研究报告 A Letter 分子植物育种 ( 网络版 ), 2011 年, 第 9 卷, 第 17351740 页 Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2011, Vol.9, 17351740 http://mpb. chinese.sophiapublisher.com 棉花硝酸盐高亲和转运蛋白基因 NRT 2 片段克隆及 RNA 干扰表达载体构建 郑丽玲 2, 张伟 1, 李艳军 1, 马玲玲 1, 魏延宏 1 石河子大学农学院 / 石河子大学绿洲生态实验室, 石河子, 832003 2 石河子大学生命科学学院, 石河子, 832003 通讯作者 : zhw_agr@shzu.edu.cn 分子植物育种, 2011 年, 第 9 卷, 第 102 篇 收稿日期 :2011 年 07 月 27 日 接受日期 :2011 年 09 月 06 日 发表日期 :2011 年 09 月 19 日 作者 doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0102 1, 张薇 这是一篇采用 Creative Commons Attribution License 进行授权的开放取阅论文 只要对本原作有恰当的引用, 版权所有人允许并同意第三方无条 件的使用与传播 引用格式 ( 中文 ): 郑丽玲等, 2011, 棉花硝酸盐高亲和转运蛋白基因 NRT 2 片段克隆及 RNA 干扰表达载体构建, 分子植物育种 (online) Vol.9 No.102 pp.17351740 (doi: 10.5376/mpb. cn.2011.09.0102) 引用格式 ( 英文 ): Zheng et al., 2011, Cotton Highaffinity Nitrate Transporter gene NRT 2 Cloning and RNA Interference Expression Vector, Fenzi Zhiwu Yuzhong (online) (Molecular Plant Breeding) Vol.9 No.102 pp.17351740 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0102) 摘要以低氮 (0.2 mmol/l) 胁迫 4 h 的氮高效棉花品种新陆早 12 号为材料, 提取棉花总 RNA, 根据蓖麻和杨树的 NRT 2 基因保守序列设计含酶切位点的特异引物, 用 RTPCR 技术获得 350 bp 的片段 将此片段以正向和反向插入到中间载体 pucmt 的 GUS 内含子序列两端 将正向片段 GUS 反向片段插入 ppzp35s, 通过酶切和 PCR 鉴定, 成功构建 RNAi 载体, 并成功转入农杆菌 GV3101 中, 为研究棉花硝酸盐高亲和转运蛋基因 NRT 2 的功能奠定一定的基础 关键词棉花 ; NRT 2 基因 ; RNA 干扰表达载体 Cotton Highaffinity Nitrate Transporter Gene NRT 2 Cloning and RNA Interference Expression Vector Zheng Liling 2, Zhang Wei 1, Li Yanjun 1, Ma Linlin 1, Wei Yanhong 1, Zhang Wei 1 1. Shihezi University of Agriculture/Shihezi University of Oasis Ecology Laboratory, Shihezi, 832003, P.R. China 2 College of Life Sciences Shihezi University, Shihezi, 832003, P.R. China Corresponding author, zhw_agr@shzu.edu.cn; Authors Abstract With low nitrogen (0.2 mmol/l) 4 h nitrogen stress cotton varieties Xinluzao high 12 for the material, total RNA was extracted in cotton, according to Castor and poplar NRT 2 gene sequences with conserved restriction sites of the primers used RTPCR technique to obtain 350 bp fragment. This fragment in forward and reverse into the intermediate plasmid pucmt of the GUS intron ends. The forward fragmentgusreverse fragment was inserted into ppzp35s, by restriction enzyme digestion and PCR, results for the successful construction of RNAi vectors, and successfully transferred to Agrobacterium GV3101, in order to study highaffinity nitrate transporter of cotton gene NRT 2 function lay a foundation. Keywords Cotton; NRT 2 gene; RNA interference expression plasmid 1 研究背景氮素是作物生长发育不可缺少的多量元素之 一, 是提高作物产量和改善品质的重要营养元素, 在作物生产中具有极其重要的作用 棉花是我国重 要的经济作物, 又是需氮量很大的作物, 近年, 随 着人们对棉花产量需求的提高, 化学氮肥的施用量 也急剧增加, 而氮肥的利用率却不断下降 吕殿青 等 (1998) 研究表明, 我国氮肥的平均利用率仅为 30%~35% 氮肥利用率低不但加大了棉花生产成 本, 造成氮肥资源的巨大浪费, 而且还导致地下水 的污染和地表水的富营养化, 对生态环境产生了严重的负面影响, 阻碍了棉花生产健康可持续发展 高亲和 NO 3 转运蛋白 (NRT 2 ) 在结构上属于硝酸盐 亚硝酸盐共转运蛋白家族,NRT 2 的 C 端,N 端和亲水结构域都位于胞质一侧, 对于 NRT 2 的研究,Trueman 等 (1996) 第一次从大麦中克隆了作物 NRT 2 基因编码的蛋白都呈现相似的结构特征, 分子大小在 54~65 kd 具有 12 个跨膜域 作物吸收的氮素主要是无机态氮, 包括硝态氮 (NO 3 ) 和铵态氮 (NH + 4 ) 两种 张维理等 (1995) 植物通过根系吸收, 1735
将硝态氮和铵态氮由体外转入体内是氮素代谢的第 一步, 它不仅受外界环境的影响, 同时也受植物自 身内在因素的影响 研究表明, 作物根系对土壤中 + NO 3 和 NH 4 的吸收和它们在植株器官 组织中的转 运是由位于细胞原生质膜氮素转运蛋白介导来完成 的 植物中氮素转运蛋白在改善植物氮胁迫条件下 的氮素吸收和利用效率具有重要作用 因此, 利用 基因工程克隆棉花硝酸盐高亲和转运蛋白基因, 并 通过转基因技术培育棉花氮高效品种, 对减少氮的 浪费, 提高氮的利用率具有十分重要的意义 李加瑞等 (2005) RNAi 是指小的双链 RNA (doublestrandedds RNA) 阻碍生物体内特定基因表 达, 使 mrna 降解, 使特定基因失活细胞表现出 缺陷表型的过程 自 RNA 干扰 (RNA interference, RNAi) 技术诞生以来, 该技术得到迅速发展, 为作 物品质改良提供了新技术, 已在 Pinto 等 (1999) 水 稻 Abbott 等 (2000) 小麦,Subramanian 等 (2005) 大 豆等多种作物的品质, 抗逆改良中得到成功应用 NRT 2 基因在水稻等作物中得到较好的利用, 而 对于棉花至今还没有相关的研究报道, 利用分子生物 学方法克隆棉花硝酸盐高亲和转运蛋白基因片断, 以 此为靶基因构建了棉花 NRT 2 基因的 RNA 干扰表达 载体, 为进一步研究该基因的功能奠定一定的基础 1 结果与分析 1.1 棉花总 RNA 的提取 用 CTAB 法, 提取低氮胁迫处理的棉花根部的 总 RNA 经分光光度计测定 OD 260 /OD 280 =1.80~2.00, OD 260 /OD 280 =2.00~2.35, 琼脂糖凝胶电泳检测显示, 28S rrna 的亮度约为 18S rrna 的两倍 ( 图 1), 说 明 mrna 质量良好, 符合实验所需 图 1 棉花根部总 RNA 琼脂糖凝胶电泳注 : 1, 2: 棉花根部总 RNA Figure 1 Cotton root total RNA agarose gel electrophoresis Note: 1, 2: Roots of cotton total RNA 1.2 正反向目的片段的克隆与鉴定 将提取的总 RNA 反转录成 cdna, 分别用正 反向引物扩增目的片段, 扩增产物经凝胶电泳检 测, 与预期一致, 获得长约 350 bp 的两条 DNA 片 段 ( 图 2) 将正反向片段分别克隆到 pgemt 载体 上, 各挑取 PCR 鉴定正确的两个阳性克隆进行测 序, 测序得到正反向序列大小均为 350 bp, 经 DNAman 比对与蓖麻的同源性为 80%, 与杨树的同 源性为 79% 图 2 NRT 2 正向序列 NRT 2 w 与反向重复序列 NRT 2 v 的扩增产物注 : M: DL2000 marker; 1, 2: 正向序列 NRT 2 w 的扩增产物 ; 3, 4: 反向重复序列 NRT 2 v 的扩增产物 Figure 2 NRT 2 forward and reverse repeat sequences NRT 2 w and NRT 2 v of amplification products and sequences (Here is the sequence obtained from fragments) Note: M: DL2000 marker; 1, 2: Forward sequence of the PCR products NRT 2 w; 3, 4: Inverted repeats NRT 2 v the PCR products 1.3 中间载体的构建 将正向克隆的质粒 pgemnrt 2 w 经 SacⅠ 和 NcoⅠ 完全双酶切后, 获得约 350 bp 的条带 ( 图 3C, 泳道 1 所示 ), 回收该片段 pucmt 质粒经 SacⅠ 和 NcoⅠ 双酶切后, 得到开环的载体骨架 ( 图 3B, 泳 道 1 和泳道 2 所示 ), 大小约为 2 773 bp, 将其回收 正向片段 NRT 2 w 与开环骨架 pucmt 连接得到重 组子 pucmnrt 2 A, 将其转化 DH5α, 进行 PCR 和酶切检测, 得到 350 bp 的条带 ( 图 3A, 泳道 1 所 示 ; 图 3C, 泳道 3 所示 ), 进一步经测序进行确认, 说明正义片段已经按正确方向插入到启动子与间 隔区之间, 形成了中间载体 pucmnrt 2 A 采用 XbaⅠ 和 XhoⅠ 分别对 NRT 2 v 的质粒和 重组子 pucmnrt 2 A 进行双酶切, 前者产生了约 350 bp 目的片段 ( 图 3C, 泳道 2 所示 ), 后者产生了 约 3 100 bp 的开环骨架 ( 图 3C, 泳道 4 所示 ), 分别 将两者回收, 连接重组, 得到干扰载体 pucmnrt 2 B, 1736
图 3 RNAi 载体 pucmnrt 2 B 构建中的酶切和 PCR 鉴定注 : M: DL2000 A marker; A: 1: pucmnrt 2 A 的 PCR; 2, 3: pucmnrt 2 B 的 PCR; B: 1, 2: SacⅠ 和 NcoⅠ 双酶切 pucm T; C: 1: SacⅠ 和 NcoⅠ 双酶切 pgemnrt 2 w; 2: XbaⅠ 和 Xho Ⅰ 双酶切 pgemnrt 2 v; 3: pucmnrt2a 的酶切 ; 4: pucm NRT 2 B 的酶切 ; D: 1, 2: 干扰载体 pucmnrt 2 B 的酶切 Figure 3 RNAi plasmid pucmnrt 2 B digestion and PCR identification in the built Note: M: DL2000 A marker; A: 1: pucmnrt 2 A of PCR; 2, 3: pucmnrt 2 B of PCR; B: 1, 2: SacⅠ and NcoⅠ double digestion pucmt; C: 1: SacⅠ and NcoⅠ double digestion pgemnrt 2 w; 2: XbaⅠ and XhoⅠ double digestion pgem NRT 2 v; 3: pucmnrt 2 A of digestion; 4: pucmnrt 2 B of digestion; D: 1, 2: interference plasmid pucmnrt 2 B of digestion 转化 DH5α, 进行 PCR 和酶切检测, 分别得到 350 bp 和 1 200 bp 左右的条带 ( 图 3A, 泳道 2 和泳道 3 所 示 ; 图 3D, 泳道 1 和泳道 2 所示 ), 说明 pucm NRT 2 B 干扰载体构建成功 1.4 RNAi 表达载体构建及鉴定 将重组子 pucmnrt 2 B 和 ppzp35s 分别用 Sac Ⅰ 和 XbaⅠ 酶进行双酶切, 分别回收 ppzp35s 大片 段和重组子 pucmnrt 2 B 的目的片段, 将两者连 接, 得到干扰表达载体 ppzp35snrt 2 B 将构建好 的干扰载体通过电击法转入农杆菌 GV3101 中, 对 转化菌落提取质粒并以 ( 表 1) 中的引物进行 PCR 验 证, 分别得到 350 bp 左右的片段 ( 图 4) PCR 检测 结果显示已成功构建了具有 ppzp35snrt 2 B 表达 框架的植物载体 ( 图 5), 构建的 RNAi 载体已进行了 烟草叶片转染, 鉴定正在等待之中 2 讨论 RNA 干扰是真核细胞本身固有的生理发展调 节机制和对抗外源基因及其侵害的一种自我保护 现象, 在利用 RNA 干扰引发的基因沉默当中, 效 率要比传统的反义 RNA 诱导的基因沉默高得多, 并 且能够稳定表达, 这使得 RNA 干扰技术成为抑制 图 4 转化农杆菌的 PCR 验证注 : M: DL2000 marker; 1: 正向序列 NAR 2 w 的扩增结果 ; 2: 反向重复序列 NAR 2 v 的扩增结果 Figure 4 Agrobacterium transformation of the PCR verification Note: M: DL2000 marker; 1: Forward sequence results of amplification NAR 2 w; 2: Reverse repeats sequence of amplification NAR 2 v results 图 5 ppzp35snrt 2 B 表达框架结构示意图注 : RB: 右边界 ; 35spm: 35S 启动子 ; sense: 正向片段 ; GUS: GUS 内含子 ; Antisense: 反向片段 ; OCS ter: OCS 终止子 ; NOS pro: NOS 启动子 ; NPTⅡ: 新霉素磷酸转移酶基因 ; NOS ter: NOS 终止子 ; LB: 左边界 Figure 5 ppzp35snrt 2 B expression framework diagram Note: RB: Right border; 35S: 35S promoter; sense: Fragment in sense orientation; GUS: GUS intron; Antisense: Fragment in antisense orientation; OCS ter: OCS terminator; NOS pro: NOS promoter; NPTⅡ: Neomycin phosphotransferase gene; NOS ter: NOS terminator; LB: Left border 基因表达的高效可靠的技术 近年来, 朱见明等 (2011) RNAi 技术广泛应用于基因功能的分析验证, 构建合适的载体是 RNAi 的关键, 本研究所构建的 RNA 干扰表达载体是含 GUS 内含子的一种发夹结 构, 具有较高的干扰效率, 是目前研究的热点 Napoli 等 (1990) 利用 RNA 干扰技术证证明了 RNAi 对大豆子叶中 IFS 基因的功能作用 李小平等采用 RNA 干扰技术证明了大豆叶片衰老与大豆 LRP 型 类受体蛋白激酶基因 rlpk2 有关 Hirotaka 等 (2006) 利用 RNA 干扰技术表明了豆科植物根瘤素合成基 因 ENOD40 对根瘤的出现和生长是必需的 徐海荣等 (2007) NO 3 转运蛋白基因已在水稻, 小麦, 蓖麻, 杨树等植物中获得克隆, 但在棉花中 还没报道, 在植物体内的表达具有组织特异性,NRT 2 1737
表 1 干扰载体正向与反向重复序列的引物序列 Table 1 Interference plasmid with the forward and reverse primers Sequence 引物名称 引物序列 酶切位点 Primer name Primers Restriction sites Fw1 CGAGCTCCTGGGATGACAGGAGGAGGT SacⅠ Fw2 CCCATGGGTGCCGATGGAGTAGCATTAGAG NcoⅠ Fv1 GCTCTAGACTGGGATGACAGGAGGAGGT XbaⅠ Fv2 CCCTCGAGTGCCGATGGAGTAGCATTAGAG XhoⅡ 注 : Fw2 和 Fv2 分别表示下游引物 ; Fw1 和 Fv1 分别表示上游引物 ; Fw1 和 Fw2 用于棉花硝酸盐高亲和转运蛋基因正向目的片段扩增 ; Fv1 和 Fv2 用于棉花硝酸盐高亲和转运蛋基因反向目的片段扩增 Note: Fw2 and Fv2 stand for reverse prime; Fw1 and Fv1 stand for forward primer; Fw1 and Fw2 high affinity for cotton nitrate transporter gene and amplification of the forward fragment; Fv1 and Fv2 high affinity for cotton nitrate transporter protein gene fragment amplified by the reverse 家族成员多具有器官和组织的特异性, 有些基因的表达还受到植物生长和发育状况的影响, 植物中的 很多 NO 2 转运蛋白基因优先在根部表达 杜培粉等 (2009) 如烟草和拟南芥, 其中烟草的叶片, 叶柄, 芽, 花及种子中只检测到了微量的 NRT 2 基因的表达, 拟南芥的 NRT 2 基因在茎中的表达量仅为根部的 1% 高亲和氮高效基因 NRT 家族不仅具有运输 NO 3, 而且具有运输氨基酸, 氯酸盐的作用 此外 NRT 家族成员还参与作物生长, 发育的调节 选择合适当的片段是 RNAi 载体构建关键因素 魏海燕等 (2008) 研究表明, 基因片段大小在 23~1 kb 都能得到理想的干扰效果 Wesley 等 (2001) 还有研究表明, 干扰片段的长度对基因干涉效有影响, 干扰片段在 50~500 bp 之间, 随着片段大小的增加, 干扰效率提高 陈新等 (2007) 基因片段太短构建操作困难, 而且过短的 dsrna 很难被 DICER 酶识别 ; 过长的基因片段在构建载体操作中很容易引起片段重组, 并且太长的 dsrna 结构本身不稳定 因此, 最佳基因片段大小应该在 200~600 bp 左右, 利于转化验证和外源基因在转基因植株中的稳定遗传 所以, 本研究设计选取 350 bp 的干扰片段, 目的是有效抑制靶标基因的表达 本研究构建了硝酸盐高亲和转运蛋基因的 RNA 干扰载体, 以正向和反向重复序列插入到中间载体 pucmt 的内含子两端, 利用 ppzp35s 作为桥梁载体, 成功构建 RNA 干涉表达载体 ppzp35snar 2 B 下一步工作将通过农杆菌介导法将植物表达载体 ppzp35snar 2 B 转入到烟草中, 利用 RTPCR 快速检测其对硝酸盐高亲和转运蛋基因的的干扰效果, 如得到较好的干扰效果将进一步探索在棉花植株上诱导 RNAi 的条件 3 材料与方法 3.1 实验材料 3.1.1 植物材料 新陆早 12 号 ( 由石河子大学农学院育种教研室 提供 ) 采用水培 ( 霍格兰营养液 ) 方法, 待棉花幼苗长 至三叶一心时进行低氮 (0.2 mmol/l) 胁迫处理 4 h 后 取棉花根部, 液氮速冻后于 80 保存 3.1.2 菌株和载体 大肠杆菌菌株 (Escherichia coli) DH5α, 根瘤农 杆菌菌株 (Agrobacterium tumefaciens) GV3101, 含有 GUS 的内含子序列的中间载体 pucmt 由园艺系 实验室惠赠, 植物表达载体 ppzp35s 由石河子大学 绿洲生态作物分子生物学实验室保存 3.1.3 试剂 限制性内切酶 SacⅠ,NcoⅠ,XbaⅠ,XhoⅠ, Taq DNA 聚合酶,T 4 DNA 连接酶购自 TaKaRa 公司, 胶回收试剂盒购自 Tiangen 公司, 其他生化试剂均 为国产分析纯 3.1.4 引物设计及合成 根据蓖麻和杨树的 NRT 2 基因保守序列, 并通 过软件分析酶切位点, 设计两对引物 ( 表 1) 3.2 方法 3.2.1 目的片断的克隆及序列测定 用 CTAB 法提取棉花根部总 RNA, 用 TIAN Script cdna 第一链合成试剂盒反转录成 cdna, 以 反转录的 cdna 为模板, 分别用正反向目的片段的 引物, 通过 RTPCR 方法扩增得到棉花高亲和硝酸 盐转运蛋白基因的正向序列 NRT 2 w 和反向重复序列 NRT 2 v 的目的片段, 反应程序 :94 预变性 4 min; 1738
94 变性 1 min;54 退火 45 s;72 延伸 45 s,25 个循环 ;72 延伸 10 min 将获得的基因片段连接 pgemteasy 载体并转化大肠杆菌 DH5α 经菌液 PCR 鉴定和酶切鉴定正确后, 挑取 2 个阳性克隆, 送上海生工生物工程技术服务有限公司测序 3.2.2 棉花 NRT 2 基因 RNA 干扰载体的构建用正向克隆的质粒 pgemnrt 2 w 和 pucmt 的质粒, 进行 SacⅠ 和 NcoⅠ 的双酶切至完全, 电泳后回收正向片段和开环的 pucmt 骨架, 采用 T 4 DNA 连接酶将两者于 4 连接过夜, 得到重组子 pucmnrt 2 A, 转化 DH5α,PCR 鉴定和酶切鉴定筛选阳性克隆 采用 XbaⅠ 和 XhoⅠ 分别对重组子 pucmnrt 2 A 和反向克隆的质粒 pgemnrt 2 v 进行完全双酶切, 电泳后回收 pucmnrt 2 A 和反向片段, 采用 T 4 DNA 连接酶将两者于 4 连接过夜, 得到重组子 pucmnrt 2 B, 转化 DH5α,PCR 鉴定和酶切鉴定筛选阳性克隆, 阳性克隆即为棉花 NRT 2 基因的 RNA 干扰载体 3.2.3 RNAi 表达载体在农杆菌中的转化与鉴定从鉴定无误的大肠杆菌中提取重组子的质粒, 将得到的重组质粒用 SacⅠ 和 xbaⅠ 双酶切, 切下含正向序列 反向重复序列和内含子间隔序列的目标片段, 并进行回收 再用 SacⅠ 和 XbaⅠ 双酶切质粒 ppzp35s, 回收大片段 将目标片段与回收的 ppzp35s 载体大片段用 T 4 DNA 连接酶在 4 下连接过夜, 转化筛选阳性克隆即得 RNA 干扰载体 ppzp 35SNRT2B 利用电击法将重组质粒 ppzp35snrt 2 B 转化到农杆菌 GV3101 中, 将菌液涂布于 TYE (20 μg/ml Rifa+50 μg/ml Kna) 固体培养基中, 于 28 条件下培养 2 d, 挑取单菌落进行 PCR 检测 作者贡献郑丽玲 张伟和张薇是本研究的主要执行人 ; 郑丽玲, 张伟完成数据分析, 论文初稿的写作 ; 李艳军, 马玲玲和魏延宏参与实验设计, 试验结果分析 ; 张薇是项目的构思者及负责人, 指导实验设计, 数据分析, 论文写作与修改 全体作者都阅读并同意最终的文本 致谢本研究由石河子大学科学技术研究发展计划 动植物育种专项计划项目 转基因专项子专 (2008ZX08005005) 资助 作者感谢石河子大学李艳军老师在本实验过程中的技术支持和有益的建议 感谢两位匿名的同行评审人的评审建议和 修改建议 本文中提到了我们实验中涉及的有关试剂供应商和测序服务商, 这并非我们为这些试剂供应商和测序服务商的产品和服务提供推荐或背书 参考文献 Abbott D.C., Wang M.B., and Waterhouse P.M., 2000, A single copy of a virusderived transgeneencoding hairp in RNA gives immunity to barley yellow dwarf virus, Molecular Plant Pathology, 1(6): 347356 Chen X., Liu Q.Z., Li Y.X., Lv H.Z., Liang Y.Q., Zhang S.G., Shao J.P., and Zhang Y.H., 2007, RNAi expression vector construction of αfarnesene synthase gene from Yali Pear (Pyrus breschneideri Rehd), Shengwu Jishu Tongxun (Lett Biotechnologe), 18(5): 786788 ( 陈新, 刘庆忠, 李杨昕, 吕慧贞, 梁雅芹, 张士刚, 邵建萍, 张元湖, 2007, 鸭梨一法尼烯合成酶基因双链 RNAi 表达载体的构建, 生物技术通讯, 18(5): 786788) Du P.F., Wu L.T., Yao Y.T., Yi F., Ruan Y., and Liu C.L., 2009, Construction of the RNAi Vector of AtTPS03 gene and Arbidopsis Transformation, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 7(3): 451455 ( 杜培粉, 伍林涛, 姚远颋, 尹峰, 阮颖, 刘春林, 2009, AtTPS03 基因 RNA 干扰载体的构建及拟南芥转化, 分子植物育种, 7(3): 451455) Hirotaka K., Eri K., Robert W.R., and Hiroshi K., 2006, RNAi knockdown of ENOD40s leads to significant suppression of nodule formation in Lotus japonicus, Plant Cell Physiol., 47(8): 11021111 Li J.R., Zhao W., Li Q.Z., Ye X.G., An B.Y., Li X., and Zhang X.S., 2005, RNA silencing of Waxy gene results in low leve is of Aamylose in the seeds of Trans genic wheat (Triticumaes tivum L.), Yichuan Xuebao (Genetics), 32(8): 846854 ( 李加瑞, 赵伟, 李全梓, 叶兴国, 安宝燕, 李祥, 张宪省, 2005, Waxy 基因的 RNA 沉默使转基因小麦种子中直链淀粉含量下降, 遗传学报, 32(8): 846854) Lv D.Q, Tong Y.A., and Sun B.H., 1998, Study on effect of nitrogen fertilizer use on environment pollution, Zhiwu Yingyang Yu Feiliao Xuebao (Plant Nutrition and Fertilizer Science), 4(1): 815 ( 吕殿青, 同延安, 孙本华, 1998, 氮肥施用对环境污染影响的研究, 植物营养与肥料学报, 4(1): 815) Napoli C., Lemieux C., and Jorgensen R., 1990, Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible cosuppression of homologous genes in trans, Plant Cell, 2(4): 279289 Pinto Y.M., Kok R.A., and Bandcombe D.C., 1999, Resistance to rice yellow mottle virus (RYMV) in cultivated African rice varieties containing RYMV transgenes, Nature Biotechnology, 17(7): 702707 1739
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