第十一届全国离子色谱学术报告会论文集浙江杭州.2006.11.28-30 283 液相色谱 - 脉冲安培电化学法测定硫酸庆大霉素注射液中各组分及杂质含量 习玲玲, 朱岩 ( 浙江大学西溪校区化学系, 杭州,310028) 摘要 : 本文建立了一种新的用反相离子对液相色谱 (LC) 分离, 以金电极为工作电极的脉冲安培电化学法 (PAD) 直接检测硫酸庆大霉素注射液中各组分及杂质含量的分析方法 流动相是含 0.033 mol L -1 草酸 0.012 mol L -1 的七氟丁酸 210 ml. L -1 的乙睛, 用稀 NaOH 调节 ph 至 3.4 整个分析周期不到 30 min 与报道 的其他方法相比, 该方法不仅能使庆大霉素各有效组分 C 1,C 1a, C 2, C 2a 得到了很好的分离, 而且也分离出了 一些未能被确证的次要组分 并考察了各色谱参数对分离测定的影响 在优化后的最佳色谱条件下, 对实际商业样品硫酸庆大霉素注射液进行了测定 实验证明, 该方法为一种不需要衍生化 灵敏的硫酸庆大霉素及样品的直接检测方法 关键词 : 庆大霉素 ; 脉冲安培电化学检测 ; 液相色谱 1 引言庆大霉素 (Gentamicin) 是从小单孢菌 (Micromonospora purpurea) 的发酵液中得到的混合物, 主要含庆大霉素 C 1 C 1a C 2 C 2a 四个有效组分, 它们在结构上是由脱氧链霉胺 (Purposamine) 和紫素胺,3- 甲基 -3- 去氧 -4- 甲基戊糖胺缩合成的苷 庆大霉素对革兰氏阴性菌有较强的抑制作用, 尤其对结核杆菌引起的感染性疾病等甚为有效 与其他氨基糖苷类抗生素一样, 主要存在耳 肾毒副作用, 必须严格控制庆大霉素的临床用量 因此, 有必要建立庆大霉素灵敏 准确的分析检测方法 临床上使用的庆大霉素主要由 C 1 C 1a C 2 C 2a 四个活性成分组成, 另外还有其他几个次要组分如西索米星 (sisomicin), 庆大霉素 C 2b ( 也称为沙加霉素,Sagamicin), 二 - 氢氧 - 庆大霉素 C 2a (Antibiotic JI-20 B, 它是 C 1 C 2 和 C 2a 的前导物, 如图 1 各组分的毒性和抗菌能力均有一定的差异, 因此复合物中各组分相对含量的变化关系着产品的疗效和毒副作用, 并且影响到产品的质量 所以对该药中各组分相对含量的测定 有关物质的检查, 对指导临床用药剂量 实现临床药物监测 保证药物疗效等方面具有重要的现实意义 由于各组分和有关物质结构相似, 理化性质相近, 可以用色谱法分离后进行检测 国外曾有许多报道分离出了庆大霉素商业样品中的 C 组分, 如纸色谱和薄层色谱法, 离子交换液相色谱 (LC), 反相液相色谱, 毛细管电泳 (CE) 但能够分离检测出组分 C 2b 的甚少 而在国内能分离出庆大霉素商业样品中的各 C 组分特别是能够将 C 2 C 2a 两组分实现分离的报道很少 另外, 庆大霉素分子中无特征紫外吸收基团, 很难用传统的 HPLC 法 ( 紫外检测器 ) 分析, 所以检测方面一直是难题 2000 版中国药典和欧洲药典都采用柱前衍生化高效液相色谱法进行含量测定, 目前也是国内对该药的一种标准分析方法 但操作繁琐 耗时, 且实验结果影响因素多, 无法明确判断该法检测到的杂质来源, 另外衍生化产物间紫外吸收系数的差异影响到各组分相对比例测定结果的准确性 微生物效价法测的是各组分总效价, 旋光法灵敏度较低, 测定的也是各组分总含量 2005 版第二部用蒸发光散射 ELSD ( Evaporative Light Scattering Detector) 法测定各组分的相对含量, 对不具有 UV 吸收的化合物不必进行衍生化, 可直接进行检测 但 ELSD 的缺点首先是流动相受特殊的制约, 只能使用挥发性洗脱液 ( 所谓 LC-MS 洗脱液 ); 与 UV 相比检测灵敏度小 ; 还有是可以检测到多余的物质 ( 如流动相中的杂质或柱流失物 ) 到目前为止, 有许多方法用于氨基糖苷类抗生素的测定, 其中包括微生物效价法, 免疫分析, 毛细管电泳, 薄层色谱法, 气相 - 液相色谱, 柱前衍生化后紫外检测的高效液相色谱, 电化学检测, 质谱法
第十一届全国离子色谱学术报告会论文集浙江杭州.2006.11.28-30 284 既然庆大霉素具有与其他氨基糖苷类抗生素分子相类似的结构, 上述这些方法也适用, 在所有用于氨基糖苷类抗生素的测定中, 脉冲安培电化学检测 (PAD) 法在氨基糖苷类抗生素测定中不失为一种灵敏的分析方法, 而且它不受流动相特殊的制约, 可应用的流动相范围宽 ; 该方法只对具电化学响应物质具有响应, 从而可避免尘埃 不溶物, 流动相中的杂质和柱填充物的干扰 ; 定量测定时可在较宽的范围内取得线性 国外曾有人报道用反相离子对色谱与脉冲安培电化学检测联用, 到目前为止, 但国内还未见报道 在本文中, 建立了一种新的用反相离子对液相色谱 (LC) 分离, 用脉冲安培电化学法 (PAD) 直接检测的分析方法 与国外的报道相比, 除所采用的流动相 固定相等条件不同外, 该方法分析周期大大缩短 我们对流动相溶液组成和含量进行了优化, 并对不同固定相的分离效果进行了比较 最后用选定的方法分析了两种庆大霉素注射液商业样品 该方法不仅能使各有效组分庆大霉素 C 1,C 1a, C 2, C 2a 得到了很好得分离, 还分离出了一些未能被确证的次要组分 实验证明, 该方法为一种不需要衍生化 灵敏的直接检测方法, 解决了其它分析手段很难解决的检测问题 图 1 庆大霉素各组分及有关物质的结构 2 实验部分 2.1 试剂及样品整个实验过程中实验用水为 18.2 去离子水 七氟丁酸购自 Sigma 公司 ; 庆大霉素和庆大霉素 C 1a 标准品均购自中国药品生物制品检验所 ( 中国北京 ); 硫酸庆大霉素注射液样品 (80mg/ 支 ) 分别来自天津药业焦作有限公司和浙江瑞新药业股份有限公司 ; 草酸和氢氧化钠为分析纯 ; 甲醇和乙腈为色谱纯 2.2 仪器和设备用于色谱分析的设备有 P680 HPLC 泵一台 (Dionex, Sunnyvale, CA, USA), 配备 20 微升的定量环 ; 柱后添加氢氧化钠的 PC10 型气动装置 (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) 一台 ; ZORBAX Rx-C 8 (250 4.6 mm. ID) 色谱柱购自 Agilent 公司 (Palo Alto, California, USA); German Century SIL C 18 (AQ 5 µm, 150 4.6 mm. ID) 色谱柱购自大连江申分离科学技术公司 ( 中国大连 );Acclaim TM 120 C 18 (5 µm120 Å, 150 4.6 mm. ID) 色谱柱购自 Dionex 公司 (Sunnyvale, CA, USA) ED50A 电化学检测器 (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) 一台, 三电极系统以金电极为工作电极,Ag/AgCl 电极为参比电极, 不锈钢计数电极为对电极 检测池温度维持在 35 C 2.3 样品制备和色谱条件所有样品均用流动相溶解以避免干扰 最终选择的色谱条件如表 1 所示 流动相用稀 NaOH 调 ph 至 3.40, 超声脱气后使用 流动相 ph 必须高达 13 左右工作电极金电极才有灵敏的响应 [44], 所以将 0.52 mol L -1 的 NaOH 用 PC10 型气动装置添加到柱后, 通过三通在柱后与流动相混合后进入检测器 柱后添加 NaOH 的流速为 0.5 ml.min -1 0.52 mol L -1 的 NaOH
第十一届全国离子色谱学术报告会论文集浙江杭州.2006.11.28-30 285 溶液的配制从 2.62 mol L -1 浓溶液配制, 用移液管加入经氮脱气的水中以免产生的碳酸损坏 电极 为此, 移取时移液管应从容器的中间部位移取且用量应不超过容器容积的三分之二为宜 检测器电位波形也如表 1 中所示, 虽然通过多步脉冲就可以完成安培的检测和电极表面的清洗, 但仍有必要每进行 60 次左右的分析后对工作电极金电极做一次表面磨光处理以获得良好的重复性 最好同时对参比电极和对电极进行擦拭以除去电极表面的沉积物 实验证明, 刚经过清洁的电极通常需要 2 h 才能获得平稳的基线 整个实验条件控制及数据采集用 Dionex Chromeleon 6.5 软件 3 结果与讨论 3.1 色谱条件的选择以保留时间和分离度为评判指标, 考察了不同色谱参数对庆大霉素各主要组分及有关物质分离情况的影响 流动相中乙腈的含量在 130 ml L -1 ~ 240 ml L -1 范围内, 随着乙腈的量增加, 保留时间缩短, 且其量的微小变化便产生很大的影响 当流动相中草酸的浓度分别为 0.025, 0.028, 0.033, 0.036 mol L -1 时, 对保留时间及分离度没有什么影响 流动相 ph 的影响如图 2 所示, 在 ph 3.0~4.0 范围内, 容量因子改变不大, 但 ph 小于 3.0 或大于 4.0 时, 容量因子迅速降低 因而, 必须将流动相的 ph 控制在具有一定酸度的范围内, 因为只有在这样的条件下, 庆大霉素各组分分子带正电荷, 而七氟丁酸刚好带负电荷, 两者形成离子对化合物, 庆大霉素各组分分子通过形成的各离子对化合物在反相柱上被保留的强弱来实现分离 最后, 我们还考察了流动相七氟丁酸的量的影响, 实验表明, 在 0.0074~0.015 mol L -1 范围内, 七氟丁酸的量对保留时间和分离结果没有显著的影响, 进一步增加七氟丁酸的量, 保留时间延长 综合虑保留时间 分离度及分析周期的长短, 我们最终选择的流动相条件为含 0.033 mol L -1 草酸 0.012 mol L -1 的七氟丁酸 210 ml. L -1 的乙睛, 用稀 NaOH 调节 ph 至 3.4 在 35 40 45 三个温度下, 我们考察了色谱柱温度的影响, 与预期的实验结果一致, 随着温度的增加, 各组分的保留时间缩短, 分离效果变差 同时, 我们将柱温控制在 35 下, 比较了三种不同的反相柱 ZORBAX Rx-C 8 (250 4.6 mm. ID) 色谱柱, SIL C 18 (AQ 5 µm, 150 4.6 mm. ID) 色谱柱和 Acclaim TM 120 C 18 (5 µm120 Å, 150 4.6 mm. ID) 色谱柱 ) 的分离效果, 实验结果表明,Acclaim TM 120 C 18 (5 µm120 Å, 150 4.6 mm. ID) 色谱柱整个分离效果较其他两种要好的多, 而且只有在采用该固定相时, 才能实现 C 2 和 C 2a 的分离 所以最终我们选择的固定相为 Acclaim TM 120 C 18 (5 µm120 Å, 150 4.6 mm. ID) 色谱柱 图 2 流动相 ph 对容量因子的影 Acclaim TM 120 C18 column (5 µm 120 Å, 150 4.6 mm. ID) 表 1 最终选择的色谱条件固定相 : Acclaim TM 120 C18 (5 µm120 Å, 150 4.6 mm. ID) 色谱柱流动相 : 草酸 0.033 mol L -1 七氟丁酸 0.012 mol L -1
第十一届全国离子色谱学术报告会论文集浙江杭州.2006.11.28-30 286 乙腈 210 ml L -1 ph 3.4 流速 1.0 ml.min -1 进样量 : 20 μl 柱温 : 35 柱后 0.52 mol L -1 NaOH 流速 : 0.5 ml.min -1 脉冲安培电化学检测器 : 工作电极 金电极 ( 直径 3 mm) 参比电极 Ag/AgCl 对电极 不锈钢计数电极 检测器设置 t (s) E(V) 0.00-0.40 0.12 0.41-0.60 0.70 0.61-1.00-0.60 积分区间 0.20-0.40 灵敏度 1μC 检测器温度 35 3.2 定量分析方法 在上述选定条件下, 取 20 µl 浓度为 0.16 mg.ml -1 的某种庆大霉素注射液样品注入色 谱仪, 色谱图如图 3, 庆大霉素 C 组分的出峰顺序依次为 C1a, C2b, C2, C2a 和 C1[26,38] 庆 大霉素组分 C2b 的最低检测限为 0.12% mg.ml -1 (24 ng)(s/n =3 ), 定量限为 0.4% mg.ml -1 (80 ng)(s/n =10 )(RSD=10.3, n=4) 直接用该样品对庆大霉素 C1a, C2b, C2, C2a 和 C1 各 组分的线性进行测定, 结果如表 2, 其中 y 为峰面积 (nc),x 为样品浓度 (mg.ml -1 ),r 是相 关系数 通过对浓度为 0.16 mg.ml -1 的样品连续进样 6 次来考察方法的重现性, 四个主要 成分峰面积的相对标准偏差 RSD 均小于 2% 另外, 从表 2 中各组分的线性方程可以看出, 各组分的响应因子基本一致 图 4 是 0.05 mg.ml -1 庆大霉素 C1a 标准品溶液的色谱图 图 5 是 0.10 mg.ml -1 庆大霉素标准品溶液的色谱图 图 3 一种硫酸庆大霉素注射液的色谱图 ( 浓度 :0.16 mg.ml -1 ) 固定相:Acclaim TM 120 C18 column (5 µm120 Å, 150 4.6 mm. ID) 1= C1a, 2 = C2b, 3 = C2, 4 = C2a, 5= C1. 图 4 庆大霉素 C1a 标准品溶液 (0.05 mg.ml -1 ) 的色谱图 流动相和固定相条件同图 3 1= C1a.
第十一届全国离子色谱学术报告会论文集浙江杭州.2006.11.28-30 287 表 2 庆大霉素 C1a, C2b, C2, C2a 和 C1 各组分的线性测定 线性范围 (mg.ml -1 ) y Range(mg.mL -1 ) 庆大霉素 C1a gentamicinc1a 0.08 ~ 0.70 y=375.17x-0.2665 0.9991 庆大霉素 C2b gentamicinc2b 0.32 ~ 2.72 y=393.25x-0.4526 0.9989 庆大霉素 C2 gentamicinc2 0.10 ~ 1.00 y=378.29x-0.5163 0.9994 庆大霉素 C2a gentamicinc2a 0.08 ~ 0.65 y=422.52x-1.2838 0.9995 庆大霉素 C1 gentamicinc1 0.06 ~ 0.55 y=413.07x-1.3976 0.9997 r 3.3 实际样品的分析 图 5. 庆大霉素标准品的色谱图 ( 浓度 :0.10 mg.ml -1 ) 流动相和固定相条件同图 3 1= C1a, 2 = C2b, 3 = C2, 4 = C2a, 5= C1. 用上述建立的方法, 我们对两种硫酸庆大霉素注射液商业样品进行了分析 用归一化法 计算各组分的百分含量, 结果如表 3 可以看出, 硫酸庆大霉素中除了含庆大霉素 C 1,C 1a, C 2, C 2a 四个主要组分外, 还含有相当多的其他组分, 这些其他组分由于没有标准品对照, 因而 无法确定它们的结构 表 3 庆大霉素样品中各组分的组成, 采用面积归一化法计算 样品 %C 1a %C 2b %C 2 %C 2a %C 1 % 其他 样品 1 21.36 4.35 12.04 15.23 18.15 26.87 样品 2 20.85 6.44 10.71 15.58 17.45 28.97 以庆大霉素 C 1,C 1a, C 2, C 2a 四个主要组分的总量为 100%, 用面积归一化法计算各组分的 百分含量, 数据如表 4 中国药典 2000 版规定用柱前衍生化高效液相色谱法和 2005 版规 定用蒸发光散射 ELSD ( Evaporative Light Scattering Detector) 法测定注射用硫酸庆大霉素 各组分含量时,C 1,C 1a, C 2 +C 2a 含量应分别为 25%~50%,15%~40%,20%~50% 结果 显示, 均在所规定的范围之内 两种样品在各组分含量上存在一定差异 表 4 庆大霉素 C1a, C2b, C2, C2a 和 C1 各组分的相对含量 样品 (samples) %C1a %C2 %C2a %C1 样品 1 30.6 19.2 22.3 27.9 样品 2 29.8 17.4 22.4 30.3 4 结论本文报道了一种用反相离子对液相色谱 (LC) 分离, 以金电极为工作电极的脉冲安培电 化学检测 (PAD) 硫酸庆大霉素的分析方法 这在国内是首次报道 该方法不仅能使各有效组分庆大霉素 C1,C1a, C2, C2a 得到了很好得分离, 而且也分离出了一些未能被确证的其他次要组分 总分析时间不超过 30min, 这与文献 [38] 国外报到的 65min 的分析时间要短的多 在优化后的最佳色谱条件下, 对实际商业样品进行了测定 实验证明, 该方法虽然在重现性上有待进一步提高, 但与其它方法比较起来, 是一种不需要衍生化 灵敏的直接检测方法