质谱条件标准品 : 质谱仪 :Thermo Scientific Q Exactive 喷雾电压 :2.6 kv 毛细管温度 :25 S-lens:5% 碰撞能量 :27% HCD 分辨率设置 : 一级 2, 二级 2 母离子扫描范围 :m/z 2-1

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鲤粽方
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1 应用 Target MS2 方法对大鼠血浆中人重组干扰素进行绝对定量的测试方案顾培明赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司 Application Notes CM93 1. 前言随着蛋白质组学的不断发展, 蛋白质组学已广泛深入到生物学研究的各个领域, 目前, 蛋白质组学研究已经由传统的大规模鉴定逐步转向了靶向蛋白质组学, 研究内容已经由蛋白质鉴定扩展到了蛋白质相对和绝对定量, 对复杂样本中蛋白质的相对与绝对定量有助于发现疾病的生物标志物, 对于研究各类疾病的发生与发展有着重要的意义基于质谱的蛋白质组学定量方法主要有 SILAC,TMT, itraq 以及应用三重四级杆的 MRM 等, 本文主要介绍了赛默飞世尔新一代台式高分辨质谱仪 Q-Exactive 在目标蛋白质定量方面的应用结果显示 Q-Exactive 不仅可以在 ng 级上样量情况下达到 98% 以上的蛋白质氨基酸序列匹配度, 同时应用 target ms2 方法, 可以很好的对复杂样本中目标蛋白质进行绝对定量, 其定量下限达到了 amol, 动态范围达到了 6 个数量级, 且线性相关系数在.99 以上 2. 实验部分 2.1 样品信息人重组干扰素 α-2b 标准品 ( 浓度为 1mg/ml), 注射人重组干扰素 α-2b 后的处理组大鼠血浆样本以及空白大鼠血浆样本 2.2 实验流程 1. 使用 Full MS/ddMS2 方法对人重组干扰素 α-2b 标准品酶解的肽段进行鉴定, 筛选其 unique peptide; 2. 将人重组干扰素 α-2b 标准品酶解肽段稀释成不同浓度的标准品, 其浓度分别为 1 4 ng/ml,1 3 ng/ml,1 2 ng/ml, 1 1 ng/ml,1 ng/ml,1-2 ng/ml, 并掺入至空白大鼠血浆样本酶解肽段中, 分别上样 18ul, 使用 Target MS2 方法根据其 unique peptide 的 fragment ion 峰面积, 绘制标准曲线 ; 3. 处理组大鼠血浆酶解肽段上样 18ul, 根据其 unique peptide 的 fragment ion 峰面积计算出大鼠血浆中人重组干扰素 α-2b 的浓度 2.3 仪器条件高效液相色谱条件高效液相色谱仪 :Thermo Scientific Easy-nLC 1 色谱柱 :C18,3µm, 1Å,75µm 15 cm 上样量 : 均 18 ul 流动相 :A:.1% Formic acid in water; B:.1% Formic acid in Acetonitrile 色谱梯度 : Time [mm:ss] Duration [mm:ss] Flow [nl/min] Mixture [%B] : : : 5: : 37: : 5: : 3: : 1: 35 9

2 质谱条件标准品 : 质谱仪 :Thermo Scientific Q Exactive 喷雾电压 :2.6 kv 毛细管温度 :25 S-lens:5% 碰撞能量 :27% HCD 分辨率设置 : 一级 7,@m/z 2, 二级 17,5@m/z 2 母离子扫描范围 :m/z 2-18; 子离子扫描范围 :start from m/z 1 Data-dependent MS/MS:Top 2 标准曲线与正式样本 : 质谱仪 :Thermo Scientific Q Exactive 喷雾电压 :2.6 kv 毛细管温度 :25 S-lens:5% 碰撞能量 :27% HCD 分辨率设置 :35,@m/z 2 Isolation Window:4 M/Z Inclusion List:M/Z 结果分析 3.1 筛选定量肽段首先使用 Q-Exactive 对人重组干扰素 α-2b 标准品的酶解肽段进行 Full MS/ddMS2 扫描, 上样量为 5ng( 不计酶解损失 ), 筛选人重组干扰素 α-2b 的 unique peptide, 该肽段必须为人重组干扰素 α-2b 所特有的肽段, 才可以用于表征人重组干扰素 α-2b 的量下图展示的为人重组干扰素 α-2b 色谱质谱的原始图, 图中可见, 整个色谱峰分离比较均一, 强度比较高 RT: SM: 7B NL: 1.2E9 Base Peak F: FTMS + p NSI Full ms [2-18] MS elute_standard_ifn _E5 7 Relative Abundance Time (min) 将上述得到的原始文件使用 Byonic 软件进行搜库处理, 观察蛋白质的序列将上述得到的原始文件使用 Byonic 软件进行搜库处理, 观匹配度, 数据库使用 DrugBank 下载的人重组干扰素 α-2b 的氨基酸序列察蛋白质的序列匹配度, 数据库使用 DrugBank 下载的人重组干扰素 α-2b 的氨基酸序列 Protein Name Log Protein Best Log Best BestTotal Total # of # of # # of # mod Coverage Name LogProb score Intensity spectra unique # of mod # AA's Prob LogProb score Intensity unique peptides peptides Coverage% in % protein IFN peptides IFN 从上述表格可见, 人重组干扰素 α-2b 的氨基酸序列匹配度达到了 98.18%, 说明 Q-Exactive 的超高灵敏度, 在不到 5ng 的上样量的情况下可以对蛋白质进行高氨基酸序列匹配度的分析, 对于后续数据分析的可靠性非常重要下图展示的是人重组干扰素 α-2b 的具体氨基酸序列匹配情况图中绿色标记的氨基酸序列为鉴定到的氨基酸, 红色标记的为鉴定到的带有修饰的氨基酸, 黑色标记的为实验中没有鉴定到的氨基酸从上述表格可见, 人重组干扰素 α-2b 的氨基酸序列匹配度达到了 98.18%, 说明 Q-Exactive 的超高灵敏度, 在不到 5ng 的上样量的情况下可以对蛋白质进行高氨基酸序列匹配度的分析, 对于后续数据分析的可靠性非常重要下图展示的是人重组干扰素 α-2b 的具体氨基酸序列匹配情况图中绿色标记的氨基酸序列为鉴定到的氨基酸, 红色标记的为鉴定到的带有修饰的氨基酸, # AA's in protein

3 3 从上述图中可以看出,165 个氨基酸中只有最后三个氨基酸没有被鉴定到, 分析发现 162 位的氨基酸为 R, 因而在 Trypsin 的酶解中会被切割, 产生的肽段为最后三个氨基酸, 该肽段过短, 不适于质谱检测从上述的色谱质谱原始图中可以看出在洗脱时间为 36.28min,m/z 为的色谱峰其强度最高, 搜库结果显示该色谱峰为人重组干扰素 α-2b 的 unique peptide EDSILAVR, 下图展示的是 EDSILAVR(m/z ) 的母离子色谱质谱抽提峰及其二级谱图,

4 下图为上述的肽段 EDSILAVR 二级谱图的解析情况, 图中可见所有的 y 系列离子均被鉴定到, 子离子的实测 m/z 与理论 m/z 偏差均在 1-3 水平, 谱图质量非常高, 结果非常可信另外, 从二级谱图中可以看出, 二级碎片子离子 y4,m/z, 其强度最高, 因而在随后的数据分析中选取 451.

4 4 下图为上述的肽段 EDSILAVR 二级谱图的解析情况, 图中可见所有的 y 系列离子均被鉴定到, 子离子的实测 m/z 与理论 m/z 偏差均在 1-3 水平, 谱图质量非常高, 结果非常可信另外, 从二级谱图中可以看出, 二级碎片子离子 y4,m/z, 其强度最高, 因而在随后的数据分析中选取这一母离子 - 子离子对来表征 EDSILAVR 的含量, 进而表征人重组干扰素 α-2b 的含量 ( 该方法即为选择反应监测技术 :SRM Selected Reaction Monitoring) 3.2 标准曲线绘制人重组干扰素 α-2b 酶解的标准肽段稀释成以下几个浓度 :1 4 ng/ml,1 3 ng/ml,1 2 ng/ml,1 1 ng/ml,1 ng/ml, 1-2 ng/ml, 各自吸样 8ul, 与 1ul 空白血浆酶解的肽段样本混匀, 上样 18ul, 质谱检测, 检测方法使用 Target MS2,inclusion list 为 m/z ,isolation window 为 4 m/z 对子离子进行抽提, 结果见下图 RT: - 6 SM: 7B Relative Abundance RT: 36.8 MA: 37 BP: RT: 36.4 MA: BP: RT: 36.4 MA: BP: RT: 35.7 MA: BP: RT: 35.7 MA: BP: RT: MA: BP: Time (min) NL: 2.85E2 ms @hcd27. [ ] MS elute_standard_ifn_e_2 NL: 5.26E3 ms @hcd27. [ ] MS elute_standard_ifn_e_ NL: 4.35E4 ms @hcd27. [ ] MS elute_standard_ifn_e1 NL: 4.45E5 ms @hcd27. [ ] MS elute_standard_ifn_e2 NL: 2.95E6 ms @hcd27. [ ] MS elute_standard_ifn_e3 NL: 3.99E7 ms @hcd27. [ ] MS elute_standard_ifn_e4 从上图可以看出, 所有 6 个浓度的标准品均在 36min 左右 EDSILAVR 的洗脱峰, 分别对各个色谱峰的峰面积 ( 即上图有一个色谱洗脱峰出现从上图可以看出, 与上述标准品的洗脱时间一致, 所有 6 个浓度的标准品均在, 中色谱峰上显示的 36min 左右有一个色谱洗脱峰 MA 数值 ) 进行积分, 结果见下述表格该色谱峰为母离子 - 子离子对的色谱峰, 即出现, 与上述标准品的洗脱时间一致, 该色谱峰为母离子 - 子离子对的色谱峰, 即 EDSILAVR 的洗脱峰, 分别对各个色谱峰的峰面积 ( 即上图中浓度 (ng/ml) 浓度 (pg/ul) 上样体积 (ul) 干扰素总量 (pg) 峰面积色谱峰上显示的 MA 数值 ) 进行积分, 结果见下述表格 1.E-2 1.E E E+ 1.E+ 8 8.E E+1 1.E E 浓度 (ng/ml) 浓度 (pg/ul) 上样体积 (ul) 干扰素总量 (pg) 峰面积 1.E+2 1.E E+2 1.E-2 1.E E E+31.E+ 1.E+3 1.E E+ 8.E E+41.E+1 1.E+4 1.E E+1 8.E E+2 1.E E E+3 1.E E E+4 1.E E

5 5 从上述结果中可以看出, 在 6 个数量级的浓度范围内, 浓度与峰面积的线性相关系数在.99 以上, 说明 Q-Exactive 的检测动态范围足够大, 可以很好的应用于蛋白质药物代谢动力学研究

6 3.3 大鼠血浆样本中人重组干扰素 α-2b 浓度的测定大鼠血浆样本上样 18ul, 质谱检测, 原始结果见下图, 图中可见在 35.33min 有一个明显的色谱洗脱峰出现, 洗脱 RT: - 6 SM: 7B 时间与上述的标准品的洗脱时间相一致, 为血浆样本中的人重组干扰素 α-2b 的肽段 EDSILAVR 的洗脱峰, 对 m/z 这一子离子的面积进行积分 NL: 5.48E3 Base Peak m/z= F: FTMS + p NSI Full ms @hcd27. [ ] MS elute_serum_beijing_lihuasu o Application Notes CM93 7 Relative Abundance RT: MA: 9787 BP: Time (min) 峰面积为 9787, 代入上述的标准曲线中进行计算, 得出原始血浆中人重组干峰面积为 9787, 代入上述的标准曲线中进行计算, 得出原达到了 98.2%;Q-Exactive 拥有足够高的动态范围, 在对人扰素 α-2b 浓度为 ng/ml 始血浆中人重组干扰素 α-2b 浓度为 ng/ml 重组干扰素 α-2b 的标准品检测中, 其动态范围达到了 6 4 总结个数量级, 并且线性相关系数达到了.99 以上简而言之, 综上所述,Q-Exactive 拥有超高的灵敏度, 在不到 5ng 上 4 总结样量的情况下对人重组干扰素 α-2b 的氨基酸序列匹配度 Q-Exactive 的超高性能可以很好的应用于大分子药物代谢的研究中去综上所述,Q-Exactive 拥有超高的灵敏度, 在不到 5ng 上样量的情况下对人重组干扰素 α-2b 的氨基酸序列匹配度达到了 98.2%;Q-Exactive 拥有足够高的动态范围, 在对人重组干扰素 α-2b 的标准品检测中, 其动态范围达到了 6 个数量级, 并且线性相关系数达到了.99 以上简而言之,Q-Exactive 的超高性能可以很好的应用于大分子药物代谢的研究中去赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司免费服务热线 : ( 支持手机用户 ) AN_CM93

Q Exactive 参数优化对蛋白质鉴定结果的影响李静赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司色谱质谱部 Application Notes CM0084 关键词 Q Exactive;Orbitrap;Proteome Discoverer 1. 前言 Q Exactive 是赛默

Q Exactive 参数优化对蛋白质鉴定结果的影响李静赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司色谱质谱部 Application Notes CM0084 关键词 Q Exactive;Orbitrap;Proteome Discoverer 1. 前言 Q Exactive 是赛默 Q Exactive 参数优化对蛋白质鉴定结果的影响李静赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司色谱质谱部 201206 Application Notes CM0084 关键词 Q Exactive;Orbitrap;Proteome Discoverer 1. 前言 Q Exactive 是赛默飞世尔科技在 2011 年 ASMS 上推出的新型四极杆和轨道阱杂交高分辨质谱仪, 它将高选择性四极杆的离子过滤与