技术与方法 生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(6):74-80 分子标记在油茶研究中的应用 1,2 董斌 1 李荣喜 2 黄永芳 2 洪文泓 2 谭莎 (1. 广东农工商职业技术学院, 广州 510507 ;2. 华南农业大学, 广州 510642) 摘要 : 近年来, 分子标记技术发展快速, 其在油茶研究中的应用也越来越广泛 由于分子标记具有高效 可靠等诸多优点, 它的快速发展为油茶开展遗传多样性分析 品种鉴定 优良基因定位 分子辅助育种 遗传图谱构建等方面研究提供了一条快速有效的途径 综述了 RAPD AFLP SSR ISSR 和 SRAP 等几种分子标记在油茶研究中的应用, 并在此基础上分析了分子标记在油茶研究中存在的问题和今后研究工作的重点 关键词 : 分子标记 ; 油茶 ; 遗传多样性 ; 基因定位 ; 分子辅助育种 DOI :10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.011 Application of Molecular Markers in Studies of Camellia oleifera Dong Bin 1,2 Li Rongxi 1 Huang Yongfang 2 Hong Wenhong 2 Tan Sha 2 (1. Guangdong Agriculture Industry Business Polytechnic College,Guangzhou 510507 ;2. South China Agricultural University, Guangzhou 510642) Abstract: Recently the molecular marker techniques develop rapidly and are widely used in studies of Camellia oleifera. Owing to advantages of high-efficiency and reliability with molecular marker technique, its rapid development offers fast and efficient measure in genetic diversity analysis, cultivar identification, valuable gene mapping, molecular marker-assisted selection and the construction of molecular gen etic maps. The applications of several molecular marker techniques, i.e., RAPD, AFLP, SSR, ISSR and SRAP etc. in studying C. oleifera are reviewed. The current problems and the focuses in the future researches are also discussed while utilizing the molecular marker in studying C. oleifera. Key words: molecular marker ;Camellia oleifera ;genetic diversity ;gene mapping ;molecular marker-assisted selection 油茶 (Camellia oleifera) 为山茶科山茶属植物, 与油棕 (Elaeis guineensis) 油橄榄(Olea europaea) 椰子 (Cocos nucifera) 并称为世界 四大木本油料植物, 是我国南方主要的木本食用油料树种 茶油脂肪酸主要由油酸 亚油酸和少量的饱和脂肪酸组成, 并含有多种功能性成分, 对于维持心血管系统功能, 提高人体免疫力, 降低胆固醇, 预防和治疗高血压具有明显功效 [1] 此外, 油茶全身都是宝, 其副产品在工业 农业 医药等方面均具有较大经济价值 我国是油茶的原产地, 栽培历史悠久 广义的油茶指山茶属 (Camellia) 植物中含油率较高 且 有一定栽培面积的树种, 我国主要栽培有油茶 小果油茶 (Camellia meiocarpa) 攸县油茶(Camellia yuhsienensis) 浙江红花油茶(Camellia chekiangoleosa) 和腾冲红花油茶 (Camellia reticulata) 等 [2] 据 三农记 清张宗法 (1700 年 ) 引证 山海经 绪书 : 员木, 南方油食也 员木 即油茶, 可见我国取油茶果榨油以供食用, 已有 2300 多年的历史 [3] 油茶经过了长期的自然及人工选择, 形成了丰富的种质资源 近年来, 科研单位不断加大对油茶优良品种的选育力度, 一些新品种 优良无性系不断出现, 随着各地区间的引种栽培, 各地区各 收稿日期 :2014-09-29 基金项目 : 广东省林业科技创新专项资金项目 (2011KJCX014-01), 广东省科技计划项目 (2011B0203003) 作者简介 : 董斌, 男, 硕士, 讲师, 研究方向 : 园林植物及经济林的科研与教学 ;E-mail :bbeenn@163.com 通讯作者 : 黄永芳, 女, 教授, 硕士生导师, 研究方向 : 经济林及森林培育的科研和教学 ;E-mail :hyfang@scau.edu.cn
2015,31(6) 董斌等 : 分子标记在油茶研究中的应用 75 优良无性系间的不断杂交, 导致形态学差异越来越小, 给油茶种质资源的分类研究带来诸多不便, 进一步影响了油茶的良种选育 生物技术的快速发展, 尤其是分子标记的广泛应用为进一步开展油茶种质资源鉴定及良种选育提供了极大的帮助 分子标记是利用限制性内切酶酶切及凝胶电泳分离不同生物体的 DNA 分子, 再经过特异探针杂交, 通过同位素显色技术揭示生物多样性的方法 自从 1974 年 Grodzicker 创立 RFLP 技术以来 [4], 分子标记发展迅速, 包括 :RAPD RFLP AFLP SSR ISSR SRAP 等技术不断面世 本文对近几年在油茶研究中使用较多的几种分子标记进行综述和讨论, 以期为该技术在油茶中的进一步研究做一些归纳性的基础工作 1 分子标记在油茶研究中的应用 1.1 油茶 RAPD 标记的应用 1990 年,Williams 等和 Welsh 等对一种较为简 [5,6] 便的检测 DNA 多态性技术做了报道, 即随机引物 PCR(Random amplified polymorphic DNA,RA- PD) 技术, 它能快速 简便而且准确地检测 DNA 的多态性 RAPD 技术与其他分子标记技术相比, 其原理简单 操作容易 成本较低, 直接揭示 DNA 水平上的差异 但随着分子标记技术的发展, 其为显性标记 重复性较差 扩增条带有限 可靠性较差等缺点逐渐显现 [7], 更多的研究需要通过形态数据分析和其他检测手段互相验证 [8,9] 黄永芳等 [10,11] 张云等 [12] [13] 阙生全等分别提出了油茶 RAPD 反应体系优化方案 陈永忠 [14] 等利用 22 个随机引物对 13 个油茶优良无性系进行 RAPD 分析, 确定了油茶品种间存在较大差异, 并以此为基础建立油茶优良无性系的 RAPD 分子鉴 [15] 别体系 张云等对油茶 32 个品系及 10 个龙眼茶农家品种开展遗传多样性分析及性状比较发现, 油茶果含油率可能与 RAPD 标记的某些基因有连锁关系, 但各品系的单株结实量与 RAPD 标记间无明 [16] 显相关 陈永忠等在对油茶雄性不育优良无性系选育研究中, 通过 RAPD 技术证明了油茶雄性不 [17] 育系与普通油茶的遗传距离较远 谭晓风等利用 RAPD 分子技术对山茶属油茶组植物进行了分子 分类发现, 油茶 狭叶油茶 (Camellia lanceoleosa) 和越南油茶 (Camellia vietnamensis) 亲缘关系最近, 与高州油茶 (Camellia gauchwensis) 相对也较近, 而茶梅 (Camellia sasanqua) 则与各种间的遗传距离 [18] 最大, 结果与形态分类学一致 黄永芳等利用 RAPD 标记技术分析了 90 份油茶种质的遗传多样性发现, 无性系间存在丰富的遗传多样性的同时, 还初步定位了与抗病性 果油率和产油量数量性状相关的谱带 总体来说,RAPD 标记技术是在制作基因图谱, 植物种质资源研究, 分类学研究及系统发育与演化的强大技术 [19], 也是 20 世纪 90 年代中后期至 21 世纪前 5 年在油茶遗传多样性研究中应用较多的分子鉴定手段, 但近年来逐步被其他分子标记技术所取代 1.2 油茶 AFLP 标记的应用扩增片段长度多态性 (Amplified fragment length polymorphism,aflp), 是 1993 年由荷兰 Keygene 公司的科学家 Zabeau 和 Vos 创建发展的一种 DNA 分子标记技术 [21] AFLP 结合了 RFLP 技术和 RAPD 技术的优点, 具有 DNA 用量少, 重复性好, 精确度较高, 多态性丰富, 引物通用等优点 同时, 它属于对基因组 DNA 进行分析的高通量分子标记, 可以在全基因组范围内对多个不同的遗传位点同时进行变异分析 [22], 广泛应用于遗传变异及基因流动方面的研究 [23] [24] 张婷等对湖北省 5 个地区油茶的遗传多样性进行研究, 发现不同地区 不同居群间遗传多样性水平相差较大, 油茶遗传分化主要存在于居群内, [25] 油茶群体存在相对隔离的情况 金龙等对安徽油茶基地 23 个健康植株进行 AFLP 分析, 再次印证了油茶具有较高遗传多样性的同时, 也表明 AFLP 标记技术在油茶遗传多样性研究的适用性 冯金玲 [26] 等探讨油茶芽苗砧嫁接体愈合过程中嫁接口和接穗是否发生基因变化发现, 在接穗母树 接穗萌发芽和砧木中有 DNA 特异条带的出现 但是 AFLP 反应步骤多 过程复杂 影响因素多, 很多实验室因不同的原因难以得到理想的结果, 导致该技术在油茶研究中较少见报 近年来, 越来
76 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.6 越多针对 AFLP 反应体系构建的研究突破, 如 : 黄 [27] 永芳等用成熟叶片为材料成功提取了高质量的 DNA, 打破了对仅能用幼嫩叶片作为提取材料的限制 张婷等 [28] [25], 金龙等也分别构建了适于油茶 AFLP 分析的反应体系 随着相关技术的进一步成熟,AFLP 标记技术在油茶中的应用将会增多 1.3 油茶 SSR 标记的应用简单重复序列 (Simple sequence repeat,ssr), 是于 1991 年由 Moore 等创立的分子标记技术之一, 该分子标记是共显性标记, 具有单基因座 等位基因变异多 多态性丰富 信息量大 操作简单 稳定性好 种族特异性强等优点, 当前在植物育种 指纹数据库构建 品种鉴定等方面得到广泛应用 [29] SSR 技术在油茶研究中应用暂不多见 彭婵等利用 SSR 技术对湖北省油茶种质资源进行分析, 结果证明同一地区的油茶品种相对外地品种具有较近 [30] 的亲缘关系, 且各品种间存在一定的差异 黄勇应用 SSR 标记技术对小果油茶和普通油茶的 5 个同域分布区的 10 个居群复合体进行居群遗传结构分析, 结果显示小果油茶和普通油茶之间的亲缘关系非常接近, 存在着因杂交而产生的基因渐渗 传统开发 SSR 标记方法投入大, 工作繁琐, 获得 SSR 阳性克隆的机率很低, 成功获得引物的机率则更低 [31] [32,33] 虽然范小宁等和刘冰等均对油茶 SSR 技术的反应体系进行了优化, 但总的来说, 由于 SSR 标记要预先获得序列信息, 导致该技术的应用受到较大限制 在油茶的研究中, 主要还是用 SSR 技术进行随机标记, 还未发现有相关研究利用油茶的特异 SSR 标记进行油茶种质资源的遗传多样性分析 1.4 油茶 ISSR 标记的应用简单重复间序列标记 (Inter-simple sequence [34] repeat,issr), 是由加拿大 Zietkiewicz 等在 1994 年提出的一种利用 PCR 扩增进行检测的分子标记研究技术 ISSR 具有简便 快捷 结果稳定 DNA 用量少和 DNA 多态性高等优点 [35], 不需要繁琐地进行基因文库构建 杂交和同位素显示等步骤, 重复序列和锚定碱基的选择是随机的, 无需知道任何靶标序列的 SSR 背景信息 但 ISSR 技术呈孟德 尔式遗传, 即显性遗传标记, 不能区分显性纯合基因型和杂合基因型 关于油茶 ISSR 技术还是集中在遗传多样性及亲 [36] 缘关系方面 张国武等采用 ISSR 分子标记, 对我国南方 10 个油茶优良无性系进行了遗传多样性分析, 结果显示油茶品种间存在较大遗传差异, 并 [37] 准确地对各无性系进行了分子鉴别 温强等采用 ISSR 分子标记方法, 对江西 25 个产量达到 750 kg/hm 2 的油茶无性系进行分子鉴别研究, 显示各无 [38] 性系遗传背景复杂 于小玉等利用 ISSR 技术针 [39,40] 对湖北湖南主要油茶品种, 代惠萍等针对秦 [41] 巴山区的油茶品种, 王保明等针对湘林系列 [42] 岑软系列等无性系, 彭继庆等针对博白大果油茶 (Camellia gigantocarpa) 天然种群和人工种群的研究均能鉴定其亲缘关系并得到品种 无性系间遗传多样性丰富的类似的结果 此外, 应用 ISSR 技术 [43] 关于油茶分类及鉴定的研究也有见报, 刘海龙等对 11 份山茶属植物进行测定, 成功区分了 5 个普通油茶无性系, 同时为香花油茶 (Camellia osmantha) 分类地位的确认提供一定的参考 关于油茶 ISSR 分子标记反应体系的筛选及条件优化也获得一定突破 [44-46], 相关研究将进一步拓展 ISSR 技术在油茶中的应用, 为油茶的分子辅助育种奠定良好的基础 1.5 油茶 SRAP 标记的应用相关序列扩增多态性分子标记 (Sequence-related amplified polymorphism,srap), 是由 Li 博士和 Quiros 博士于 2001 年创立的一种利用 PCR 扩增进 [47] 行检测的分子标记研究技术 SRAP 具有多态性高 操作简便 中等产量 高共显性 低成本 重复性高 易于分离条带及测序等优点 [48], 可以同时对外显子 内含子和启动子区域进行特异性扩增 [49] 基于油茶 SRAP 分子反应体系的研究成果不断见报 [50-54], 为该技术在油茶研究中的进一步推广奠定了基础 [55] 王鹏良等利用 SRAP 技术对岑软 3 号油茶组培苗进行分子检测, 表明在以芽繁芽的组织培养 [56] 体系中具有较好的遗传稳定性 范小宁等对 4 个控制授粉家系的子代遗传多样性进行分析, 提出杂交育种培育油茶新品种时应以杂交后代个体选择
2015,31(6) 董斌等 : 分子标记在油茶研究中的应用 77 为主, 优良家系选择对油茶产量提升的潜力较小 [57,58] 黄勇 杨扬等利用 SRAP 技术对全国 19 个小果油茶居群进行分析, 发现小果油茶的遗传多样性在居群和物种 2 个层次上均较为丰富, 不同居群间存在较为频繁的基因流动, 遗传变异主要来自局群 [59] 内 此外, 彭邵锋等对全国 14 个油茶高产良种 [60] 进行遗传多样性分析, 林萍等对油茶长林系列 [61] 的研究及韩欣等对赣南油茶良种的研究更进一步地建立了该类油茶良种的分子鉴别体系 近年来,SRAP 分子标记虽在油茶研究中广泛应用, 为油茶遗传多样性及遗传稳定性的鉴定提供了良好的分析手段, 但可应用于油茶优良种质分子鉴别研究的 SRAP 引物较少, 且该技术的稳定性仍需进一步提高 [61] 2 存在的问题油茶属异花授粉植物, 在我国分布范围较广泛, 在长期的自然生长和人工选择下, 不同区域 不同品种 甚至不同近缘种之间不断杂交, 导致种内变异极其丰富, 遗传背景非常复杂, 多种分子标记均验证了这种现象 虽然 DNA 分子标记技术在油茶品种及近缘种鉴定 遗传多样性 亲缘关系等研究中取得了不少成果, 展现了广阔的应用前景, 但是仍然存在一些不足 :(1) 当前分子标记主要开展针对油茶遗传多样性和遗传距离的研究, 与性状连锁开展的研究较少见报 (2) 在已广泛应用的 RAPD ISSR 等分子标记技术只能作为诊断性的分子标记初步定位出与部分性状相关的谱带, 虽然越来越多的特异性谱片段被标记出来, 但几种分子标记技术均未能对目的基因精确定位和有效分离, 难以直接应用在实际生产中 (3) 当前分子标记的研究并未能较好地参与到油茶遗传图谱的构建, 遗传图谱的不完善延缓了相关功能基因的发现 (4) 现有的研究较少采取多种分子标记综合应用, 与形态学 细胞学以及其他的一些生物技术手段综合评价较少开展 (5) 在油茶的遗传育种中, 分子标记育种与常规育种还未能很好结合, 大多数分子标记仍停留在实验室阶段, 在实际育种过程中仅仅作为一种辅助育种的工具 3 展望未来的研究, 应进一步加大对油茶丰产 高油 抗病虫害 抗逆境胁迫等方面相关的功能基因挖掘和利用的力度 充分应用分子标记技术鉴别并分离与重要农艺性状相关的特殊基因, 获得与其紧密连锁的分子标记, 加快在分子辅助育种上的应用进程 [62] ; 同时, 应进一步开发和利用永久性群体所构建高密度遗传图谱, 对其重要性状进行准确 QTL 定位 [63], 加强与实际生产的联系 近年来, 油茶 cdna 文库 [64] EST 文库 [65,66], 转录组 [67,68], 叶 [69] 绿体基因组等逐步构建, 这些标志性成果将油茶分子生物学的研究推向新的高度 可以预见在不久的将来, 针对油茶基因组学 转录组学及蛋白组学的研究将是油茶分子生物学新的热点 此外, 油茶全基因组测序也必将被公布, 随着核酸序列数据库等资源的公共化和各组学的深入研究, 利用相关资源开发出更为直接有效的分子标记技术, 诸如已在相应植物研究中陆续取得成功的 cdna-aflp [70,71] cdna-srap [72] 和 EST-SSR [73] 等, 这类新型分子标记技术的应用必将极大推动油茶各方面的研究 同时, 还应借助生物信息学等手段开展与茶 (Camellia sinensis) 山茶(Camellia japonica) 等近缘种核酸序列数据库等资源的比对, 此举必将获得大量与重要农艺性状相关的功能基因, 定位也将越来越精确 届时, 油茶分子标记辅助育种将会得到更快速发展, 从而为选育综合性状优良的油茶新品种提供更加有力的支持 参考文献 [1] 李丽, 吴雪辉, 寇巧花. 茶油的研究现状及应用前景 [J]. 中 国油脂, 2010, 35(3):10-14. [2] 国家油茶科学中心. 油茶高效实用栽培技术 [M]. 北京 : 科 学出版社, 2010. [3] 庄瑞林. 中国油茶 [M]. 第 2 版. 北京 : 中国林业出版社, 2008. [4]Grodzicker T, Williams J, Sharp P, et al. Physical mapping of temperature-sensitive mutations of adenoviruses[j]. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 1975, 39 :439-446. [5]Williams JGK, Kubelik AR, Livak KJ, et al. DNA polymorphisms
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