吉 林 省 食 品 安 全 地 方 标 准 水 产 品 中 呋 喃 唑 酮 代 谢 物 (AOZ) 的 测 定 ELISA 法 编 制 说 明 长 春 市 水 产 品 质 量 安 全 检 测 中 心 二 O 一 三 年 九 月
一 研 究 背 景 硝 基 呋 喃 类 药 物 及 其 代 谢 物 可 使 实 验 动 物 发 生 癌 症 和 基 因 突 变, 会 对 人 类 造 成 潜 在 危 害, 可 引 起 溶 血 性 贫 血 多 发 性 神 经 炎 眼 部 损 害 和 急 性 肝 坏 死 等 残 病, 农 业 部 第 193 公 告 禁 止 食 品 动 物 中 使 用 呋 喃 唑 酮, 所 有 食 品 动 物 所 有 可 食 组 织 均 不 得 检 出 呋 喃 唑 酮 曾 被 广 泛 应 用 为 水 产 动 物 的 药 物 和 促 生 长 的 饲 料 添 加 剂 属 硝 基 呋 喃 类 药 物, 是 人 工 合 成 的 广 谱 抗 生 素, 有 非 常 好 的 抗 菌 作 用, 其 在 动 物 体 内 迅 速 分 解 为 代 谢 物 (AOZ) 由 于 呋 喃 唑 酮 价 格 便 宜, 药 效 快, 目 前 也 仍 有 大 量 养 殖 户 违 禁 使 用, 用 于 治 疗 及 预 防 养 殖 鱼 类 的 疥 疮 赤 鳍 病 溃 疡 病 等, 在 饲 料 中 添 加 或 养 殖 药 浴 使 用, 导 致 水 产 品 中 呋 喃 唑 酮 代 谢 物 检 出 的 事 件 屡 有 发 生, 如 2006 年 的 阳 澄 湖 大 闸 蟹 致 癌 风 波 和 多 宝 鱼 事 件 均 是 由 呋 喃 唑 酮 残 留 所 引 发 二 制 定 标 准 的 必 要 性 和 意 义 1. 维 护 人 民 群 众 的 切 身 利 益 水 产 品 道 鲜 美, 肉 质 细 嫩, 水 分 较 多, 脂 肪 较 少, 是 营 养 价 值 较 高 又 易 于 消 化 的 食 物, 是 人 们 喜 爱 的 营 养 食 品, 自 古 以 来 人 类 就 把 水 产 品 作 为 最 理 想 的 食 品 它 具 有 含 蛋 白 质 高, 脂 肪 胆 固 醇 低, 有 多 种 维 生 素, 易 于 人 体 消 化 吸 收, 促 进 新 陈 代 谢 的 特 点, 这 是 其 他 肉 类 所 无 法 比 拟 的, 而 且 水 产 品 是 最 适 宜 人 类 健 康 的 蛋 白 质 资 源, 世 界 上 许 多 国 家 都 把 利 用 海 洋 水 面 作 为 解 决 人 类 食 用 蛋 白 质 的 重 要 来 源 据 科 学 预 算, 人 们 膳 食 中 摄 入 的 动 物 蛋 白 质 有 一 半 左 右 来 自 水 产 品 但 近 年 来, 在 渔 业 生 产 及 养 殖 业 快 速 发 展 的 同 时, 渔 业 生 产 环 境 遭 受 污 染 以 及 养 殖 加 工 流 通 各 环 节 滥 用 或 不 规 范 使 用 药 物 和 添 加 剂 的 事 件 时 有 发 生, 水 产 品 中 的 药 物 残 留 问 题 已 经 成 为 制 约 水 产 养 殖 业 发 展 的 一 个 大 的 瓶 颈, 同 时 对 于 消 费 者 的 自 身 安 全 也 造 成 了 极 大 的 心 理 阴 影, 目 前 水 产 品 的 质 量 安 全 堪 忧 2. 为 食 品 安 全 监 管 及 工 商 管 理 部 门 执 法 提 供 依 据 本 标 准 起 草 小 组 通 过 查 阅 国 内 外 相 关 法 律 法 规, 结 合 吉 林 省 的 实 际 情 况, 制 定 出 适 合 吉 林 省 内 水 产 品 检 测 的 标 准, 为 食 品 安 全 突 发 事 件 提 供 技 术 支 持, 同 时 也 可 为 执 法 部 门 提 供 执 法 依 据 和 保 障, 切 实 保 证 消 费 者 的 合 法 权 益, 让 群 众 免 受 食 品 安 全 风 险 的 侵 害, 真 正 为 老 百 姓 提 供 安 全 保 障 3. 完 善 国 家 标 准 的 需 要 呋 喃 唑 酮 代 谢 物 的 测 定 已 经 有 高 效 液 相 色 谱 法 的 行 业 标 准, 但 是 该 检 测 方 法 由 于 所 需 2
仪 器 比 较 昂 贵, 且 检 测 过 程 繁 琐 耗 时, 严 重 导 致 了 目 前 在 吉 林 省 内 对 呋 喃 类 药 物 的 检 测 力 度 不 够 为 了 适 应 快 速 检 测 经 济 便 宜 科 学 准 确 的 需 要, 本 标 准 研 究 了 呋 喃 唑 酮 代 谢 物 的 酶 联 免 疫 检 测 方 法, 用 于 水 产 样 品 的 筛 选 及 测 定 三 工 作 过 程 1. 前 期 工 作 查 阅 相 关 最 新 资 料 和 文 献, 结 合 吉 林 省 的 实 际 和 国 内 实 验 室 的 特 点, 发 现 一 种 新 的 检 测 方 法 酶 联 免 疫 法 测 定 水 产 品 中 呋 喃 唑 酮 代 谢 物, 建 立 了 一 个 快 速, 简 单, 费 用 低 廉, 能 为 我 省 大 多 数 的 检 测 机 构 所 使 用 的 方 法 同 时 对 确 定 的 检 测 方 法 进 行 检 出 限 回 收 率 精 密 度 等 试 验, 确 保 该 方 法 的 切 实 可 行 2. 实 验 室 间 验 证 工 作 邀 请 吉 林 省 出 入 境 检 验 检 疫 局 检 验 检 疫 中 心 吉 林 省 渔 业 生 态 环 境 监 测 及 水 产 品 监 督 检 测 中 心 农 业 部 渔 业 环 境 及 水 产 品 质 量 监 督 检 验 测 试 中 心 ( 哈 尔 滨 ) 等 单 位 进 行 了 实 验 室 间 的 验 证 工 作 通 过 统 计 分 析 各 个 实 验 室 的 检 测 数 据, 验 证 了 方 法 的 准 确 度 和 精 密 度 最 低 检 出 限 等 参 加 验 证 的 实 验 室 一 致 认 为 : 该 方 法 灵 敏 度 高 检 测 结 果 重 复 性 好, 在 检 出 限 回 收 率 精 密 度 等 方 面 满 足 药 残 检 测 的 要 求, 适 用 于 水 产 品 中 呋 喃 唑 酮 代 谢 物 残 留 量 的 测 定 四 制 标 原 则 本 标 准 编 制 遵 循 简 单 快 速 低 廉 实 用 的 原 则, 尽 可 能 与 国 家 标 准 接 轨, 注 重 标 准 的 可 操 作 性, 严 格 按 照 GB/T 1.1-2000 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分 : 标 准 的 结 构 和 编 写 规 则 和 GB/T 20001.4-2001 标 准 编 写 规 则 第 4 部 分 : 化 学 分 析 方 法 的 要 求 编 写 的 五 标 准 主 要 条 款 的 说 明 1. 标 准 的 名 称 本 标 准 适 用 于 水 产 品 中 呋 喃 唑 酮 代 谢 物 (AOZ) 的 测 定, 故 标 准 命 名 为 水 产 品 中 呋 喃 唑 酮 代 谢 物 (AOZ) 的 测 定 酶 联 免 疫 法 2. 标 准 的 范 围 目 前 水 产 品 主 要 包 括 淡 水 及 海 水 类 产 品, 本 标 准 适 用 于 市 场 上 常 见 的 鲜 活 鱼 类 虾 蟹 类 贝 类 及 软 体 类 水 产 品 中 呋 喃 唑 酮 代 谢 物 的 测 定 3. 方 法 原 理 样 品 中 的 呋 喃 唑 酮 代 谢 物 经 衍 生 化 后 与 酶 标 板 上 固 定 的 抗 原 竞 争 特 异 性 抗 体, 加 入 酶 3
标 Ⅱ 抗, 与 抗 体 反 应, 通 过 酶 催 化 显 色 剂, 利 用 显 色 来 判 别 样 品 中 的 呋 喃 唑 酮 残 留 4. 前 处 理 条 件 对 于 硝 基 呋 喃 类 代 谢 物 的 测 定, 鉴 于 其 残 留 物 主 要 以 蛋 白 结 合 的 形 态 存 在, 只 有 在 适 当 的 酸 性 条 件 下 经 水 解 过 程, 才 能 释 放 出 游 离 的 代 谢 产 物, 而 且 因 残 留 物 的 浓 度 一 般 非 常 低, 需 要 用 衍 生 化 手 段 来 提 高 灵 敏 度, 衍 生 化 最 常 用 的 试 剂 为 2- 硝 基 苯 甲 醛, 衍 生 化 试 剂 能 与 硝 基 呋 喃 游 离 代 谢 产 物 的 自 由 氨 基 团 反 应, 形 成 具 有 良 好 特 性 的 芬 香 亚 胺 类 衍 生 物 衍 生 化 代 谢 物 缓 冲 液 和 提 取 液 的 选 取 参 照 国 标 方 法 ( 农 业 部 1077 号 公 告 -2-2008) 同 时 对 于, 前 处 理 的 摸 索, 我 们 主 要 采 用 是 酶 联 免 疫 试 剂 盒 的 操 作 规 程, 对 该 方 法, 目 前 市 场 上 大 多 数 的 试 剂 盒 都 是 可 行 的, 且 方 法 已 经 相 对 成 熟 同 时 浙 江 省 的 地 方 标 准 DB33T 744-2009 水 产 品 中 呋 喃 唑 酮 呋 喃 它 酮 代 谢 物 的 快 速 测 定 酶 联 免 疫 法 采 用 的 也 是 类 似 的 方 法 对 于 该 方 法, 我 们 在 实 验 室 进 行 了 反 复 的 验 证 研 究 及 改 进, 同 时 找 第 三 方 实 验 室 进 行 验 证, 结 果 证 明 是 可 行 的 前 处 理 方 法 : 取 水 产 可 食 部 分 1.0±0.05 g 的 均 质 物 ( 鱼 / 虾 ) 至 50 ml 聚 苯 乙 烯 离 心 管 中, 加 入 4 ml 去 离 子 水,0.5 ml 1 mol/l 盐 酸 溶 液 和 100 µl 衍 生 化 试 剂, 充 分 振 荡 2 min; 在 60 孵 育 3h; 分 别 加 入 5mL 0.1mol/L 磷 酸 氢 二 钾 溶 液 0.4 ml 1 mol/l 氢 氧 化 钠 和 5 ml 乙 酸 乙 酯, 剧 烈 振 荡 30 s;3000 r/min 以 上, 温 度 20-25 离 心 10 min; 取 出 2.5 ml 上 层 有 机 相 至 10 ml 干 净 玻 璃 试 管 中,50~60 水 浴 氮 气 流 下 吹 干 ; 用 1mL 正 己 烷 溶 解 干 燥 物, 用 1 ml 复 溶 液 工 作 液 充 分 混 合 ; 高 脂 肪 样 本, 可 加 大 正 己 烷 用 量, 用 3mL 正 己 烷 溶 解 干 燥 物 在 室 温 下 (20-25 )3000 r/min 以 上 离 心 10 min; 除 去 上 层 有 机 相, 取 50 µl 下 层 水 相 用 于 分 析 5. 仪 器 分 析 条 件 5.1 所 用 主 要 仪 器 酶 标 仪 或 酶 联 免 疫 分 光 光 度 计 5.2 波 长 选 择 根 据 试 剂 盒 的 条 件 及 实 际 测 试 确 定 采 用 450nm 段 波 长 最 为 合 适 5.3 仪 器 工 作 温 度 经 过 不 同 温 度 间 的 对 比, 确 定 仪 器 酶 标 板 及 样 品 在 20-25 条 件 下, 吸 光 度 值 达 到 最 好 5.4 其 他 需 要 小 型 仪 器 4
旋 转 蒸 发 仪 / 氮 气 吹 干 装 置 均 质 器 振 荡 器 涡 旋 仪 离 心 机 天 平 : 感 量 刻 度 移 液 管 洗 耳 球 玻 璃 试 管 聚 苯 乙 烯 离 心 管 微 量 移 液 器 6. 酶 联 免 疫 法 线 性 范 围 呋 喃 唑 酮 代 谢 物 标 准 系 列 工 作 液 浓 度 分 别 为 0.0ng/L 25 ng/l 75 ng/l 225 ng/l 675 ng/l 2025 ng/l, 将 各 浓 度 依 次 进 样 后, 以 浓 度 的 对 数 为 横 坐 标, 以 百 分 吸 光 度 率 为 纵 坐 标, 建 立 标 准 曲 线, 直 线 方 程 为 Y=-14.227X+33.926, 相 关 系 数 r=0.9992 曲 线 在 25~ 2.25ng/L 浓 度 范 围 内 线 性 很 好 如 果 实 测 样 品 的 含 量 超 过 此 范 围, 可 对 其 进 行 稀 释 表 1 图 1 为 标 准 曲 线 图 表 1: 标 准 品 百 分 吸 光 度 值 浓 度 (ng/l) 0 25 75 225 675 2025 吸 光 度 值 2.132 1.852 1.515 1.183 0.858 0.505 2.138 1.818 1.517 1.175 0.872 0.479 平 均 值 2.135 1.835 1.516 1.179 0.865 0.492 百 分 吸 光 度 率 (%) 85.95 71.01 55.22 40.52 23.04 标 准 曲 线 Y=-14.227X+33.926 R 2 0.9992 图 1: 呋 喃 唑 酮 标 准 曲 线 5
7. 方 法 检 出 限 根 据 试 剂 盒 的 灵 敏 度 (10ng/kg), 采 用 灵 敏 度 10 倍 的 浓 度, 并 通 过 实 际 的 试 验 验 证, 确 定 该 方 法 检 出 限 ( 定 量 限 ) 为 0.1µg/kg 8. 方 法 的 对 比 及 回 收 率 和 精 密 度 假 阳 性 对 比 测 定 : 分 别 向 鲤 鱼 鳕 鱼 对 虾 样 品 中 加 入 AOZ 标 准 溶 液 配 制 成 0.1µg/kg 0.2µg/kg 0.5µg/kg 1µg/kg, 分 别 采 用 ELISA 方 法 与 液 相 色 谱 - 质 谱 串 联 法 进 行 对 比, 测 定 样 品 的 阴 阳 性, 结 果 图 2 所 示 图 2 ELISA 与 LC-MS 对 比 结 果 ELISA LC-MS 浓 度 0.1 0.2 0.5 1 0.1 0.2 0.5 1 鲤 鱼 + + + + + + + + 鳕 鱼 + + + + + + + + 对 虾 + + + + + + + + + 代 表 结 果 呈 阳 性 - 代 表 结 果 呈 阴 性 由 上 图 可 见, 在 检 测 限 范 围 内,ELISA 方 法 与 LC-MS 的 结 果 是 一 致 的 分 别 以 阴 性 鲤 鱼 对 虾 鳕 鱼 样 品 为 加 标 对 象, 分 别 加 入 3 个 水 平 的 呋 喃 唑 酮 代 谢 物 标 准 溶 液, 按 照 送 审 稿 的 样 品 处 理 方 法 及 相 同 的 色 谱 条 件, 进 行 回 收 率 的 测 定, 同 时 每 个 样 品 重 复 6 次, 计 算 出 每 个 添 加 水 平 的 回 收 率 范 围 和 相 应 的 相 对 标 准 偏 差 (RSD) 值 方 法 回 收 率 结 果 见 图 2 表 2 表 3 表 4 6
加 标 浓 度 0.1 0.5 1 吸 光 度 值 浓 度 1.695 0.082 1.687 0.084 1.698 0.081 1.695 0.082 1.647 0.096 1.666 0.09 1.184 0.44 1.177 0.45 1.158 0.48 1.191 0.43 1.177 0.45 1.171 0.46 0.964 0.91 0.974 0.88 0.995 0.82 0.981 0.86 0.988 0.84 0.964 0.91 表 2 阴 性 鲤 鱼 数 据 平 均 值 RSD (%) 回 收 率 范 围 0.09 6.93 82%-96% 0.45 3.81 86%-96% 0.87 4.24 82%-91% 加 标 浓 度 0.1 0.5 1 吸 光 度 值 浓 度 1.663 0.091 1.687 0.084 1.698 0.081 1.698 0.081 1.695 0.082 1.687 0.084 1.206 0.41 1.158 0.48 1.191 0.43 1.171 0.46 1.206 0.41 1.177 0.45 0.960 0.92 0.981 0.86 0.999 0.81 表 3 阴 性 对 虾 数 据 平 均 值 RSD (%) 回 收 率 范 围 0.08 4.49 81%-91% 0.44 6.43 82%-96% 0.85 4.14 81%-92% 7
0.991 0.83 0.988 0.84 0.999 0.81 加 标 浓 度 0.1 0.5 1 吸 光 度 值 浓 度 1.695 0.082 1.687 0.084 1.653 0.094 1.684 0.085 1.691 0.083 1.684 0.085 1.206 0.41 1.177 0.45 1.171 0.46 1.206 0.41 1.177 0.45 1.158 0.48 0.981 0.86 0.977 0.87 0.995 0.82 0.999 0.81 0.960 0.92 0.964 0.91 表 4 阴 性 鳕 鱼 数 据 平 均 值 RSD (%) 回 收 率 范 围 0.09 5.06 82%-93% 0.44 6.33 78%-96% 0.87 4.51 86%-92% 六 方 法 验 证 由 我 中 心 提 供 方 法 及 试 剂 盒, 分 别 发 送 到 3 个 参 加 方 法 验 证 的 实 验 室 进 行 验 证, 验 证 单 位 提 供 水 产 样 品, 每 个 浓 度 均 对 每 个 样 品 测 定 6 次, 结 果 见 下 表 6 表 7 表 8 表 6: 验 证 机 构 1 检 测 结 果 样 品 添 加 浓 度 回 收 率 范 围 (%) RSD(%) 0.1 79%-95% 6.49 鲤 鱼 0.5 82%-96% 6.00 1.0 83%-93% 3.78 对 虾 0.1 81%-93% 5.39 8
0.5 78%-98% 8.82 1.0 82%-93% 3.90 0.1 81%-93% 5.27 鳕 鱼 0.5 78%-98% 9.76 1.0 81%-93% 4.38 表 7: 验 证 机 构 2 检 测 结 果 样 品 添 加 浓 度 回 收 率 范 围 (%) RSD(%) 0.1 78%-91% 6.12 鲤 鱼 0.5 82%-96% 5.42 1.0 82%-91% 4.24 0.1 79%-85% 2.74 对 虾 0.5 82%-96% 6.43 1.0 81%-92% 4.14 0.1 82%-93% 4.61 鳕 鱼 0.5 78%-96% 7.61 1.0 86%-92% 4.51 表 8 验 证 机 构 3 检 测 结 果 样 品 添 加 浓 度 回 收 率 范 围 (%) RSD(%) 0.1 78%-86% 3.56 鲤 鱼 0.5 78%-96% 6.93 1.0 85%-94% 3.44 0.1 79%-91% 5.54 对 虾 0.5 78%-96% 7.67 1.0 81%-94% 5.1 鳕 鱼 0.1 80%-91% 5.07 9
0.5 80%-96% 7.1 1.0 84%-94% 4.13 七 验 证 结 论 经 实 验 验 证 : 本 方 法 在 精 密 度 重 现 性 检 出 限 等 方 面 完 全 达 到 了 水 产 品 中 呋 喃 唑 酮 代 谢 物 快 速 测 定 的 要 求, 其 方 法 方 便 快 捷, 应 在 省 内 广 泛 应 用 八 参 考 文 献 [1] GB/T 603 化 学 试 剂 试 验 方 法 中 所 用 制 剂 及 制 品 的 制 备 [2] GB/T 5009.1 食 品 卫 生 标 准 检 验 方 法 理 化 部 分 总 则 [3] GB/T 6682-2008 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法 [4] 动 物 性 食 品 中 呋 喃 唑 酮 代 谢 物 酶 联 免 疫 检 测 方 法 的 研 究 食 品 研 究 与 开 发 2007.vol28.12 [5] 呋 喃 唑 酮 及 其 代 谢 物 3- 氨 基 -2- 恶 唑 烷 酮 在 鲤 鱼 体 内 的 残 留 规 律 福 建 农 林 大 学 学 报 2009.vol38.2 [6] 水 产 品 中 呋 喃 唑 酮 代 谢 物 AOZ 的 检 测 能 力 验 证 分 析 分 析 试 验 室 2012. vol31.7 10