TR101-说明书修改稿4

T7 High Yield RNA Transcription kit TR101 www.vazyme.com Vazyme biotech co., ltd. 使用说明书 Version 7.1

目录 Contents 01/ 产品概述... 02 02/ 产品组分... 02 03/ 保存条件... 02 04/ 适用范围... 02 05/ 自备材料... 02 06/ 模板制备... 02 07/ 实验过程... 03 07-1/ 转录方案... 03 07-2/ 体外转录... 03 07-3/ 产物纯化... 05 07-4/RNA 定量... 05 07-5/ 数据参考... 05 08/ 常见问题及解决方案... 06

01/ 产品概述 T7 High Yield Transcription Kit 进行了转录反应体系的优化,T7 RNA Polymerase 从模板 DNA T7 启动子下游开始合成与 DNA 中一条链互补的 RNA, 简单快速获得大量的 RNA 分子, 转录时可在底物中加入修饰的核苷酸, 制备生物素或染料标记的 RNA 本试剂盒以 0.5 μg 的模板投入量可以产生 150-200 μg 的 RNA, 转录合成的 RNA 可用于诸如 RNA 结构与功能研究 RNA 酶保护 探针杂交 RNAi 显微注射及体外翻译等多方面的下游应用 02/ 产品组分 组分 T7 RNA Polymerase Mix 10 Reaction Buffer ATP Solution UTP Solution GTP Solution CTP Solution DNase I Control Template (0.5 µg/µl) RNase-free H2O TR101-01 (50 rxn) 50 µl 10 µl 1 ml TR101-02 (100 rxn) 20 µl 2 1 ml 03/ 保存条件 -20 保存 04/ 适用范围 体外 RNA 合成 05/ 自备材料 1. 模板 : 带 T7 RNA 聚合酶启动子序列的线性化质粒 PCR 产物或合成的 DNA 片段 2. 纯化 : 苯酚 氯仿 醋酸钠 乙醇 ; 或 RNA 纯化柱 ;RNase-free H 2O 3. 其他 :RNase-free EP 管 移液器吸头 ;PCR 仪 06/ 模板制备 带有双链 T7 启动子的线性化质粒 PCR 产物或者合成的 DNA 片段都可以作为 T7 High Yield RNA Transcription Kit 体外转录模板, 模板可用 TE 缓冲液或 RNase-free H2O 溶解, 推荐浓度 0.5 μg/ul 02

1. 质粒模板带 T7 启动子的质粒可以作为转录模板, 质粒的线性化和纯度会影响转录的产量及 RNA 的完整性 环状质粒由于没有有效的终止, 会转录出不同长度的 RNA 产物, 为了得到特定长度的 RNA, 质粒必须完全线性化, 线性化的质粒请确保双链为平末端或编码链 5 端为突出结构 ( 图 1 中的 B 链 ) 每个反应建议投入 1 µg 线性化质粒作模板 质粒线性化后, 建议纯化后再作为模板体外转录, 以避免 RNase 蛋白 RNA 及盐残留对体系的影响 2.PCR 产物模板带 T7 启动子的 PCR 产物可以作为体外转录模板 PCR 扩增模板时将 T7 启动子 (TAATACGA CTCACTATAGGG) 加在有义链的上游引物的 5 端 PCR 产物可以不经纯化直接作为模板, 但纯化后会得到更高的 RNA 产出 PCR 产物为转录模板, 需电泳确认产物的单一性, 建议每个反应体系中投入 0.1-0.5 µg 模板 3. 合成的 DNA 模板合成的带有 T7 启动子的 DNA 片段也可以作为体外转录的模板 推荐每个反应体系中投入 0.1-0.5 µg 模板 07/ 实验过程 07-1/ 转录方案 T7 启动子 5 -TAATACGACTCACTATAGGG 3 -ATTATGCTGAGTGATATCCC 转录起始位点 -3 A -5 B 转录 5 -GGG -3 B 链互补 RNA 图 1. RNA 转录方案 07-2/ 体外转录 RNA 的转录方案如图 1 所示, 请参考图中 DNA 设计转录模板 本试剂盒不提供修饰的 NTP 和帽子类似结构 体外转录反应操作之前, 请佩戴手套并使用无核酸酶 EP 管和试剂, 以避免引入 RNase 污染 1. 将除 T7 RNA Polymerase Mix 外的组分振荡混匀, 短暂离心收集于管底, 冰上储存备用 2. 根据所需产物类型选择下面的步骤 A B C 三个反应体系配置溶液, 建议模板加入 0.1-1 μg 03

A. 按下表配制反应体系 ( 非修饰 RNA 体系 ): 组分 10 Reaction Buffer ATP Solution GTP Solution UTP Solution CTP Solution DNA 模板 T7 RNA Polymerase Mix RNase-free H2O 体积 x μl up to 20 μl B. 按照下表配制反应体系 ( 修饰 RNA 体系 ): 组分 体积 10 Reaction Buffer ATP Solution GTP Solution CTP Solution UTP Solution 1.5 μl Modified UTP(10 mm) 5 μl DNA 模板 x μl T7 RNA Polymerase Mix RNase-free H2O up to 20 μl 体系以 Modified UTP 为例, 若使用其他的 Modified NTP 底物, 请参照 UTP Solution 与 Modified UTP 比例配制反应体 C. 按照下表配制反应体系 ( 加帽 RNA 体系 ): 组分 体积 10 Reaction Buffer ATP Solution CTP Solution UTP Solution GTP Solution 0.4 μl m7g(5')ppp(5')g(50 mm) 2.4 μl DNA 模板 x μl T7 RNA Polymerase Mix RNase-free H2O up to 20 μl 体系以 m7g(5')ppp(5')g 为例, 若使用其他的帽子结构, 请参考 GTP Solution 与帽子结构的比例配制反应体系 4. 用移液器轻轻混匀各组分, 并短暂离心收集,37 孵育 2 h 为避免蒸发对反应体系的影响, 建议在 PCR 仪中进行反应 可根据产物片段大小适当的调整反应时间, 如 合成小于 0.3 kb 的 RNA, 可将反应延长至 4 h 或更长时间,16 h 过夜反应不会影响产物的质量 5. 在反应体系中加入 1 μl 的 DNase I,37 孵育 15 min, 消化转录的 DNA 模板 ( 可选 ) 相对于产物 RNA, 模板 DNA 的含量非常低, 一般不用去除, 也可以用 DNase I 消化 6. 合成的 RNA 经电泳分析 纯化后, 可用于下游实验 产物浓度极高, 需用 RNase-free H2O 稀释后再检测 04

07-3/ 产物纯化非修饰 RNA 可采用过柱或酚 / 氯仿抽提纯化法 ; 修饰 RNA 推荐使用过柱纯化法 ; 对产物片段大小要求较高则推荐使用切胶回收纯化 请用 RNase-free H2O 配制试剂, 且使用 RNase-free EP 管 1. 酚 / 氯仿纯化法酚 / 氯仿抽提可去除蛋白和大部分游离核苷酸 a. 加入 160 μl RNase-free H 2O 将产物稀释至 180 μl b. 加入 20 μl 3 M 的醋酸钠 ( ph 5.2 ) 到稀释后的产物中, 用移液器充分混匀 c. 加入 200 μl 的酚 / 氯仿混合液 (1:1) 进行抽提, 室温 10000 rpm 离心 5 min, 将上层溶液 ( 水相 ) 转移至新的 RNase-free EP 管中 d. 加入与水相等体积的氯仿抽提 2 次, 收集上层水相 e. 加入 2 倍体积的无水乙醇并混匀,-20 孵育至少 30 min,4 15000 rpm 离心 15 min f. 弃上清并加入 500 μl 预冷的 70% 乙醇洗涤 RNA 沉淀,4 15000 rpm 离心, 弃上清 g. 开盖干燥 2 min, 加入 20-50 μl RNase-free H 2O 或其他缓冲液溶解 RNA 沉淀 h. -80 保存 2. 柱纯化柱纯化可以去除蛋白和游离核苷酸 纯化前加入 80 µl RNase-free H 2O 将产物稀释至, 再按柱纯化说明书进行纯化 由于 RNA 产量较高, 为避免超出结合柱的承载能力, 请对所需柱子数量进行预估 07-4/RNA 定量 1. 紫外吸收法 : 游离核苷酸会影响定量的准确性, 采用此方法前请先进行 RNA 纯化 2. 染料法 : 用 RiboGreen 染料进行 RNA 定量, 游离核苷酸不会影响定量, 可以对纯化或者未纯化的反应产物中的 RNA 进行准确定量 07-5/ 数据参考 图 3.1.4 kb 模板投入量与产量的关系 05

0.3kb 0.8kb 2kb 3kb 5kb 10kb Size of Transcript 图 4. 反应时间与产量的关系 图 5. 不同长度转录产物电泳图 08/ 常见问题及解决方案 1. 转录产物产量低模板与产量密切相关, 实验组产量明显低于对照组, 可能原因 :1 实验模板中有抑制反应的成分 ;2 实验模板本身原因 建议做一个对照组, 一个实验组 若对照组产量低, 请咨询诺唯赞技术支持 若对照组产量正常但实验组产量低, 说明实验模板本身原因导致产是低, 请尝试以下方案解决 : a. 重新纯化模板 ; b. 确定模板定量以及其完整性 ;c. 延长 37 反应时间 ;d. 加大模板投入量 ; e. 尝试其它的启动子和 RNA 聚合酶 2. 短片段转录产物产量低转录起始片段短会抑制反应, 转录产物小于 0.3 kb 时, 延长反应时间或增加模板量可以提高 RNA 产量 过夜反应 (16 h) 或者使用 2 µg 模板可以使 RNA 产量最大化 3. 产物电泳拖尾现象电泳过程中有拖尾现象, 可能原因 :1 实验操作过程被 RNA 酶污染 ;2DNA 模板被 RNase 污染 体系中的 RNA 酶抑制剂只能抑制痕量的 RNA 酶残留, 建议重新纯化模板 DNA, 并在实验过程中使用 RNase-free 的枪头和 EP 管, 佩戴一次性乳胶手套和口罩, 所有试剂均用 RNase-free H 2O 配制 4.RNA 产物片段大于预期如果电泳显示产物条带大于预期, 可能原因 :1 质粒模板可能没有完全线性化 ;2 有义链 3 端为突出结构 ;3RNA 存在未完全变性的二级结构 建议确认模板结构, 并将电泳方式由琼脂糖胶换成变性胶来检测 RNA 产物 5.RNA 产物片段小于预期如果电泳显示产物条带小于预期大小, 可能原因 :1 模板序列中包含类似于 T7 RNA 聚合酶的终止序列 ;2 模板中 GC 含量高形成高级结构 ;3RNase 污染 不同的聚合酶识别不同的终止序列, 若含是模板中含终止结构, 建议尝试不同的 RNA 聚合酶 如果模板为高 GC, 建议加入 SSB 蛋白, 以提高转录效率 出现产物条带与预期不一致, 请跑变性胶检测产物 06

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