扩 丘 五 // d 安 号 弘 公 ζ /4fl "' \ \ 恬 环 数 制 除 四 阜 2. 27? 白 - \\ 23 飞 飞 飞 \\\ 飞 \ 22 2<- >1- "U 斗 斗 "'I.:.! "'I.:::: ::1 4_~ 4_:::: 4 日 b_u 0_1 b.'.,!' to 对 教 浓 度 图 10-6 双 探 针 杂 交 荧 光 实 时 定 量 per 原 理 示 意 199.

204 定 量 检 测 其 基 本 原 理 与 上 述 定 量 万 法 不 尽 相 同 在 PCR 反 应 体 系 中 除 引 物 外, 加 入 了 一 条 杂 交 探 针 杂 交 探 针 结 构 包 括 一 个 核 心 杂 交 区 域, 碱 基 序 列 与 检 测 的 靶 序 列 完 全 互 补 ; 另 外 在 核 心 区 域 的 两 侧 各 有 互 补 的 数 个 碱 基, 这 样 在 常 温 下, 探 针 两 端 互 补 的 碱 基 相 互 配 对 形 成 一 个 " 发 夹 " 结 构 在 探 针 的 5' 端 和 3' 端 分 别 标 记 荧 光 素 和 荧 光 碎 灭 基 团, 当 探 针 呈 " 发 夹 " 结 构 时, 由 于 5' 端 和 3' 端 连 续 多 个 碱 基 完 全 互 补, 使 两 个 标 记 物 的 空 间 距 离 很 近 ; 当 用 激 发 光 剌 激 时, 5'~ 自 荧 光 素 的 发 射 光 被 3'~ 击 碎 灭 基 团 所 吸 收 而 无 法 检 测 到 在 PCR 变 性 过 程 中, 探 针 的 " 发 夹 " 结 构 在 高 温 下 解 链, 复 性 时 探 针 核 心 部 分 直 接 与 靶 序 列 结 合, 从 而 使 部 分 探 针 荧 光 素 与 碎 灭 基 团 分 离, 这 时 荧 光 素 的 发 射 光 可 以 被 有 效 检 测 ( 图 10-7) PCR 反 应 体 系 组 成 A= AAA C At A A A E B AAA3 r A C O U CF C E - 7 岛 画 二 r + Iii J 古 1 付 嗒 J' ~. 链 DNA 变 性 与 重 性, 发 夹 酣 卡 与 模 植 杂 交, Q 与 F 分 开, 在 重 性 末 期 收 集 F 荧 光 III; ~ 复 性 y 忆 期 与 模 板 杂 变 的 提 针 重 新 恢 复 发 文 状, 收 集 不 到 荧 光 A AZ AAA, E < t c E h 马 A t AGAGEaMHV ' AAA= 图 10-7 分 子 信 标 技 术 定 量 per 原 理 示 意 i 亥 万 法 定 量 的 基 础 在 于 探 针 与 靶 序 列 的 结 合 量 直 接 与 靶 序 列 的 数 量 相 关, 而 探 针 的 结 合 量 直 接 决 定 了 供 检 测 的 荧 光 值 因 此 将 荧 光 值 与 靶 序 列 数 量 直 接 联 系 在 一 起 通 过 实 时 检 测 标 准 品 和 样 品 的 荧 光 曲 线 能 准 确 地 计 算 样 品 的 靶 序 列 浓 度. 200.

205 第 二 节 SYBR Green I 荧 光 染 料 模 式 各 种 探 针 技 术 结 合 全 自 动 热 帽 环 荧 光 检 测 仪 在 核 酸 定 量 中 的 应 用, 不 仅 使 核 酸 定 量 工 作 的 质 量 大 大 向 前 迈 进 了 一 步 而 且 给 核 酸 定 量 技 术 的 不 断 发 展 指 明 了 万 向 SYBR gree 口 I 荧 光 染 料 模 式 结 合 熔 点 曲 线 分 析 是 核 酸 定 量 荧 光 实 时 检 测 技 术 中 的 又 一 个 成 员, 但 它 与 探 针 技 术 有 着 不 同 的 定 量 原 理 和 应 用 范 围 一 基 本 原 理 SYBR gree 口 I 是 一 种 无 毒 无 害 的 荧 光 染 料, 与 漠 化 乙 皖 一 样, 它 能 特 异 性 嵌 入 双 链 DNA, 在 受 到 外 来 激 发 光 剌 激 时, 产 生 强 烈 的 可 检 测 荧 光 双 链 DNA 浓 度 越 高, 检 测 到 的 荧 光 值 越 大 在 PCR 过 程 中, SYBR gree 口 I 与 其 他 试 剂 一 样 在 扩 增 前 以 极 低 浓 度 加 入 反 应 体 系 中 在 反 应 体 系 中 有 模 板 DNA 存 在 情 况 下, 在 每 一 个 PCR t 盾 环 的 延 伸 末 期 定 时 收 集 荧 光 信 号 由 于 靶 基 因 得 到 越 来 越 多 的 扩 增, 因 此 SYBR gree 口 I 荧 光 信 号 也 随 着 帽 环 的 进 行 越 来 越 强, 并 最 终 将 每 个 帽 环 所 检 测 到 的 荧 光 值 连 接 起 来 得 到 一 条 实 时 的 PCR 扩 增 曲 线 在 获 得 该 曲 线 后, 并 不 能 直 接 进 行 定 量 分 析, 而 必 须 先 进 行 熔 点 曲 线 分 析 以 判 断 扩 增 中 收 集 到 的 荧 光 信 号 的 特 异 性 高 低 我 们 不 难 看 出, SYBR green I 模 式 进 行 核 酸 定 量 检 测 的 最 大 优 点 是 万 便 快 速 一 万 面 避 免 了 探 针 技 术 中 对 探 针 设 计 合 成 的 严 格 要 求 与 较 高 的 检 测 成 本, 另 一 万 面 同 样 实 现 了 完 全 的 无 害 闭 管 操 作, 避 免 了 对 操 作 人 员 的 危 害 和 实 验 室 的 污 染 然 而 该 技 术 有 一 个 最 大 的 缺 点 是 荧 光 信 号 的 特 异 性 得 不 到 保 证 与 探 针 技 术 只 收 集 特 异 性 荧 光 信 号 不 同, SYBR gree 口 I 模 式 检 测 收 集 到 得 荧 光 信 号 不 仅 包 含 了 靶 基 因 扩 增 片 段 中 嵌 入 的 荧 光 染 料 信 号 而 且 还 包 括 了 反 应 体 系 中 诸 多 非 特 异 扩 增 双 链 与 引 物 聚 合 体 荧 光 染 料 结 合 所 发 出 的 荧 光 因 此, 如 何 判 断 荧 光 信 号 中 特 异 性 部 分 得 高 低 是 进 行 定 量 检 测 得 关 键 前 面 所 介 绍 的 熔 点 曲 线 是 在 PCR 结 束 后 进 行 一 次 0.1 'c / s 的 逐 渐 缓 慢 地 升 温 过 程, 并 进 行 连 续 的 荧 光 收 集 这 样 可 获 得 DNA 变 性 过 程 中 双 链 DNA 逐 渐 减 少, 荧 光 值 不 断 下 降 的 熔 点 曲 线, 通 过 计 算 机 拟 和 可 以 计 算 出 某 一 温 度 范 围 内 荧 光 变 化 值, 进 而 获 得 某 一 片 段 的 L 曲 线 由 于 反 应 体 系 中 不 同 双 链 片 段 碱 基 组 成 和 长 度 的 差 异, 其 L 值 也 会 出 现 较 大 差 异 这 样 可 以 通 过 熔 点 曲 线 分 析 区 别 出 一 个 反 应 体 系 中 特 异 性 荧 光 信 号 的 强 弱, 进 而 判 断 能 否 进 行 准 确 的 定 量 分 析 ( 如 图 10-8). 201.

206 SYBRgr 回 11 不 掺 入 单 链 DNA 青 青 世 育 1 曲 * 一 否 世 食 PCR 扩 增 找 得 大 量 DNA 现 睦 口 :::r::;.:!i:: 口 \/\/\/ SYBR 胃 回 11 掺 入 双 链 DNA z 营 T 哇 并 提 出 荧 光 E 6.' 6.0- li.ti , 主 q 4 才 5 司 42n 棋 2_~- OJ::i-,., -o.t'i- I I I I I I I I I I I I,,, 1 ;: 3 '1 ~ ~ ;< 8 II 1 日 l' 12 日 14 1Ci 11J 日 ~U 21 'll 'lfj ;:Q V 画 2( ao 31 az 33 J 吗 面 帽 环 数 随 着 per 产 物 的 增 加, S BR green I 荧 光 恒 不 断 提 高 阴 性 1 j 熙 几 坦 ~ 1.0 生 ~ " 略 武 M /,/ 二 二 二 na-; ~~D ~(J ro.d "" 胃 口 E 口 强 度 ('C) 82.D :;F 巴 0310.:1 ~ED (IIJJJ GZ_C 熔 点 曲 线 分 析 以 保 证 获 得 特 异 性 荧 光 值 用 于 定 量 分 析 图 10-8 SYBR green I 模 式 定 量 检 测 原 理 示 意 202.

207 因 此 我 们 可 以 认 为, 在 利 用 SYBR green I 模 式 进 行 核 酸 定 量 时, 其 最 大 的 前 提 条 件 是 获 得 一 个 最 优 的 PCR 反 应 体 系 和 PCR 反 应 条 件 以 避 免 过 多 的 非 特 异 扩 增 发 生 与 引 物 聚 合 体 的 形 成 其 次 在 实 验 设 计 中 尽 量 扩 增 较 大 的 片 段 以 便 靶 片 段 的 L 值 处 于 较 高 的 水 平, 同 时 有 利 于 区 分 开 靶 片 段 与 其 他 非 特 异 片 段 的 熔 点 曲 线 峰 值 这 样 在 实 时 检 测 收 集 荧 光 信 号 时, 可 以 适 当 提 高 荧 光 收 集 时 的 温 度 如 从 以 前 的 72 'c 收 集 荧 光 提 高 到 85 'c 收 集 荧 光, 以 尽 量 避 开 非 特 异 的 荧 光 信 号, 而 保 留 特 异 性 信 号 以 上 提 到 了 SYBR gree 口 I 模 式 进 行 核 酸 定 量 检 测 中 的 问 题 和 可 能 的 解 决 办 法, 需 要 大 家 从 应 用 中 去 理 解 掌 握 在 进 行 熔 点 曲 线 分 析 判 断 己 获 得 较 为 特 异 的 PCR 实 时 检 测 曲 线 后, 定 量 步 骤 与 其 他 自 动 荧 光 检 测 分 析 程 序 一 样, 通 过 帽 环 Ct 值 的 确 定 和 外 校 正 曲 线 的 建 立, 计 算 出 各 个 标 本 起 始 的 模 板 拷 贝 数 二 II 备 床 应 用 SYBR green I 模 式 具 有 简 便 快 速 等 显 著 优 点, 其 基 本 操 作 与 常 规 PCR 差 别 不 大, 反 应 体 系 中 加 入 极 低 浓 度 的 SYBR green I 荧 光 染 料 ( 如 1/10 000) 对 PCR 扩 增 影 响 不 大, 因 此 它 是 一 种 各 实 验 室 可 以 自 行 设 计 的 实 验 但 应 注 意 PCR 反 应 的 特 异 性 问 题, 尽 管 可 以 采 取 一 些 措 施 来 提 高 特 异 性 荧 光 的 收 集, 而 非 特 异 信 号 始 终 有 部 分 重 叠 在 荧 光 信 号 中, 因 此 其 定 量 检 测 的 准 确 性 与 探 针 技 术 比 较 仍 有 一 定 的 差 距 SYBR gree 口 I 模 式 结 合 熔 点 曲 线 分 析 进 行 核 酸 定 性 检 测 是 绰 绰 有 余 的 目 前 SYBR gree 口 I 模 式 在 临 床 上 未 用 于 病 原 体 定 量 检 测, 而 在 特 异 性 基 因 与 基 因 表 达 产 物 鉴 定 与 定 量 上 却 有 应 用 ( 杨 元 ) 参 考 文 献 1 De SilvaD, herrmnn M, TabitiK& Wittwer C. Rapid Genotying and Quantion on the LightCyclerTM with Hybridization Probes. Biochemica, 1998, 2: 12 2 K hler T, Thamm B, Laner D, et a1. Quantitation of mrna by polymerase chain reac tion. Springer lab manual. Springer Verlag Heidelberg, Rasmussen R, Morrision T, Herrmann M& Wittwer C. Quantitative PCR by Continous Fluo rescence Monitoring of a Double Strand DNA Specific Binding Dye. Biochemica. 1998, 2: 8 4 Scheinert P. QuantitativePCR. BioTec, 1998, 1: 58 5 Wittwer C, Ririe K, Rasmussen R. Fluorescence Monitoring of Rapid Cycle PCR for Quantifica tion. In: Boston Birkhauser, Eds. F. Ferre, Immune Response Corporation, CA: Gene Quantification: Methods and Applications, Birkhauser Boston, Zimmermann K, Mannhalter JW. Technical Aspects of Quantitative Competitive PCR. Bio Techniques, 1996, 21: Heid CA, Stevens J, Livak KJ, et a1. Real time quantitative PCR. Genome Res, 1996, 6: Schmittgen TD. Real- time quantitative PCR. Methods, 2001, 25: Bieche I, Olivi M, Champeme MH, et a1. Novel approach to quantitative polymerase chain reac

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209 第 十 一 章 DNA 序 列 测 定 技 术 核 酸 的 基 本 组 成 单 位 是 核 昔 酸 核 昔 酸 又 是 由 磷 酸 基 团 戊 糖 和 碱 基 通 过 一 定 的 结 合 万 式 构 成 的 组 成 核 昔 酸 的 戊 糖 有 核 糖 和 脱 氧 核 糖 两 种, 含 有 核 糖 的 核 酸 为 核 糖 核 酸 (RNA), 含 有 脱 氧 核 糖 的 为 脱 氧 核 糖 核 酸 (DNA) 构 成 DNA 的 碱 基 主 要 有 4 种 : 腺 口 票 岭 (A) 鸟 口 票 岭 ( G) 胞 唔 陡 ( C) 胸 腺 口 密 陡 (T), 构 成 RNA 的 碱 基 也 有 4 种 : 腺 嘿 岭 (A) 鸟 嘿 岭 (G) 胞 口 密 陡 (C) 尿 口 密 院 (D) 虽 然 组 成 核 酸 的 碱 基 只 有 4 种, 但 它 们 的 不 同 排 列 组 合 构 成 了 千 差 万 别 的 核 酸, 而 且, 正 是 这 些 核 酸 的 序 列 决 定 了 其 二 级 三 级 结 构 以 及 决 定 了 其 编 码 的 蛋 白 质 的 序 列, 核 酸 序 列 改 变 导 致 核 酸 的 功 能 变 异, 并 引 起 遗 传 性 疾 病 如 镰 形 细 胞 性 贫 血 是 由 于 自 珠 蛋 白 基 因 中 一 个 碱 基 的 变 异 所 致 核 酸 序 列 测 定 就 是 指 利 用 一 定 的 技 术 万 法 测 定 出 核 酸 高 分 于 中 碱 基 的 排 列 顺 序 由 于 生 命 的 遗 传 信 息 储 存 在 核 酸 的 序 列 之 中, 了 解 各 种 生 物 基 因 组 中 核 酸 序 列 的 基 本 情 况, 将 有 利 于 更 深 入 地 了 解 生 命 的 本 质 核 酸 序 列 分 析 的 研 究 及 实 践 己 经 进 行 了 多 年 1977 年, 英 国 科 学 家 出 口 ger 创 造 了 酶 法 测 序 双 脱 氧 链 终 止 法, 完 成 了 φx174 DNA 全 序 列 个 核 昔 酸 的 测 定 同 年, 美 国 科 学 家 Maxam 和 Gilbert 创 立 了 化 学 法 测 序 技 术 化 学 阵 解 法, 并 于 1978 年 用 该 法 测 定 了 SV40 DNA 的 5224 个 核 昔 酸 这 两 种 万 法 的 建 立 使 DNA 序 列 测 定 在 万 法 学 上 获 得 一 次 飞 跃, 为 此, Sanger, Maxam 和 Gilbert 共 同 获 得 1990 年 诺 贝 尔 化 学 奖 现 行 的 核 酸 序 列 分 析 万 法 都 是 以 上 述 两 种 万 法 为 基 础, 综 合 了 DNA 操 作 新 技 术 而 不 断 改 进 和 创 新 形 成 的 首 先 是 M13 噬 菌 体 载 体 的 构 建, 解 决 了 制 备 单 链 模 板 的 难 题 ; 后 来 是 质 粒 载 体 的 应 用, 又 解 决 了 直 接 对 双 链 模 板 的 测 序 ; 而 以 荧 光 素 取 代 放 射 性 核 素 用 于 核 酸 序 列 测 定, 则 最 后 发 展 成 高 通 量 (high throughout) 的 DNA 的 自 动 测 序 技 术 由 于 DNA 聚 合 酶 的 不 断 修 饰 和 荧 光 底 物 的 不 断 更 新, 在 很 长 的 一 段 时 间 里, 荧 光 测 序 法 保 持 其 主 导 地 位, 毛 细 管 电 泳 也 正 在 取 代 平 板 电 泳 运 今 己 有 美 国 PE 公 司 瑞 典 的 Pharmacia Biotech 公 司 等 商 家 推 出 的 多 种 全 自 动 DNA 测 定 仪 问 世, 这 是 DNA 序 列 测 定 的 又 一 次 飞 跃 启 动 于 1990 年 的 人 类 基 因 组 计 划 (human genome project, HPG) 借 助 于 这 些 高 通 量 测 序 手 段, 现 己 基 本 完 成 整 个 人 类 基 因 组 中 3 X 10 9 bp 的 全 序 列 测 定 和 基 因 制 图 该 计 划 完 成 后, 人 类 基 因 组 计 划 将 由 结 构 基 因 组 学 (stuctural ge nomics) 时 代 进 入 以 功 能 基 因 组 学 (functional genomics) 研 究 为 主 的 后 基 因 组 计 划 (post genome proj ect) 时 代 同 时, 对 人 类 遗 传 密 码 的 破 译 将 为 人 类 健 康 带 来 极 大 的 好 处 一 DNA 序 列 分 析 的 原 理 在 DNA 序 列 测 定 中, 目 前 最 常 用 的 仍 然 是 酶 法 双 脱 氧 链 终 止 法 (dideoxyribo nucleic acid chain termination) 和 化 学 阵 解 法 这 两 种 经 典 的 万 法 二 者 都 利 用 了. 205.

210 DNA 半 保 留 复 制 的 特 点, 即 在 体 外 复 制 系 统 中 使 新 合 成 的 DNA 链 不 同 程 度 地 终 止 或 断 裂, 再 配 以 一 定 的 检 测 手 段, 直 接 读 取 DNA 序 列 ( 一 ) Maxam - Gilbert 化 学 降 解 法 测 序 的 原 理 Maxam - Gilbert 化 学 阵 解 法 ( 简 称 化 学 法 ) 由 Maxam 和 Gilbert 于 1977 年 创 立 其 基 本 原 理 是 把 5' 末 端 放 射 性 核 素 标 记 的 DNA 用 碱 基 专 一 的 化 学 试 剂 分 别 进 行 修 饰, 使 相 应 核 昔 酸 间 的 糖 昔 键 因 不 稳 定 而 断 裂, 再 使 该 处 的 磷 酸 核 糖 骨 架 断 裂, 得 到 以 特 定 碱 基 为 3' 末 端 的 四 组 片 段 这 些 片 段 随 后 用 变 性 聚 丙 烯 酌 肢 凝 胶 电 泳 分 离, 再 经 过 放 射 自 显 影 即 可 直 接 i 卖 出 核 昔 酸 的 序 列 这 项 技 术 一 般 可 以 测 出 距 离 标 记 位 点 250 个 核 昔 酸 以 内 的 DNA 序 列 如 果 使 用 1m 长 的 测 序 胶, 则 一 次 性 i 卖 出 的 核 昔 酸 数 目 可 以 超 过 600 个 在 这 种 万 法 中, DNA 被 特 异 性 切 割 是 基 于 硫 酸 二 甲 国 旨 和 脚 的 作 用 它 们 能 特 异 地 修 饰 并 将 碱 基 从 其 糖 基 上 除 去, 再 在 一 定 条 件 下 使 核 酸 骨 架 断 裂 其 中 硫 酸 二 甲 醋 破 坏 嘿 岭, 它 能 使 鸟 瞟 岭 甲 基 化 甲 基 化 的 嘿 岭 脱 落, 在 碱 性 条 件 下 加 热 己 脱 口 票 岭 的 DNA, 磷 酸 二 醋 键 就 会 断 裂 由 于 G 被 甲 基 化 的 速 度 比 A 快 5 倍, 所 以 在 放 射 自 显 影 图 上 能 看 到 深 浅 不 同 的 条 带 (G 道 ), 深 带 相 当 于 在 G 断 裂 产 生 的 片 段, 浅 带 相 当 于 在 A 处 断 裂 产 生 的 片 段 然 而, 若 将 甲 基 化 了 的 DNA 片 段 先 用 稀 盐 酸 处 理, 则 脱 口 票 岭 反 应 主 要 发 生 在 A 位 置 上, 因 为 此 时 甲 基 化 腺 昔 的 糖 昔 键 不 如 甲 基 化 鸟 昔 的 糖 昔 键 稳 定 这 时 再 用 碱 基 断 开 磷 酸 二 醋 键, 即 得 到 A + G 道 的 条 带 将 A + G 道 和 平 行 的 G 道 加 以 比 较 就 可 以 区 分 磷 酸 核 糖 骨 架 断 裂 发 生 于 A 处 还 是 G 处 胞 口 密 院 ( C) 和 胸 腺 口 密 院 (T) 可 受 月 井 的 作 用 分 解, 然 后 由 赈 院 催 化 日 反 应, 使 磷 酸 基 脱 落 这 些 反 应 造 成 了 在 C 和 T 处 的 断 裂 (C + T 道 ) 为 了 辨 别 这 两 种 唔 睫, 可 使 另 一 管 在 2 ma l/ L 的 NaCl 溶 液 中 进 行 酣 解, 这 时 T 的 反 应 受 到 抑 制, 产 生 的 条 带 相 当 于 C 位 置 (C 道 ) 比 较 G, A + G, C + T 和 Ci 革 的 条 带, 就 可 i 卖 出 DNA 序 列 ( 图 11-1) ( 二 ) Sa 吨 er 双 脱 氧 链 终 止 ; 去 Sa 吨 盯 在 双 脱 氧 链 终 止 法 中 独 创 性 地 使 用 了 特 异 寻 物, 特 异 引 物 在 DNA 聚 合 酶 的 作 用 下 进 行 延 伸 反 应 正 常 的 体 外 合 成 体 系 中, DNA 聚 合 酶 在 引 物 的 引 导 下 沿 着 模 板 链 的 3' 5' 万 向 移 动, 利 用 反 应 体 系 中 的 4 种 dntp 沿 5' 3' 万 向 合 成 一 条 与 模 板 互 补 的 新 链 在 体 系 中 加 入 2', 3' 双 脱 氧 核 昔 三 磷 酸 (ddntp), 当 它 们 掺 入 正 在 合 成 的 新 链 DNA 后, 由 于 其 脱 氧 核 糖 的 3' 位 缺 少 一 个 起 基, 从 而 不 能 与 后 续 dntp 的 5' 磷 酸 基 团 之 间 形 成 磷 酸 二 醋 键, 新 链 DNA 的 合 成 终 止 这 样, 在 DNA 合 成 体 系 中 既 有 正 常 反 应 所 需 的 4 种 dntp, 又 有 一 定 比 例 的 ddntp, 新 合 成 的 DNA 链 在 可 能 掺 入 该 种 核 昔 酸 的 位 置 均 有 可 能 随 机 终 止 由 于 存 在 这 种 ddntp 与 同 种 dntp 的 竞 争, 合 成 产 物 即 为 一 系 列 长 度 不 同 的 多 核 昔 酸 片 段 这 些 片 段 的 5' 端 即 引 物 端 是 固 定 的, 而 终 止 位 置 (ddntp 掺 入 的 位 置 ) 则 随 模 板 链 碱 基 序 列 而 改 变 一 般 在 一 次 测 序 反 应 中 设 置 一 套 4 组 反 应, 每 一 组 反 应 体 系 中 分 别 加 入 4 种 ddntp 中 的 一 种, 其 余 成 分 相 同 这 些 ddntp 将 分 别 终 止 于 模 板 链 与 其 互 补 的 每 一 个. 206.

211 32 p G (A + G) C CC + T) 马 ACACTGAArGTTCATGTCGA. I me P ACACTGAACGTTGATGTCGA. P I me ACACTGAACGTTCATGTCGA 飞 I me P ACACTGAACGTTCATGTCGA.. t me 32 p 仅 一 端 带 有 放 射 性 标 记 的 靶 DNA A>C 进 行 5 组 瞄 基 特 异 性 的 裂 解 反 应 PLrumL AFLhyFlunvFL AAAAAA T 川 - 坦 T E A A 坦 A A P 中 I MM FUPU 户 J U 户 FU 口 户 A m4 U L 且 ACAC 阳 CGTfATGTC 蹦 且 完 电 流 分 析 放 射 怀 记 的 DNA 片 段 图 11-1 Maxam - Gilbert 化 学 降 解 法 测 序 原 理 示 意 A, C, G Ejj(; T 位 置 上 将 4 组 合 成 产 物 分 别 点 样 于 含 有 尿 素 的 聚 丙 烯 酌 肢 凝 胶 的 4 个 点 样 孔 上, 经 过 高 压 电 泳 分 离, 即 可 将 长 度 仅 相 差 1 个 核 昔 酸 的 DNA 单 链 分 开 按 照 加 样 的 顺 序, 即 可 判 断 与 模 板 互 补 的 新 生 链 的 序 列 ( 图 11-2) Maxam - Gilbert 化 学 法 和 Sanger 链 终 止 法 测 序 同 时 问 世, 前 者 不 但 重 复 性 好, 而 且 更 容 易 为 普 通 研 究 人 员 所 掌 握, 只 需 要 一 些 常 见 而 又 简 单 的 试 剂 ; 后 者 需 要 单 链 模 板 特 异 性 寡 核 昔 酸 寻 物 以 及 高 质 量 的 DNA 聚 合 酶, 使 用 起 来 不 如 Maxam - Gil bert 化 学 法 然 而, 随 着 M13 噬 菌 体 和 其 他 类 型 载 体 的 开 发 利 用 引 物 合 成 的 普 及 以 及 测 序 技 术 的 日 臻 完 善, 双 脱 氧 链 终 止 法 如 今 远 比 Maxam - Gilbert 法 应 用 得 广 泛 不 过, 化 学 阵 解 法 始 终 具 有 一 个 明 显 的 优 点, 即 它 所 测 定 的 序 列 直 接 来 源 于 DNA 分 于, 而 不 是 酶 促 合 成 反 应 所 产 生 的 拷 贝, 既 可 避 免 DNA 复 制 过 程 中 的 错 误 掺 入, 还 可 以 通 过 化 学 保 护 及 甲 基 化 干 扰 实 验 来 研 究 DNA 二 级 结 构 及 蛋 白 质 与 DNA 的 相 互 作 用 事 实 上, Maxam - Gilbert 法 正 是 在 体 外 研 究 lac 阻 抑 物 与 lac 操 纵 基 因 相 互 作 用 时 酝 酿 发 展 起 来 的, 如 今 它 也 主 要 是 应 用 于 这 一 万 面. 207.

212 5' GTTGCAATGCT CAACGTTCGA 3' ~DNA 聚 合 酶 3' 模 板 5' 寻 牧 l 时 ATP/ddATP dctp dgtp dttp 本 AGCddA *AGC 丰 ATTGCddA 本 AGC 丰 ATTGC 丰 Ad da 串 da TP dctp/ddctp dgtp dttp F 的 终 I 时 长 串 AGddC 丰 AGC 丰 ATTGddC 丰 AGC 丰 ATTGC 牢 A*AddC *datp dctp dgtp/ddgtp dttp 申 :AddG *AGC 中 ATTddG 栅 邮 A C G T 凝 股 电 璋 的 方 向 AGCATTGCAAC AGCATTGCAA AGCATTGCA AGCATTGC AGCATTG AGCATT AGCAT AGCA AGC AG 图 11-2 Sanger 双 脱 氧 链 终 止 法 DNA 序 否 IJ 分 析 的 原 理 示 意 DNA 序 列 测 定 的 方 法 根 据 所 测 序 的 DNA 的 性 质 可 分 为 单 链 测 序 和 双 链 测 序, 根 据 所 用 标 记 物 的 不 同 又 可 分 为 放 射 性 核 素 标 记 测 序 和 荧 光 素 标 记 测 序 此 外, 还 可 按 照 测 序 的 条 件 分 为 恒 温 测 序 和 循 环 测 序 ( 一 ) 单 链 测 序 Sa 吨 er 所 设 计 的 双 脱 氧 链 终 止 法 在 初 期 是 使 用 单 链 DNA 模 板, 因 此 单 链 模 板 尤 为 重 要, 但 在 当 时 却 是 该 法 的 限 制 因 素 M13 系 列 载 体 的 寻 入 使 这 一 问 题 迎 刃 而 解 单 链 测 序 的 基 本 步 骤 如 下 1. 单 链 DNA 的 制 备. 208.

213 (1) 以 M13 为 载 体 : M13 感 染 细 胞 后 并 不 使 细 胞 裂 解, 而 是 将 成 熟 的 病 毒 颗 粒 释 放 到 胞 外, 因 而 制 备 模 板 DNA 的 万 法 也 比 较 简 单 普 遍 采 用 聚 乙 二 醇 (PEG) 沉 淀 法 (2) PCR 法 : 用 于 测 序 的 单 链 DNA 模 板 可 以 通 过 不 对 称 PCR 获 得 其 主 要 原 理 是 在 PCR 的 扩 增 过 程 中, 两 条 引 物 浓 度 为 50 : 1 或 100 : 1 合 成 的 单 链 DNA 可 用 作 测 序 的 模 板, 用 原 引 物 E\l(; 内 侧 引 物 测 序 2. 双 脱 氧 链 终 止 反 应 现 今 己 有 许 多 现 成 的 DNA 测 序 试 剂 盒, 这 些 试 剂 盒 含 有 测 序 所 需 的 大 多 数 成 分, 如 DNA 聚 合 酶, 4 种 dntp 和 ddntp, 反 应 缓 冲 液 以 及 通 用 引 物 等 一 般 采 用 放 射 性 核 素 标 记, 参 照 试 剂 盒 所 提 供 的 说 明 进 行 操 作, 均 可 获 得 满 意 的 效 果 3. 测 序 胶 高 压 电 泳 及 放 射 自 显 影 测 序 胶 一 般 为 含 8 mo l/ L 尿 素 的 变 性 胶, 在 灌 制 时 要 尽 量 避 免 产 生 气 泡 测 序 胶 的 电 泳 最 好 采 用 高 电 压, 一 般 在 V 以 上 采 用 高 电 压 的 好 处 是 能 使 条 带 更 细 更 集 中, 因 而 分 辨 率 更 高 然 而, 高 电 压 会 引 起 测 序 胶 发 热, 若 整 块 胶 受 热 不 均 匀 则 会 使 条 带 弯 曲 因 此, 一 般 应 在 测 序 系 统 中 加 上 恒 温 板, 使 整 块 胶 的 温 度 比 较 均 一 这 样, 一 万 面 可 减 少 条 带 的 弯 曲 现 象, 另 一 万 面 也 可 帮 助 打 开 DNA 片 段 中 的 二 级 结 构 4. DNA 序 列 的 阅 读 DNA 序 列 的 人 工 阅 读 需 要 一 定 的 经 验, 而 现 今 己 有 一 些 阅 读 放 射 自 显 影 胶 片 的 软 件, 可 帮 助 判 读 DNA 序 列 ( 二 ) 双 链 测 序 随 着 DNA 测 序 技 术 的 不 断 改 进 和 完 善, 双 链 DNA 测 序 己 越 来 越 多 地 被 采 用 一 般 而 言, 可 将 待 测 DNA 片 段 克 隆 在 质 粒 载 体 上,E\l(; 直 接 采 用 PCR 产 物 进 行 测 序 与 单 链 DNA 测 序 比 较, 双 链 测 序 具 有 以 下 优 点 :1 较 大 的 插 入 片 段 在 质 粒 载 体 上 稳 定 性 更 好 ;2 操 作 万 便 省 时 省 力, 避 免 了 制 备 M13 单 链 DNA 模 板 的 繁 杂 工 作 双 链 测 序 可 以 标 记 寻 物 E\l(;ddNTP, 这 取 决 于 所 用 的 DNA 模 板 是 质 粒 DNA 或 是 PCR 产 物 若 是 质 粒 DNA, 可 采 用 标 记 引 物 E\l(;ddNTP 的 万 法, 若 是 PCR 产 物, 则 以 标 记 ddntp 为 好 1. 经 典 法 一 般 质 粒 DNA 大 都 采 用 双 链 测 序, 并 采 用 标 记 寻 物 的 万 法 其 中 较 常 用 的 质 粒 载 体 有 PUC 系 列 PGEM 系 列 以 及 Pbluescript 系 列 这 些 载 体 上 的 多 克 隆 位 点 便 于 外 源 性 DNA 的 插 入, 而 多 克 隆 位 点 两 端 都 带 有 便 于 测 序 引 物 互 补 结 合 的 序 列, 如 M13 正 反 向 测 序 引 物 SP6 引 物 序 列 T7 引 物 序 列 T3 号 物 序 列 等 这 些 寻 物 都 己 商 品 化, 容 易 获 得 一 般 而 言, 应 用 质 粒 DNA 测 序 结 果 比 较 稳 定, 可 i 卖 序 列 较 长 双 链 DNA 模 板 的 制 备 可 采 用 碱 裂 解 法 E\l(; 煮 沸 法, 也 可 采 用 现 成 的 试 剂 盒 ( 如 QlAGEN 公 司 的 Plasmid Kits, Bio - Rad 公 司 的 Prep - A - Gene ) 提 取 纯 化 后 的 双 链 DNA 模 板 需 经 变 性, 分 离 成 单 链 DNA 才 能 进 行 测 序 常 用 的 万 法 为 碱 变 性 和 加 热 变 性 接 下 来 的 测 序 步 骤 与 单 链 DNA 测 序 相 同 2. PCR 产 物 测 序 法 用 PCR 万 法 扩 增 靶 DNA, 随 后 用 扩 增 的 DNA 产 物 直 接 进 行 测 序, 己 成 为 快 速 分 子 生 物 学 分 析 研 究 极 有 用 的 策 略 采 用 这 一 策 略, 可 完 全 省 去 首 209

214 先 进 行 PCR 产 物 克 隆 这 一 耗 时 的 步 骤, 而 且 可 直 接 从 粗 制 的 生 物 样 品 中 得 到 目 的 DNA 序 列, 既 省 时 省 力 又 万 便 快 捷 通 常 采 用 标 记 ddntp 的 万 法 进 行 帽 环 测 序 现 今 己 有 PE 公 司 和 Pharmacia 公 司 等 研 制 了 相 应 的 测 序 试 剂 盒 这 种 万 法 省 去 了 克 隆 等 复 杂 步 骤, 现 在 己 越 来 越 多 地 被 采 用 ( 三 ) 用 E l. 射 性 极 秦 标 记 进 行 DNA 测 序 如 前 所 述, DNA 序 列 分 析 是 基 于 DNA 的 化 学 阵 解 或 使 用 双 脱 氧 核 昔 酸 使 DNA 聚 合 酶 延 伸 产 物 的 随 机 链 终 止 最 初 的 DNA 序 列 分 析 是 使 用 32p 或 35 S 等 放 射 性 素 作 为 标 记 在 测 序 反 应 中, 至 少 一 种 三 磷 酸 核 昔 (dntp) 是 放 射 性 放 射 性 核 素 标 记 的 反 应 结 束 后, 将 反 应 产 物 上 样 于 变 性 聚 丙 烯 酌 肢 凝 胶 ( 即 含 尿 素 的 PAGE; 疑 胶 ), 并 经 高 压 电 泳 分 离 产 物 将 凝 胶 转 移 至 一 个 固 相 支 持 物 进 行 放 射 自 显 影, 而 后 根 据 A, C, G, T 各 泳 道 的 带 进 行 读 序 此 万 法 提 供 了 一 种 相 对 简 单 的 DNA 序 列 分 析 的 万 法, 并 很 快 被 研 究 人 员 采 用 然 而, 此 法 所 需 的 吸 取 溶 液 和 胶 的 转 移 颇 为 繁 琐, 对 放 射 自 显 影 胶 片 上 碱 基 序 列 的 准 确 判 i 卖 亦 需 要 判 读 者 的 经 验 和 对 各 个 细 节 的 特 别 注 意 ( 四 ) 用 荧 光 标 记 进 行 DNA 测 序 自 Sanger 酶 法 进 行 DNA 测 序 问 世 几 年 以 后, 荧 光 DNA 测 序 万 法 亦 相 继 问 世 荧 光 DNA 测 序 和 放 射 性 核 素 DNA 测 序 万 法 完 全 一 样, 也 是 利 用 Sanger 测 序 反 应, 只 是 用 荧 光 标 记 取 代 了 放 射 性 标 记 在 Pharmacia ALF 等 单 荧 光 标 记 四 泳 道 测 序 系 统, A, C, G, T 四 个 反 应 用 同 一 种 荧 光 ( 如 cy5) 标 i 己 的 荧 光 引 物 进 行, 反 应 结 束 后 将 反 应 产 物 分 别 上 样 于 4 个 相 邻 的 泳 道 电 泳, 当 荧 光 标 记 的 DNA 片 段 移 动 至 胶 底 部 时 由 激 光 激 发 产 生 的 荧 光 信 号 可 被 检 测 器 检 测, 并 被 记 录 下 来 在 ABI 系 列 DNA 自 动 测 序 系 统, A, C, G, T 四 个 反 应 采 用 不 同 荧 光 染 料 标 i 己 的 同 一 寻 物 序 列 选 择 的 染 料 都 能 被 仪 器 中 的 氧 离 于 激 光 激 发, 1 旦 发 射 波 长 间 隔 约 为 20 nm (535 日 1 丑, 555 日 1 丑, 580 日 m 和 605 日 m) 染 料 的 荧 光 发 射 谱 的 重 叠 需 要 能 进 行 多 元 分 析 的 软 件 来 分 辨 四 种 不 同 颜 色 的 信 号 借 助 这 种 特 殊 的 软 件 可 以 清 晰 地 分 辨 不 同 颜 色 的 条 带 因 不 同 染 料 结 构 所 致 的 电 泳 迁 移 率 的 变 异 可 通 过 在 染 料 和 引 物 5' 端 之 间 插 入 一 种 可 变 长 度 的 分 隔 臂 来 加 以 控 制, 将 相 对 迁 移 率 移 位 减 少 至 约 1/4 个 碱 基 反 应 结 束 后, 将 A, C, G, T 反 应 管 合 并, DNA 用 乙 醇 处 理, 然 后 溶 于 上 样 缓 冲 液, 点 样 于 变 性 聚 丙 烯 酌 肢 I~ 是 胶 上 由 于 每 一 种 染 料 的 独 特 的 发 射 光 谱, A, T, C, G 反 应 可 在 同 一 泳 道 中 共 电 泳 ( 五 ) 循 环 测 序 循 环 测 序 ( cycle sequencing) 是 PCR 介 导 的 测 序 万 法, 它 采 用 耐 热 的 DNA 聚 合 酶, 以 温 度 帽 环 的 模 式 在 模 板 上 进 行 多 轮 的 双 脱 氧 核 昔 酸 测 序 反 应 在 测 序 反 应 过 程 中, 一 万 面 模 板 DNA 得 到 扩 增 ; 另 一 万 面, ddntp 地 掺 入 形 成 以 特 定 ddntp 结 尾 的 长 短 不 同 的 DNA 片 段, 通 过 电 泳 分 离, 便 可 获 得 待 测 DNA 分 于 的 碱 基 序 列 帽 环 测 序 由 三 个 步 骤 组 成 首 先, PCR 扩 增 的 DNA 双 链 变 性 成 单 链 状 态 ; 其 次, 放 射 性 核 素 E\l(; 非 放 射 性 核 素 标 记 的 引 物 与 其 中 的 一 条 链 上 的 互 补 序 列 退 火 ; 最 后, 退 火 后 的 引 物 在 耐 热 DNA 聚 合 酶 的 催 化 下 发 生 链 延 伸 终 止 反 应 由 此 产 生 的 模 板 链 与 延 伸 终 止 链 形 210

215 成 的 部 分 双 链 产 物, 在 下 一 次 帽 环 中 再 次 被 变 性, 释 放 出 模 板, 作 为 下 一 轮 反 应 的 模 板, 同 时 每 轮 产 生 的 链 终 止 产 物 被 累 积 下 来 这 些 帽 环 步 骤 重 复 20 次 ~40 次, 使 链 终 止 产 物 以 线 性 万 式 获 得 扩 增 与 标 准 的 测 序 万 法 比 较, 这 种 万 法 能 提 高 测 序 反 应 产 生 的 信 号 浓 度 循 环 测 序 具 有 以 下 优 点 :1 所 需 的 模 板 量 大 大 降 低, 因 为 帽 环 测 序 时 同 一 模 板 分 于 可 以 反 复 多 次 用 做 模 板 ( 一 般 只 需 200 吨 ) ;2 可 在 小 量 制 备 的 模 板 上 进 行 筛 选 反 应 ; 3 在 高 温 下 进 行 测 序 反 应, 可 使 DNA 聚 合 酶 催 化 的 聚 合 反 应 能 够 通 过 模 板 二 级 结 构 的 区 域 ;4 多 轮 的 热 变 性 步 骤 使 诸 如 质 粒 粘 粒 ADNA 及 PCR 产 物 等 双 链 模 板 不 需 要 一 个 单 独 的 变 性 步 骤 而 直 接 进 行 测 序 ;5 由 于 在 初 始 加 入 试 剂 后 便 不 需 要 中 途 添 加 试 剂, 故 测 序 反 应 可 自 动 化 因 11-3 ( 见 插 页 ) 所 示 为 MegaBACE 全 自 动 测 序 仪 参 考 文 献 1 Ambrose, B.]. Band R. C Pless. DNA sequencing: Chemical methods. Methods Enzymol, 1987, 152: J Sambrook, EF Fritsch, T Maniatis (translated by Jin DY, Li MF). Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Beijing: Science Press,

216 阶 男 十 立 旱 基 因 芯 片 技 术 基 因 芯 片 技 术 是 近 10 年 来 发 展 起 来 的, 综 合 了 分 子 生 物 学 信 息 科 学 材 料 科 学 计 算 机 技 术 等 多 学 科 技 术 的 核 酸 固 相 杂 交 检 测 技 术 基 因 芯 片 (gene chip) 又 称 DNA 芯 片 (DNA chip) EjJ(; DNA 微 阵 列 (DNA microarray), 为 生 物 芯 片 (biological chip) 的 一 种 基 因 芯 片 检 测 原 理 是 将 大 量 DNA 探 针 分 于 固 定 于 固 体 支 持 物 (substrate) 上, 然 后 与 荧 光 素 标 记 的 样 品 核 酸 进 行 杂 交, 通 过 检 测 杂 交 信 号 的 位 置 及 强 弱 判 断 样 品 中 靶 分 于 的 性 质 与 数 量, 从 而 获 得 样 品 的 序 列 信 息 由 于 用 该 技 术 可 以 将 大 量 的 序 列 不 同 的 针 探 分 别 固 定 在 同 一 个 固 体 支 持 物 上, 并 排 成 易 于 分 辨 的 阵 列, 所 以 可 同 时 对 样 品 中 复 杂 的 DNA 分 于 EjJ(; RNA 分 于 的 序 列 信 息 进 行 检 测 分 析, 其 效 率 比 传 统 核 酸 印 迹 杂 交 (Southern blotting 和 Northern blotting 等 ) 大 幅 度 提 高 该 技 术 实 现 了 在 微 芯 片 固 相 载 体 上 对 大 量 目 的 DNA / RNA 的 特 异 杂 交 检 测, 具 有 高 通 量 多 样 化 微 量 化 集 成 化 自 动 化 等 显 著 优 点, 在 医 学 领 域 具 有 十 分 广 泛 的 应 用 前 景 20 世 纪 80 年 代 初, 科 学 家 就 提 出 了 固 相 核 酸 杂 交 的 设 想, 其 后, 俄 罗 斯 美 国 及 英 国 的 科 学 家 分 别 报 道 了 用 杂 交 测 定 核 酸 序 列 的 万 法 1991 年, Affymetrix 公 司 Fodor 等 建 立 了 原 位 光 刻 合 成 技 术, 为 寡 核 昔 酸 在 片 原 位 合 成 制 作 高 密 度 基 因 芯 片 奠 定 了 基 础, 同 时 也 标 志 着 核 酸 检 测 技 术 己 发 展 到 了 一 个 新 的 阶 段 1994 年, 俄 美 科 学 家 共 同 研 制 了 用 于 自 地 中 海 贫 血 基 因 突 变 筛 查 的 基 因 芯 片, 并 用 于 自 地 中 海 贫 血 己 知 突 变 检 测 由 于 其 测 序 的 速 度 比 传 统 万 法 提 高 了 近 倍, 被 认 为 是 一 种 全 新 的 快 速 测 序 万 法 鉴 于 基 因 芯 片 潜 在 的 巨 大 商 业 价 值, 20 世 纪 90 年 代 中 期, 更 多 的 商 业 公 司 如 Motorola, Packard 等 也 加 入 了 芯 片 的 开 发 行 列 1996 年 底, Affymetrix 公 司 推 出 可 应 用 的 基 因 芯 片 和 较 完 整 的 芯 片 制 造 杂 交 扫 描 及 数 据 分 析 系 统, 其 他 如 General Scanni 日 g Inc, Tele - chern, Cartesian 等 公 司 亦 相 继 研 制 出 芯 片 用 激 光 共 聚 焦 扫 描 仪 及 分 析 软 件 在 我 国, 较 早 从 事 基 因 芯 片 研 究 的 机 构 有 军 事 医 学 科 学 院 清 华 大 学 复 旦 大 学 东 南 大 学 等 科 研 机 构 以 及 西 安 超 群 南 京 益 来 等 公 司 到 目 前 为 止, 基 因 表 达 芯 片 的 制 作 及 使 用 己 经 基 本 成 熟 芯 片 技 术 在 基 础 研 究, 尤 其 是 在 基 因 表 达 万 面 己 得 到 成 功 应 用, 而 在 医 学 应 用 万 面 也 己 开 发 出 如 HIV 肿 瘤 及 少 数 遗 传 病 基 因 诊 断 相 关 芯 片 等 但 由 于 芯 片 和 检 测 系 统 价 格 昂 贵, 再 加 上 专 利 及 许 多 技 术 问 题 还 有 待 解 决, 因 此 目 前 尚 未 大 规 模 应 用 于 临 床 检 验 根 据 不 同 的 分 类 标 准, 基 因 芯 片 可 分 为 以 下 主 要 类 型 1. 根 据 点 阵 密 度 分 类 根 据 基 因 芯 片 上 DNA 点 阵 密 度 不 同, 可 分 为 低 密 度 芯 片 (l ~ 点 每 平 万 厘 米 ), 中 密 度 芯 片 (l 000 ~ 点 每 平 万 厘 米 ) 和 高 密 度 芯 片 ( 超 过 点 每 平 万 厘 米 ) 三 大 类 2. 根 据 点 阵 的 生 产 万 式 分 类 根 据 点 阵 的 产 生 万 式 又 可 分 为 点 样 芯 片 和 原 位 合 成 芯 片. 212.

217 3. 根 据 芯 片 的 功 能 分 类 根 据 芯 片 的 功 能 可 分 为 基 因 表 达 谱 芯 片 和 DNA 测 序 芯 片 两 类 基 因 表 达 语 芯 片 可 以 将 克 隆 到 的 成 千 上 万 个 基 因 特 异 的 探 针 或 其 edna 片 段 固 定 在 一 块 DNA 芯 片 上, 对 来 源 于 不 同 个 体 ( 正 常 人 与 患 者 ) 组 织 细 胞 周 期 发 育 阶 段 分 化 阶 段 病 变 剌 激 ( 包 括 不 同 诱 导 不 同 治 疗 手 段 ) 下 的 细 胞 内 mrna Ejj(; 逆 转 录 后 产 生 的 edna 进 行 检 测, 从 而 对 这 些 基 因 表 达 的 个 体 特 异 性 组 织 特 异 性 发 育 阶 段 特 异 性 分 化 阶 段 特 异 性 病 变 特 异 性 剌 激 特 异 性 进 行 综 合 的 分 析 和 判 断, 迅 速 将 某 个 或 几 个 基 因 与 疾 病 联 系 起 来, 极 大 地 加 快 了 对 这 些 基 因 功 能 的 确 定, 同 时 可 进 一 步 研 究 基 因 与 基 因 之 间 相 互 作 用 的 关 系 DNA 测 序 芯 片 则 是 基 于 杂 交 测 序 发 展 起 来 的 其 原 理 是, 任 何 线 状 的 单 链 DNA Ejj(; RNA 序 列 均 可 分 解 成 系 列 碱 基 数 固 定 错 落 且 重 叠 的 寡 核 昔 酸, 又 称 亚 序 列 (subsequence), 假 如 我 们 能 把 原 序 列 所 有 这 些 错 落 重 叠 的 亚 序 列 全 部 检 测 出 来, 就 可 据 此 重 新 组 建 出 原 序 列 另 外 也 可 根 据 所 用 探 针 的 类 型 不 同 分 为 edna 微 阵 列 (Ejj(; edna 微 阵 列 芯 片 ) 和 寡 核 昔 酸 阵 列 ( 或 芯 片 ), 根 据 应 用 领 域 不 同 而 制 备 的 专 用 芯 片 如 毒 理 学 芯 片 (toxchip) 病 毒 检 测 芯 片 ( 如 肝 炎 病 毒 检 测 芯 片 ) p53 基 因 检 测 芯 片 表 达 谱 芯 片 诊 断 芯 片 指 纹 图 i 普 芯 片 测 序 芯 片 等 等 第 一 节 基 因 芯 片 的 制 作 和 使 用 方 法 一 基 因 芯 片 的 制 作 基 因 芯 片 技 术 主 要 包 括 5 个 主 要 步 骤 : 芯 片 制 备 样 品 制 备 杂 交 反 应 与 信 号 检 测 和 结 果 分 析 ( 图 12-1) 或 革 ~DNA per iligo 准 备 - 逆 转 录 标 记 点 样 及 国 定 \ \ J F 飞 主 探 / 针 标 记... 啕 十 per 标 记 随 机 寻 物 标 记 罔 谱 才 1 措 与 数 据 分 析 图 12-1 表 达 谱 基 因 芯 片 的 制 备 与 应 用 示 意. 213.

218 ( ) 基 因 芯 片 的 材 料 基 因 芯 片 主 要 由 载 体 材 料 和 其 上 的 寡 核 昔 酸 探 针 或 edna 探 针 组 成 其 中, 制 作 芯 片 的 固 相 支 持 材 料 可 以 是 硅 片 玻 璃 片 金 属 片 有 机 高 分 于 薄 膜 等 玻 片 来 源 万 便, 其 表 面 经 硅 ; 院 处 理 后 可 与 各 种 生 物 分 于 偶 联, 既 可 用 透 射 光 或 反 射 光 检 i 卖, 又 可 用 光 刻 法 在 玻 璃 上 刻 出 微 流 路, 利 用 微 量 分 于 泵 在 载 体 上 完 成 生 物 分 于 的 连 接 杂 交 清 洗 及 检 测 等, 因 此, 玻 璃 材 料 的 应 用 较 为 广 泛 固 定 于 片 基 上 的 靶 基 因 探 针 可 以 是 寡 核 昔 酸 探 针, 也 可 以 是 克 隆 化 的 基 因 靶 基 因 可 选 择 染 色 体 DNA (Ell(; 基 因 组 DNA), 也 可 选 择 edna ( 或 人 工 合 成 DNA) 目 前, 以 edna 的 研 究 为 主, 因 为 edna 是 染 色 体 上 编 码 蛋 白 质 的 DNA 序 列, 具 有 医 疗 和 其 他 领 域 的 研 究 价 值 和 商 业 价 值 ( 二 ) 基 因 芯 片 的 制 备 基 因 芯 片 的 制 备 综 合 了 生 命 科 学 化 学 染 料 微 电 于 技 术 激 光 统 计 学 等 领 域 的 前 沿 技 术, 主 要 包 括 芯 片 的 制 备 ( 选 择 点 样 仪 和 玻 片 靶 基 因 的 扩 增 和 固 定 ) 杂 交 探 针 的 制 备 (mrna 的 抽 提 mrna 的 逆 转 录 per 和 探 针 荧 光 标 记 ) 杂 交 条 件 的 优 化 技 术 ( 杂 交 液 杂 交 条 件 和 洗 涤 条 件 的 选 择 ) 和 数 据 分 析 技 术 其 中, 基 因 芯 片 的 制 备 主 要 依 赖 于 微 细 加 工 ( mierofabrieatio 川 自 动 化 及 化 学 合 成 技 术 制 备 过 程 就 是 将 特 定 的 一 组 寡 核 昔 酸 片 段 Ell(; edna 作 为 基 因 探 针, 按 顺 序 排 列 在 载 体 上 芯 片 的 制 备 除 了 用 到 微 加 工 工 艺 外, 还 需 要 使 用 机 器 人 技 术, 以 便 能 快 速 准 确 地 将 探 针 放 置 到 芯 片 上 的 指 定 位 置 ( 三 ) 样 自 制 备 生 物 样 品 往 往 是 复 杂 的 生 物 分 于 混 合 体, 除 少 数 特 殊 样 品 外, 一 般 不 能 直 接 与 芯 片 反 应, 有 时 样 品 的 量 很 小 所 以, 必 须 将 样 品 进 行 提 取 扩 增, 获 取 其 中 DNA Ell(; RNA, 然 后 用 荧 光 标 记, 以 提 高 检 测 的 灵 敏 度 和 使 用 者 的 安 全 性 ( 四 ) 杂 交 反 应 杂 交 反 应 是 荧 光 标 记 的 样 品 与 芯 片 上 的 探 针 进 行 反 应 产 生 一 系 列 信 息 的 过 程 选 择 合 适 的 反 应 条 件 能 使 生 物 分 于 之 间 的 反 应 处 于 最 佳 状 况 中, 减 少 生 物 分 于 之 间 的 错 配 率 ( 五 ) 信 号 检 测 和 结 果 分 析 杂 交 反 应 后 的 芯 片 上 各 个 反 应 点 的 荧 光 位 置 荧 光 强 弱 经 过 芯 片 扫 描 仪 和 相 关 软 件 可 以 分 析 图 像, 将 荧 光 转 换 成 数 据, 即 可 以 获 得 有 关 生 物 信 息 二 基 因 芯 片 的 制 作 方 法 根 据 点 阵 的 产 生 万 式, 基 因 芯 片 又 分 为 点 样 芯 片 和 原 位 合 成 芯 片 与 之 相 对 应 的 基 因 芯 片 制 作 万 法 分 为 寡 核 昔 酸 微 点 样 法 (mierospotting) 和 原 位 合 成 法 (in situ syn thesis) 两 大 类 ( ) 做 点 样 法 1. 点 接 触 法 点 接 触 法 (mechanical mierospotting) 由 Shalon 等 建 立, 是 将 每 个 样 品 的 寡 核 昔 酸 探 针 预 先 合 成 纯 化, 然 后 用 自 动 化 微 量 点 样 仪 器 直 接 点 到 载 体 上, 其 密 度 可 达 到 2 778/em 2 (10 000/3. 6 em 2 ) 因 基 因 芯 片 的 探 针 点 阵 的 点 与 点 的 距 离 非 常 214

219 小, 所 以 选 择 高 性 能 的 点 样 设 备 非 常 重 要 可 选 的 点 样 仪 如 安 玛 西 亚 的 Lucidea spotter 基 因 芯 片 点 样 仪 ( 图 12-2, 见 插 页 ), 该 仪 器 点 样 精 度 高 重 复 性 好, 点 样 精 度 达 o. 5 μm 之 内 喷 墨 法 喷 墨 法 (i nk jets) 是 以 定 滴 供 给 的 万 式, 通 过 压 电 晶 体 或 其 他 推 进 万 式, 从 喷 嘴 中 把 样 品 喷 射 到 载 体 上, 其 密 度 可 达 10000/ cm 2 0 做 点 样 法 中 探 针 的 固 定 是 一 个 重 要 环 节 目 前, 固 定 探 针 的 万 法 较 多, 主 要 通 过 寡 核 昔 酸 和 载 体 之 间 的 共 价 交 联 E\l(; 静 电 作 用 吸 附 ( 二 ) 原 值 合 成 法 1. 光 蚀 刻 法 光 蚀 刻 法 (photolithography) 由 Affymetrix 公 司 Fodor 等 建 立, 是 将 光 刻 技 术 与 寡 核 昔 酸 的 合 成 相 结 合, 得 到 位 置 确 定 高 密 度 的 寡 核 昔 酸 序 列 这 种 芯 片 通 常 称 为 genechip 该 万 法 可 使 探 针 密 度 达 到 10 6 /cm 2, 探 针 间 距 20μm, 是 目 前 合 成 密 度 最 高 的 万 法 Affymetrix 公 司 利 用 该 万 法 生 产 了 可 同 时 检 测 6500 个 人 类 基 因 的 芯 片, 并 正 在 制 备 含 (5~ 10) X 10 5 个 探 针 的 人 类 基 因 检 测 芯 片 尽 管 如 此, i 亥 芯 片 制 作 万 法 亦 有 明 显 缺 点 : 需 要 大 量 时 间 设 计, 制 造 价 格 昂 贵 的 光 掩 膜 ; 合 成 中 每 步 缩 合 率 一 般 仅 为 92% ~94%; 探 针 长 度 仅 2 bp~8 bp, 合 成 30 日 t 时 一 般 得 率 仅 20% 年, McCall 等 提 出 了 将 光 控 合 成 技 术 与 光 敏 抗 蚀 技 术 相 结 合, 以 酸 作 为 脱 保 护 剂, 得 率 可 达 98%, 以 解 决 光 衍 射 造 成 的 脱 保 护 不 彻 底 问 题, 并 将 探 针 密 度 提 高 到 的 更 高 密 度 2. 原 位 试 剂 合 成 法 原 位 试 剂 合 成 法 是 通 过 六 聚 乙 二 醇 及 环 氧 丙 基 三 甲 基 氧 基 硅 炕 在 玻 璃 上 产 生 炕 基 { 白 瓷 基, 在 Applied Biosystem 381A 合 成 仪 上 用 标 准 试 剂 在 玻 璃 片 上 不 同 区 域 全 自 动 合 成 不 同 探 针 3. 压 电 打 印 法 压 电 打 印 法 (piezoelectric printing) 是 由 美 国 lncyte Pharmaceuti cals 等 公 司 建 立 的 利 用 亚 磷 酌 氨 试 剂, 而 不 需 要 其 他 化 学 试 剂 的 寡 核 昔 酸 固 相 合 成 法, 其 得 率 可 达 98%, 探 针 长 度 达 40 bp~50 bpo 4. 分 于 印 章 法 分 于 印 章 法 是 我 国 东 南 大 学 开 发 的 一 种 在 片 压 印 原 位 定 点 DNA 合 成 法 根 据 所 需 的 探 针 阵 列 制 备 微 印 章, 然 后 在 印 章 上 逐 个 涂 上 单 核 昔 酸, 再 将 涂 有 不 同 单 核 昔 酸 的 印 章 逐 个 压 印 在 同 一 基 片 上, 直 到 得 到 所 需 的 序 列 长 度 这 是 我 国 独 立 创 建 的 一 种 高 密 度 探 针 原 位 合 成 法 ( 三 ) 真 他 制 作 万 法 此 外, 目 前 还 发 展 了 一 些 较 有 特 色 的 芯 片, 它 们 的 制 作 万 法 略 有 区 别, 如 : 1. 三 维 芯 片 三 维 芯 片 (microarray of gel ~ immobilized compounds 0 日 a chip, MAClchip) 是 由 美 俄 合 作 开 发 的 一 种 芯 片 它 是 在 一 块 载 玻 片 上 固 定 了 多 达 个 聚 乙 烯 酌 肢 凝 胶 微 条, 每 个 微 条 均 可 用 作 生 物 分 于 分 析 三 维 化 的 微 凝 胶 条 增 加 了 杂 交 反 应 的 面 积 和 探 针 分 于 数, 从 而 提 高 了 芯 片 检 测 的 敏 感 性, 并 且 在 芯 片 上 可 同 时 进 行 扩 增 与 检 测 2. 肤 核 酸 芯 片 肤 核 酸 芯 片 是 一 种 将 肤 核 酸 (peptide nucleic acid, PNA) 作 为 探 针 制 作 的 芯 片 PNA 是 一 种 以 甘 氨 酸 为 骨 架 的 核 酸 衍 生 物, 与 核 酸 结 构 相 似, 它 能 够 根 据 碱 基 互 补 配 对 原 则 识 别 特 定 序 列 的 靶 核 酸, 并 能 与 其 牢 固 结 合 由 于 PNA 不 带 电 215

220 荷, 与 DNA 结 合 的 特 异 性 和 有 效 性 都 比 同 样 序 列 的 DNA 探 针 优 越 3. 流 过 式 芯 片 流 过 式 芯 片 (flow - thru chip) 是 美 国 Gene Logic 公 司 开 发 的 一 种 微 通 道 芯 片 它 将 寡 核 昔 酸 探 针 结 合 于 微 通 道 内 的 特 定 区 域, 然 后 让 荧 光 标 记 后 的 样 品 流 过 该 区, 以 完 成 探 针 与 模 板 的 杂 交 由 于 增 大 了 探 针 吸 附 表 面,i 亥 芯 片 检 测 灵 敏 度 有 较 大 的 提 高 ; 加 之 微 通 道 加 速 了 杂 交 反 应, 因 而 反 应 速 度 快 ; 由 于 采 用 了 特 殊 的 共 价 化 学 技 术 将 探 针 吸 附 于 微 通 道 内, 使 每 一 种 流 过 式 芯 片 可 反 复 使 用 多 次, 从 而 使 其 成 本 降 低 清 华 大 学 用 生 物 芯 片 所 制 作 的 具 有 不 同 用 途 的 全 功 能 缩 微 芯 片 实 验 室 (Lab - on chip), 可 使 分 析 过 程 全 自 动 化 三 基 因 芯 片 的 检 测 方 法 ( ) 分 喜 杂 交 样 品 核 酸 需 要 经 过 体 外 扩 增 和 标 记 才 能 经 与 芯 片 杂 交 而 被 检 测 目 前 最 常 用 的 是 把 PCR 方 法 扩 增 持 检 测 靶 核 酸 同 时 掺 入 荧 光 素 分 于 如 FAM, Cy5, Cy3 等, 以 获 得 足 量 的 标 记 持 检 靶 分 于 基 因 芯 片 的 分 于 杂 交 原 理 和 普 通 核 酸 杂 交 一 样, 即 单 链 的 标 记 靶 核 酸 分 子 根 据 碱 基 互 补 配 对 的 原 则, 与 固 定 在 固 体 基 质 上 的 与 之 互 补 的 单 链 探 针 结 合 成 双 链 结 构, 滞 留 在 杂 交 位 点 而 被 检 测, 未 能 与 探 针 结 合 的 核 酸 分 于 则 被 洗 掉 由 于 固 定 于 玻 璃 片 上 的 DNA 探 针 密 度 较 大, 且 带 有 较 多 的 负 电 荷, 而 荧 光 标 i 己 的 靶 序 列 需 要 克 服 较 强 的 静 电 斥 力 才 能 与 芯 片 上 的 探 针 杂 交, 因 此 选 择 合 适 的 杂 交 设 备 十 分 必 要 如 图 12-3 ( 见 插 页 ) 所 示 的 芯 片 用 杂 交 仪 可 同 时 杂 交 12 块 芯 片, 并 可 以 单 独 设 定 各 自 的 温 度 和 杂 交 时 间, 探 针 还 可 重 复 使 用 另 外, 由 于 一 般 生 物 样 本 中 所 含 的 待 检 测 模 板 量 较 低, 直 接 标 记 后 达 不 到 芯 片 检 测 仪 器 的 灵 敏 度 下 限, 因 而 往 往 需 对 待 检 样 品 核 酸 进 行 体 外 扩 增 增 加 样 品 模 板 量 的 万 法 很 多, 目 前 应 用 最 多 的 是 常 规 PCR 法, 而 其 他 新 万 法 也 在 不 断 出 现, 并 有 可 能 发 展 为 更 万 便 快 捷 的 模 板 增 量 万 法 如 Mosaic Technologies 公 司 发 展 的 固 相 PCR 系 统, 可 避 免 交 叉 污 染 且 勿 需 液 相 处 理 ; Lynx Therapeutics 公 司 提 出 的 大 规 模 并 行 固 相 克 隆 系 统 (massively parallel solid - phase ci oni 日 剖, 可 以 对 样 品 中 数 以 万 计 的 DNA 片 段 同 时 进 行 克 隆 由 于 模 板 增 量 时 可 能 造 成 较 大 误 差, 也 有 研 究 者 正 在 研 究 不 必 经 过 扩 增 模 板 的 更 敏 感 的 检 测 万 法 进 行 芯 片 检 测, 如 荧 光 抗 体 夹 心 技 术 及 夏 庆 杰 提 出 的 荧 光 探 针 杂 交 链 反 应 技 术 等 基 因 芯 片 上 进 行 分 于 杂 交 条 件 的 选 择 与 研 究 目 的 密 切 有 关 在 基 因 表 达 研 究 中, 可 采 用 较 低 严 格 性 杂 交, 如 低 温 度 长 时 间 高 样 品 浓 度 及 高 盐 浓 度 等 ; 突 变 检 测 时, 则 需 要 提 高 杂 交 严 谨 性, 如 短 时 高 温 低 盐 浓 度 等 ; 多 态 性 分 析 时, 通 常 设 计 出 一 套 四 种 寡 聚 核 昔 酸, 只 在 中 央 位 点 碱 基 有 所 不 同, 根 据 每 套 探 针 在 某 一 特 点 位 点 的 杂 交 严 谨 程 度, 即 可 测 定 出 该 碱 基 的 种 类 ( 二 ) 扫 描 阅 读 杂 交 反 应 结 束 后, 经 过 清 洗 芯 片, 去 除 未 杂 交 的 标 记 靶 分 于 及 其 他 杂 质 后 在 基 因 芯 片 扫 描 仪 上 进 行 芯 片 的 荧 光 扫 i 卖, 并 把 荧 光 扫 描 信 号 转 变 成 可 供 分 析 的 图 像 数 据, 再 利 用 计 算 机 分 析 和 处 理 这 些 数 据, 给 出 检 测 结 果 同 芯 片 的 制 作 杂 交 一 样, 芯 片 扫 i 卖 也. 216.

221 直 接 影 响 芯 片 的 分 析 结 果 商 业 化 芯 片 扫 描 仪 主 要 有 两 类 : 激 光 共 聚 焦 扫 描 仪 和 CCD 扫 描 仪 前 者 以 激 光 作 为 激 发 光 源, 可 以 产 生 较 高 强 度 的 发 射 荧 光, 从 而 有 较 高 的 检 测 灵 敏 度, 检 测 极 限 可 达 o. 1 个 荧 光 分 于 每 平 万 微 米 又 由 于 激 光 经 聚 焦 后 产 生 极 小 的 光 斑, 因 此 具 有 较 高 的 分 辨 率, 最 高 可 达 几 个 微 米 扫 描 时 间 较 长, 完 成 一 次 扫 描 一 般 需 时 5 mi 日 左 右, 比 较 适 合 于 研 究 使 用 CCD 芯 片 扫 描 仪 结 构 比 较 简 单, 其 激 发 光 源 多 采 用 llii: 灯 E\l(; 高 压 京 灯 芯 片 经 激 发 产 生 的 图 像 信 号 由 CCD 摄 像 头 直 接 传 送 到 图 像 卡, 变 成 数 字 信 号, 由 计 算 机 储 存 和 分 析, 给 出 检 测 结 果 其 特 点 是 扫 描 时 间 短, 灵 敏 度 和 分 辨 率 稍 低, 比 较 适 合 于 临 床 诊 断 使 用 荧 光 检 测 万 法 重 复 性 较 好, 但 其 缺 点 是 灵 敏 度 偏 低 一 些 更 快 速 灵 敏 的 检 测 万 法 正 在 被 研 究 中, 包 括 质 谱 法 化 学 发 光 法 光 导 纤 维 法 DNA 生 物 传 感 器 法 等 均 是 有 希 望 取 代 荧 光 法 的 手 段 第 二 节 基 因 芯 片 在 医 学 中 的 应 用 目 前, 基 因 芯 片 己 被 广 泛 应 用 于 生 物 医 学 研 究 领 域, 如 基 因 表 达 测 序 分 析 基 因 作 图 突 变 检 测 多 态 性 分 析 等 研 究, 特 别 是 在 基 因 表 达 检 测 中 己 有 大 量 成 功 范 例 1995 年, Schena 等 报 道 利 用 基 因 芯 片 测 定 了 拟 南 芥 酵 母 及 人 黑 色 素 瘤 细 胞 系 的 基 因 组 表 达 情 况, 证 实 该 技 术 切 实 可 行 然 而, 在 基 因 芯 片 的 所 有 应 用 领 域 中, 医 学 应 用 的 价 值 最 具 潜 力 ( ) 基 因 表 这 检 测 首 先, 鉴 于 人 类 的 一 些 遗 传 性 疾 病 及 肿 瘤 的 相 关 基 因 可 能 因 基 因 环 境 异 常 而 出 现 异 常 表 达, 因 此 基 因 芯 片 可 以 用 于 疾 病 基 因 表 达 异 常 的 检 测 其 二, 在 涉 及 一 些 多 基 因 遗 传 常 见 病 如 糖 尿 病 高 血 压 冠 心 病 等 的 病 因 筛 查 中, 基 因 芯 片 技 术 作 为 较 为 理 想 的 了 解 基 因 网 络 关 系 的 技 术 之 一, 将 扮 演 重 要 的 角 色 ( 二 ) 遗 传 性 疾 病 诊 断 遗 传 病 是 一 大 类 严 重 威 胁 人 类 健 康 的 疾 病, 随 着 越 来 越 多 的 遗 传 病 发 病 机 制 被 明 确, 如 何 采 用 快 速 简 洁 可 靠 的 万 法 对 遗 传 病 进 行 诊 断 和 预 防 己 是 一 个 需 要 急 迫 解 决 的 问 题 许 多 突 变 检 测 技 术, 如 连 锁 分 析 PCR - SSCP, HAD, DGGE, RFLP, DHPLC 等 为 基 因 突 变 检 测 提 供 了 有 效 的 手 段, 但 这 些 万 法 在 突 变 筛 查 中 均 存 在 筛 查 范 围 局 限 突 变 位 置 不 确 定 操 作 比 较 复 杂 等 问 题 基 因 芯 片 则 为 解 决 上 述 问 题 提 供 了 一 种 选 择 目 前, 基 因 芯 片 己 成 功 地 应 用 于 囊 性 纤 维 化 基 因 p53 基 因 珠 蛋 白 基 因 西 各 氨 酸 酶 基 因 HIV-1 蛋 白 酶 基 因 等 多 种 基 因 突 变 的 检 测 ( 三 ) 肿 瘤 相 关 基 因 诊 断 肿 瘤 是 严 重 威 胁 人 类 生 命 的 疾 病 之 一, 肿 瘤 的 发 生 发 展 往 往 涉 及 多 个 基 因 的 异 常, 对 相 关 基 因 进 行 检 测 可 以 作 为 肿 瘤 诊 断 预 后 的 重 要 指 标 目 前, 抑 癌 基 因 p53 的 基 因 芯 片 检 测 技 术 己 趋 成 熟, 其 商 业 化 试 剂 将 对 多 种 肿 瘤 的 诊 断 和 分 期 起 到 重 要 作 用 另 外, Hacia JG 等 利 用 基 因 芯 片 对 BRCA1 基 因 突 变 进 行 筛 查, 获 得 理 想 结 果, 展 示 了 基 因 芯 片 技 术 在 肿 瘤 基 因 诊 断 中 较 好 的 应 用 前 景 所 有 这 些 工 作 都 提 示 基 因 芯 片 技 术 极 有 可 能 成 为 肿 瘤 基 因 大 规 模 突 变 筛 查 的 常 规 技 术. 217.

222 ( 四 ) 感 染 性 疾 病 病 原 体 检 测 随 着 人 类 和 病 原 微 生 物 基 因 组 研 究 的 深 入, 越 来 越 多 的 碱 基 序 列 被 确 定, 为 病 原 体 检 测 采 用 核 酸 技 术 提 供 了 丰 富 的 材 料 美 国 最 近 修 订 的 性 病 诊 断 标 准 己 将 核 酸 指 标 列 为 确 诊 依 据 之 一 核 酸 诊 断 将 是 继 免 疫 法 之 后 的 又 一 重 要 诊 断 手 段, 是 该 领 域 的 发 展 万 向 基 因 芯 片 技 术 作 为 核 酸 研 究 领 域 的 一 个 重 要 技 术, 在 提 高 病 原 体 检 测 的 可 靠 性 大 规 模 筛 查 等 万 面 将 大 有 用 武 之 地 其 次, 利 用 基 因 芯 片 监 测 筛 选 病 原 体 的 耐 药 性 将 是 芯 片 的 另 一 应 用 领 域 如 Telenti 等 报 告 的 结 核 杆 菌 RNA 聚 合 酶 rρ 基 因 与 利 福 平 抗 性 有 关, Head 等 应 用 中 密 度 基 因 芯 片 通 过 对 吵 B 基 因 序 列 扫 描, 对 抗 药 性 TB 菌 株 进 行 了 准 确 快 速 鉴 定, 这 些 工 作 为 基 因 芯 片 在 病 原 体 耐 药 性 筛 查 中 的 应 用 奠 定 了 基 础 利 用 基 因 芯 片 的 优 势 对 较 多 病 原 体 及 病 原 体 大 量 基 因 同 时 进 行 检 测, 为 感 染 性 疾 病 的 诊 断 与 治 疗 带 来 了 新 的 前 景 ( 五 ) 法 医 学 亲 辛 鉴 定 和 个 人 识 到 法 医 学 亲 于 鉴 定 和 个 人 识 别 是 法 医 工 作 的 重 要 内 容, 在 这 些 工 作 中 较 多 的 涉 及 人 类 基 因 组 多 态, 而 基 因 芯 片 在 高 通 量 多 态 分 析, 尤 其 是 SNPs (single nucleotide polymor phisms) 筛 查 中 亦 有 其 优 势 SNPs 作 为 第 三 代 遗 传 图 语 标 记, 在 连 锁 分 析 DNA 指 纹 分 析 等 万 面 有 重 要 的 应 用 价 值, 将 为 法 医 提 供 更 行 之 有 效 的 检 测 手 段 和 更 多 的 万 法 选 择 ( 六 ) 药 物 研 究 基 因 芯 片 在 药 学 和 药 物 治 疗 学 中 的 应 用 主 要 有 两 个 万 面 : 新 药 筛 选 和 用 药 监 测 分 于 生 物 学 和 高 通 量 筛 选 己 是 当 今 工 业 化 规 模 新 药 开 发 的 技 术 支 柱 之 一, 基 因 芯 片 则 是 集 二 者 于 一 身, 其 对 化 合 物 作 用 于 组 织 细 胞 后 基 因 表 达 的 变 化 监 测, 不 仅 可 以 准 确 了 解 化 合 物 作 用 的 靶 标 及 在 胞 内 的 作 用 途 径, 而 且 有 助 于 进 行 药 效 观 察 上 述 同 样 的 原 理, 基 因 芯 片 在 临 床 用 药 的 监 测 中 亦 将 发 挥 重 要 的 作 用 (t) 预 防 医 学 由 于 芯 片 高 通 量 并 行 性 的 基 因 检 测 特 点 使 大 规 模 地 微 生 物 筛 查 更 为 万 便 准 确, 所 以 基 因 芯 片 为 卫 生 防 疫 检 疫 等 提 供 了 一 种 有 效 的 技 术 手 段, 在 预 防 医 学 中 有 广 阔 的 应 用 前 景 第 二 节 基 因 芯 片 技 术 的 现 状 和 发 展 前 景 生 物 芯 片 技 术 经 过 十 年 余 的 发 展, 显 示 出 其 巨 大 的 优 越 性 和 广 阔 的 应 用 前 景, 许 多 发 达 国 家 的 政 府 和 企 业 财 团 己 加 入 到 生 物 芯 片 技 术 的 研 究 与 开 发 中 美 国 科 学 杂 志 把 生 物 芯 片 评 选 为 1998 年 的 世 界 十 大 科 技 突 破 之 一 1998 年 6 月 29 日, 美 国 宣 布 正 式 启 动 生 物 芯 片 计 划, 世 界 上 许 多 国 家 也 开 始 纷 纷 加 大 投 入, 一 个 以 生 物 芯 片 为 核 心 的 相 关 产 业 正 在 全 球 崛 起 目 前, 仅 美 国 就 有 发 DNA 芯 片 技 术 为 主 的 公 司 有 十 几 家, 己 有 2000 多 家 公 司 参 与 研 制 生 物 芯 片, 其 中 开 8 家 生 物 芯 片 公 司 股 票 上 市 目 前, 国 际 上 每 年 在 生 物 芯 片 技 术 领 域 投 资 总 额 达 7 亿 ~1O 亿 美 元, 其 中 大 公 司 投 资 3 亿 美 元 金 融 投 资 机 构 投 资 1. 5 亿 美 元, 其 余 为 国 家 和 个 人 投 资 表 12-1 是 美 国 部 分 生 物 芯 片 公 司 的 纳 斯 达 克 记 录. 218.

223 表 12-1 美 国 部 分 生 物 芯 片 公 司 的 纳 斯 达 克 记 录 公 司 名 称 上 市 年 份 发 行 价 现 价 市 f 直 ( 美 元 / 股 ) ( 美 元 / 股 ) ( 美 元 ) Incyte Affymetrix Hyseq Aurora Nanogen Curagen Caliper Sequenom 我 国 政 府 和 科 学 家 也 注 意 到 了 这 一 发 展 趋 势, 许 多 研 究 机 构 也 都 加 入 到 这 一 领 域 1997 年 9 月 16 日 到 18 日 在 北 京 召 开 了 " 香 山 科 学 " 会 议, 其 主 题 为 DNA 芯 片 的 现 状 与 未 来 会 议 对 生 物 芯 片 技 术 的 重 要 性 达 成 了 共 识 : 生 物 芯 片 是 生 命 科 学 领 域 的 一 次 革 命, 我 国 有 条 件 和 能 力 从 事 这 一 新 技 术 的 研 究 和 开 发, 建 议 尽 快 建 立 自 己 的 生 物 芯 片 研 究 队 伍 和 基 地, 以 便 尽 早 拥 有 自 己 的 专 利 技 术, 创 建 中 国 自 己 的 生 物 芯 片 产 业 中 国 工 程 院 2000 年 1 月 6 日 在 京 举 办 首 次 工 程 科 技 论 坛, 专 题 为 " 生 物 芯 片 技 术 " 在 论 坛 上 科 学 家 提 出 : 以 生 物 芯 片 技 术 为 核 心 的 各 相 关 产 业 正 在 全 球 崛 起, 世 界 工 业 发 达 国 家 己 开 始 有 计 划 大 投 入, 争 先 恐 后 地 对 该 领 域 知 识 产 权 进 行 保 护 我 国 应 迅 速 制 定 适 合 中 国 国 情 的 对 策, 以 避 免 出 现 象 计 算 机 产 业 那 样 因 没 有 自 己 的 芯 片 专 利 和 技 术 而 受 制 于 人 的 被 动 局 面 表 12-2 是 我 国 部 分 生 物 制 药 上 市 公 司 的 汇 总 情 况 表 12-2 部 分 国 内 生 物 制 药 上 市 公 司 汇 总 股 票 名 称 总 股 本 流 通 股 本 99 EPS 项 目 备 注 分 类 深 石 化 AS 124 B 3276 EPO 生 物 工 程 海 王 生 物 a - 2b 干 扰 素 EPO 生 物 工 程 三 九 生 化 肿 瘤 坏 死 因 子 生 物 工 程 东 阿 阿 胶 EPO 生 物 工 程 丽 珠 集 团 A B V 干 扰 素 EPO 生 物 工 程 东 湖 高 新 生 物 农 药 生 化 药 物 天 坛 生 物 基 因 工 程 乙 肝 疫 苗, 人 血 代 用 品 生 物 工 程 复 星 实 业 重 组 链 接 酶, Y, 干 扰 素, EPO 生 物 工 程 华 晨 集 团 单 克 隆 抗 体, 基 因 功 能 发 现 基 因 治 疗 生 物 工 程 天 目 药 业 冻 干 鼠 表 皮 生 长 因 子 生 化 药 物 友 好 集 团 与 国 家 基 因 组 南 方 研 究 中 心 合 作, 主 要 从 事 基 因 诊 断 生 物 工 程. 219

224 ( 续 表 12-2) 股 票 名 称 威 远 生 化 星 湖 股 份 通 化 东 宝 张 江 高 科 总 股 本 流 通 股 本 EPS 项 目 备 注 生 物 农 药 肌 昔 原 料 药 及 其 深 加 工 人 膜 岛 素 持 有 复 旦 张 江 生 物 医 药 公 司 23%, 研 发 中 的 产 品 有 肿 瘤 血 管 仰 制 因 子 分 类 生 化 产 品 生 化 药 物 生 物 工 程 生 物 工 程 尽 管 基 因 芯 片 技 术 发 展 迅 速, 并 己 取 得 一 些 成 果, 但 尚 未 形 成 大 规 模 的 应 用, 其 原 因 可 分 为 两 个 万 面 其 一, 费 用 高 : 从 芯 片 制 作 看, 需 要 较 多 的 价 格 昂 贵 仪 器, 如 用 于 原 位 合 成 寡 核 昔 酸 的 光 刻 机 和 合 成 仪 或 用 于 合 成 后 点 样 的 全 自 动 点 样 仪 ; 在 芯 片 杂 交 信 号 检 测 时, 需 要 激 光 共 聚 焦 扫 描 仪 或 荧 光 显 微 镜 等 设 备 均 成 为 基 因 芯 片 成 本 居 高 不 下 的 重 要 原 因 其 二, 芯 片 技 术 本 身 还 存 在 一 定 的 问 题 比 较 典 型 的 有 :1 现 阶 段 芯 片 检 测 的 灵 敏 度 决 定 了 需 要 首 先 扩 增 模 板 一 般 采 用 PCR 万 法 进 行 这 一 步 骤, 不 可 避 免 地 带 来 PCR 所 具 有 的 局 限 2 目 前 广 泛 采 用 的 荧 光 标 记 万 法 存 在 检 出 灵 敏 度 较 低 的 问 题 ; 而 一 些 新 的 检 测 万 法 如 质 谱 法 化 学 发 光 法 光 导 纤 维 法 和 DNA 生 物 传 感 器 法 等 正 在 被 研 究 中 3 分 于 杂 交 步 骤 亦 存 在 一 些 有 待 解 决 的 问 题, 加 之 芯 片 杂 交 的 条 件 高 度 个 体 化, 难 以 形 成 比 较 统 一 规 范 的 杂 交 环 境, 给 应 用 带 来 障 碍 4 目 前 的 芯 片 技 术 开 发 较 多 重 视 芯 片 本 身 的 创 新 和 改 造, 而 相 关 分 子 生 物 学 技 术 创 新 略 有 欠 缺 所 有 上 述 问 题 的 解 决 都 将 是 一 个 艰 巨 的 过 程 总 之, 基 因 芯 片 的 研 究 和 应 用 仍 会 面 临 许 多 困 难, 1 旦 前 景 是 光 明 的 从 芯 片 问 世 到 现 在 短 短 几 年 时 间, 芯 片 技 术 己 得 到 飞 速 发 展 基 因 芯 片 技 术 的 进 步 必 将 更 加 依 赖 于 物 理 化 学 及 信 息 学 领 域 的 新 成 果, 随 着 新 技 术 的 应 用 和 越 来 越 多 的 学 科 融 合, 该 技 术 的 全 面 应 用 是 可 以 预 见 的 基 因 芯 片 技 术 作 为 一 个 技 术 平 台, 不 仅 在 基 因 测 序 多 态 分 析 基 因 表 达 研 究 克 隆 选 择 文 库 筛 选 突 变 检 测 病 原 诊 断 等 万 面 有 巨 大 的 应 用 价 值, 而 且 将 在 健 康 保 健 药 物 研 究 优 生 法 医 检 疫 食 品 和 环 境 监 测 及 工 农 业 等 领 域 展 现 出 极 大 的 应 用 潜 力 基 因 芯 片 技 术 将 给 人 类 带 来 巨 大 的 积 极 影 响 ( 夏 庆 杰 ) 参 考 文 献 1 蒋 中 华 等. 生 物 分 子 固 定 化 技 术 及 应 用. 北 京 : 化 学 工 业 出 版 社, 马 立 人, 蒋 中 华. 生 物 芯 片. 北 京. 化 学 工 业 出 版 社, J Sambrook, EF Fritsch, T Maniatis (translated by Jin DY, Li MF). Molecular cloning: a laboratory manual. 2 时 Beijing: Science Press, SchenaM. DNA Microarrays --APRACTICAL APPROACH, OXFORD UNIVERSITY PRESS, Zhang L, Zhou W, Velculescu VE, et a1. Science, 1997, 276: Brown PO, Boststein D. Nat. Genet, 1999, 21: Perou CM, Sorlie T, Eisen MB, et a1. Nature, 2000, 406: Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE, et a1. Nature, 2000, 403:

225 第 十 三 章 临 床 分 子 遗 传 学 检 验 的 质 量 控 制 近 十 年 来, 随 着 人 类 和 各 种 病 原 微 生 物 基 因 组 研 究 的 深 入, 越 来 越 多 的 基 因 碱 基 序 列 被 确 定, 为 采 用 核 酸 技 术 进 行 临 床 分 子 生 物 学 检 测 提 供 了 丰 富 的 资 料 国 内 外 能 进 行 基 因 诊 断 的 遗 传 病 己 逾 百 种, 各 种 病 原 体 基 因 诊 断 己 被 临 床 广 泛 采 纳 基 因 诊 断 在 理 论 上 具 有 高 灵 敏 度 高 特 异 性 万 便 快 速 及 应 用 范 围 广 等 特 点, 无 疑 将 是 临 床 诊 断 技 术 发 展 的 万 向 之 一 在 我 国, 临 床 分 于 核 酸 检 测 大 约 起 始 于 20 世 纪 80 年 代 中 晚 期, 当 时 检 测 的 主 要 是 少 数 遗 传 性 疾 病, 如 镰 形 细 胞 贫 血 症 地 中 海 贫 血 等 20 世 纪 90 年 代 初, 随 着 PCR 技 术 的 引 进 和 应 用, 使 遗 传 病 与 病 原 体 核 酸 检 测 更 加 万 便 快 速, 检 测 范 围 亦 不 断 扩 大 但 是 由 于 检 测 技 术 的 局 限, 从 业 人 员 缺 乏 必 要 的 培 训 及 检 测 质 量 控 制 水 平 较 低 等 原 因, 检 测 的 可 靠 性 和 适 用 性 距 离 临 床 的 要 求 还 有 相 当 距 离 90 年 代 中 后 期, 一 些 新 的 分 于 核 酸 检 测 技 术 开 始 在 基 因 诊 断 中 得 到 应 用, 其 中 比 较 典 型 的 有 荧 光 探 针 定 量 PCR 荧 光 原 位 杂 交 DNA 测 序 等, 使 检 测 结 果 更 为 明 确 可 靠 1 旦 临 床 分 于 遗 传 学 检 测 的 实 验 室 质 量 控 制 工 作 仍 远 远 落 后 于 临 床 应 用 的 要 求, 成 为 制 约 其 临 床 应 用 的 主 要 因 素 之 一 临 床 分 于 核 酸 检 测 的 特 点 是 针 对 不 同 的 检 测 项 目, 有 完 全 不 同 的 质 量 控 制 重 点 尽 管 如 此, 结 合 国 内 外 的 实 践 经 验, 对 临 床 分 于 核 酸 检 测 实 验 室 的 共 同 质 量 控 制 万 面 的 内 容 仍 可 做 如 下 论 述, 以 供 参 考 第 一 节 室 内 质 量 控 制 室 内 质 量 控 制 大 致 分 为 实 验 室 管 理 室 内 污 染 监 控 和 检 测 质 量 控 制 三 个 主 要 部 分 ( ) 实 验 室 管 理 在 实 验 室 管 理 中 应 加 强 以 下 四 个 万 面 的 工 作 1. 从 业 人 员 培 训 分 于 核 酸 检 测 作 为 一 种 全 新 的 临 床 检 测 手 段, 不 仅 要 求 从 业 人 员 要 了 解 基 本 的 分 子 生 物 学 知 识, 而 且 必 须 具 备 相 关 的 临 床 知 识 但 即 使 是 高 等 院 校 的 毕 业 生, 要 同 时 具 备 上 述 两 种 知 识 背 景 也 是 不 现 实 的, 因 此 检 测 人 员 的 培 训 显 得 非 常 重 要 就 培 训 的 重 点 而 言, 理 论 培 训 应 放 在 核 酸 的 基 本 结 构 与 基 因 组 知 识 基 因 扩 增 和 分 于 杂 交 基 本 原 理 应 用 及 相 关 衍 生 技 术 遗 传 病 的 临 床 表 现 常 规 检 测 基 本 分 于 病 因 和 基 因 诊 断 原 理 等 万 面 其 次, 对 从 业 人 员 进 行 实 验 技 能 的 培 训, 在 实 践 中 增 加 感 性 认 识, 养 成 规 范 化 操 作 的 习 惯, 使 其 成 为 日 常 工 作 中 的 自 觉 行 为, 并 初 步 具 备 正 确 判 断 结 果 和 分 析 问 题 的 能 力 其 三, 在 整 个 培 训 过 程 中, 必 须 随 时 强 调 防 止 污 染, 并 详 细 介 绍 可 能 的 污 染 源 污 染 处 置 办 法 和 防 污 染 措 施 2. 规 范 化 操 作 程 序 的 制 定 和 执 行 核 酸 检 测 比 较 程 序 化, 这 为 规 范 化 操 作 提 供 了 前 提 条 件 该 工 作 分 为 两 个 部 分. 221.

226 其 一, 实 验 程 序 的 制 定 和 执 行 : 遗 传 病 基 因 诊 断 的 实 验 程 序 比 较 个 体 化, 需 针 对 不 同 的 病 种 制 定 相 应 的 万 案, 万 案 一 经 确 定, 其 改 动 必 须 有 相 应 的 理 论 依 据 应 注 意 的 是 实 验 万 案 中 必 须 包 含 质 量 控 制 措 施, 下 面 以 男 性 不 育 Y 染 色 体 AZF 区 域 微 缺 失 检 测 为 例 予 以 说 明 检 测, 不 仅 应 设 置 内 对 照, 即 人 类 基 因 组 其 他 位 点 如 SRY, ZFY, ZFX 等 的 扩 增, 而 且 还 应 同 时 采 用 正 常 男 性 和 女 性 的 标 本 进 行 外 对 照 平 行 实 验, 以 确 保 结 果 的 可 靠 性 各 实 验 室 应 根 据 自 身 的 具 体 情 况 加 以 完 善, 并 定 期 对 实 验 程 序 进 行 检 查 核 对, 及 时 修 改, 保 持 持 续 改 进 上 述 实 验 程 序 的 制 定 必 须 形 成 书 面 文 件, 执 行 时 有 实 验 记 录 其 二, 实 验 仪 器 和 用 具 使 用 程 序 的 制 定 和 执 行 : 实 验 仪 器 和 用 具 关 系 到 计 量 是 否 准 确, 同 时 也 是 实 验 污 染 的 重 点 监 控 对 象, 因 此 正 确 使 用 和 清 洁 保 养 是 非 常 重 要 的 以 微 量 移 液 器 为 例, 应 明 确 定 区 使 用 定 期 校 准 定 时 灭 菌 定 量 吸 液 的 原 则, 即 检 测 区 域 之 间 不 得 泪 用 移 液 器 ; 作 为 微 量 检 测 实 验, 计 量 器 的 校 准 应 坚 持 至 少 每 周 1 次, 每 半 年 由 专 业 人 员 校 准 1 次 ; 为 防 止 核 酸 片 段 污 染, 移 液 器 应 每 月 一 次 高 温 高 压 灭 菌, 并 每 天 在 稀 酸 (l mol HCl) 中 至 少 浸 泡 30 mi 日, 紫 外 线 照 射 30 mi 日 ; 在 移 液 器 选 择 使 用 中, 必 须 按 照 吸 取 量 基 本 居 于 移 液 器 刻 度 范 围 中 值 来 确 定, 切 勿 使 用 小 于 吸 取 量 的 吸 头, 以 免 造 成 超 吸, 使 移 液 器 整 个 污 染 离 心 机 使 用 必 须 强 调 严 格 按 使 用 程 序, 尽 量 避 免 离 心 中 试 管 开 盖 溶 液 外 泻 的 事 件 发 生, 如 发 生 类 似 情 况, 应 用 稀 酸 (lmol HCl) 擦 拭, 紫 外 线 照 射 来 避 免 污 染 此 外, 扩 增 仪 电 泳 仪 及 无 菌 台 的 使 用 也 均 应 有 严 格 的 操 作 程 序, 并 形 成 书 面 文 件, 以 保 证 执 行 程 序 的 连 续 性, 避 免 因 操 作 人 员 更 替 对 实 验 的 影 响 另 外, 要 特 别 注 意 的 是 实 验 过 程 所 涉 及 的 耗 材, 如 手 套 离 心 管 吸 头 等 必 须 是 一 次 性 使 用, 切 勿 片 面 强 调 节 约 而 因 小 夫 大 3. 设 备 与 空 间 管 理 为 了 防 止 污 染, 实 验 相 关 设 备 均 应 严 格 执 行 分 区 使 用 原 则, 切 忌 随 意 跨 区 搬 动 离 心 机 扩 增 仪 电 泳 仪 无 菌 台 及 冰 箱 的 使 用 均 应 有 书 面 说 明 检 测 空 间 应 根 据 各 实 验 室 的 具 体 情 况 严 格 分 区, 其 原 则 应 该 是 : 整 个 检 测 空 间 相 对 封 闭, 避 免 频 繁 的 空 气 对 流 ; 标 本 处 理 扩 增 加 样 核 酸 扩 增 与 产 物 检 测 必 须 空 间 分 离, 并 形 成 四 区 依 次 的 单 向 走 动 ; 核 酸 扩 增 与 产 物 检 测 区 应 居 于 另 两 个 区 的 下 风 处, 并 安 装 通 气 设 备, 以 便 及 时 排 除 空 气 中 可 能 存 在 的 扩 增 产 物 气 溶 胶 4. 实 验 试 剂 管 理 在 试 剂 保 管 中 强 调 两 点 其 一, 保 存 的 条 件 : 常 规 分 于 诊 断 试 剂 应 放 置 在 20 'c 环 境 中, 为 保 持 温 度 的 恒 定, 应 尽 可 能 使 用 实 验 室 专 用 冰 箱, 切 勿 将 试 剂 放 置 在 无 霜 的 家 用 冰 箱 内 另 外 要 注 意 的 两 个 原 则 : 未 拆 封 试 剂 与 己 部 分 使 用 试 剂 分 区 放 置, 所 有 未 使 用 试 剂 与 临 床 标 本 等 分 区 ; 其 二, 严 格 的 登 记 制 度 : 与 其 他 临 床 试 剂 相 比, 分 于 诊 断 试 剂 有 更 严 格 的 使 用 期 限 制, 所 有 试 剂 均 应 严 格 登 记 使 用 期 限, 严 禁 使 用 过 期 试 剂 在 试 剂 使 用 规 则 万 面, 应 注 意 在 使 用 前 低 温 解 冻, 解 冻 后 应 置 于 冰 上, 室 温 条 件 下 放 置 时 间 不 超 过 10 mi 日 ; 打 开 管 盖 前 务 必 作 低 速 瞬 时 离 心, 达 到 1 昆 匀 和 防 止 试 剂 浪 费 污 染 的 目 的 新 开 封 试 剂 应 尽 量 一 次 性 用 完, 最 多 使 用 不 超 过 2 次, 以 防 反 复 冻 融 导 致 试 剂 失 效, 并 减 少 实 验 室 污 染 的 机 会 ( 二 ) 室 内 污 染 监 控 分 于 核 酸 检 测 实 验 室 进 行 的 实 验 操 作 对 象 均 是 DNA Ejj(; RNA, 在 体 外 获 得 大 量 的 持 检 222

227 DNA 是 检 测 的 关 键 所 在 因 此 在 各 种 检 测 技 术 中 最 常 用 的 技 术 是 PCR 技 术 或 以 此 为 核 心 的 其 他 检 测 技 术, 随 之 而 来 的 问 题 就 是 如 何 防 止 监 测 和 处 理 PCR 带 来 的 实 验 室 污 染 问 题 1. 实 验 室 污 染 源 和 可 能 发 生 污 染 的 实 验 环 节 实 验 室 污 染 源 和 可 能 发 生 污 染 的 实 验 环 节 参 见 表 表 13-1 核 酸 检 测 污 染 源 和 污 染 环 节 临 床 标 本 前 处 理 PCR 力 口 丰 丰 PCR 书 ~J:i 曾 既 往 PCR 产 物 污 染 易 发 生 易 发 生 易 发 生 临 床 标 本 问 污 染 易 发 生 可 发 生 不 发 生 2. 实 验 室 污 染 监 测 第 一, 在 临 床 标 本 前 处 理 时, 加 一 个 阴 性 临 床 标 本 同 步 进 行 ; 第 二, PCR 扩 增 时, 再 加 一 个 阴 性 模 板 同 步 扩 增 两 个 阴 性 标 本 任 一 出 现 阳 性 结 果 都 提 示 污 染 产 生, 需 对 实 验 室 重 新 清 洁, 重 复 实 验 3. 实 验 室 污 染 控 制 办 法 1 在 实 验 技 术 上 应 尽 量 采 用 自 动 化 程 度 高 和 防 污 染 手 段, 如 PE 公 司 的 PE7700 系 统 Roche 公 司 LightCycler 系 统 等 ; 另 外, PCR 扩 增 中 底 物 取 代 法, 即 用 dutp 取 代 dttp, 扩 增 前 加 入 UNG 酶 ( 尿 口 密 院 糖 昔 酶 ) 对 避 免 既 往 产 物 的 污 染 是 一 个 很 好 的 万 法 2 实 验 空 间 设 置 为 单 向 走 动, 每 天 30 mi 日 以 上 紫 外 线 照 射 3 实 验 用 具 和 仪 器 设 备 坚 持 每 周 一 次 稀 酸 擦 拭, 每 天 30 mi 日 以 上 紫 外 线 照 射 4 严 格 操 作 程 序, 坚 持 使 用 一 次 性 实 验 耗 品 5 实 验 弃 物, 包 括 标 本 营 一 次 性 消 耗 品 扩 增 产 物 管 及 琼 脂 糖 凝 胶 等 定 期 高 温 焚 毁 ( 三 ) 检 测 质 量 控 制 作 为 保 证 检 测 结 果 的 可 靠 性, 检 测 的 质 量 控 制 工 作 具 有 举 足 轻 重 的 作 用, 它 可 以 分 为 以 下 几 个 万 面 1. 标 本 采 集 和 保 存 以 往 对 临 床 标 本 的 采 集 和 保 存 重 视 不 够 我 们 对 长 期 的 实 验 资 料 进 行 总 结 发 现, 不 同 的 医 师 所 取 标 本, 其 阳 性 率 有 显 著 差 异, 提 示 标 本 的 采 集 对 检 测 结 果 有 直 接 的 影 响 因 此 应 有 专 人 收 集 标 本 或 尽 量 统 一 医 师 取 材 万 法 标 本 一 般 不 流 存, 以 免 冻 融 过 程 中 细 胞 破 裂, DNA 丢 失 过 多, 保 存 在 4 'c 不 得 超 过 24 h, 室 温 下 不 得 超 过 3 h o 2. 试 剂 质 量 评 价 在 新 批 号 试 剂 使 用 前, 应 在 实 验 室 进 行 基 本 的 质 量 评 价, 包 括 代 表 10 3 ~105 个 拷 贝 的 质 粒 DNA 标 本 和 阴 性 标 本 的 扩 增, 在 结 果 相 符 的 情 况 下 万 可 在 临 床 使 用 3. 临 床 标 本 预 处 理 预 处 理 的 目 的 是 获 得 扩 增 所 需 的 靶 序 列 DNA 为 避 免 标 本 间 的 交 叉 污 染 和 既 往 PCR 产 物 污 染, 在 严 格 处 理 程 序 的 基 础 上, 必 须 将 过 去 保 留 的 阳 性 标 本 和 阴 性 标 本 一 道 处 理, 以 便 检 测 出 现 不 符 的 结 果 时, 可 以 将 问 题 定 位 于 该 步 骤 4. 扩 增 前 加 样 在 加 样 时, 必 须 严 格 按 照 操 作 程 序, 同 时 设 置 阴 性 和 阳 性 对 照, 以 万 便 出 现 污 染 时 对 污 染 环 节 的 判 断 另 外, 微 量 移 液 器 的 使 用 应 符 合 规 程 要 求, 尽 量 保 证 加 样 体 积 的 准 确 这 是 防 污 染 的 重 点 5. 结 果 判 读 以 采 用 常 规 PCR 电 泳 检 测 为 例, 阳 性 结 果 判 断 必 须 符 合 以 下 条 件 : 223

228 1 扩 增 带 应 与 阳 性 对 照 完 全 平 齐 ;2 DNA 相 对 分 于 质 量 标 记 所 示 扩 增 片 段 大 小 与 资 料 一 致 ;3 阳 性 对 照 均 有 扩 增, 阴 性 对 照 无 扩 增 ;4 切 勿 将 引 物 聚 合 体 非 特 异 扩 增 带 等 与 目 的 带 泪 j 肴 在 采 用 全 自 动 仪 器 检 测 时, 应 对 计 算 机 收 集 的 数 据 信 息 进 行 仔 细 分 析, 根 据 我 们 的 经 验 :1 超 过 40 个 帽 环 出 现 的 扩 增 信 号 的 变 化 必 须 重 新 实 验 ;2 于 动 分 析 时 必 须 客 观, 勿 使 过 多 的 主 观 因 素 影 响 结 果 的 判 断 结 果 判 i 卖 是 获 得 诊 断 结 论 的 最 后 一 关, 因 此 必 须 谨 慎, 尤 其 是 遗 传 病 的 基 因 诊 断, 结 果 应 有 相 关 资 深 人 员 审 核 第 二 节 室 问 质 量 评 价 样 品 开 发 遗 传 病 基 因 异 常 范 围 广 泛, 基 因 诊 断 个 体 针 对 性 太 强, 加 之 不 同 实 验 室 采 用 的 诊 断 万 法 各 异, 难 以 确 定 不 同 实 验 室 共 同 的 室 问 质 量 控 制 样 品 然 而 正 是 以 上 原 因, 提 醒 我 们 必 须 加 强 实 验 室 的 室 内 质 量 控 制, 包 括 针 对 不 同 遗 传 病 基 因 诊 断 的 对 照 品 设 置 与 实 验 室 内 部 定 期 采 用 不 同 的 诊 断 万 法 对 同 一 个 患 者 的 基 因 异 常 进 行 检 测, 以 验 证 结 果 的 可 靠 性 等 措 施 对 遗 传 病 基 因 诊 断 的 室 问 质 量 控 制 并 不 是 无 所 作 为 的, 根 据 我 们 的 经 验, 可 以 组 织 多 个 比 较 权 威 的 基 因 诊 断 实 验 室 进 行 各 种 遗 传 病 患 者 标 本 的 收 集 与 保 存, 通 过 最 可 靠 的 万 法 确 定 这 些 患 者 的 遗 传 异 常, 然 后 将 标 本 发 放 至 各 基 因 检 测 实 验 室, 以 获 得 其 检 测 结 果, 并 评 价 这 些 实 验 室 基 因 诊 断 水 平 病 原 体 核 酸 检 测 的 室 问 质 量 控 制 样 品 开 发 相 对 比 较 容 易, 目 前 国 内 开 展 室 问 质 控 的 病 种 较 少, 但 随 着 该 类 检 测 的 普 及, 室 问 质 量 控 制 样 品 的 开 发 工 作 将 会 有 进 一 步 的 发 展 主 要 表 现 在 以 下 两 个 万 面 1. 菌 体 质 量 控 制 样 品 以 完 整 的 菌 体 为 质 量 控 制 样 品, 其 优 点 在 于 :1 菌 体 标 本 有 完 整 的 基 因 组 DNA, 避 免 不 同 实 验 室 所 用 试 剂 扩 增 位 点 差 异 的 限 制 ;2 菌 体 标 本 地 检 测 过 程 与 临 床 标 本 检 测 完 全 一 致, 有 利 于 整 个 检 测 过 程 的 监 控 但 存 在 活 菌 体 标 本 的 保 存 和 运 输 问 题 2. 重 组 载 体 质 量 控 制 样 品 以 含 扩 增 片 段 的 载 体 为 质 量 控 制 样 品, 其 优 点 在 于 : 1 较 宽 松 的 保 存 和 运 输 条 件 ;2 载 体 DNA 可 进 行 较 准 确 的 定 量, 在 灵 敏 度 质 控 中 意 义 明 显 其 缺 点 :1 无 法 对 标 本 预 处 理 进 行 质 控 ;2 不 同 商 家 试 剂 扩 增 位 点 差 异 使 载 体 个 体 化 强, 造 成 同 种 病 原 体 检 测 亦 需 多 种 载 体 DNA 的 问 题 但 可 通 过 商 家 报 批 试 剂 时 同 时 提 供 相 关 载 体 来 解 决 临 床 核 酸 检 测 室 问 质 量 控 制 工 作 的 建 立 完 善 需 要 各 行 政 主 管 部 门 专 业 机 构 和 试 剂 生 产 厂 家 共 同 完 成, 其 中 室 问 质 量 控 制 样 品 的 选 择 开 发 是 工 作 的 核 心 尽 管 目 前 临 床 核 酸 检 测 还 处 于 发 展 的 初 级 阶 段, 但 为 了 规 范 和 促 进 该 工 作, 建 立 其 室 问 质 量 评 价 系 统 己 刻 不 容 缓 核 酸 检 测 作 为 临 床 检 测 的 一 个 分 支, 在 短 短 十 余 年 的 发 展 和 应 用 中 己 呈 现 出 明 显 的 技 术 优 势, 并 且 随 着 全 自 动 定 量 核 酸 检 测 和 基 因 芯 片 技 术 的 应 用, 这 种 优 势 还 将 进 一 步 224

229 凸 显 作 为 一 种 新 兴 的 检 测 手 段, 核 酸 检 测 在 发 展 和 新 技 术 应 用 的 初 期 面 临 诸 多 问 题, 因 此 应 该 结 合 国 外 的 经 验, 尽 快 建 立 和 完 善 临 床 核 酸 检 测 的 质 量 控 制 工 作, 争 取 做 到 先 规 范 再 发 展 或 边 规 范 边 发 展 第 二 节 临 床 分 子 核 酸 检 验 实 验 室 质 量 控 制 要 求 ( ) 患 者 及 真 标 本 的 资 料 保 存 1. 所 有 患 者 的 资 料, 包 括 其 病 例 复 印 件 其 他 检 查 报 告 复 印 件 检 测 申 请 等 应 储 存 于 一 个 安 全 的 计 算 机 系 统 内, 并 设 置 严 格 的 进 入 程 序 与 密 码 ; 计 算 机 系 统 应 是 内 部 联 网, 可 以 在 被 授 权 的 情 况 下 在 任 一 终 端 看 到 资 料 ; 资 料 应 有 计 算 机 硬 盘 外 的 电 于 拷 贝, 以 防 丢 失 2. 实 验 室 应 保 证 正 确 的 患 者 资 料 被 输 入 计 算 机, 并 保 存 一 份 书 面 资 料 以 防 不 测 3. 资 料 由 于 各 种 原 因 需 要 更 改 或 补 充, 应 及 时 书 面 解 释 原 因, 并 与 资 料 一 起 存 档 0 4. 标 本 管 上 至 少 应 有 两 种 或 两 种 以 上 患 者 特 有 的 标 志, 如 姓 名 编 号 或 病 例 号 5. 手 写 标 本 管 标 记 容 易 出 错, 应 尽 量 打 印 粘 贴 ( 二 ) 标 本 储 存 1. DNA 标 本 可 以 在 4 'c 20 'c 或 40 'c 环 境 中 长 期 保 存, 但 不 管 储 存 在 哪 一 种 温 度 条 件 下, 都 必 须 保 证 DNA 的 完 整 性 2. 尽 量 避 免 DNA 标 本 的 反 复 冻 融, 影 响 DNA 的 质 量 实 验 室 可 以 分 装 出 一 定 体 积 的 DNA 标 本 于 4 'c 保 存 以 供 使 用, 而 勿 需 将 全 部 标 本 同 时 反 复 解 冻 3. 不 管 是 原 始 标 本 还 是 提 取 后 的 DNA 标 本 均 应 有 备 份, 备 份 应 储 存 在 其 他 冰 箱 或 实 验 室 里, 至 少 在 一 年 以 后 才 能 动 用 为 避 免 标 本 丢 失 或 便 于 储 存, 建 议 用 3 mm 纸 做 干 缎 血 片 储 存 全 血 标 本 4. 标 本 储 存 前 应 至 少 标 明 两 种 以 上 识 别 标 志, 如 姓 名 疾 病 名 称 等, 数 字 通 常 容 易 受 到 标 本 位 置 移 动 等 因 素 的 影 响 而 最 后 难 以 识 别 ( 三 ) DNA 提 取 1. 实 验 室 应 有 专 门 避 免 DNA 抽 提 过 程 中 DNA 相 互 污 染 的 措 施, 并 具 备 专 门 的 DNA 提 取 区 域 生 物 安 全 柜 及 带 滤 芯 的 吸 头 等 2. 不 管 采 用 何 种 技 术 抽 提 DNA, 标 本 在 管 与 管 之 间 的 转 移 次 数 应 尽 量 减 少, 以 避 免 人 为 误 差 3. 自 动 化 DNA 提 取 仪 器 及 其 试 剂 可 以 避 免 操 作 过 程 中 的 人 为 误 差, 应 推 广 使 用 ( 四 ) 实 验 处 置 1. 实 验 步 骤 应 在 实 验 前 形 成 书 面 文 件 2. 在 DNA 提 取 PCR 加 样 或 其 他 操 作 中, 所 有 转 移 管 都 必 须 重 复 检 查, 避 免 不 同 标 本 的 泪 j 肴 3. 所 有 实 验 试 剂 的 记 录 应 保 留, 以 便 出 现 问 题 时 可 追 溯 并 得 到 解 决 4. 尽 管 商 品 化 的 即 刻 使 用 的 试 剂 比 实 验 室 自 己 分 装 的 试 剂 价 格 昂 贵,1 且 操 作 简 便 实 验 环 节 少, 不 易 出 现 实 验 误 差, 应 推 荐 使 用. 225.

230 5. 实 验 室 应 有 自 己 的 程 序 保 证 正 确 的 标 本 被 转 移 到 正 确 的 反 应 管 或 电 泳 泳 道 内 ( 五 ) 对 照 自 正 常 男 性 和 女 性 标 本 相 对 分 于 质 量 标 记 阴 ' 生 对 照 特 异 突 变 对 照 等 应 设 置 ( 六 ) 结 果 及 真 评 价 实 验 室 内 部 应 有 自 己 的 检 测 质 量 标 准, 如 1 分 二 很 好 2 分 二 可 报 告 3 分 二 不 能 报 告, 并 记 录 在 案 (t) 检 测 报 告 1. 检 测 报 告 基 本 内 容 参 见 图 基 因 诊 断 报 告 格 式 举 例 编 号 姓 名 出 生 年 月 性 别 民 族 : 标 本 送 检 医 师 : 送 检 医 院 ( 科 室 ): 申 请 检 测 理 由 申 请 人 签 字 : 日 期 临 床 诊 断 : 其 他 实 验 室 检 查 结 果 : 家 系 情 况 ( 注 明 被 检 者 与 先 证 者 的 关 系 ): 基 因 诊 断 目 的 基 因 诊 断 方 法 及 其 技 术 指 标 : 基 因 诊 断 步 骤 : 基 因 诊 断 结 果 基 因 诊 断 结 论 (l 分 析 漏 诊 误 诊 的 可 能 性 ; 2 阶 段 性 诊 断 结 果 不 下 结 论 ): 建 议 l 其 他 检 查 2 家 系 其 他 成 员 预 测 3 产 前 诊 断 4 遗 传 咨 询 参 考 资 料 与 数 据 : 报 告 人 : 审 核 人 l 审 核 人 2 报 告 日 期 图 13-1 检 测 报 告 基 本 内 容 示 意 2. 所 有 报 告 应 有 两 个 具 有 签 发 报 告 权 的 人 员 独 立 进 行 检 查 审 核 并 签 名 3. 因 为 标 准 模 式 的 报 告 限 制 了 报 告 的 弹 性 需 要, 因 此 并 不 推 荐 使 用 4. 考 虑 到 报 告 的 保 密 问 题 和 各 种 传 递 报 告 万 式 的 风 险, 应 预 先 征 求 申 请 者 的 意 见 ( 八 ) 标 准 文 件 不 仅 各 种 实 验 室 管 理 需 要 形 成 标 准 文 件, 而 且 每 个 实 验 室 都 应 将 使 用 的 检 测 技 术 和 程 序 形 成 规 范 的 书 面 文 件. 226.

231 参 考 文 献 1 Kwok S. Avoiding false positive with PCR. uature, 1989, 339: Longo MC, Berninger MS, Hartley JL. Use of UNG to control carryover contamination in PCR. Gene, 1990, 93 : 郑 怀 竞. 基 因 扩 增 临 床 检 验 指 南. 北 京. 北 京 医 科 大 学 出 版 社, 杨 元, 张 思 仲, 邓 少 丽. 临 床 核 酸 检 测 实 验 室 的 基 本 质 量 控 制 措 施. 临 床 检 验 杂 志, 2002, 20 (l) :

232 一 附 录 一 常 用 试 剂 的 配 制 各 种 ph 值 的 Tris 缓 冲 液 的 配 制 某 一 特 定 ph 值 的 o. 05 mal/l Tris 缓 冲 液 的 配 制 : 将 50 ml O. 1 mal/l Tris 碱 溶 液 与 附 录 表 1 所 示 相 应 体 积 的 O. 1 mal/l HCI 混 合, 力 口 水 至 100 ml o 附 录 表 1 所 需 ph 值 (25 'C) 各 种 ph 值 的 Tris 缓 冲 液 的 配 制 ov -- mo / H C m & 工,, F - 常 见 的 市 售 酸 碱 浓 度 常 见 市 售 酸 碱 浓 度 参 见 附 录 表 2 0 附 录 表 2 常 见 的 市 售 酸 碱 浓 度 溶 质 分 子 式 相 对 分 子 质 量 物 质 的 量 浓 度 质 量 浓 度 质 量 分 数 配 制 1 mo l/ L 溶 液 相 对 密 度 (mol/l) (g/l) (%) 的 加 入 量 (ml/ L) 冰 乙 酸 CH2COOH 乙 酸 CH2COOH 甲 酸 HCOOH 盐 酸 HC]

233 - 固 ( 续 附 录 表 2) 相 对 分 子 质 量 物 质 的 量 浓 度 质 量 浓 度 质 量 分 数 配 制 1 mo l/ L 溶 液 溶 质 分 子 式 相 对 密 度 (mol/l) (g/l) (%) 的 加 入 量 (ml/ L) 硝 酸 HN 高 氯 酸 HCL 磷 酸 H3 P 硫 酸 H2S 氢 氧 化 绞 NH40H 氢 氧 化 何 KOH 氢 氧 化 纳 NaOH 常 用 贮 存 液 的 配 制 除 菌 二 铀 ma l/ L 乙 酸 按 把 770g 乙 酸 按 溶 解 于 800 ml 水 中, 加 水 定 容 至 1 L 后 过 滤 mal/l EDTA (ph 8.0) 在 800 ml 水 中 加 入 g 二 水 乙 二 肢 四 乙 酸 (EDTA - Na. 2H 2 0), 在 眼 力 搅 拌 器 上 剧 烈 搅 拌 用 NaOH 调 节 溶 液 的 ph 值 至 8.0 ( 约 需 20 g NaOH 颗 粒 ), 然 后 定 容 至 1 L, 分 装 后 高 压 灭 菌 备 用 3. 漠 化 乙 皖 (1 0 gil) 在 100 ml 水 中 加 入 1 g 澳 化 乙 链, 眼 力 搅 拌 数 小 时 以 确 保 其 完 全 溶 解, 然 后 用 铝 宿 包 容 器 或 转 移 至 棕 色 瓶 中, 保 存 于 室 温 mal/l MgCb 在 800 ml 水 中 溶 解 g MgCb 6 H 2 0, 用 水 定 容 至 1 L, 分 装 成 小 份 并 高 压 灭 菌 备 用 5. 3 ma l/ L 乙 酸 纳 在 800 ml 水 中 溶 解 g 三 水 乙 酸 纳, 用 冰 乙 酸 调 节 ph 值 至 5.2 或 用 稀 乙 酸 (ph 5.2 和 ph 值 7.0) 调 节 ph 值 至 7.0, 力 口 水 定 容 至 1 L, 分 装 后 高 压 灭 菌 6. 5 mal/l NaCl 在 800 ml 水 中 溶 解 g NaCl, 加 水 定 容 至 1 L, 分 装 后 高 压 灭 菌 7. 10% 十 二 炕 基 硫 酸 铀 (SDS) 在 900 ml 水 中 溶 解 100 g 电 泳 级 SDS, 加 热 至 68 'c 助 溶, 加 入 几 滴 浓 盐 酸 调 节 溶 液 的 ph 值 至 7.2, 力 口 水 定 容 至 1 L, 分 装 后 备 用 x SSC 在 800 ml 水 中 溶 解 g NaCl 和 88.2 g 拧 橡 酸 纳, 加 入 数 滴 10 mal/lnaoh 溶 液 调 节 ph 值 至 7.0, 力 口 水 定 容 至 1L, 分 装 后 高 压 灭 菌 x SSPE 在 800 ml 水 中 j 容 解 g NaCl, g NaH 2 P0 4 H 2 0 和 7.4 gedta, 用 NaOH 溶 液 调 节 ph 值 至 7.4 ( 约 需 6. 5ml10ma l/ LNaOH), 加 水 定 容 至 1 L, 分 装 后 高 压 灭 菌 mal/l Tris 在 800 ml 水 中 溶 解 gtris 碱, 加 入 浓 HCl 调 节 ph 至 所 229

234 需 值 ph HCI (ml) 应 使 溶 液 冷 却 至 室 温 后 万 可 最 后 调 走 ph 值, 力 口 水 定 容 至 1L, 分 装 后 高 压 灭 菌 11. Denhardt 试 剂 Denhardt 试 剂 1996) 通 常 配 制 成 50 x 贮 存 液, 过 滤 保 存 于 20 'c 可 将 该 贮 存 液 10 倍 稀 释 于 预 杂 交 液 ( 常 含 有 O. 5 % SDS 100 mg/l 经 变 性 并 打 断 的 蛙 精 DNA 的 6X SSC 或 6 x SSPE) 中, 50 x Denhardt 液 含 5 g 聚 庶 糖 ( Ficoll, 400 型 : Pharmacia), 5 g 聚 乙 烯 口 比 咯 炕 酣 和 5 g 牛 血 洁 白 蛋 白, 力 口 水 至 终 体 积 为 500 ml a 12. 蛋 白 酶 K c 蛋 白 酶 K c 20 gil 溶 于 水, -20'C 保 存 13. 膜 RNA 酶 RNA 酶 A 溶 于 10 mmol/l Tris - HCI (ph 值 7.5) 15 mmol/l NaCI 中, 配 成 10 gil 的 质 量 浓 度, 于 100 'c 加 热 15 mi 日, 缓 慢 冷 却 至 室 温, 分 装 成 小 份 20 'c 保 存 14. ACD ( 抗 凝 剂 ) 拧 棱 酸.48 g 拧 棱 酸 纳 1.32 g 葡 萄 糖 g, 加 超 纯 水 至 100 ml a 15. O. 1 % NP ml NP - 40 原 液 加 超 纯 水 至 ml a mol/l KCI 低 渗 液 称 取 KCI 5.59 g 溶 于 ml 茶 馆 水 中, 4'C 保 存 %EDTA 溶 液 EDTA 0.1 g Na2 HP0 4 O. 576 g NaCl4 g KH 2 HP04 O. 1 g, KCI O. 1 g 葡 萄 糖.1 g 依 次 溶 于 三 蒸 水 中, 加 入 0.4% 酣 红 2.5 ml, 最 后 加 三 蒸 水 500 ml a 高 压 灭 菌, 保 存 于 4 'c 冰 箱 内 使 用 时 以 5%NaC0 3 溶 液 分 散 细 胞 18. 膜 蛋 白 酶 EDTA 混 合 液. 1 月 夷 蛋 白 酶 和 0.02% EDTA 按 1 : 1 混 合, 用 NaHC0 3 调 ph 值 至 6. 8~7. 0, 冰 箱 内 保 存, 用 以 消 化 细 胞 19. 生 理 盐 水 NaCI 8. 5 g, 三 蒸 情 水 加 到 ml, 4'C 冰 箱 内 保 存 20. 5%NaHC0 3 NaHC0 3 5 g, 三 茶 馆 水 加 到 100 ml, 过 滤 除 菌, 斗 C 冰 箱 内 保 存 21. D- HanK 液 ( 无 Ca 2 +, Mg 2 +) NaCI 8. 0 g 葡 萄 糖 LOg KCI O. 4 g 重 蒸 水 ml N a2 HP0 4 12H20 O. 157 g 1% 酣 红 2.0 ml KH2P g, 混 合 后 103 kpa 20 mi 日 高 压 灭 菌, 4 'c 冰 箱 内 保 存 使 用 时 可 用 5%NaHC03 调 ph 值 至 7.2 a ( 王 军 林 立 ). 230.

235 附 录 二 常 用 名 词 术 语 英 文 缩 语 释 意 ASA ASO AS allele - specific amplificatio 日 等 位 基 因 特 异 性 扩 增 allele - specific olignucleotide hybridizatio 日 等 位 基 因 特 异 性 寡 核 昔 酸 杂 交 A 吨 elamn 安 格 尔 曼 综 合 征 AR a 缸 L 川 osomal reces 臼 sive inh 肚 1e 盯 n 山 旧 e 常 染 色 体 隐 性 遗 传 AD 缸 a 削 uto som 丑 1al 也 d om 丑 In 且 1ar 且 1t III 且 肚 h e 盯 ntan 且 C 优 e 常 染 色 体 显 性 遗 传 AHG AZF ASRCR an 且 1tih 肚 冗 1er 盯 m 丑 10 叩 pμ 内 hia 剖 g 10 呻 bu 池 吐 Ilin 且 1 抗 血 友 病 球 蛋 白 缺 乏 症 azoospermia factor 无 精 于 因 于 allele - specific PCR 等 位 基 因 PCR ARMS amplificatio 日 refractory mutatio 日 system 扩 增 阻 滞 突 变 检 测 体 系 CCM CMC CF CAIS CP CGH CSGE CFLP datp dctp dgtp dttp chemical cleavage method 化 学 裂 解 chemical mismath cleavage 化 学 错 配 裂 解 cystic fibrosis 囊 性 纤 维 化 complete androgen insensitivity synclrome 雄 性 素 全 不 敏 感 综 合 征 chromosome painting 染 色 体 涂 抹 comparative gemomic hybridization 比 较 基 因 组 杂 交 conformation sensitive gel electrophoresis 构 象 敏 感 凝 胶 电 泳 cleacage fragment length polymorphism 裂 解 片 段 长 度 多 态 性 deoxyadenosine triphosphate 脱 氧 腺 昔 三 磷 酸 deoxycytidine triphosphate 脱 氧 胞 昔 三 磷 酸 deoxyguanosine triphosphate 脱 氧 鸟 昔 三 磷 酸 deoxythymidine triphosphate 脱 氧 胸 昔 三 磷 酸 dntp any of the four deoxynucleotide triphosphates 四 种 脱 氧 核 昔 三 磷 酸 中 任 意 一 种 : DNA DGGE ddf datp, dctp, dgtp, dttp. deoxyribonucleic acid 脱 氧 核 糖 核 酸 denaturing gel gradient electrophoresis 变 性 梯 度 凝 胶 电 泳 dideoxy finger printing 双 脱 氧 指 纹 图 语 DHPLC denaturing high performance Ii 年 lid chromatog raphy 变 性 高 效 液 相 语 DMD / BMD DM FH Duchenne and Becker muscular dystrophy 杜 / 贝 氏 月 几 营 养 不 良 症 dystrophia myotonica 强 直 性 肌 营 养 不 良 症 familial hypercholesterolemia 家 族 性 高 胆 固 醇 血 症 FPC familial polyposis coli 家 族 性 结 肠 息 肉 FRDA FISH HPG HD Friedreich ataxia 弗 里 德 赖 希 共 济 失 调 fluorescence in situ hybridizatio 日 荧 光 原 位 杂 交 human genome project 人 类 基 因 组 计 划 Huntingron disease 亨 廷 顿 舞 蹈 征. 231.

236 HA heteroduplex analysis 异 源 双 键 分 析 IRS interspersed repetitive sequence 重 复 序 列 PCR polymerase chain reation 多 聚 酶 链 式 反 应 long- PCR 长 距 离 PCR ICR Ligase chain reactio 日 连 接 酶 链 反 应 mpcr multi - PCR 多 重 PCR MALDI-TOF 基 质 辅 助 激 光 解 吸 附 电 离 飞 解 时 间 质 谱 法 NFl neurofibromatosis I 型 神 经 纤 维 瘤 npcr nested - PCR 巢 式 PCR NASBA nucleic acids sequences - based amplification 核 酸 序 列 扩 增 法 PTT protein truncation test 蛋 白 截 短 测 试 PWS prader - willi 综 合 征 PTA plasma thromboplastic antecedent deficiency 血 浆 凝 血 活 酶 前 质 缺 乏 症 PKU phenylketouria 苯 酣 尿 症 PAH phenylalanine hydroxylase 苯 丙 氨 酸 丑 化 酶 PRINS primed in situ syntheses 引 物 介 导 的 原 位 DNA 合 成 RFLP restrictio 日 fragment length polymorphism 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 RNA ribonucleic acid 核 糖 核 酸 RDB reverse dot blot 反 向 斑 点 杂 交 SKY spectral karyotyping 光 谱 染 色 体 核 型 SCA hereditary spinocerebellar ataxia 遗 传 性 脊 髓 小 脑 性 共 济 失 调 STR short tandem repeats 短 串 联 重 复 SNP single nucleotide polymorphism 单 核 昔 酸 多 态 性 SSCP single - strand conformationd polymorphism 单 链 构 象 多 态 性 UPD uniparental disomy 单 亲 二 体 征 VNTR variable number tandem rpeats 串 联 重 复 可 变 数 目 VDA variant detector arrays 变 异 检 测 阵 列 法 VDRR viamin D resistant rickets 抗 维 生 素 D 向 倭 病 XR X - linked recessicve inherita 口 ce X 连 锁 隐 性 遗 传 XD X -linked dominant inheritance X 连 锁 显 性 遗 传 OLA oligonucleotide ligatio 日 assay 寡 核 昔 酸 连 接 扩 增 ( 王 军 林 立 ). 232.

237 附 录 二 国 内 外 部 分 仪 器 试 剂 供 应 商 名 录 公 司 名 称 地 址 和 电 话 主 要 产 品 成 都 川 大 华 西 遗 传 医 学 有 成 都 市 科 华 北 路 99 号 7-11 多 种 遗 传 病 基 因 诊 断 试 剂 盒 和 分 子 生 限 公 司 电 话 物 学 检 测 设 备, 液 相 芯 片 设 备 及 配 套 试 剂 ; 各 种 单 克 隆 抗 体 细 胞 因 子 等 重 庆 三 优 生 物 工 程 有 限 公 司 重 庆 市 沙 坪 坝 区 沙 正 街 多 种 基 因 诊 断 试 剂 盒 和 基 因 诊 断 检 测 电 话 : 设 备 安 玛 西 亚 中 国 有 限 公 司 上 海 代 表 处 上 海 市 肇 嘉 洪 路 746 号 DNA 测 序 仪 基 因 芯 片 点 样 仪 杂 交 电 话 仪 香 港 柴 湾 利 众 街 12 号 基 因 有 限 公 司 电 话 多 种 试 剂 仪 器 分 子 生 物 学 细 胞 生 物 学 及 免 疫 学 的 美 国 应 用 生 命 系 统 公 司 中 国 北 京 市 朝 阳 区 东 三 环 北 路 2 号 基 因 扩 增 仪 DNA 及 蛋 白 质 测 序 仪 公 司 电 话 核 酸 合 成 仪 及 试 剂 上 海 基 达 基 因 技 术 有 限 公 司 中 国 上 海 宜 山 路 1289 号 UT-PCR 试 剂 深 圳 捷 纳 生 物 技 术 有 限 公 司 深 圳 市 南 山 区 玉 泉 路 毅 哲 大 厦 1106 室 唐 氏 综 合 征 产 前 筛 查 等 试 剂 盒, MA SA 技 术 平 台 ( 王 军 林 立 ). 233.

238 附 录 四 常 用 系 谱 符 号 及 其 含 义 符 号 含 义 I 2 家 军 ~i 普 固 1, rr, ill 世 代 数 E 1, 2, 3 排 行 皿. - o o E F S d f吐 a一 T, 页,, 万 2 1 男 性 男 性 患 者 女 性 ~ 性 患 者 性 别 不 详 X 连 锁 陆 性 边 传 虫 病 基 同 携 带 者 婚 配 近 亲 结 婚 先 ijt 者 死 了 牛 病 己 死 亡 未 生 育 it 产. 234.