[ 应用纪要 ] 在人血浆的药物定量分析中可获得飞克级的柱上灵敏度 Yun W. Alelyunas,Mark D. Wrona,Russell J. Mortishire-Smith,Nick Tomczyk 和 Paul D. Rainville 沃特世公司 ( 美国马萨诸塞州米尔福德 ) 应用优势 针对性定量模式可用于常规定量分析 操作简单, 可在 Tof 平台上实现类似三重四极杆的工作流程 高选择性和高灵敏度的采集模式 与全扫描和定量 / 定性操作模式互补 文件小型, 适用于常规定量分析 简介高分辨率质谱 (HRMS) 已在药物研发机构中获得了广泛应用 在药物化学 药物代谢和药代动力学以及杂质鉴定中,HRMS 的使用对定性筛查和结构确认产生了革命性影响 虽然三重四极杆质谱仪 (MS) 仍是定量分析的黄金标准, 但是随着 HRMS 技术的发展, 其选择性 动态范围 线性 灵敏度等有了很大的提升, 从而提高了 HRMS 在定量分析中的应用 在复杂基质干扰物存在的情况下, 三重四极杆 MS 方法将面临极大挑战, 而有着与之显著不同的特性的 HRMS 数据采集则能够达到出色的选择性和灵敏度, 从而成功实现定量分析 沃特世解决方案 ACQUITY UPLC I-Class 系统 SYNAPT G2-S HDMS 高分辨质谱仪 最近, 针对定量分析, 沃特世 (Waters ) 在 SYNAPT G2-S HDMS 和 Xevo G2-XS 系统上推出了新的 Target Enhancement 数据采集模式 Tof-MRM 在这种 模式下, 四极杆选择母离子, 并有选择性地在碰撞室中进行碎裂 然 后,Tof 可选择性的增加目标碎片的占空比, 提高了响应和选择性 1 采 用 Tof-MRM 采集模式后,HRMS 平台定量分析的选择性和灵敏度可大幅提 升, 从而提高 HRMS 定量分析性能 本研究采用 SYNAPT G2-S 仪器, 测定并比较了以下三种数据采集模式的 定量属性 ( 检测限 (LOD) 定量限 (LOQ) 和线性动态范围 ): 全扫描 MS MS E 和 Tof-MRM ACQUITY UPLC 1.7 µm BEH Technology C 18 色谱柱 Masslynx 和 TargetLynx 软件 关键词阿普唑仑, 维拉帕米, 氯吡格雷, 丁螺环酮,UPLC,HRMS,QTof,Tof-MRM,MS, MS E,LOD,LOQ, 灵敏度, 线性, 线性动态范围 1
实验 液相色谱条件 LC 系统 : ACQUITY UPLC I-Class 色谱柱 : ACQUITY BEH C 18 2.1 50 mm,1.7 µm 柱温 : 60 样品温度 : 10 进样体积 : 5 µl 流速 : 0.6 ml/min 流动相 A: 0.1% 甲酸水溶液流动相 B: 0.1% 甲酸的乙腈 / 甲醇 (90%/10%) 溶液梯度 : 流动相 B 在 4 min 内从 2% 增加至 60%, 在 1 min 内从 60% 增加至 95%, 在 95% 保持 1 min 后恢复到初始条件 总运行时间为 7 min 实验 MS 设置 : 母离子质量数 MS E 碰撞能量 (C E) 设置 : 低 CE,2.0 ev; 高 CE, Tof-MRM 设置 : 从 10 增至 30 ev 母离子质量数 ( 参见 结 果与讨论 部分了解详 细信息 ) MS 条件 MS 系统 : SYNAPT G2-S HDMS 电离模式 : ESI +, 分辨率模式 ( 20,000 FWHM) 采集范围 : 50-1000 m/z 毛细管电压 : 1 kv 锥孔电压 : 30 V 离子源温度 : 120 脱溶剂气温度 : 500 锥孔气流速 : 20 L/h 脱溶剂气流速 : 800 L/h 扫描时间 : 0.2 s 2
样品描述样品用 3 倍乙腈沉淀后, 离心后, 将上清液用 H 2 O 按 1:1 比例稀释 将被测化合物 ( 阿普唑仑 维拉帕米 氯吡格雷 丁螺环酮 ) 用上述稀释液配制成 100 ng/ml, 并梯度稀释, 得到 100 ng/ml 至 1 pg/ml 的浓度 方法条件 使用 Waters ACQUITY UPLC I-Class SYNAPT G2-S QTof 系统上进行 LC/MS 分析实验 使用沃特世的 MassLynx 进 行数据采集, 并使用 TargetLynx 进行数据处理 结果与讨论 使用 ACQUITY UPLC I-Class SYNAPT G2-S HDMS 对四种化合物 ( 阿普唑仑 维拉帕米 氯吡格雷 丁 螺环酮, 如图 1 所示 ) 进行定量分析 通过电喷雾正离子模式和以下三种采集模式采集数据 : MS MS E 和 Tof-MRM( 分辨率模式 ) MS 模式在宽质量数范围内采集数据 MS E 模式通过快速低 CE 和高 CE 扫描来采集母离子和离子的采集数据 这种低能和高能快速切换的数据采集方式可获得 全部目标化合物以及碎片离子的质谱信息, 可进行结构分析 因此,MS E 方法常被用于定量 / 定 性同时进行的工作流程 为了实现针对性的定量分析, 使用 Tof-MRM 模式和 Target Enhancement 采集 数据 在 Tof-MRM 模式下, 在四极杆 (MSMS) 中选择母离子, 然后通过仪器的 Target Enhancement 功 能可增加目标离子的灵敏度 Tof-MRM 可用于完整离子 ( 母离子 > 母离子, 未使用 CE) 或碎片离 子 ( 母离子 > 碎片离子, 使用 CE) 的采集 与传统全扫描模式相比,Tof-MRM 大大增强了定量分 析的灵敏度和选择性 图 2 显示了 SYNAPT G2-S 上 Target Enhancement 数据采集模式的示意图 阿普唑仑 丁螺环酮 氯吡格雷 维拉帕米 图 1. 本研究中使用的化合物的结构 3
碎片离子 Target Enhancement 提高目标离子的占空比 所选母离子 图 2. SYNAPT G2-S 的示意图, 展示了与 Tof-MRM Target Enhancement 相关的区域 在本研究中, 三种数据采集模式均采用相同的液相色谱条件 锥孔电压 离子源设置 数据采 集速度和相同的数据处理参数 ( 数据平滑和积分 ), 使用通用的 LC 和 MS 条件 图 3 显示了每种化合物的提取离子流图, 以 24 pg/ml 的样品为例, 比较了三种数据采集模式 图 4 显示了测量的峰面积, 在 24 pg/ml 的低浓度和 100 pg/ml 的中等浓度下比较了不同的采集模式 由图可以看出,Tof-MRM 的响应比其它两种采集数据的扫描模式高 2 8 倍 MS 和 MS E 模式的响应处于相当的数量级 图 5 示给出了丁螺环酮的全扫描 MS 和 Tof-MRM 扫描模式之间的质谱数据的差异 与 MS 全扫描数据相比,Tof-MRM 质谱表现出更高的信号强度和更低的基线噪音, 从而提高了灵敏度和选择性 通过四种化合物的代表性样品测量了 Tof-MRM 采集模式的峰数据点 : 以 49 pg/ml 作为低浓度的代表,12,500 pg/ml 作为高浓度的代表 包含 13-19 个点的所有色谱峰 ( 基线到基线 ) 表明,Tof-MRM 与 UPLC 色谱联用时的采样速度足以完成定量分析 丁螺环酮 (24 pg/ml) 维拉帕米 (24 pg/ml) 阿普唑仑 (24 pg/ml) 氯吡格雷 (24 pg/ml) 图 3. 使用 MS MS E 和 Tof-MRM 数据采集模式在 24 pg/ml 浓度下所得的叠加提取质谱图 4
24 pg/ml 浓度下的峰面积比较结果 100 pg/ml 浓度下的峰面积比较结果 图 4. 24 pg/ml( 左 ) 和 100 pg/ml( 右 ) 浓度下的峰面积图, 使用 MS MS E 和 Tof-MRM 模式采集数据 图 5. 丁螺环酮在 400 pg/ml 浓度下的质谱图 MS 全扫描 ( 上图 ) 和 Tof-MRM 扫描 ( 下图 ) 5
检测限和线性动态范围的测定基于验证标准的生物分析方法 根据大于 3 的信噪比测定检测 限 使使用 1/X 加权进行标准曲线拟合 表 1 显示了使用三种数据采集模式分析四种化合物的结 果汇总 结果表明, 人血浆存在时, 三种模式 ( 尤其是 Tof-MRM 模式 ) 均能提供出色的线性动态范围 3.6 至 3.9 log 单位的范围可用于常规定量研究 与 MS 和 MS E 相比,Tof-MRM 在 LOD 和 LOQ 方面分别表现出 4 8 和 4 12 的增强 对于四种化合物中的三种,SYNAPT G2-S 仪器都获得了 1.5 pg/ml( 或 7.5 fg) 的灵敏度, 并且使用 Tof-MRM 模式采集的数据得到了 10 或更大的信噪比 图 6 显示了四种化合物 ( 包括血浆空白 ) 在 LOQ 浓度和 4 倍 LOQ 浓度下的 Tof-MRM 提取质谱图 表 2 汇总了计算 LOD LOQ 和线性动态范围时使用的所有数据点的偏差百分比 化合物 采集类型 动态范围 [Log] (pg/ml) R 2 LOD LOQ (pg/ml) LOQ 处的 S/N 数据文件大小 (MB) 阿普唑仑 Tof-MRM 6-50,000 [3.9] 0.992 6 6 6.7 18 MS 24-100,000 [3.6] 0.995 12 24 5.6 660 MSE 49-100,000 [3.3] 0.999 49 49 7.0 500 丁螺环酮 Tof-MRM <1.5-12,500 [3.9] 0.997 <1.5 1.5 10 18 MS 6-50,000 [3.9] 0.996 6 6 5.1 660 MSE 6-50,000 [3.9] 0.994 6 6 4.3 500 氯吡格雷 Tof-MRM 6-25,000 [3.6] 0.995 1.5 6 10 18 MS 12-100,000 [3.9] 0.995 12 12 8.8 660 MSE 24-100,000 [3.6] 0.997 12 24 13 500 维拉帕米 Tof-MRM <1.5-12,500 [3.9] 0.996 <1.5 1.5 11 18 MS 12-100,000 [3.9] 0.996 12 12 6.9 660 MSE 24-100,000 [3.6] 0.995 6 24 4.1 500 表 1. 每种数据采集模式下各个化合物的检测限 定量限 线性范围 线性动态范围和文件大小 对于那些已报告的最高线性范围为 100,000 pg/ml( 本研究中制备的最高浓度 ) 的化合物, 其实际线性范围可能更宽 表 1 最后一列是每种数据采集模式下每次进样的数据文件大小 Tof-MRM 文件大小约为 20 MB, 与 MS 和 MS E 文件相比, 减小了 95% 以上 这种文件大小的减小可加快数据处理, 降低数据存储需 求, 并且增强其在定量应用中的易用性 6
6 pg/ml 1.5 pg/ml 6 pg/ml 1.5 pg/ml Buspirone 丁螺环酮 Verapamil 维拉帕米 24 pg/ml 6 pg/ml 24 pg/ml 6 pg/ml Alprazolam 阿普唑仑 Clopidogrel 氯吡格雷 图 6. 血浆空白在 LOQ 浓度和 4 倍 LOQ 浓度下的 Tof-MRM 叠加提取质谱图 标准品 柱上 编号 浓度 进样量 (pg/ml) (fg) 表 2. 计算所得的所有化合物的偏差百分比和本研究中所用的浓度 阿普唑仑偏差 % 丁螺环酮偏差 % 氯吡格雷偏差 % 维拉帕米偏差 % Tof-MRM MS MS E Tof-MRM MS MS E Tof-MRM MS MS E Tof-MRM MS MS E 1 1.53 7.7 6.6-4.4 2 3.05 15-14.9-5.1 3 6.10 31 6.3 2.4-1.1 8.3 5.6 0.5 4 12.2 61-13.4 2-3.7-12.4-4.1 2.1 7.7 0.5 5 24.4 122 3.6 8.2 0.4 8.2-8 -8.9-2.1 1.6 1.8-5.7-0.4 6 48.8 244-6.2-10.6 2.4 0.2 8.6 0.6-4.5-0.3 1.7-2.9 11 6.2 7 97.7 488-8.5-9.2-2.9-1.5 0.6-2.4-7.7-5.4-3.3-6.7-2.6-5 8 195 977-8.2-1.1-2 -3-5 -4.3-6.9-5.1-11.1-4.4-1.3-10.8 9 391 1953-3.7-5.7-1 -0.3 0.3 1.4-4.3 0.1-4.6-2.2-2.2-3.8 10 781 3906-1.6-4 -6-0.3-3 3.7-1.4-2.8-1.7-0.7-1.7-2.1 11 1563 7813 3.5-0.4-1 5.2 3.4 6 3.7 2.5 3.2 4.8 3 9.1 12 3125 15625 5.6 3 1.5 9.6 1.6 8.3 5 3.3 2.9 10.1 6.3 7.8 13 6250 31250 10.2 1.7-0.9 6.3 2.7 8 11 3.4 7.2 9.2 4.8 8.1 14 12500 62500 10.6 1.5 0-12.7 2.1 3.8 8.4 2.6 1.5-7.5 3.4 3.5 15 25000 125000 12 5.7 1.2-0.5 0 4 3.6 2.6 4 4 16 50000 250000-10.3 1.1 0.3-14.1-13 -1.4-1.2-5.4-4.6 17 100000 500000 9.9 8.3-0.4 1.1-14.1-11.9 7
结论 参考文献 2 Tof 平台功能强大的数据采集模式 灵活性和出色的采集 速度为科学家们的研究提供极大帮助 基于该技术, 我们 证实了在人血浆基质中,Tof-MRM 数据采集模式可获得柱上 fg 级别检测限, 并具有高的信噪比 宽的线性动态范围 Tof MRM 的定量分析功能让科学家们可以使用类似 MRM 的工 作流程进行生物定量分析 Tof-MRM 功能大大加强了 HRMS 平 台在生物定量分析中的应用, 大大拓展了 HRMS 平台的应 用 使其不仅可以进行常规的定性分析, 更可实用 Tof-MRM 可直接应用于低检测限的生物分析 目标代谢 稳定性和 PK/PD 分析研究 1. Waters application note: 720004728en Targeted High Resolution Quantification with Tof-MRM and HD-MRM. 2. Waters application note: 720004762en Effect of MS Scan Speed on UPLC Peak Separation and Metabolite Identification: Time-of-Flight HRMS vs. Orbitrap. 沃特斯中国有限公司沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司 Waters,The Science of What s Possible,SYNAPT,Xevo,HDMS,ACQUITY UPLC 和 MassLynx 是沃特世公司的注册商标 BEH Technology 和 TargetLynx 是沃特世公司的商标 其它所有商标均归各自的拥有者所有 2014 年沃特世公司 印制于中国 2014 年 9 月 720005182ZH AG-PDF 北京 :010-5209 3866 上海 :021-6156 2666 广州 :020-2829 6555 成都 :028-6578 4990 香港 :852-2964 1800 免费售后服务热线 :800 (400) 820 2676 www.waters.com