生物技术通报 BIOTECHNOLOGY 研究报告 BULLETIN 014年第9期 薄荷 GPPS 基因原核表达及 RNA 干扰载体构建 于盱 梁呈元 刘艳 李维林 江苏省中国科学院植物研究所 南京 14 摘 要 利用薄荷挥发油合成途径关键酶之一的薄荷牻牛儿基焦磷酸合酶 GPPS 基因特异引物 扩增得到 GPPS 基因开 放式阅读框 1 11 并将其插入到原核表达载体 pet-8a 中 经酶切测序验证的重组质粒 pet-8a-gpps 转入 Rosetta DE 利用 IPTG 诱导表达融合蛋白 结果显示 终浓度为 1 mmol/l 的 IPTG 进行诱导后 6 h SDS-PAGE 显示薄荷 GPPS 基因在 Rosetta DE 中获得高效表达 目前利用 RNA 干扰技术研究基因功能的方法已日趋成熟 以 GPPS 大亚基基因为靶目标 成功构建了薄 荷 GPPS 大亚基基因的 pbi11-rnai-gpps 干扰载体 关键词 薄荷 GPPS 原核表达 RNAi 载体构建 Prokaryotic Expreesion and RNA Interference Vector Construction for Geranyl Diphosphate Synthase of Mentha haplocalyx Briq. Yu Xu Liang Chengyuan Liu Yan Li Weilin Institute of Botany Jiangsu Province and the Chinese Academy of Sciences Nanjing 14 Abstract: Geranyl diphosphate synthase GPPS gene total ORF 1 11 was amplified with specific primers and linked to expression vector pet-8a. Verified by double restriction enzyme digestion and sequencing, recombined vector pet-8a-gpps was transferred to Rosetta DE and the recombined protein was overexpressed after 6 h induced by 1 mmol/l IPTG. Using RNA interference method to research gene function is matured gradually. In our research, the expression vector pbi11-rnai-gpps targeting to GPPS gene was structured successfully. Key words: Mentha haplocalyx Briq. GPPS Prokaryotic expreesion 单萜类化合物是重要的植物天然化学成分 其 主要功能与植物授粉 种子散播和生物防御过程有 唇形科植物薄荷 Mentha haplocalyx Briq. 1 关 是常用中药材 其干燥地上部分入药 性辛凉 归 肺 肝经 薄荷挥发油具有利胆 镇痛 抗炎 RNAi Vector construction 属植物椒样薄荷中克隆得到该蛋白的 cdna 序列 GPPS 蛋白是由大小两个亚基组成的异源二聚体 其 中大亚基与催化活性直接相关 而小亚基功能尚不 明确 10 RNA 干扰是小双链 RNA 通过降解 mrna 而抑 透疹 4-7 等多种药理作用 挥发油中的主要成分为 制体内基因表达技术 这一利用转录后的基因沉默 单萜类 其中薄荷醇含量一般占 75% 以上 薄荷醇 机制能够高效特异的用于鉴定基因功能 11 1 本研 合成途径属质体发生的 -C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷 究在克隆得到我国主流薄荷品种 78 GPPS 大亚 8 酸途径 MEP 牻牛儿基焦磷酸合酶 Geranyl 基基因的基础上构建 GPPS 基因大亚基的原核表达 diphosphate synthase GPPS 是催化单萜类成分 C10 载体并进行该亚基蛋白的高效表达 另外 本试验 骨 架 形 成 的 关 键 酶 之 一 Burke 等 9 首次从薄荷 构建 GPPS 大亚基基因的 RNA 干扰载体 以期为进 收稿日期 014-0-18 基金项目 江苏省自然科学基金项目 BK010475 江苏省农业科技自主创新资金项目 CX 11 101 作者简介 于盱 女 博士研究生 研究方向 药用植物资源和育种 E-mail yuxu84@16.com 通讯作者 梁呈元 副研究员 研究方向 药用植物资源和育种 E-mail liangcy618@aliyun.com 李维林 研究员 研究方向 药用植物资源和天然产物化学 E-mail lwlcnbg@cnbg.net
014 年第 9 期于盱等 : 薄荷 GPPS 基因原核表达及 RNA 干扰载体构建 85 一步研究其功能奠定基础 1 材料与方法 1.1 方法 1.1.1 植物材料所用材料为薄荷属植物薄荷品种 78, 种植于江苏省中科院植物研究所 1.1. 菌株与质粒大肠杆菌菌株 DH5α 和 pum-t 质粒均购自北京百泰克生物技术公司, 原核表达载体 pet-8a, 大肠杆菌菌株 Rosetta(DE),pBI11 质粒由本实验室保存 1. 方法 1..1 GPPS 基因原核表达载体构建 1..1.1 GPPS 大亚基基因克隆及 pum-t-gpps 载体构建根据 GPPS 大亚基基因的 cdna 序列, 设计并合成下列引物 MhGPPS-F :5 '-ATGGCATATGAG- TGCTCTTGTTAATC-'( 下划线部分为 Nde I 酶切位点 );MhGPPS-R :5'-CGAAGGATCCCGATTGTCCCT ATAAGCA-'( 下划线为 BamH I 酶切位点 ) 将目的片段纯化后的 GPPS 大亚基基因全长产物与 pum-t 载体连接 参照 pum-t 载体操作说明, 16 反应 0 min,4 反应 45 s, 转化 DH5α 感受态细胞, 氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆, 双酶切进行鉴定 1..1. pet-8a-gpps 载体构建及鉴定抽提 pet- 8a 载体质粒和 pum-t-gpps 质粒, 分别进行 Nde I 和 BamH I 双酶切后回收目的片段,T4 DNA 连接酶 16 连接过夜, 转化 DH5α 感受态细胞, 氨苄抗性筛选阳性克隆 抽提重组质粒 pet-8a-gpps,nde I 和 BamH I 双酶切鉴定, 并送测序 1..1. IPTG 诱导 GPPS 基因表达及 SDS-PAGE 检测重组蛋白分别将空 pet-8a 载体和重组质粒 pet- 8a-GPPS 转化至感受态表达宿主菌株 (Rosetta), 按 1% 接种新鲜菌液 pet-8a-gpps(rosetta) 到含有氨苄青霉素的 LB 培养基中, 并以 pet-8a(rosetta) 空载体为对照组 当菌体生长至吸光值约为 0.6 时加入终浓度为 1 mmol/l 的 IPTG 进行诱导表达, 继续培养 6 h 和 15 h 后, 分别取 1 ml 菌液,1 000 r/min 离心 5 min, 弃上清, 加上样缓冲液溶解菌体沉淀, 以 1% SDS-PAGE 电泳进行蛋白质分析, 观察目标蛋白的表达情况 1.. GPPS 基因 RNA 干扰载体构建 1...1 目的基因的 PCR 扩增根据 GPPS 大亚基基因的 cdna 序列, 设计并合成下列引物 下划线部分分别表示括号中相应的酶切位点 :GppsR1 :5'- ATAGAGCTCGTCGGCGGCGACGAGTC -'(Sac I ); GppsR :5'-CGGTACGTAATATCGTCCACCACCT GA-'(SnaB I);GppsR :5'-CGGTCTAGAATGCGG TACTCCCTTCTCG-'(Xba I);GppsR4 :5'-ATACCC GGGATATCGTCCACCACCTGA-'(Sma I) 分别利用上述 对引物 (GppsR1 和 GppsR, GppsR 和 GppsR4), 采用 PCR 技术, 扩增 GPPS 基因编码区 515 和 575 的片段 其中两端添加 Sac I 和 SnaB I 酶切位点的扩增产物为反向片段, 添加 Xba I 和 Sma I 酶切位点的扩增产物为正向片段 PCR 产物在经 TA 克隆并测序后, 经过酶切及连接, 先后亚克隆至 pbi11 载体的 GUS 基因片段两端, 并利用 GUS 基因部分片段作为 RNAi 表达载体的内含子 (Intron) 序列 转化子经筛选 酶切鉴定并测序后, 获得能在植物体内产生 GPPS 相应序列发夹结构 (hairpin RNA,hpRNA) 的植物 RNAi 表达载体 pbi11-rnai-gpps 1... 重组载体向农杆菌感受态细胞的转化 Ca- Cl 法制备农杆菌感受态 : 根癌农杆菌 LBA4404 接种于适量的 YEB( 含利福平 50 mg/l) 液体培养基中, 于 8 00 r/min 振荡培养至 OD 600 =0.5 左右, 5 000 r/min 离心 5 min 收集菌体, 加入 0 mmol/l 的 CaCl 溶液悬浮细胞, 冰浴 0 min 4,5 000 r/min 离心 5 min 并收集菌体, 再次加入 0 mmol/l 的 CaCl 溶液悬浮细胞, 将细胞分装于 1.5 ml 的离心管中, 同时贮藏于 -70 冰箱备用 质粒的农杆菌感受态细胞转化采用冻融法 : 加 5 ng DNA 于 50 μl 感受态细胞中, 冰浴 10-15 min, 液氮速冻 min, 液氮中取出细胞后, 直接放置于 7 水浴 5 min 加入 1 ml YEB 液体培养基, 于 8,00 r/min 培养 4 h 菌体 4 000 r/min 离心后弃去上清, 重新加入 μl YEB 液体培养基悬浮细胞, 涂布于含有相应抗生素的 YEB 固体培养基 ( 含 1.5% 琼脂 ) 上, 于 8 倒置培养 6-48 h, 至长出菌斑 阳性转化子的筛选采用菌落 PCR 和提取质粒酶切鉴定的方法进行
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 86 Vec 结果.1 014年第9期 Time h 1 Rec 4 pum-t-gpps质粒载体构建 PCR 产物连接到 pum-t 上 经 Nde I 和 BamH kd 116.0 66. I 双酶切可得到 1 左右目的基因片段 说明 45.0 pum-t-gpps 质粒载体构建成功 图 1-A 图 1-B. M 5.00 pet-8a-gpps载体构建及鉴定 5.0 重组质粒 pum-t-gpps 和 pet-8a 分别经限制 性内切酶 Nde I 和 BamH I 双酶切 得到 GPPS 全长 1 1 mmol/l IPTG 分别经 6 h 15 h 诱导 pet-8a + 空载体菌 Vec 和酶切后的 pet-8a 用 T4 DNA 连接酶连接两个片 表达结果 4 1 mmol/l IPTG 分别经 6 h 15 h 诱导 pet-8a-gpps 重组 段得到重组质粒 pet-8a-gpps 将重组质粒转化至 载体菌 Rec 表达结果 M 蛋白分子量标准 图 表达宿主菌 Rosetta DE 挑取阳性克隆提取质粒 薄荷 GPPS 大亚基原核表达蛋白 SDS-PAGE 图 进行双酶切 得到全长 GPPS 基因 图 1-C 表明 的两条片段 图 -A 和图 -B PCR 产物经 TA 目的片段已经连接到载体 pet-8a 上 原核表达载 克隆并双酶切 图 -C 验证 PCR 扩增片段正确 体构建成功 分 别 纯 化 回 收 Sac I/SnaB I 双 酶 切 的 GPPS PCR 反 M1 M1 1 A M 4 10 9416 6557 461 07 564 转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞 挑取转化子 将 PCR 验证的阳性克隆子进行 Sac I/SnaB I 双酶切及 BamH I/SnaB I 验 证 结 果 图 -D 图 -E 显 示 双酶切后 分别得到 515 和 9 的产物片 段 表明 GPPS 反向片段连接成功 随后 将连接 了 GPPS 反 向 片 段 的 pbi11 载 体 经 Xba I/Sma I 双 B C A GPPS 大亚基 PCR 产物 M1 DL DNA 分子量标准 1 PCR 扩增产物 B pum-t-gpps 载体双酶切验证 GPPS 大亚基原核表达 TA 阳性克隆 子 Nde I/BamH I 双酶切产物 C pet-8a-gpps 载体双酶切验证 M λ-hind III DNA 分子量标准 GPPS 大亚基原核表达载体阳性克隆子 Nde I 单 酶切产物 4 GPPS 大亚基原核表达载体阳性克隆子 Nde I/BamH I 双酶切 产物 图 1 薄荷 GPPS 大亚基原核表达载体构建及验证. 向片段及 pbi11 载体 经 T4 连接酶重新连接后 GPPS基因的原核表达 切后回收 与经同样双酶切的 GPPS 正向片段进行 连接 转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞并挑取克隆 子后 将 PCR 验证的阳性克隆子进行 Sac I/Xba I 双 酶切验证 结果 图 -F 表明 酶切后得到大小 为 1 496 大小的产物片段 最终成功构建了薄荷 GPPS 大亚基基因的 RNAi 干扰载体 讨论 近年来 人们对萜类挥发油生物合成途径进行 将 含 有 重 组 质 粒 pet-8a-gpps 的 表 达 菌 株 了大量的研究 对薄荷醇的生物合成途径也有了深 Rosstta DE 经 1 mmol/l IPTG 诱 导 表 达 6 h 和 入的了解 1 14 牻牛儿基焦磷酸合酶 GPPS 为 15 h 后 进行 SDS-PAGE 凝胶电泳 pet-8a 空载体 短链异戊烯基合酶家族成员 催化一分子的 IPP 与 Vec 为对照 结果 图 显示 在 IPTG 诱导表 DMAPP 形 成 GPP 为 单 萜 提 供 碳 骨 架 15 本 研 达 6 h 和 15 h 后 样品在约 7 kd 附近出现新生的 究以我国主流薄荷品种 78 叶片为材料 提取 蛋白条带 与 GPPS 大亚基蛋白的分子量相符 总 RNA 并以其反转录 cdna 为模板克隆得到编码.4 薄荷GPPS大亚基基因RNAi表达载体的构建 GPPS 大亚基蛋白的全长 cdna 将该序列首先插入 设计分别加上 Sac I SnaB I 和 Xba I Sma I 酶 克隆载体 pum-t 中 提高了产物连接效率 而且该 切位点的引物 GppsR1 GppsR 及 GppsR GppsR4 质粒上的多克隆酶切位点 方便以后将 GPPS 大亚 以薄荷 cdna 为模板 扩增出大小为 515 和 575 基基因克隆至表达载体中 本研究采用的原核表达
014 年第 9 期于盱等 : 薄荷 GPPS 基因原核表达及 RNA 干扰载体构建 87 M 1 A M M 5 M 6 7 M 8 9 B D E F M :DL DNA 分子量标准 ;1 :GPPS 基因正向片段 PCR 扩增产物 ; : GPPS 基因反向片段 PCR 扩增产物 ;:pmd-19t-gpps-rnai 载体经 Xba I/Sma I 双酶切产物 ;4 :pmd-19t-gpps-rnai 载体经 SnaB I/Sac I 双酶切产物 ;5 : RNAi 载体 pbi11-gpps-rnai-r 经 SnaB I/Sac I 双酶切产物 ;6 :RNAi 载体 pbi11-gpps-rnai-r 经 BamH I 单酶切产物 ;7 :RNAi 载体 pbi11-gpps- RNAi-R 经 BamH I/Sac I 双酶切产物 ;8,9 :RNAi 载体 pbi11-gpps-rnai 经 Xba I/Sma I 双酶切产物 图 薄荷 GPPS 大亚基 RNAi 载体的构建及酶切验证 载体 pet-8a 质粒, 该质粒使用 T7 启动子, 编码区 C 端添加了 His-Tag 序列, 使表达的目的蛋白带上 His-Tag 便于通过该 Ni + 亲和层析纯化目的蛋白 目前基因研究重心已经从结构基因组研究转向功能基因组学研究 因此人们迫切需要一种高效 特异的判断基因功能的生物试验技术 RNAi 是指一些小的双链 RNA, 它可以通过降解 mrna 高效地使特定的基因沉默, 得到丧失功能的突变体, 该技术是现代分子生物学中研究基因功能的全新方法之一 [16], 在基因表达调控 作物品种改良方面都有应用 [17] 因此,RNAi 载体构建成为在植物中运用 RNAi 技术必不可少的关键工具 本试验在构建 GPPS 大亚基基因的 RNAi 载体时, 对 GPPS 基因大亚基保守区域进行分析, 通过 RNAi 设计软件预测相应的 RNAi 干扰位点, 从 TA 克隆载体上扩增 GPPS 基因编码区 515 和 575 的片段, 以正反方向连接到中间克隆载体, 其发夹臂长, 能 M 4 C 够保证形成完整的发夹结构 GPPS 基因的克隆, 原核表达研究以及 RNAi 载体构建, 一方面为进一步阐述 GPPS 基因在薄荷挥发油生物合成途径中的重要功能提供条件和依据, 另一方面也为利用分子育种手段提高薄荷中挥发油的含量奠定基础 4 结论本研究以香料作物薄荷为试验材料克隆获得其单萜合成途径中的关键酶 GPPS 基因序列, 成功构建 GPPS 大亚基基因原核表达载体, 经诱导后获得蛋白表达 成功构建获得了 GPPS 大亚基基因 RNAi 干扰载体 参考文献 [1]Dudareva N, Negre F, Nagegowda DA, Orlova I. Plant volatiles : recent advances and future perspectives[j]. Crit Rev Plant Sci, 006(5):417-440. []Serna L, Marin C. Trichomes :different regulatory networks lead to convergent structures[j]. Trends Plant Sci, 006, 11 :74-80. [] 中华人民共和国卫生部国家药典委员会. 中华人民共和国药典 :(010 年版一部 )[M]. 北京 : 化学工业出版社人民卫生出版社, 010. [4] 彭蕴茹, 钱士辉, 石磊, 等. 薄荷非挥发性提取部位的药理活性研究 [J]. 中药材, 008, 1(1):104-107. [5] 王晖, 许卫铭, 王宗锐. 薄荷醇对柴胡镇痛成分表观生物利用度的影响 [J]. 中成药, 1996, 18(6):4-6. [6]Lee MY, Lee JA, Seo CS, et al. Protective effect of Mentha haplocalyx ethanol extract(mh)in a mouse model of allergic asthma[j]. Phytotherapy Research, 011, 5 :86-869. [7]Chan BC, Hong KL, Leung PC, et al. Traditional Chinese medicine for a topic eczema :PentaHerbs formula suppresses inflammatory mediators release from mast cells[j]. Journal of Ethnopharmacology, 008, 10 :85-91. [8]Croteau R. Biosynthesis and catabolism of monoterpenoids[j]. Chem Rev, 1987, 87 :99-954. [9]Burke C, Wildung MR, Croteau R. Geranyl diphosphate synthase : cloning expression and characterization of this prenyltransferase as a heterodimer[j].proc Natl Acad Sci USA, 1999(96):106-1067.
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