酵素
酵素 (enzyme) Bűchner 於 1897 年發現酵母菌的細胞液可將糖類發酵成酒精, 證實非活體發酵 (unorganized ferments) 之可行性 Dixon 與 Webb 在 1979 年的定義為 : 酵素為一種含有特殊的活性能力, 且具有催化特性之蛋白質 現在一般定義為 : 一群催化生物體內化學反應 ( 如 : 分解 合成 再生及輸送等 ) 的蛋白質或核酸, 為了加快這些反應, 以供給生物體所需之催化劑, 這些催化劑亦稱為 生物觸媒 (biological catalysts)
酵素之反應物稱為受質或基質 (substrate) 大多數酵素的轉化數 (turnover number) 為 100~1,000,000 個基質 /sec 化學反應式 : S + E S-E complex P + E
酵素的命名與分類 1978 年國際生物化學協會 (International Union of Biochemistry; IUB) 將目前的酵素歸納為六大類 : 1. 氧化還原酶 Oxidoreductase -H or +O 2, 產生 e - 轉移作用 2. 轉移酶 Transferase 將基質 function group 轉移至新受質 3. 水解酶 Hydrolase A-B + H 2 O AOH + BH 4. 解離酶 Lyase 以非水解方式移除 functional group 5. 異構酶 Isomerase 催化不對稱碳中心之光學異構物 L D 6. 聯結酶 Ligase 藉 ATP 高能磷酸鍵斷裂時所產生的能量, 使兩個分子結合 X + Y + ATP X*Y + ADP + Pi 參閱 p5-7~5-9
酵素的作用 (1) 具有一般催化劑的性質, 催化效率高, 可使化學反應加速進行 (2) 參與反應後, 本身結構不變, 可以重覆使用 (3) 可以改變正向或逆相之反應速率, 但不會改變化學平衡狀態 (4) 可以降低活化能, 但無法改變反應 ΔG 活化能 ΔG' S P S-E +E +E
酵素的特性 1. 酵素的結構為複雜的球狀蛋白質 (M.W. = 10 4 ~10 6 Da ), 由一個或數個次單位 (subunits) 組成 2. 酵素存在於生物體中, 大部分在溫和環境 (25~50 o C) 下進行反應, 少部份在極端條件下如 0 o C 以下或 100 o C 以上, 仍具活性 3. 在 37 o C 下, 酵素可以提高反應速率達到對照組的 10 12 ~10 20 倍 4. 對基質具有高度特異性 (specificity), 通常僅能催化一種或一類結構非常相似的物質 依此可分為低特異性 基團特異性 絕對特異性 立體化學特異性等 5. 高溫 酸 鹼 紫外線 重金屬與界面活性劑等會使酵素變性, 而導致活性喪失 6. 可添加穩定劑或以化學修飾法 固定化方法 基因工程等方法, 可以改良酵素的穩定性和應用性
酵素的特異性 ( 專一性 ) 低特異性 (low specificity): 對基質無專一性而僅對欲切斷的鍵結有專一性 基團特異性 (group specificity): 僅對於特定基團之化學鍵作用 如 :Trypsin 對 Arginine 和 Lysine 之 carboxyl group 所形成之胜肽鍵作用 絕對特異性 (absolute specificity): 僅對某種基質進行某一種反應 大多數酵素屬於此類 立體化學特異性 : 僅對某種特殊光學或幾何異構物 (optical or geometrical isomers) 作用 Deacylase Deacylase + Acyl group L-N-acylamino acid L-amino acid (L-N- 乙醯胺基酸 ) (L- 胺基酸 ) D-N-acylamino acid (D-N- 乙醯胺基酸 ) 無反應
輔助因子 (cofactor) 與輔酶 (coenzymes) Prosthetic group ( 輔助基,cofactor): 金屬離子 血鐵素 鐵與硫聚合物, 或輔酶等 輔酶 (coenzymes) 不是酶, 通常為維生素和其衍生物 ( 如 :NADH, FAD, FMN 等 ), 可作為 O 2, CO 2, e - 之攜帶者
* 酵素催化作用的機制 酵素的催化反應是在活性中心發生, 活性中心包括受質與酵素之結合區 (binding site) 與催化基團 (catalytic groups), 通常位於酵素表面, 此構造通常由蛋白質內部兩個區域 (domains) 之界面所形成 活性中心通常與受質形狀 電荷和極性互補, 結合的力量包括 : 氫鍵 (H), 離子鍵 (I), 疏水性交互作用 ( hydrophobic interaction) 和凡得瓦力 (V) 等非共價鍵
酵素動力學 (Enzyme Kinetics) 酵素動力學為研究酵素對某一反應進行的快慢, 以及反應物變產物的過程與機制, 與反應速率 反應級數有關 (1) 反應速率 : 是指單位時間內反應物減少的量, 或是產物增加的量 為 V vs. [S] 圖中之斜率 (2) 反應級數 : 反應級數 (order) 與反應物的種類有關 例 Zero order kinetics: 反應速率與反應濃度無關 v = k First order kinetics: A P v = k [A] Second order kinetics: A+B P v = k [A][B]
參閱課本 P.5-15
穩定狀態的酵素動力學 (Steady-state enzyme kinetics) 麥氏方程式 (Michaelis-Menten Equation) 酵素 (E) 與基質 (S) 作用產生產物 (P), 以 ES complex 為中間產物 k1 E + S ES E + P k2 其中 k1, k2, k3, k4 為各反應之反應速率常數 ; 則 k 1 [E][S]+ k 4 [E][P] = k 2 [ES]+ k 3 [ES] =(k 2 + k 3 )[ES] k3 k4
M-M Equation ( 續上 ) 反應初期時 : [P] = 0; 則 k 1 [E][S] = (k 2 + k 3 )[ES] 移項得 [E]/ [ES] = (k 2 + k 3 )/ k 1 [S], 令 Km = (k 2 + k 3 )/ k 1 ; 則 [E]/ [ES]= Km/ [S] Km 稱為 Michaelis-Menten 常數 ( 單位 mole/l 或 M) i. 若 [E 0 ] 為酵素總量, [E] 為自由態酵素, [ES] 為酵素 - 基質複合體 ; 則 [E 0 ] = [E] + [ES] ii. 將 [E] = [E 0 ]-[ES] 代入方程式 [E]/ [ES]= Km/ [S] 中, 移項得 : [ES] = [E 0 ] [S] / {[S] + (k 2 + k 3 )/ k 1 } iii. 又 P 生成速率 (v) 與 [ES] 成正比, v = k 3 [ES]. iv. 將 [ES]= v/ k 3 代入方程式 [ES] = [E 0 ] [S] / {[S] + (k 2 + k 3 )/ k 1 } 中, 可得 V = k 3 [E 0 ] [S] / {[S] + Km} v. 當基質濃度極高時, 反應最大速率 Vmax = k 3 [E 0 ] 代入 V = k 3 [E 0 ] [S] /{[S] + Km} 中可得 : V = Vmax[S] / {[S] + Km} 參閱 p.5-13~5-15
斜率 : Km/V max 縱軸截距 : 1/V max 橫軸截距 : -1/K m 參閱圗 5-3
* 酵素活性的抑制作用 (1) 競爭型抑制作用 (Competitive Inhibition) 競爭型抑制劑與基質 (S) 構造相近, 能和以基質競爭酵素的活化部位 基質濃度增至極大時, 仍可以達到 V max K EI E + I EI E +P 其中 I 為抑制劑, K IE 為抑制劑 - 酵素解離常數當 [I] 增加時, Km 變大, Vmax 不變 1/v Lineweaver-Burk 圖 [I] 3 [I]2 [I] 1 E S I 濃度 : [I] 3 >[I] 2 >[I] 1 0 1/[s]
(2) 非競爭型抑制作用 (Noncompetitive Inhibition) 非競爭型抑制劑與基質 (S) 構造不同, 故和基質沒有競爭反應 此抑制劑結合 E 和 S 結合部位以外之部位, 而對酵素產生抑制作用 K ESI ES +I ESI EI +P 當 [I] 增加時, Vmax 變小, Km 不變 Lineweaver-Burk 圖 I 1/v [I] 3 [I] 2 [I] 1 E S 濃度 : [I] 3 >[I] 2 >[I] 1 0 1/[s]
(3) 反競爭型抑制 (Uncompetitive Inhibition) 反競爭型抑制劑僅能與 ES complex 結合, 使產物無法生成 K ESI ES + I ESI EI +P 其中 I 為抑制劑 K IES 為抑制劑 - 酵素 - 基質解離常數 當 [S] 增加時, Km 和 Vmax 減少 1/v Lineweaver-Burk 圖 [I] 3 [I] 2 I E [I] 1 E S 參閱課本 p.5-17~5-19 P 0 濃度 : [I] 3 >[I] 2 >[I] 1 1/[s]
* 不同類型之酵素抑制作用之特徵 抑制作用類型抑制結合對象 V max Km 不同抑制劑濃度所得之 1/v 對 1/[S] 圖形 競爭型 E 不變 變大 在縱軸相交於一點 (Competitive) 非競爭型 E 和 ES 變小不變在橫軸相交於一點 (Noncompetitive) 反競爭型 ES 變小 變小 互相平行 (Uncompetitive)
影響酵素反應速率的因子 ( 續後 ) 1. 溫度 (temperature) 酵素最適作用溫度 : 30~40 o C 高溫 (45 o C) 以上時 變性而破壞 (denaturation) 低溫時 失去活性 (deactivation) 2. ph 最適 ph 值 : 4.0~8.0 3. 穩定化因子 (stabilizer) 電解質與離子強度 陰離子較陽離子無專一性 K + Mg 2+ Co 2+ Mn 2+ Zn 2+ Fe 2+ 等金屬離子對酵素之活性具有活化或熱穩定之作用 與金屬之種類 濃度及酵素種類, 均有相關性 重金屬離子 ( 如 : Hg +2, Pb +2, Ag + ) 抑制酵素活性
( 續後 ) 4. 酵素的活性中心 (Active center of enzyme) 酵素的活性中心對於催化作用扮演重要角色 其與基質結合後先形成非共價鍵結中間產物, 再分解斷裂成最終產物 常見的胺基酸殘基有絲胺酸 半胱胺酸 離胺酸或組胺酸等 5. 其他因子 水活性與水分含量 水活性 0.8~0.99 之間酵素反應達到最高 抑制作用 : 水分含量低於 13% 以下 剪斷力和壓力 剪斷力 (Shearing force): 當 Shear value >10 4 /sec 時, 開始不活化 ; 當 >10 7 時,50% 的酵素因變性而失去活性 高壓下可使酵素失去活性
放射線 酵素種類 : 觸媒 catalase 的抗力 >> 羧基胜肽酶 carboxypeptidase 水份 :20~30% 破壞最多 ; 乾燥可降低破壞 溫度 : 愈高愈易受傷害 氧 : 愈高愈易受傷害 界面 蛋白質存在於介面時, 由於表面張力作用的結果, 常使部分蛋白質二 三 四級結構被拆開, 使蛋白質之次單位 (subunits) 分散於介面上, 酵素失去活性
酵素的分離與純化 胞外酵素 : 利用高速離心分離 胞內酵素 : 細胞破碎 真空濃縮 膜過濾 提高濃度 或 交聯葡萄聚糖凝膠 (Sephadex) 聚丙烯醯胺凝膠 (Polyacrylamide gel) 與親合性層析法 (Affinity chromatograpgy) 等管柱層析法, 進行溶析 (elution) 分離
*1. 凝乳酶 (Rennet) 食品加工上常用的酵素 食品工業使用量最多, 用於牛乳凝乳 乾酪之生產 原來自小牛胃部 現多利用基因工程, 由酵母菌 Kluyveromyces lactis 生產 酪蛋白 (casein) 為乳蛋白之主要成分, 主含 s 等類型 凝乳酶的作用為將 - 酪蛋白水解形成副 - 酪蛋白 (para- -casein), 並釋出含糖部分之親水性胜肽 (glycomacropeptide), 因副 - 酪蛋白具有疏水性, 與鈣結合成副 - 酪蛋白鈣, 使酪蛋白膠粒形成凝聚而產生凝乳 ( 見圖 5-9)
*2. 果膠酶 (Pectinase) 果膠質是一種異質多醣類 (heteropolysaccharides), 是高等陸生植物之中膠層及初級細胞壁之主要構成物質 聚合程度及酯化程度的改變, 會改變追熟 採收後處理及加工過程蔬果之質地, 例如 : 葡萄 綠豆芽 敏豆莢等蔬果經中溫 (50~70 ) 預熱後再高溫烹煮時, 其組織硬度比直接烹煮者高, 這是因為中溫預煮提高了果膠酯酶的活性, 使得果膠分子上的甲酯基水解成自由 COOH 基, 而由內在的鈣離子形成架橋結構所致 在天然植物中, 其活性以莖部頂端最低, 而往底端方向遞增, 根部最高 食品加工所需的果膠酵素大多數以黴菌來生產, 主要適用於果汁萃取及澄清化 果膠酶可分為 : (1) 果膠脂酶 ;(2) 聚半乳糖醛酸酶 ;(3) 果膠裂解酶
*3. 細胞自溶酶 (Cathepsins): 是一群存在於動物細胞溶酶體 (lysosome) 內的蛋白質水解酵素, 在低 ph 值下具高活性, 最適 ph 值為 2.5~4.5 與其它蛋白酶, 如胰蛋白酶 凝乳蛋白酶等胞外酵素之不同處, 在於其存在於胞內 已知有超過五種組織蛋白酶被發現, 且命名為細胞自溶酶 A B C D E 與肉品的熟成有關 動物於死後之組織中 ph 值下降時, 由肌肉細胞之溶酶體中釋放出 這些蛋白酶滲入組織而使肌原纖維斷裂
*4. 多酚氧化酶 (Polyphenol oxidase, PPO) 此酵素之基質為二酚化合物 (diphenols) 在完整蔬果細胞中酚類化合物與酚酶是隔開存在, 因此不發生褐變反應, 若以刀切水果或蔬菜, 如蘋果 香蕉 馬鈴薯等, 被切表面細胞破裂, 酚酶與酚類化合物接觸, 並暴露於空氣中, 則經由酚酶之作用, 酚類化合物會轉變成鄰苯二酮 (ortho-quinone), 在迅速聚合成褐色素或黑色素 (melanin), 而造成酵素性褐變 酚酶以銅離子為輔基 (prosthetic group), 當氧與銅離子存在時, 如果植物組織受傷, 褐變反應即開始
5. 過氧化酶 (Peroxidase) 與蔬果殺青 (blanching) 之關係 : 過氧化酶廣泛存在於植物組織中, 且耐熱性極強, 以熱處理時, 如果過氧化酶活性消失, 則其它酵素必大部分已被破壞 ; 又因其測定法靈敏度極高, 且呈色反應容易進行, 因此長久以來被做為植物性食品殺青是否適宜的指標 6. 超氧岐化酶 (Superoxide dismutase, SOD) : 此酵素之名稱暗示它可催化超氧化物之歧化反應 : O 2 - +HO 2 3 O 2 +H 2 O 2 雖其產生之氧以基態存在, 但同時也產生具潛在破壞性之過氧化氫 此酵素以取得專利在食品中當抗氧化劑使用, 但必須同時使用觸酶以破壞所產生之過氧化氫, 才會更有效 此酵素少量存在於大部分組織中, 由於來源不同,SOD 之活性部位可能包含有 Fe Mn Cu Zn 等
7. 麩胱甘肽過氧化酶 (Glutathione peroxidase) 此酵素可藉由還原態之麩胱甘肽 (GSH) 來還原過氧化物 : 2GSH+ROOH ROH+H 2 O+GSSG 雖然在生物體中可破壞過氧化物, 但在食品中是否可當作抗氧化劑, 則尚不明確 8. 胰蛋白酶抑制因子 ( 劑 ) (Trypsin inhibitor): 豆科植物種子及葉子含有能在體內抑制酵素活性的蛋白質, 而減低攝入蛋白質的消化率及營養價值 胰蛋白抑制劑及胰凝乳蛋白酶抑制劑廣泛的存在於所有豆科植物, 如 : 黃豆等, 它們可造成胰液分泌過多, 抑制消化道中酵素的活性, 使動物無法完全吸收養分, 造成某些動物生長遲緩 排泄物中若檢出有抑制劑與胰蛋白酶的複合物, 則可能有嚴重的含硫胺基酸流失
固定化酵素 (Immobilized enzymes) 以物理或化學方法限制酵素的移動, 酵素於作用完畢後, 可與產物分離後再度利用 方法有 : 吸附法 包埋法 共價鍵法與交聯鍵結法 優點 : 酵素再利用, 大幅降低成本 增加連續式操作工程的多變性 可使多種不同酵素反應槽串連成連續式反應系統 提高酵素 ( 三級結構 ) 或細胞之穩定性 缺點 : 不一定適用於每一種基質 有毒性化學物質殘留 連續式操作時, 可能受微生物污染而污染食品 酵素固定化後之性質可能與原來酵素不同, 進而影響操作
酵素固定化的方法 ( 參閱圖 5-21) 方法原理優點缺點 吸附法物理 ( 凡得瓦爾力 ): 玻璃 活性炭 矽膠 離子 ( 靜電引力 ): DEAE- 纖維素 離子交換樹脂 包埋法酵素固定於高分子聚合物膠體 ( 如 : 聚丙烯醯胺 澱粉 纖維三醋酸酯 ) 中 共價鍵結法 交聯鍵結法 酵素與載體藉由試劑將兩者共價結合 利用 : 醯化 烷基化 異氰酸或重氮鹽等連結酵素官能基 ( 胺基 羧基 酚基及羥基等 ) 戊二醛之雙醛官能基聯結酵素分子與分子間形成聚合分子 不會破壞酵素活性 酵素活性破壞小 結合力強 穩定度高 酵素不易脫落 酵素吸附於不溶性載體, 穩定度高 吸附力弱, 容易造成酵素脫落使活性喪失 ( 吸附力 : 離子鍵 > 凡得瓦爾力 ) 酵素易脫落 可能會造成部分酵素活性的破壞損失 可能會造成部分酵素活性的破壞損失
酵素穩定性的改良 (1) 添加酵素穩定劑 保護劑 : 蛋白質 中性鹽類 醣類或多醇類 輔助因子 ( 重金屬 界面 酵素抑制劑會降低穩定性 ) 還原劑 (2) 化學修飾與酵素固定法 化學修試劑 單一官能基修飾 : 改變酵素表面電荷 雙官能基修飾 : 分子內交互鍵結 水溶性聚合物聯結 酵素固定法 : 多點吸附法 ( 見圖 5-23) (3) 新菌種之開發與基因工程 篩選與菌種突變 選擇並轉殖優良的酵素基因, 使其於微生物或細胞體內表現與生產 定位突變 (site-directed mutagenesis)