微生物實驗室的生物安全 M111 @ 2013/09, NDMC 生物安全 (biosafety) 是生物技術安全 (safety of biotechnology) 的簡稱 狹義地指現代生物技術的研究 開發 應用及轉基因生物可能對生物多樣性 生態環境和人類健康產生潛在的危害 廣義地指與生物有關的各種原素對社會 經濟 人類健康及生態環境所產生的危害或潛在風險 病原微生物所致的安全問題, 如病原微生物實驗室的安全隱患 生物武器 生物恐怖 重大傳染病的暴發流行等, 也是人類社會所面臨的最現實的生物安全問題 病原微生物實驗室生物安全的核心是防擴散和防感染 關於病原微生物實驗室生物安全, 我國法令包括對病原微生物的分類管理, 對實驗室的分級管理, 實驗室感染的控制以及監督和法律責任等 3 級別一級 (P1) 二級 (P2) 三級 (P3) 四級 (P4) 病原微生物實驗室的分級 處理對象 對人體 動植物或環境危害較低, 不具有對健康成人 動植物致病的致病因子 對人體 動植物或環境具有中等危害或具有潛在危險的致病因子, 對健康成人 動植物和環境不會造成嚴重危害, 具有有效的預防和治療措施 對人體 動植物或環境具有高度危險性, 主要透過氣溶膠使人類傳染上嚴重的甚至是致命的疾病, 或對動植物和環境具有高度危害的致病因子 通常有預防治療措施 對人體 動植物或環境具有高度危險性, 透過氣溶膠途徑傳播或傳播途徑不明或未知的危險的致病因子 沒有預防治療措施
一 二級實驗室不得從事高致病性病原微生物實驗工作 三級 四級實驗室獲得允許者可從事高致病性病原微生物實驗工作 從事高致病性病原微生物相關實驗工作應當有 2 名以上的從業人員共同進行 在同一個實驗室的同一個獨立安全區域內, 只能同時從事一種高致病性病原微生物的相關實驗工作 應有健全安全保衛制度 實驗室從業人員應掌握實驗室技術規範 操作規程 生物安全防護知識和實際操作技能 應有符合要求的防護用品, 應建立健康檔案 ; 進行預防接種 實驗室應有科學 嚴格的管理制度, 定期對實驗室設施設備 材料等進行檢查 維護和更新, 應對廢水 廢氣以及其他廢物進行合理處置, 防止環境污染 5 實驗室感染的控制以及監督和法律責任 實驗室感染控制工作包括定期檢查實驗室的生物安全防護 病原微生物菌 ( 毒 ) 種和樣本儲存與使用 安全操作 實驗室排放的廢水和廢氣以及其他廢物處置等實施情況 實驗室發生高致病性病原微生物洩漏時, 預防 控制措施包括..封閉被病原微生物污染的實驗室或可能造成病原微生物擴散的場所 ; 開展流行病學調查 ; 對病患進行隔離治療, 對相關人員進行醫學檢查 ; 對密切接觸者進行醫學觀察 ; 進行現場消毒 ; 對染疫或者疑似染疫的動物採取隔離 撲殺等措施 微生物實驗室一般規則 1. 進實驗室即需穿著實驗衣, 實驗室內禁止飲食 喝水等 2. 實驗前後請徹底洗淨雙手 3. 留長髮者請綁好, 以防操作時引火燃燒危險 ( 酒精燈使用完後馬上熄滅且勿置桌緣 ) 4. 實驗用之所有微生物及器具未經許可嚴禁攜出室外 5. 請保持實驗室的清潔, 實驗前後將桌面清理乾淨, 實驗結束後將物品歸回原位 : 一般垃圾與實驗垃圾 ( 用過的培養皿 吸管 棉棒 玻片 針筒 針頭 試管 動物屍體等 ) 分開處理 6. 接種環 接種針使用前後必須以酒精燈燒到通紅, 以達到完全滅菌的目的 7. 實驗前請確實瞭解實驗目的及步驟才開始操作, 實驗後記下結果 : 實驗結果之觀察必須親自出席, 仔細觀察並記錄, 不可抄襲別人之數據 8
Cell culture incubator Nitrogen Tank ( -196 O C ) Refrigerator ( -20 O C / -80 O C / -135 O C ) Microscope ( Visible / Fluorescence) Laminar flow Centrifuger Water bath 輻射實驗室相關管制工作 定期檢測項目 : a. CO 2 鋼瓶之 CO 2 壓力 b. CO 2 培養箱之 CO 2 濃度 溫度及水盤有無污染 c. 濾網定期更換 氣象層析儀 (GC) 12
輻射實驗室相關管制工作 ( 案例 ) 13 14 消毒滅菌常用術語 1. 滅菌 (sterilization)..殺滅物體上所有微生物的方法 2. 消毒 (disinfection)..殺死物體上或環境中的病原微生物的方法 3. 防腐 (antisepsis)..防止或抑制皮膚表面細菌生長繁殖的方法 4. 清潔 (cleaning)..是指透過除去塵埃和一切污穢以減少微生物數量的過程 5. 無菌 (asepsis) 和無菌操作..無菌是無活菌的意思, 多是滅菌的結果 防止細菌進入人體或其它物品的操作技術, 稱為無菌操作 15 第一節消毒滅菌的方法 一 物理消毒滅菌法 ( 一 ) 熱力滅菌法 ( 二 ) 輻射殺菌法 ( 三 ) 濾過除菌法 ( 四 ) 乾燥與低溫抑菌法二 化學消毒滅菌法 ( 一 ) 高效消毒劑 (high-level disinfectants) ( 二 ) 中效消毒劑 (intermediate-level disinfectants) ( 三 ) 低效消毒劑 (low-level disinfectants) 16
一 物理消毒滅菌的方法 ( 一 ) 熱力滅菌法 1. 乾熱滅菌法焚燒 ; 燒灼 ; 干烤 ; 紅外線 2. 濕熱滅菌法巴氏消毒法 (pasteurization); 煮沸法 (boiling); 流動蒸汽消毒法 ; 間歇蒸汽滅菌法 (functional sterilization); 高壓蒸汽滅菌法 (autoclaving) 物理性消毒滅菌 - 煮沸法 消毒原理 : 運用水沸溫度 75~100 O C 持續 30 分鐘注意事項 : 適合玻璃器皿器械等消毒, 但不適合塑膠類醫材用 煮沸法並無法消除具有孢子型態的微生物 不適用於人體皮膚消毒 物理性消毒滅菌 - 高壓蒸氣滅菌法 消毒原理 : 利用高壓高熱的水分子均勻滲透入, 使病原體受熱 濕的作用, 使蛋白質凝固變性 可消滅所有微生物 (Disinfection, 滅菌 ) 注意事項 : 不適用於不耐熱或不耐濕之物品 操作人員均須具備滅菌釜 (autoclave) 基本操作技能 滅菌時間與方式 以高壓蒸氣滅菌釜 (autoclave) 來進行滅菌, 其條件設定為溫度 121, 相當於 1.2 kg/cm 2, 短時間 ( 一般約 20~30 分鐘 ) 一次滅菌, 可將能耐高溫之微生物及其孢子消滅, 適用於培養基 橡皮器具 血清及其他厚壁之玻璃器具 若用於培養基滅菌時, 需考慮製備不同的培養基有不同的滅菌條件, 以下方法採用滅菌之條件為 : 溫度 121, 滅菌時間 30 分鐘 19
一般操作流高壓蒸汽滅菌鍋 (autocleave) 具密閉 高溫 高壓之特性 桌上型滅菌釜落地型滅菌釜 高溫高壓滅菌釜1. 2. 3. 4. 21 一 物理消毒滅菌法 ( 一 ) 熱力滅菌法 ( 二 ) 輻射殺菌法 1. 紫外線 2. 電離輻射 3. 微波 (microwave) ( 三 ) 濾過除菌法 1. 濾菌器 (filter) 液體除菌 2. 空氣除菌採用生物潔淨技術 ( 四 ) 乾燥與低溫抑菌法 23 物理性消毒滅菌 - 紫外線照射 消毒原理 : 波長 254nm 的紫外線會使細胞的 DNA 起變化, 使其喪失繁殖的能力 注意事項 : 紫外線的穿透度極低, 無法消毒到物品的背面或內側 消毒時間約 20 分鐘以上, 依菌種而異, 對孢子及芽孢殺菌效果差 對人體細胞也有破壞作用 24
波長 260 nm 左右的紫外輻射有很強的致死效應 不能有效穿透玻璃 污物薄層 水 以及其他一些物質 紫外輻射只在少數場合用於滅菌 房間天花板或無菌操作櫃安置紫外燈, 用於對空氣和物體表面進行滅菌 紫外輻射對皮膚和眼睛有害 今很多醫療用品都利用鈷 -60 所放出的 γ 射線進行消毒 這種消毒程序比用蒸氣消毒更有效及便宜 用完即棄的針筒 棉花 手術用品就是很好的例子 由於不需經過高溫處理, 很多會被高溫破壞的物料, 例如塑膠等, 都可以使用放射程序消毒 加上 γ 射線有穿透能力, 物件可以在包裝封密後才進行消毒, 確保物件在解封前不會受到細菌污染 26 物理性消毒滅菌 - 光觸媒殺菌法 2010 年 10 月期間, 在美國發現了炭疽菌郵件後, 美國政府亦是利用 X 射線, 為可疑的郵件消毒, 以免炭疽菌在美國引起恐慌, 其消毒的原理亦是一樣 消毒原理 : 在受光激發後, 在觸媒 ( 二氧化鈦 ) 表面產生活性位置以進行光催化反應注意事項 : 需使用紫外光 (λ=365nm), 才能激發二氧化鈦產生並產生具強氧化還原力的自由基 微生物需接觸到光觸媒表面才能起反應, 殺菌時間要 30 分鐘以上 紫外線不能直接照射到人體的肌膚, 眼睛不可直視 27 28
物理性消毒滅菌 - 過濾法 (Filtration) 過濾滅菌只是將微生物從樣品溶液中過濾除去, 而不是直接殺死它們 薄膜過濾器 (membrane filter) 醋酸纖維素 硝酸纖維素 聚碳酸醋 或其他合成物質製成的厚約 0.1 μm 的圓形濾膜 孔徑為 0.2 μm 的膜可用來過濾大多數細胞, 但不能過濾病毒 藥劑 眼藥水 培養基 油 抗生素 和其他熱敏感溶液進行除菌 無菌操作櫃 / 室 層流生物安全操作櫃 (laminar flom biological Safety cabinet) - 利用高效微粒空氣過濾器 (high-efficiency Particulate air (HEPA) filter) 進行除菌可以過濾掉 99.97% 的 0.3 μm 顆粒 29 30 二 化學消毒滅菌法 ( 一 ) 高效消毒劑 (high-level disinfectants) 1. 含氯消毒劑 ;2. 過氧化物消毒劑 ; 3. 醛類消毒劑 ;4. 環氧乙烷 ( 二 ) 中效消毒劑 (intermediate-level disinfectants) 1. 含碘消毒劑 ;2. 醇類消毒劑 ( 三 ) 低效消毒劑 (low-level disinfectants) 1. 季銨鹽類 ;2. 氯已定 ;3. 高錳酸鉀 化學性消毒滅菌 - 酒精消毒法 消毒原理 :75% 酒精可使病原體蛋白質凝固, 達到殺菌效果 ;95% 酒精會使菌體外層產生一層保護莢膜, 而影響消毒效果 注意事項 : 可有效消滅細菌營養體 真菌和含脂病毒, 但對內孢子無效, 對無外套膜病毒 ( 如 : 腸病毒 ) 效果不穩 長期和重複使用後也可能對橡膠或部分塑膠造成退色 膨脹 硬化和破裂 簡易之方法為 3 份 95% 酒精加 1 份水, 稀釋後濃度為 71.25% 31
化學性消毒滅菌 - 氯液消毒法 化學性消毒滅菌 - 酚液 消毒原理 : 使菌體產生氧化作用, 然後產生原子態氧使細胞組成分氧化, 可以殺死營養細胞和真菌, 但不能殺死孢子 注意事項 : 若是含 5% 次氯酸鈉, 建議以 1:100 稀釋 也就是 1 份漂白水加 99 份的冷水作為表面消毒 漂白水會刺激黏膜 皮膚和呼吸道, 且會在光或熱下分解, 並容易與其他化學物質 ( 如 : 鹽酸 ) 起反應, 產生有毒氣體 氯常用於城市給水及游泳池消毒, 也應用於乳酪和食品工業 33 酚類 Phenolics 1867 年, Joseph Lister 利用它減少手術過程中微生物感染所造成的危險 酚及酚衍生物如甲酚 二甲苯酚 和鄰苯酚等, 在醫院和實驗室用作消毒劑 市售來舒消毒液 (Lysol) 是酚類的混合物 作用是使蛋白質變性和使細胞膜破裂 34 化學性消毒 (4) 碘液 碘是重要的殺菌劑 碘藉由氧化細胞構造和碘化細胞中的蛋白質, 可做為皮膚殺菌劑 在高濃度下可以殺死孢子 使用 2% 碘化鉀的酒精水溶液中, 可作成碘酒施用 優碘 : 常用於外科手術前的皮膚消毒, 以及醫院和實驗室的消毒 35 36
第二節消毒滅菌的運用 一 醫療器械物品的消毒滅菌 ( 一 ) 高危器械物品使用時需進入無菌組織的物品 所有這些物品都應該滅菌 ( 二 ) 中危器械物品用時不進入無菌組織但接觸黏膜的器械 採用消毒即可 ( 三 ) 低危器械物品只接觸未損傷皮膚但不進入無菌組織和不接觸黏膜的物品 一般用後清洗 消毒即可 ( 四 ) 快速周轉的醫療器械 37 ( 四 ) 黏膜的消毒 ( 五 ) 病患排泄物與分泌物的消毒滅菌 ( 六 ) 病患污染物品的消毒 ( 七 ) 飲水的消毒 ( 八 ) 環境的消毒 38 第三節影響消毒滅菌效果的因素 一 微生物的種類二 微生物的物理狀態三 微生物的數量四 消毒劑性質 濃度與作用時間五 溫度六 酸鹼度七 有機物 評估消毒與滅菌成效 : Example: colonies test / Attest Biological indicators are the only method that indicates the sterilization process was effective and the spores were killed. A nonpathogenic but highly resistant spore, Geobacillus stearothermophilus, is used to provide a maximum challenge to the steam sterilization process. 40
Hands Spread Disease SOAP 預防污染發生 (1/2) 1. 無菌操作基本技術, 實驗進行前, 無菌室及無菌操作台 (Laminar Flow) 以紫外燈照射 30-60 分鐘滅菌, 以 75% ethanol 擦拭無菌操作台面, 並開啟無菌操作台風扇運轉數分鐘後, 才開始實驗操作 2. 無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞, 必要物品, 例如試管架 吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置, 其他實驗用品用完即應移出, 以利於氣流之流通 實驗用品以 75% ethanol 擦拭後才帶入無菌操作台內 3. 小心取用無菌之實驗物品, 避免造成污染 例如勿碰觸吸管尖頭部份或是容器瓶口 41 預防污染發生 (2/2) 防止污染, 研究人員的操作觀念是關鍵 1 器皿準備中的預防( 滅菌消毒工作落實 ) 2 操作前的預防..乾淨的無菌操作台, 培養皿, 培養液, 操作人員的無菌觀念 3 操作過程中的預防..瓶口不能於工作檯面風向逆向 ; 火焰燒灼滅菌, 專管專用, 試管斜位, 避免交談, 完畢後整理 清掃等等 無菌接種法 44
Experiment 1: Autoclave method ( 請注意為實驗結果展示 ) Bacteria strain E. coli Bacillus subtilis Autoclave (+) A C Autoclave (-) B D 1. A/B/C/D tube should be contained at least 2 ml LB broth. 2. Inoculated bacteria with loop after burning / cooling. Experiment 2: Boiling method ( 請注意為實驗結果展示 ) Bacteria strain E. coli Bacillus subtilis Boiling (+) 1 3 Non-boiling 2 4 1. A/B/C/D tube should be contained at least 2 ml LB broth. 2. Inoculated bacteria with loop after burning / cooling. 46 Experiment 3: UV-light method Experiment 4: Alcohol sterile for Skin Bacillus subtilis E. coli UV Non-alcohol Alcohol steriled Thick Papers 48