第 13 章 生 殖 生 物 技 术 在 动 物 迁 地 保 护 中 的 应 用 随 着 人 类 开 发 和 利 用 自 然 活 动 的 加 剧, 动 物 的 自 然 生 存 环 境 日 益 受 到 人 为 因 素 的 破 坏 野 生 动 物 的 迁 地 保 护 已 成 为 维 护 动 物 多 样 性 的 一 个 重 要 手 段 动 物 的 迁 地 保 护 工 作 的 开 展, 使 得 人 们 可 以 采 用 一 些 新 技 术 来 维 护 动 物 的 遗 传 多 样 性 如 近 年 发 展 起 来 的 生 殖 生 物 技 术 (reproductive biotechnology) 已 在 野 生 动 物 的 迁 地 保 护 中 发 挥 了 重 要 的 作 用 动 物 的 生 殖 生 物 技 术 是 指 近 年 来 发 展 起 来 的 精 卵 和 胚 胎 体 外 操 作 技 术, 包 括 精 子 卵 母 细 胞 和 胚 胎 的 冷 冻 保 存, 以 及 胚 胎 移 植 体 外 授 精 单 精 子 注 射 授 精 核 移 植 ( 包 括 最 近 轰 动 一 时 的 无 性 克 隆 动 物 ) 转 基 因 动 物, 胚 胎 干 细 胞 培 养 等 技 术 这 些 技 术 最 初 都 是 在 实 验 动 物 和 家 畜 上 发 展 起 来 的 近 年 来 有 些 已 用 于 野 生 动 物 的 迁 地 保 护, 如 精 子 卵 母 细 胞 和 胚 胎 的 冷 冻 保 存 胚 胎 移 植 等 下 面 将 对 每 一 技 术 的 原 理 和 实 验 操 作 分 别 作 一 介 绍 由 于 不 同 种 类 的 动 物 其 生 殖 生 理 有 着 很 大 的 差 别, 对 人 工 控 制 下 的 生 理 反 应 也 有 很 大 的 区 别, 因 此 本 文 将 以 某 一 种 类 动 物 为 例 来 介 绍 某 一 特 定 的 生 殖 技 术 13.1 精 液 冷 冻 和 人 工 授 精 人 工 授 精 是 指 用 人 工 方 法 从 性 成 熟 的 雄 性 动 物 上 采 得 精 液, 经 过 检 查 处 理, 再 注 入 雌 性 动 物 生 殖 道 或 子 宫 内, 以 达 到 受 精 的 目 的 人 工 授 精 可 大 大 提 高 雄 性 动 物 的 配 种 效 率, 是 家 畜 育 种 和 动 物 保 护 中 一 个 有 效 的 技 术 手 段 它 通 常 包 括 精 液 采 集 精 液 冷 冻 和 人 工 输 精 3 个 步 骤 13.1.1 精 液 采 集 常 用 的 精 液 采 集 方 法 有 电 刺 激 和 假 阴 道 两 种 方 法 13.1.1.1 电 刺 激 采 精 法 此 方 法 主 要 适 用 于 较 小 和 中 等 体 型 的 动 物 在 动 物 固 定 不 动 的 情 况 下, 用 电 刺 激 仪 给 直 肠 或 阴 茎 以 一 定 的 电 流 刺 激, 导 致 其 射 精 中 枢 兴 奋 而 射 精 本 文 以 我 们 实 验 室 改 进 的 猕 猴 (Macaca mulatta) 阴 茎 电 流 刺 激 采 精 方 法 ( 杨 上 川 等 1994) 为 例 对 此 技 术 加 以 介 绍 材 料 : 6~12 岁 性 成 熟 的 雄 性 猕 猴, 氯 胺 酮, 生 理 盐 水, 电 刺 激 采 精 仪, 已 消 毒 的 50ml 烧 杯 1 ~ 2 个, 光 学 显 微 镜,TH 培 养 液 ( 表 13-1) 本 章 作 者 : 陈 建 春, 王 红, 门 红 升, 季 维 智
第 13 章 生 殖 生 物 技 术 在 动 物 迁 地 保 护 中 的 应 用 143 表 13-1 TALP TALP-Hepes(TH) 和 MCM 培 养 液 方 法 : 采 精 仪 为 S44 型 方 波 发 生 器 (USA) 电 极 由 铝 箔 条 和 脱 脂 棉 条 组 成, 铝 箔 条 宽 3~5mm, 长 60~80mm; 脱 脂 棉 宽 8~12mm, 长 80~100mm 刺 激 频 率 设 定 为 17 脉 冲 / 秒, 延 迟 时 间 17ms, 波 宽 17ms, 起 始 电 压 0 或 10V 将 动 物 保 定 为 仰 卧 式, 用 氯 胺 酮 以 3~4mg/kg 肌 肉 注 射, 使 之 轻 度 麻 醉 用 脱 脂 棉 条 轻 轻 绕 在 阴 茎 基 部 和 近 龟 头 端, 再 用 铝 箔 条 绕 在 脱 脂 棉 上 ( 切 勿 使 铝 箔 条 与 阴 茎 表 皮 接 触 ) 阴 茎 基 部 环 为 正 极, 近 龟 头 端 接 地 通 电 刺 激 前 先 将 脱 脂 棉 用 生 理 盐 水 浸 透, 并 使 之 与 阴 茎 表 面 达 到 最 大 接 触 刺 激 方 式 有 以 下 两 种 : (1) 间 断 刺 激 方 式 : 将 电 压 从 10V 增 至 60V, 每 增 加 10V 为 一 组, 共 分 为 6 组 进 行 刺 激 强 度 从 10V 开 始, 接 通 电 压 3~5 秒 钟, 断 开 1 秒 钟, 重 复 5 次, 即 完 成 第 1 组 刺 激 如 无 射 精 发 生, 再 用 20V 40V 直 至 60V 以 相 同 方 式 刺 激 如 在 刺 激 电 压 升 到 60V 时 不 发 生 射 精, 可 让 动 物 休 息 20~30 秒 钟, 再 从 10~60V 进 行 刺 激 可 重 复 6~7 次 (2) 连 续 刺 激 方 式 : 电 压 从 0 增 至 60V, 以 5~10V/s 的 速 度 升 高 电 压, 每 增 加 10V 持 续 刺 激 10~15 秒 钟, 然 后 再 以 相 同 的 速 度 增 加 10V, 直 至 60V 若 有 必 要 可 进 行 6~7 次 刺 激, 每 两 次 刺 激 之 间 让 动 物 休 息 20~30 秒 钟 不 论 用 哪 种 方 式 刺 激, 动 物 射 精 时 都 应 停 止 刺 激 将 收 集 到 的 精 液 在 室 温 下 孵 育 30~45 分 钟 后, 分 离 液 化 部 分, 测 量 液 化 体 积 及 凝 块 体 积 用 TH 培 养 液 (Bavister 等 1983) 稀 释 液 化 部 分, 再 用 血 细 胞 计 数 板 在 显 微 镜 下 观 察 精 子 形 态 及 运 动 方 式, 并 计 算 出 精 子 浓 度 及 正 常 形 态 精 子 和 运 动 精 子 的 比 例 国 外 对 灵 长 类 动 物 的 电 刺 激 受 精 采 用 非 麻 醉 的 方 式 进 行 (Bavister,Boatman 等 1983) 采 用 这 种 方 法 的 猴 子 需 要 经 过 一 段 时 间 的 训 练, 以 适 应 采 精 程 序, 并 需 要 一 些 特 别 的 笼 具 非 麻 醉 的 电 刺 激 采 精 法 所 采 用 的 刺 激 模 式 与 上 述 方 法 类 似, 一 般 说 来 刺 激 电 压 略 偏 低 此 方 法 的 优 点 是 不 会 造 成 阴 茎 电 刺 激 损 伤
144 遗 传 多 样 性 研 究 的 原 理 与 方 法 13.1.1.2 假 阴 道 采 精 法 此 方 法 适 用 于 体 型 较 大 的 动 物, 如 牛 等 其 原 理 为 利 用 台 牛 ( 常 为 同 种 母 牛 ) 来 诱 导 种 公 牛, 导 致 其 性 兴 奋, 待 种 公 牛 爬 跨 台 牛 并 产 生 射 精 动 作 时, 立 即 用 假 阴 道 收 集 精 液 下 面 以 我 室 建 立 大 额 牛 (Bos frontalis) 采 精 方 法 为 例 来 介 绍 此 技 术 材 料 : 雄 性 和 雌 性 性 成 熟 大 额 牛 数 头 ( 须 没 有 传 染 病 和 生 殖 系 统 疾 病 ), 牛 采 精 用 保 定 架, 假 阴 道 2 套, 医 用 凡 士 林, 温 度 计 2 只,pH 试 纸 或 ph 计 方 法 : 首 先 将 用 作 台 牛 的 雌 性 大 额 牛 一 头 固 定 在 保 定 架 上, 安 装 好 假 阴 道 并 从 注 水 孔 向 内 注 入 热 水, 然 后 通 过 注 水 嘴 阀 门 用 力 向 内 吹 气 再 用 凡 士 林 润 滑 假 阴 道 内 胎, 并 测 量 假 阴 道 内 腔 的 温 度, 要 求 假 阴 道 内 腔 的 温 度 应 在 40~50 之 间 随 后 将 待 采 精 的 雄 性 大 额 牛 牵 到 固 定 好 的 雌 性 大 额 牛 背 后 采 精 人 应 右 手 持 假 阴 道, 并 使 假 阴 道 与 牛 体 保 持 平 行 站 于 牛 的 右 侧 待 公 牛 爬 跨 台 牛 时, 迅 速 用 左 手 握 着 公 牛 的 阴 包 ( 不 能 握 着 伸 出 的 阴 茎, 否 则 将 导 致 阴 茎 缩 回 或 立 即 射 精 ), 将 伸 出 的 阴 茎 导 入 假 阴 道 观 察 到 牛 的 射 精 动 作 ( 腹 部 用 力 前 挺 ) 时, 采 精 过 程 即 完 成 采 到 的 精 液 要 立 即 测 量 并 记 录 其 ph 值, 然 后 再 用 血 细 胞 计 数 器 计 算 精 子 浓 度, 以 决 定 稀 释 倍 数 随 后 用 冷 冻 保 护 液 ( 见 精 液 冷 冻 ) 按 一 定 的 比 例 对 精 液 进 行 稀 释 通 常 情 况 下, 一 头 种 公 牛 每 星 期 可 采 精 两 次 13.1.2 精 液 的 冷 冻 精 液 卵 和 胚 胎 的 冻 存 对 于 人 类 医 学 家 畜 繁 殖 及 野 生 濒 危 动 物 的 保 护 都 有 重 要 意 义 在 过 去 几 十 年 的 研 究 中, 已 有 许 多 喜 人 的 进 展, 在 实 验 动 物 家 畜 非 人 灵 长 类 及 人 类 中, 均 有 不 少 精 液 卵 胚 胎 冻 存 成 功 的 报 道 在 野 生 动 物 中, 已 有 累 计 21 个 种 的 冷 冻 精 液 用 于 人 工 授 精 获 得 成 功, 其 中 有 11 个 种 是 被 列 入 红 皮 书 的 珍 稀 濒 危 动 物 (Rott 1995) 许 多 国 家 已 建 立 了 相 当 规 模 的 精 子 库 及 胚 胎 库, 其 中 值 得 注 意 的 是 独 具 特 色 的 Jackson 实 验 室 的 实 验 动 物 胚 胎 库, 它 收 集 冻 存 了 许 多 转 基 因 小 鼠 的 胚 胎 和 基 因 去 除 小 鼠 (gene knock out mice) 胚 胎, 这 实 际 上 是 为 医 学 生 物 学 研 究 保 存 了 具 有 现 实 意 义 的 动 物 模 型 资 源 小 鼠 的 精 子 卵 胚 胎 的 冻 存 是 研 究 得 最 深 最 成 功 的, 这 家 胚 胎 库 实 质 上 是 把 这 些 研 究 带 入 实 际 应 用 阶 段 但 是, 生 殖 细 胞 的 冷 冻 也 存 在 许 多 未 解 决 的 问 题, 冻 存 技 术 本 身 尚 在 发 展 和 完 善 ; 科 学 家 仍 缺 乏 长 期 冻 存 对 其 长 久 影 响 的 数 据 当 然, 此 研 究 的 前 景 是 乐 观 的, 相 信 随 着 冷 冻 技 术 胚 胎 技 术 乃 至 生 殖 生 物 技 术 的 发 展 和 完 善, 冷 冻 精 子 卵 和 胚 胎 将 进 入 实 质 性 的 应 用 和 商 业 阶 段 近 年 来 发 展 起 来 的 辅 助 性 生 殖 技 术, 如 透 明 带 下 精 子 注 射 技 术 (subzona insemination) 和 卵 质 内 精 子 注 射 技 术 (intracytoplamic sperm injection)(catt 等 1995;Kazem 等 1995) 将 有 力 地 推 动 这 一 趋 势 13.1.2.1 鱼 类 精 液 的 冻 存 到 目 前 为 止, 已 有 50 多 种 淡 水 鱼 和 咸 水 鱼 的 精 液 冻 存 的 报 道 几 种 常 用 的 具 有 代 表 性 的 防 冻 液 和 稀 释 液 见 表 13-2 降 温 方 法 包 括 液 氮 蒸 气 降 温 冷 冻 干 冰 滴 冻 及 程 控 降 温 等 液 氮 蒸 气 降 温 致 冻 当 然 最 为 方 便, 但 也 最 难 控 制 因 为 液 氮 蒸 气 的 密 度 样 品 的 大 小 和 数 量 样 品 悬 置 的 高 度 液 氮 罐 的 形 状 和 室 温 高 低 都 会 影 响 降 温 速 率
第 13 章 生 殖 生 物 技 术 在 动 物 迁 地 保 护 中 的 应 用 145 表 13-2 几 种 主 要 鱼 类 的 防 冻 液 配 方 鱼 类 精 液 的 冷 冻 及 复 苏 方 法 如 下 : (1) 在 精 液 中 加 适 量 的 稀 释 液 和 防 冻 液, 使 精 子 浓 度 为 10 8 个 /ml, 防 冻 剂 的 浓 度 为 表 13-2 所 示 将 精 液 分 装 于 冷 冻 小 管 或 冷 冻 管 中, 并 认 真 标 记 记 录 将 冷 冻 管 在 4 条 件 下 平 衡 20~ 30 分 钟 (2) 程 控 降 温 : 以 每 分 钟 5 的 下 降 速 度 将 温 度 降 到 -50, 并 平 衡 2 分 钟, 然 后 转 移 到 液 氮 中 长 期 保 存 (3) 液 氮 蒸 气 降 温 : 把 样 品 悬 置 于 预 定 高 度 的 液 氮 蒸 气 中 约 15 分 钟, 冻 凝 后 迅 速 转 移 到 液 氮 中 保 存 (4) 干 冰 滴 冻 : 把 样 品 以 每 滴 10~20 毫 升 的 量 滴 到 预 期 的 干 冰 小 窝 中,5 分 钟 后 收 集 到 预 冷 的 冷 冻 管 中, 并 迅 速 转 移 到 液 氮 中 保 存 (5) 复 苏 : 将 冷 冻 精 液 在 40 的 水 浴 中 复 苏, 当 最 后 一 粒 冰 渣 消 融 时 迅 速 取 出 (6) 将 精 液 放 在 离 心 管 中 离 心, 使 其 重 新 悬 浮 于 稀 释 液 中, 检 查 存 活 率 运 动 度 及 受 精 能 力 13.1.2.2 鸟 ( 禽 ) 类 的 精 液 冻 存 鸟 类 精 液 的 冻 存 也 有 不 少 报 道, 常 用 的 防 冻 液 见 表 13-3, 常 用 的 稀 释 液 见 表 13-4
146 遗 传 多 样 性 研 究 的 原 理 与 方 法 表 13-3 鸟 类 精 液 防 冻 液 1. 冷 冻 程 序 将 采 到 的 精 液 置 于 5 冰 箱 或 冷 屋 中 将 0.15ml 的 精 液 与 0.45ml 的 防 冻 剂 在 冷 冻 管 中 混 匀, 在 5 条 件 下 平 衡 10 分 钟 ( 注 : 鸟 类 精 液 浓 度 通 常 为 3~5 10 9 个 /ml, 冻 存 浓 度 一 般 为 1 10 9 个 /ml) 以 每 分 钟 3 的 速 度 从 5 降 到 35, 在 35 中 平 衡 5 分 钟, 然 后 迅 速 转 移 到 液 氮 中 保 存 2. 复 苏 (1) 在 5 条 件 下, 每 隔 2 分 钟 分 别 加 入 0.08,0.22,0.40,0.73,1.50,1.90ml 稀 释 液, 并 混 匀 (2) 在 5 条 件 下, 以 700r/min 的 离 心 力 离 心 15 分 钟 (3) 弃 上 清 液, 使 精 子 悬 浮 于 0.1ml 的 稀 释 液 中 (4) 检 测 精 子 活 力 (5) 进 行 人 工 授 精, 以 检 查 受 精 能 力 13.l.2.3 家 畜 精 液 的 冻 存 人 们 对 家 畜 精 液 冻 存 的 研 究 进 行 得 最 为 广 泛 和 深 入, 如 家 畜 精 液 对 酸 度 离 子 强 度 的 要 求 (Fiser 等 1981;Melrose 1962;Paquignon 1984;Nagase 等 1968), 对 防 冻 剂 及 其 浓 度 的 要 求 (Cassou 1964;Melrose 1962;Berndison,Foote 1976;Graham 等 1978;Mormer 等 1976; Cochran 等 1984;Wales,O'shea 1968;Watson 1981), 抗 生 素 的 选 用 及 其 副 作 用 (Dann 等 1981; Berndison,Foote 1976), 冻 存 浓 度 (Colas 1975;Paquignon 1984;Picken, Berndtson 1974) 及 冻 存 的 降 温 速 度 和 方 法 等 但 是 由 于 家 畜 精 子 生 理 特 性 的 多 样 性, 因 而 没 有 一 个 标 准 化 的 冷 冻 程 序 可 供 选 择 这 里 列 出 牛 精 液 冻 存 的 程 序, 是 已 用 于 商 业 化 的 程 序 1. 几 种 溶 液 及 配 制 方 法 (1) 缓 冲 液 TEST N-tris(Hydroxyl methyl)methy1-2-aminoethane-sulfonic acid
第 13 章 生 殖 生 物 技 术 在 动 物 迁 地 保 护 中 的 应 用 147 (TEST)48.6g/dm 3,Tris(Hydroxyl methyl)amino-methane 11.0g/dm 3 将 上 述 两 溶 液 加 入 双 蒸 水 中, 调 ph 至 7.1 用 0.2µm 的 滤 器 过 滤, 然 后 贮 存 于 4 下 虽 然 TEST 缓 冲 液 可 存 于 4 下 待 用, 但 完 全 的 TEST-egg yolk-glycerol(test-ey-g) 最 好 新 鲜 配 制 所 有 试 剂 均 为 分 析 纯 (2)TEST-EY 稀 释 液 : 于 TEST 缓 冲 液 中 加 9g/L glucose,500 IU/ml 青 霉 素 钠 ( 钾 ), 0.5mg/ml 硫 酸 链 霉 素 ; 调 渗 透 压 至 350mmol; 加 15%( 体 积 比 ) 卵 黄, 卵 黄 必 须 完 全 与 清 蛋 白 分 离 并 用 滤 纸 吸 干 在 2 000r/min 下 离 心 20 分 钟, 小 心 倒 出 上 清 液, 加 甘 油 至 浓 度 为 3% ( 体 积 比 ) 混 匀 后 用 2 000r/min 离 心 20 分 钟 将 上 清 液 过 滤 后 存 于 4 或 20 下 备 用 (3)TEST-EY-G 防 冻 液 : 加 甘 油 到 15%( 体 积 比 ) 2. 冷 冻 程 序 及 复 苏 程 序 (1) 在 高 质 量 无 污 染 的 精 液 中 加 入 适 量 的 稀 释 液 TEST-EY, 混 匀, 然 后 加 入 适 量 的 防 冻 液 TEST-EY-G, 使 得 精 液 的 浓 度 为 5 10 8 个 /ml, 甘 油 的 浓 度 为 6%~9%( 体 积 比 ) (2) 将 上 述 混 合 液 迅 速 分 装 于 冷 冻 小 管 (cryo-straw) 中, 另 一 端 用 straw powder 封 闭 (straw powder = polyvinyl acetate powder, 简 称 PVA powder) (3) 取 一 1 000ml 的 烧 杯, 加 入 500ml 室 温 无 菌 水, 将 冷 冻 管 放 入 水 中, 然 后 将 烧 杯 放 到 5 冰 箱 中, 静 置 3 小 时, 使 样 品 温 度 缓 慢 地 降 至 5 (4) 将 样 品 迅 速 转 移 到 液 氮 蒸 气 中, 静 置 于 离 液 面 5 厘 米 处 (5)7 分 钟 后, 将 样 品 投 入 液 氮 中 长 期 冻 存 (6) 需 将 精 液 复 苏 时, 可 从 液 氮 中 取 出 小 管,3 秒 钟 后 插 入 35 水 浴 箱 中,15 秒 钟 后 取 出, 检 查 和 测 定 活 力 或 进 行 人 工 授 精 实 验 13.1.2.4 非 人 灵 长 类 精 液 的 冷 冻 保 存 非 人 灵 长 类 精 液 的 冻 存 比 人 类 和 家 畜 的 精 液 冻 存 要 困 难 得 多, 这 主 要 是 因 为 对 非 人 灵 长 类 精 液 冷 冻 机 制 了 解 较 少, 不 同 动 物 的 精 子 对 防 冻 剂 和 冻 存 过 程 中 环 境 及 其 相 态 改 变 的 耐 受 能 力 不 同 (Hammerstedt 等 1990) 有 关 非 人 灵 长 类 精 液 冻 存 仅 在 猕 猴 红 面 猴 长 尾 猴 黑 猩 猩 大 猩 猩 松 鼠 猴 食 蟹 猴 等 种 类 中 有 初 步 报 道, 但 只 有 大 猩 猩 黑 猩 猩 食 蟹 猴 的 冷 冻 精 液 人 工 授 精 成 功, 而 且 受 孕 率 很 低 (Douglass 等 1981;Gould,Styperek 1989; Tollner 等 1990) 本 节 把 我 们 冻 存 藏 酋 猴 精 液 的 方 法 作 一 介 绍 ( 陈 建 春 等 1994) (1) 冷 冻 稀 释 保 存 液 : 甘 油 4.0g/100ml, 卵 黄 10.0ml/100ml, 乳 糖 10.0g/100ml, 葡 萄 糖 1.0g/100ml 将 上 述 物 质 混 合, 用 Tris 调 ph 值 至 7.2 (2) 冷 冻 方 法 : 在 精 液 中 加 入 适 当 体 积 的 冷 冻 稀 释 保 存 液, 在 4 下 平 衡 2 0 分 钟, 然 后 加 入 等 体 积 的 保 存 液, 再 平 衡 20 分 钟 此 时 精 液 浓 度 为 10 7 个 /ml 左 右 分 装 后 以 每 分 钟 1 的 速 度 降 温 到 -6, 再 以 每 分 钟 0.3 的 速 度 降 温 至 -8, 并 在 -7 时 自 动 种 冰, 然 后 以 每 分 钟 1 的 速 度 降 温 到 30, 最 后 以 每 分 钟 25 的 速 度 降 温 到 -120, 最 后 快 速 转 移 到 液 氮 中 保 存 13.1.3 人 工 授 精 本 文 中 以 牛 (Bos taurus) 人 工 授 精 为 例 人 工 授 精 所 用 精 液 常 为 冷 冻 精 液 精 液 细 管 先 在 39~41 水 浴 箱 中 解 冻, 待 管 内 精 液 颜 色 变 后 即 可 取 出 然 后 用 细 管 输 精 枪 卡 苏 式 输 精 枪 (Cassou gun) 于 1 小 时 内 将 精 液 输 入 待 配 种 牛 子 宫 内 输 精 方 法 为 直 肠 把 握 法, 即 用 左
148 遗 传 多 样 性 研 究 的 原 理 与 方 法 手 通 过 直 肠 握 着 子 宫 颈 近 阴 道 端, 右 手 持 输 精 枪 导 入 子 宫 颈, 然 后 将 精 液 推 入 宫 腔 内 13.2 哺 乳 动 物 卵 的 冻 存 与 精 子 和 胚 胎 相 比, 哺 乳 动 物 卵 的 冷 冻 保 存 仍 然 不 成 功 虽 然 已 有 一 些 动 物 如 小 鼠 (Surrey 等 1990;Shaw 等 1990;Friedler 等 1987;Massip 等 1984) 兔 子 (Diedrich 等 1986) 牛 (Niemann 1991) 和 人 (Quinn 等 1986;Trounson 1986) 卵 冻 存 成 功 的 报 道, 但 在 不 同 的 实 验 室, 其 冻 存 效 果 却 很 不 相 同 (Rall 1987;Massip 等 1986;Mazur 1984), 许 多 问 题 还 有 待 深 入 研 究 本 节 介 绍 以 我 国 常 用 的 实 验 动 物 昆 明 小 鼠 卵 的 冷 冻 方 法 (Men 等 1997) 13.2.1 低 浓 度 防 冻 剂 慢 速 程 控 降 温 法 在 室 温 下, 将 卵 依 次 移 到 含 0.5 1.0 1.5mol/dm 3 丙 二 醇 的 PB1( 见 表 13-5) 中 分 别 平 衡 5 分 钟 5 分 钟 和 10 分 钟, 然 后 封 装 于 含 1.5mol/dm 3 丙 二 醇 0.2mol/dm 3 蔗 糖 PB1/20 %FCS 溶 液 的 0.25ml 的 冷 冻 小 管 中, 在 0 下 平 衡 45 分 钟 后, 放 入 冷 冻 仪 (Planner KRYO10, USA) 实 行 程 控 降 温 冷 冻 冷 冻 步 骤 为 :1 以 每 分 钟 2 的 速 度 从 0 降 到 7 ;2 在 7 种 冰 后 平 衡 5 分 钟 ;3 以 每 分 钟 0.3 的 速 度 从 7 降 到 30 后, 迅 速 转 移 到 液 氮 中 保 存 1~ 4 周 后 在 37 水 浴 箱 中 复 苏 将 复 苏 后 的 卵 依 次 转 移 到 含 1.0mol/dm 3 丙 二 醇 0.2mol/dm 3 蔗 糖 /PB1 0.5mol/dm 3 丙 二 醇 0.2mol/dm 3 蔗 糖 /PB1 0.2mol/dm 3 蔗 糖 /PB1 液 中 分 别 平 衡 5 分 钟 后, 转 移 到 新 鲜 培 养 液 中 (Friedler 等 1987) 表 13-5 PB1 M2 和 M16 培 养 液
第 13 章 生 殖 生 物 技 术 在 动 物 迁 地 保 护 中 的 应 用 149 13.2.2 玻 璃 化 法 玻 璃 化 液 为 90% 的 VS1: 含 2.53mol/dm 3 的 二 甲 亚 砜,2.36mol/dm 3 的 乙 酷 胺,1.19mol /dm 3 的 丙 二 醇,5.4% 的 聚 乙 二 醇 (Mr = 6 000) 在 室 温 下, 将 卵 平 均 封 装 于 0.25ml 的 冷 冻 小 管 内, 直 接 投 入 液 氮 中 冻 存 1 周 后 在 0 的 冰 水 浴 中 复 苏 (Lassalie 等 1985) 13.3 胚 胎 的 冻 存 20 世 纪 50 年 代 初 期 的 胚 胎 低 温 冻 存 成 功 是 低 温 生 物 学 史 上 激 动 人 心 的 进 展 到 目 前 为 止, 已 有 十 几 种 哺 乳 动 物 的 胚 胎 被 成 功 冻 存 80 年 代 初 期, 玻 璃 化 冻 存 小 鼠 胚 胎 的 成 功 是 又 一 个 重 大 进 展 但 该 玻 璃 化 法 中 防 冻 液 较 复 杂, 而 且 毒 性 较 高, 要 求 在 4 条 件 下 操 作 近 十 几 年 的 研 究 中 已 寻 找 到 易 玻 璃 化 且 毒 性 较 低 的 防 冻 剂 乙 二 醇 (Ethylene glycol), 并 以 此 为 核 心 发 展 出 新 的 玻 璃 化 液 和 玻 璃 化 法 从 首 例 玻 璃 化 冻 存 小 鼠 胚 胎 成 功 以 来 (Rall,Fahy 1985), 玻 璃 化 冻 存 一 直 是 研 究 热 点 因 为 玻 璃 化 法 较 慢 速 降 温 法 简 单 省 时 经 济 玻 璃 化 是 一 种 液 体 不 经 过 结 冰 而 直 接 凝 固 的 现 象 从 理 论 上 讲, 玻 璃 化 冻 存 可 以 完 全 避 免 胚 胎 被 冰 晶 损 伤 但 由 于 要 玻 璃 化, 首 先 要 求 防 冻 剂 的 浓 度 不 能 太 低, 这 势 必 带 来 一 定 程 度 的 渗 透 压 损 伤 和 防 冻 剂 毒 性 损 伤 所 以, 选 用 毒 性 小 而 又 能 在 较 低 浓 度 条 件 下 实 现 玻 璃 化 的 防 冻 剂, 一 直 是 优 化 玻 璃 化 法 的 研 究 方 向 (Fahy 等 1987,1984) 对 几 种 防 冻 剂 的 玻 璃 化 特 性 及 毒 性 的 比 较 研 究 表 明 (Shelton 1993), 玻 璃 化 性 能 优 劣 的 顺 序 为 Butylene glycol(bg, 3.0mol/dm3)>Propylene glycol(pg,4.0mol/dm 3 )>DMSO (5.0mol/dm 3 )>Glycerol (Gly,5.0mol/dm 3 )>Ethylene glycol(eg,6.5mol/dm 3 ) 而 Methanol(Met) dextran (Dex) Ficoll(Fic) Polyethylene glycol(peg) 及 Polyvinyl pyrrolidone(pvp) 在 有 害 浓 度 下, 仍 不 能 实 现 玻 璃 化, 所 以 不 能 成 为 主 要 的 玻 璃 化 防 冻 剂 其 中 6 种 防 冻 剂 毒 性 的 大 小 顺 序 为 EG<Met<DMSO<Gly<PEG<BG 所 以, 尽 管 Met 被 认 为 是 渗 透 快 无 毒 性 的 有 效 防 冻 剂 (Rall 等 1984;Calonkowka 等 1991),BG 被 认 为 是 最 优 良 的 玻 璃 化 试 剂, 但 Met 和 BG 都 不 适 宜 充 当 玻 璃 化 防 冻 剂 同 时, 根 据 混 合 防 冻 剂 更 易 玻 璃 化 从 而 减 小 有 害 性 的 原 则,Ali 和 Shelton 设 计 并 比 较 了 几 种 玻 璃 化 液, 发 现 VS11 和 VS14(VS11:6.5mol/dm 3 EG, 1.8mol/dm 3 Gly;VS14:5.5mol/dm 3 EG,1.0moldm 3 Sucrose) 可 作 为 良 好 的 玻 璃 化 液, 其 中 VS14 的 毒 性 最 低, 胚 胎 在 室 温 下 VS14 中 平 衡 30 分 钟, 仍 无 毒 性 损 伤 而 此 前 的 标 准 玻 璃 化 液 已 成 功 地 用 于 小 鼠 桑 椹 胚 和 囊 胚 的 玻 璃 化 冻 存 (Zhu 等 1993;Rall,Wood 1994) 慢 速 降 温 法 要 求 使 用 较 低 浓 度 的 防 冻 液, 一 般 为 1.5mol/dm 3 的 甘 油 或 DMSO, 降 温 速 率 必 须 由 较 昂 贵 的 仪 器 来 控 制, 降 温 过 程 需 要 种 冰 (ice-seeding), 完 成 一 次 冻 存 需 要 较 长 的 时 间, 且 液 氮 消 耗 量 也 较 大 小 鼠 及 人 胚 的 慢 速 降 温 冻 存 结 果 优 于 家 畜, 猪 胚 的 冻 存 一 直 是 个 难 题, 因 为 猪 胚 对 温 度 和 防 冻 剂 都 很 敏 感 最 近 在 猪 胚 冻 存 上 取 得 突 破, 即 用 离 子 处 理 猪 胚 后, 用 显 微 操 作 技 术 把 胚 胎 中 的 脂 肪 吸 除, 然 后 用 常 规 的 慢 速 降 温 法 冻 存 经 此 法 冻 存 的 猪 胚 在 复 苏 后 其 存 活 率 和 受 孕 率 都 很 高 (Nagashima 等 1995) 慢 速 降 温 法 在 家 畜 胚 胎 冻 存 中 有 广 泛 的 应 用, 玻 璃 化 法 在 家 畜 胚 胎 冻 存 中 应 用 较 少, 而 且 结 果 也 不 太 理 想 本 节 提 供 一 种 经 典 的 慢 速 降 温 法 和 新 近 发 展 起 来 的 玻 璃 化 法, 供 参 考 使
150 遗 传 多 样 性 研 究 的 原 理 与 方 法 用 13.3.1 慢 速 降 温 法 慢 速 降 温 法 的 特 点 是 :1 防 冻 剂 浓 度 低, 一 般 为 1mol/dm 3 ;2 降 温 速 度 慢, 通 常 为 每 分 钟 降 0.1~0.3, 有 时 要 求 种 冰 (ice-seeding) 不 足 之 处 是 要 求 使 用 精 确 可 靠 的 昂 贵 的 微 机 降 温 仪 常 用 的 防 冻 剂 为 甘 油 丙 二 醇 和 DMSO 下 面 为 以 甘 油 作 防 冻 剂 的 标 准 化 程 控 降 温 慢 速 冷 冻 及 复 苏 步 骤 : (1) 在 冷 冻 管 中 加 入 0.1ml 0.25mol/dm 3 的 甘 油 防 冻 液 ( 用 培 养 液 或 稀 释 液 配 制 均 可 ) (2) 加 入 约 10~20 个 胚 胎, 在 37 5%CO2 的 培 养 箱 中 平 衡 20 分 钟 (3) 加 入 0.1ml 1.0mol/dm 3 的 甘 油 防 冻 液, 用 上 法 平 衡 40 分 钟 (4) 以 每 分 钟 2 的 速 度 从 室 温 降 至 7, 并 平 衡 15 分 钟 (5) 以 每 分 钟 0.3 的 速 度 从 7 降 至 35 (6) 将 冷 冻 管 投 入 液 氮 中 保 存 (7) 需 复 苏 时, 可 将 冷 冻 管 放 在 37 水 浴 箱 中 复 苏 (8) 在 10cm 的 培 养 皿 中 加 入 3ml 0.7mol/dm 3 的 蔗 糖 稀 释 液 (9) 将 冷 冻 胚 胎 连 同 防 冻 剂 一 道 转 移 到 上 述 培 养 皿 中 (10) 室 温 下 平 衡 30 分 钟 ( 用 稀 释 液 除 去 防 冻 剂 ) (11) 以 PBS 快 洗 3 次 (PBS 配 方 见 表 13-6) (12) 用 体 外 培 养 或 胚 胎 移 植 法 检 查 和 测 定 其 发 育 能 力 表 13-6 PBS 缓 冲 液 用 DMSO 或 丙 二 醇 作 防 冻 剂 时, 冷 冻 程 序 也 基 本 同 上, 只 是 用 丙 二 醇 作 防 冻 剂 时, 要 求 在 7 时 种 冰, 然 后 平 衡 10~15 分 钟 13.3.2 玻 璃 化 冻 存 法 玻 璃 化 法 虽 然 以 其 简 单 经 济 的 特 点 而 应 用 前 景 广 大, 但 由 于 玻 璃 化 液 的 毒 性, 目 前 该
第 13 章 生 殖 生 物 技 术 在 动 物 迁 地 保 护 中 的 应 用 151 法 尚 基 本 处 于 在 小 鼠 中 试 用 阶 段 以 下 是 毒 性 低 可 以 在 室 温 下 操 作 的 最 新 玻 璃 化 法 13.3.2.1 缓 冲 液 稀 释 液 玻 璃 化 液 的 配 制 (1) 缓 冲 液 PB1 PBS+5.56mmol/dm 3 glycose +0.33mmol/dm 3 pyruvate +100IU/ml penicillin G +3mg/ml BSA (2) 蔗 糖 溶 液 (S-PB1 稀 释 液 ) PB1 +0.5ml 稀 释 液 (3) 玻 璃 化 液 EFS(Ethylene glycol+ficoll+sucrose) PB1+40%( 体 积 比 )ethylene glycol +18%(W/V)Ficoll +0.3mol/dm 3 sucrose 先 配 制 FS: 3.51ml PB1 加 BSA +1.5g Ficoll 70(mw 70 000,Pharmacia,Sweden) +0.856g sucrose, 溶 解 过 滤 后 冷 存 再 配 制 EFS: 2V ethylene glycol+3v FS 混 匀 过 滤 后, 在 4 或 20 下 保 存 13.3.2.2 玻 璃 化 冻 存 的 复 苏 (1) 调 节 室 温 到 20, 并 使 所 有 的 溶 液 用 具 都 平 衡 到 这 一 温 度 (2) 把 straw 的 棉 塞 端 连 到 1ml 注 射 器 上, 如 图 13-1 所 示 分 别 装 入 各 种 溶 液 图 13-1 胚 胎 冷 冻 装 置 图 (3) 把 约 10 粒 胚 胎 转 移 到 EFS 中, 平 衡 2 分 钟
152 遗 传 多 样 性 研 究 的 原 理 与 方 法 (4) 将 胚 胎 迅 速 转 移 到 冷 冻 麦 管 中 如 图 13-1 所 示 封 装 ( 分 装 溶 液 和 胚 胎 于 麦 管 中, 是 本 法 之 技 术 难 点, 需 要 事 先 作 些 练 习 ) (5) 将 冷 冻 装 置 的 PVA 端 向 下, 迅 速 投 入 液 氮 中 实 现 玻 璃 化 (6) 将 冷 冻 装 置 连 同 液 氮 一 道 转 移 到 液 氮 罐 中 迅 速 冻 存 (7) 将 冷 冻 装 置 在 20 水 浴 中 复 苏 (8) 将 冷 冻 装 置 水 平 放 置, 剪 去 内 端 的 封 塞 (9) 让 防 冻 液 稀 释 液 连 同 胚 胎 一 道 流 入 盛 有 2ml 蔗 糖 溶 液 的 10cm 培 养 皿 中, 平 衡 5 分 钟 (10) 把 胚 胎 转 移 到 PB1 中 洗 2~3 次 (11) 把 存 活 胚 胎 转 移 到 M16 培 养 液 ( 表 13-5) 中 培 养 (37,5%CO2 ) 或 转 移 到 M2( 表 13-5) 中 进 行 胚 胎 移 植 玻 璃 化 成 败 的 关 键 在 于 操 作 迅 速 准 确 这 要 求 事 先 作 周 密 的 准 备, 使 全 部 溶 液 材 料 用 具 及 仪 器 都 到 位 待 用 13.4 体 外 授 精 和 胚 胎 移 植 体 外 授 精 是 指 授 精 过 程 在 动 物 生 殖 道 以 外 完 成 的 一 种 技 术 方 法 现 代 的 体 外 授 精 概 念 包 括 以 下 内 容 : 体 外 成 熟, 指 卵 母 细 胞 在 体 外 用 成 熟 培 养 液 在 一 定 的 条 件 下 完 成 成 熟 过 程 ; 体 外 授 精, 指 在 体 外 完 成 精 子 和 卵 子 的 结 合 过 程 ; 体 外 培 养, 指 受 精 卵 通 过 体 外 培 养, 在 体 外 完 成 着 床 前 的 某 一 发 育 阶 段 的 过 程 胚 胎 移 植 是 指 将 作 为 供 体 的 雌 性 动 物 的 受 精 卵 桑 椹 胚 或 囊 胚 由 输 卵 管 或 子 宫 角 内 冲 出, 移 植 到 雌 性 受 体 的 输 卵 管 或 子 宫 角 内, 使 其 发 育 成 正 常 子 代 的 过 程 目 前 所 指 的 胚 胎 移 植 通 常 包 括 超 数 排 卵 取 胚 和 胚 胎 移 植 等 步 骤 胚 胎 移 植 依 据 动 物 种 类 的 不 同 又 可 分 为 手 术 移 植 和 非 手 术 移 植 下 面 将 分 别 介 绍 这 两 种 移 植 及 体 外 授 精 方 法 13.4.1 手 术 法 胚 胎 移 植 灵 长 类 动 物 的 胚 胎 移 植 成 功 的 报 道 不 多, 现 以 较 为 成 功 的 猕 猴 (Macaca mulatta) 为 例 (Wolf 等 1989) 作 一 介 绍 13.4.1.1 卵 的 体 内 成 熟 体 外 授 精 (IVF) 及 体 外 胚 胎 培 养 (IVC) 1. 超 数 排 卵 及 卵 的 收 集 具 有 正 常 月 经 周 期 (28 天 左 右 ) 的 雌 性 成 年 母 猴 在 月 经 开 始 的 第 一 天, 即 手 术 前 第 9 天 至 手 术 前 第 2 天 : (l) 用 30IU FSH(Laboratories Serono,USA) 注 射, 每 天 2 次 (2) 手 术 前 2 天 注 射 30lU FSH+30IU LH(Laboratories Serono,USA), 每 天 2 次 手 术 前 2 天 : (1) 检 查 手 术 器 件 培 养 用 的 矿 物 油 培 养 箱 气 罐 (2) 检 查 所 需 培 养 液 原 液 TL-Hepes,TL 及 改 进 的 CMRL 液 ( 见 表 13-7 至 表 13-9)
第 13 章 生 殖 生 物 技 术 在 动 物 迁 地 保 护 中 的 应 用 153 表 13-7 TL-Hepes 的 配 制 注 :(1) 培 养 时 加 入 谷 氨 酸 丙 酮 酸 和 血 清 ( 见 实 验 部 分 );(2) 将 配 制 好 的 培 养 液 混 匀 后, 调 节 渗 透 压 至 290±5Pa, 或 从 培 养 液 中 取 出 7.5ml, 换 进 7.5ml 水, 混 匀 手 术 前 1 天 : (1) 超 声 波 检 测 猴 卵 巢 ( 确 定 卵 巢 对 激 素 已 有 相 应 的 反 应 ) (2) 注 射 2 000IU 的 人 绒 毛 膜 激 素 (hcg) (3) 检 测 培 养 箱 中 气 体 及 温 度 情 况 (4) 配 制 改 进 的 CMRL-1066 培 养 液 ( 贮 存 在 4 冰 箱 可 使 用 8 天 )
154 遗 传 多 样 性 研 究 的 原 理 与 方 法 (5) 将 下 列 试 剂 混 合 后 置 于 4 冰 箱 中 过 夜 10ml TL(2 支 ) 40ml TL-Hepes(1 支 ) 187.5ml TL-Hepes(1 瓶 / 猴 ) (6) 动 物 在 手 术 前 16~24 小 时 禁 食, 术 前 6 小 时 禁 水 手 术 当 天 : (1) 将 1 支 2ml 的 小 牛 血 清 (BCS) 和 1 支 10ml 的 小 牛 血 清 混 合, 并 在 56 水 浴 箱 中 灭 活 25 分 钟 (2) 配 制 获 能 培 养 液 IVF 培 养 液 洗 精 子 培 养 液 卵 收 集 和 清 洗 培 养 液, 配 制 方 法 见 表 13-10 (3) 制 备 2 个 获 能 培 养 皿 (35mm 培 养 皿 中 加 2ml 获 能 培 养 液 +2ml 矿 物 油 ) 和 1 个 获 能 培 养 皿 (35mm 培 养 皿,2ml 获 能 培 养 液 ), 在 培 养 箱 中 平 衡 1 小 时 以 上 培 养 箱 中 CO2 含 量 为 5% (4) 制 作 49µl 胚 胎 培 养 滴 (35mm 培 养 皿 中 加 入 3.5ml 矿 物 油 ), 放 在 培 养 箱 中 平 衡 1 小 时 以 上 (5) 制 作 94µl 授 精 培 养 滴 (35mm 培 养 皿 中 加 入 3.5ml 矿 物 油 ), 放 在 培 养 箱 中 平 衡 1 小 时 以 上 (6) 采 集 精 液 并 清 洗 ( 方 法 见 下 文 ) 将 精 子 置 于 获 能 培 养 液 中, 在 培 养 箱 内 获 能 (20 10 6 个 /ml,5%co2)2 小 时 以 上 (7) 做 好 手 术 准 备 (8) 在 12 支 10ml 的 试 管 内 分 别 加 入 1ml 卵 收 集 及 清 洗 培 养 液, 于 37 下 保 温 (9) 手 术 ( 注 射 hcg28~30 小 时 后 吸 卵 ) (10) 授 精 前 1 小 时, 加 40µl 咖 啡 因 和 4Oµl dbcamp 原 液 于 2ml 的 精 子 获 能 培 养 液 中 (11)hCG 注 射 后 35~36 小 时, 检 查 卵 的 极 体, 将 MII 期 ( 不 包 含 GV 期 ) 卵 放 入 授 精 滴 (5 个 / 滴 ), 每 滴 加 入 2µl 咖 啡 因 和 2µl dbcamp 原 液 (12) 在 授 精 滴 中 加 入 2µl/ 滴 的 稀 释 精 液 表 13-10 猕 猴 IVM( 体 外 成 熟 ) IVF ( 体 外 授 精 ) 及 IVC( 体 外 胚 胎 培 养 ) 液 的 制 备 2. 体 外 授 精
第 13 章 生 殖 生 物 技 术 在 动 物 迁 地 保 护 中 的 应 用 155 手 术 后 第 1 天 至 实 验 结 束 : (1) 溶 解 2mlBCS, 置 56 水 浴 箱 中 灭 活 25 分 钟 (2) 配 制 胚 胎 培 养 皿 (35mm 培 养 皿,49µl 培 养 液 十 3.5ml 矿 物 油 ), 置 培 养 箱 内 平 衡 1 小 时 以 上 ( 培 养 箱 内 含 5%CO2 和 5%O2) (3) 授 精 后 12~I3 小 时 检 查 卵 原 核 (4) 把 受 精 卵 放 入 胚 胎 培 养 皿 内 (5) 每 24 小 时 观 察 一 次 胚 胎 发 育 情 况, 直 至 胚 胎 发 育 停 止 每 48 小 时 需 换 新 鲜 培 养 液 ( 配 制 的 新 鲜 培 养 液 贮 存 于 4 冰 箱 内 可 用 8 天 ) 3. 猕 猴 精 子 的 制 备 及 体 外 授 精 (1) 制 备 获 能 培 养 皿 (35mm 培 养 皿 中 加 入 2ml 获 能 培 养 液 十 2ml 硅 油 ), 放 入 培 养 箱 内 平 衡 1 小 时 (2) 用 电 刺 激 采 精 法 将 精 液 收 集 到 预 先 温 热 的 15ml 离 心 管 内, 在 37 水 浴 箱 中 放 25 分 钟 (3) 记 录 精 液 体 积 (4) 取 10µl 精 液 加 入 990µl 双 蒸 水 (1:100) 中 作 精 子 记 数 (5) 估 计 精 子 活 力 : 取 10µl 精 液, 加 入 90µl 洗 精 子 培 养 液 (ph 值 7.4,37 ), 混 匀 后 取 20µl 放 到 预 先 温 热 (37 ) 的 硅 化 载 玻 片 上, 用 20mm 20mm 的 硅 化 盖 玻 片 覆 盖, 于 倒 置 显 微 镜 下 观 察 精 子 存 活 百 分 率 和 活 动 度 注 意 未 成 熟 的 和 异 常 的 精 子 如 果 精 子 存 活 率 <80%, 则 不 能 用 于 授 精 (6) 用 1ml 移 液 管 把 精 液 放 入 含 有 10ml 洗 精 子 培 养 液 (ph 值 7.4, 室 温 下 ) 的 15ml 离 心 管 内, 轻 柔 地 混 匀, 再 分 装 在 2 支 15ml 离 心 管 (5ml/ 支 ) 中, 以 500r/min 离 心 5 分 钟 (7) 迅 速 将 离 心 后 的 上 清 液 吸 弃, 轻 柔 地 打 散 精 子 团 (8) 把 精 液 放 入 含 有 10ml 新 鲜 洗 精 子 培 养 液 的 15ml 离 心 管 中, 混 匀, 然 后 分 装 至 2 支 15ml(5ml/ 支 ) 离 心 管 中 离 心, 离 心 后 吸 除 上 清 液, 把 2 支 离 心 管 中 的 精 液 合 并, 记 录 精 液 量 (9) 每 10µl 精 液 中 加 入 990µl 的 双 蒸 水 (1:100), 用 记 数 板 立 即 进 行 精 子 记 数 (10) 按 20 10 6 /ml 的 浓 度 把 稀 释 的 精 液 加 入 预 先 平 衡 的 获 能 培 养 皿 (2ml 获 能 培 养 液 十 2ml 硅 油,35mm 培 养 皿 ) 内, 放 在 培 养 箱 平 衡 2 小 时 以 上 (11) 授 精 前 1 小 时 加 40µl 咖 啡 因 和 40µl dbcamp 于 授 精 培 养 皿 内 终 浓 度 =1.0m mol /dm 3 (12) 观 察 获 能 培 养 皿 中 精 子 的 超 活 化 (13) 加 2µl 咖 啡 因 和 2µldbcAMP 于 授 精 培 养 滴 内 (14) 取 100µl 非 聚 集 的 精 子, 加 入 含 有 300µl 获 能 培 养 液 的 组 织 培 养 皿 内, 然 后 取 2µl 精 子 悬 液 加 入 94µl 含 有 卵 母 细 胞 的 受 精 培 养 滴 内 此 时 精 子 在 培 养 滴 内 的 终 浓 度 为 1 10 6 个 /ml TL 和 TL-Hepes 需 提 前 配 制, 冷 冻 贮 存 下 ( 低 于 20 ) 可 使 用 1 个 月, 咖 啡 因 原 液 冻 存 可 使 用 4 个 月 实 验 当 天 在 TL TL-Hepes 液 中 分 别 加 入 丙 酮 酸 盐 和 BSA, 配 制 成 TALP 和 TALP-Hepes 培 养 液 4. 原 液 的 配 制 (1) 100mmol/dm 3 dbcamp:3mg dbcamp 溶 于 122µl 157mmol/dm 3 NaCl 中
156 遗 传 多 样 性 研 究 的 原 理 与 方 法 (2)100mmol/dm 3 咖 啡 因 :97mg 咖 啡 因 溶 于 10ml 157mmol/dm 3 NaCl 中,200µl/ 支 分 装 冻 存 (3)100mmol/dm 3 丙 酮 酸 :11mg 丙 酮 酸 溶 于 1ml 157mmol/dm 3 NaCl 中 (4)100mmol/dm 3 谷 氨 酚 胺 :14.6mg 谷 氨 酰 胺 溶 于 1ml 157mmol/dm 3 NaCl 中 除 咖 啡 因 外, 其 余 原 液 均 必 须 在 实 验 当 天 配 制 13.4.1.2 体 外 成 熟 体 外 授 精 及 体 外 胚 胎 培 养 具 有 正 常 月 经 周 期 (28 天 左 右 ) 的 雌 性 成 年 母 猴 在 月 经 开 始 的 第 一 天, 即 手 术 前 第 8 天 至 手 术 前 1 天, 每 天 注 射 30lU FSH(Metrodin)2 次 手 术 前 1 天 的 做 法 与 13.4.1.1 中 超 数 排 卵 及 卵 的 收 集 中 做 法 相 同 手 术 当 天 : (1) 将 1 支 2ml 和 1 支 10ml 的 小 牛 血 清 (BCS) 混 合 后, 在 56 水 浴 箱 内 灭 活 25 分 钟 (2) 制 备 10ml 体 外 成 熟 培 养 液 和 200ml 卵 母 细 胞 收 集 及 清 洗 培 养 液 (3) 制 作 49µl 体 外 成 熟 培 养 滴 (35mm 培 养 皿 中 加 3.5ml 矿 物 油 ), 置 培 养 箱 中 平 衡 1 小 时 以 上 培 养 箱 内 CO2 浓 度 为 5% (4) 手 术 准 备 (5) 在 12 支 10ml 的 试 管 中 分 别 加 入 1ml 卵 收 集 液 和 清 洗 培 养 液 后, 将 试 管 置 于 37 下 保 温 (6) 手 术 ( 与 最 后 一 次 注 射 FSH 时 间 间 隔 12~16 小 时 后, 吸 卵 ) (7) 将 卵 母 细 胞 用 卵 收 集 液 和 清 洗 培 养 液 清 洗 后, 放 入 成 熟 培 养 滴 中 培 养 36~38 小 时 (8) 将 10ml TL(2 支 ) 及 40ml TL-Hepes (1 支 ) 在 4 冰 箱 中 放 过 夜 手 术 后 第 1 天 : (1) 将 1 支 5ml 的 小 牛 血 清 于 56 水 浴 箱 内 灭 活 25 分 钟 (2) 制 备 获 能 培 养 液 授 精 培 养 液 及 洗 精 子 培 养 液 (3) 制 作 2 个 获 能 培 养 皿 (35mm 培 养 皿 中 加 2ml 获 能 培 养 液 +2ml 矿 物 油 ) 和 1 个 获 能 培 养 皿 (35mm 培 养 皿 中 加 2ml 获 能 培 养 液 ), 放 培 养 箱 中 平 衡 (5%CO2)1 小 时 以 上 (4) 制 作 94µl 的 授 精 培 养 滴 (35mm 培 养 皿 中 加 3.5ml 矿 物 油 ), 置 培 养 箱 中 平 衡 1 小 时 (5%CO2 ) 以 上 (5) 收 集 精 液 并 清 洗, 将 精 子 滴 于 获 能 培 养 液 中, 在 培 养 箱 中 获 能 (20 10 6 个 /ml,5 %CO2)2 小 时 以 上 (6) 授 精 前 1 小 时 将 40µl 咖 啡 因 和 40µl dbcamp 加 于 2ml 的 精 子 获 能 培 养 液 中 (7) 当 卵 在 成 熟 培 养 滴 中 培 养 35~36 小 时 后, 检 查 卵 的 极 体, 将 MII 期 ( 不 包 含 GV 期 ) 卵 放 入 授 精 滴 (5 个 / 滴 ), 再 在 每 滴 中 加 入 2µl 咖 啡 因 和 2µl 的 dbcamp (8) 加 入 2µl/ 滴 的 稀 释 精 液 于 授 精 滴 中 手 术 后 第 2 天 至 实 验 结 束 : (1) 将 2ml BCS 于 56 水 浴 箱 内 灭 活 25 分 钟 (2) 配 制 胚 胎 培 养 皿 (35mm 培 养 皿 中 加 49µl 培 养 液 十 3.5ml 矿 物 油 ), 将 培 养 皿 放 入 培 养 箱 中 平 衡 1 小 时 (5%CO2,5%O2) 以 上 (3) 检 查 受 精 后 12~13 小 时 的 卵 的 原 核 (4) 把 受 精 卵 放 入 胚 胎 培 养 滴 (5%CO2,5%O2) 内
第 13 章 生 殖 生 物 技 术 在 动 物 迁 地 保 护 中 的 应 用 157 (5) 每 24 小 时 观 察 一 次 胚 胎 发 育 情 况, 直 至 胚 胎 发 育 停 止 每 48 小 时 需 换 一 次 新 鲜 培 养 液 ( 配 制 好 的 新 鲜 培 养 液 贮 存 于 4 冰 箱 可 用 8 天 ) 13.4.1.3 胚 胎 移 植 胚 胎 移 植 即 将 新 鲜 胚 胎 移 植 到 性 周 期 同 步 化 的 受 体 猕 猴, 或 将 胚 胎 冷 冻 保 存 后 移 植 给 自 然 发 情 的 受 体 猕 猴 移 植 时 要 注 意 胚 胎 与 受 体 子 宫 的 生 理 环 境 要 同 步 首 先 用 氯 胺 酮 麻 醉 受 体 猕 猴, 再 通 过 手 术 方 法 暴 露 其 子 宫 用 一 后 端 连 有 注 射 器 的 硅 化 玻 璃 细 管 吸 取 3~5µl PBS-PVA 缓 冲 液 ( 表 13-6), 内 含 1~2 粒 胚 胎 将 细 管 插 入 紧 临 输 卵 管 和 子 宫 结 合 部 的 子 宫 内 2~3cm 深 处 通 过 轻 轻 推 动 注 射 器, 将 胚 胎 连 同 极 少 量 培 养 液 送 入 子 宫 将 子 宫 位 置 复 原 后 分 层 缝 合 腹 部 13.4.2 非 手 术 法 胚 胎 培 养 和 移 植 牛 的 胚 胎 移 植 现 常 用 超 数 排 卵 授 精 法 当 胚 胎 在 体 内 发 育 到 囊 胚 后, 以 冲 洗 法 取 得 胚 胎 进 行 移 植, 或 从 屠 宰 场 获 取 牛 卵 巢 中 的 卵 进 行 体 外 培 养 成 熟 体 外 授 精, 培 养 发 育 至 囊 胚 后 进 行 移 植 这 里 介 绍 从 屠 宰 场 取 卵 巢 获 得 卵 进 行 体 外 培 养 的 方 法 13.4.2.1 牛 卵 母 细 胞 体 外 成 熟 体 外 授 精 及 体 外 胚 胎 培 养 1. 体 外 成 熟 (1) 实 验 当 天 配 制 所 需 培 养 液 :0.9% 的 生 理 盐 水 3L( 用 于 清 洗 卵 巢 );BM-Hepes 培 养 液 ( 成 分 见 表 13-11)100ml( 用 于 吸 卵 ) 将 上 述 溶 液 放 入 37 下 温 育 表 13-11 BM-Hepes(mBM-Hepes) 培 养 液 注 :mbm-hepes 是 不 含 乳 酸 的 BM-Hepes 培 养 液 于 4 贮 存 可 保 存 2 星 期, 20 冻 存 可 保 存 2 个 月
158 遗 传 多 样 性 研 究 的 原 理 与 方 法 配 制 成 熟 培 养 液, 制 作 成 熟 培 养 滴 (60mm 培 养 皿 中 先 加 25µl 成 熟 培 养 液, 再 加 10ml 矿 物 油, 再 加 25µl 成 熟 培 养 液 ), 最 终 制 成 每 滴 50µl 的 成 熟 培 养 滴, 放 于 培 养 箱 内 平 衡 (5%CO2 39 )2 小 时 (2) 吸 卵 准 备 : 在 工 作 区 域 内 覆 盖 白 色 吸 水 纸 将 抽 吸 塞 插 入 50ml 离 心 管 口 ( 此 活 塞 被 1 支 玻 璃 管 和 2 个 针 头 从 中 穿 过 ), 把 其 余 的 50ml 离 心 管 置 于 泡 沫 塑 料 垫 中, 放 在 37 温 玻 台 上 抽 吸 针 与 活 塞 上 的 玻 璃 管 相 接,2µm 的 Millivex gv 滤 器 与 针 头 相 接 (3) 当 卵 巢 从 屠 宰 场 被 送 到 实 验 室 时, 用 温 度 计 测 卵 巢 的 温 度 并 把 其 倒 入 37 生 理 盐 水 的 烧 杯 中 清 洗 2 次, 将 血 水 洗 尽 随 后, 把 卵 巢 保 存 于 盛 有 生 理 盐 水 的 烧 杯 中, 将 烧 杯 置 于 温 玻 台 上 (4) 抽 吸 卵 巢 中 所 有 的 滤 泡 每 支 离 心 管 中 装 入 30ml 滤 泡 液 后, 将 离 心 管 置 于 37 温 玻 台 上 的 泡 沫 塑 料 垫 上 如 果 此 时 抽 吸 针 已 钝, 可 改 换 新 针 当 抽 吸 完 成 后, 把 温 育 的 BM-HEP-ES 培 养 液 和 装 有 滤 泡 液 的 离 心 管 拿 进 培 养 间 (5) 所 有 操 作 步 骤 都 应 尽 快 完 成 含 有 卵 母 细 胞 或 胚 胎 的 培 养 皿 应 尽 可 能 地 在 温 玻 台 上 进 行 操 作, 并 且 所 有 的 卵 母 细 胞 胚 胎 和 培 养 皿 从 培 养 箱 取 出 操 作 的 时 间 应 控 制 在 最 短, 培 养 箱 的 开 门 次 数 开 门 时 间 和 开 门 的 大 小 都 应 控 制 在 最 小 数 量 (6) 实 验 准 备 :60mm 培 养 皿 1 个 35mm 培 养 皿 3 个 几 个 格 子 培 养 皿 1 支 drummond 微 量 加 样 器 和 加 样 头,1 个 希 尔 球 和 1 个 消 毒 的 Pasteur 吸 管 (7) 卵 培 养 : 把 套 有 希 尔 球 的 Pasteur 吸 管 放 入 50ml 离 心 管 底 部, 将 抽 吸 出 的 沉 积 物 放 入 方 格 培 养 皿 中, 并 加 入 mbm-hepes( 表 13-11), 晃 动 混 匀 在 drummond 微 量 加 样 器 上 套 上 消 过 毒 的 枪 头, 把 方 格 培 养 皿 置 于 显 微 镜 下, 用 加 样 器 吸 找 卵 母 细 胞 选 出 至 少 有 3 层 以 上 致 密 颗 粒 细 胞 包 围 胞 浆 均 匀 的 卵 母 细 胞 将 选 出 的 卵 移 入 装 有 mbm-hepes 的 35mm 培 养 皿 上 抽 吸 其 他 离 心 管 中 沉 积 物, 重 复 这 一 步 骤 第 1 次 抽 吸 完 成 后 的 所 有 离 心 管 均 需 进 行 第 2 次 抽 吸 当 所 有 的 卵 母 细 胞 已 收 集 到 35mm 培 养 皿 上 后, 换 新 的 drummond 枪 头, 并 将 卵 母 细 胞 吸 入 装 有 mbm-hepes 的 3 个 35mm 培 养 皿 中 清 洗 3 次 随 后, 从 培 养 箱 内 取 出 已 平 衡 的 成 熟 培 养 液 ( 表 13-12) 的 培 养 皿, 把 卵 母 细 胞 移 入 培 养 滴, 每 滴 放 10 个 卵 细 胞 ( 尽 可 能 地 少 吸 进 mbm-hepes) 尽 快 将 培 养 皿 放 回 培 养 箱 表 13-12 牛 卵 体 外 成 熟 (IVM) 培 养 液 (8) 用 70% 酒 精 清 洗 显 微 镜 台 和 抽 吸 工 作 台 温 玻 台 用 双 蒸 水 酒 精 及 超 纯 水 分 别 清 洗 抽 吸 活 塞 后, 将 活 塞 放 于 温 箱 内 干 燥 高 压 消 毒 后 待 用 (9) 需 记 录 的 数 据 :1 卵 巢 到 达 时 间 和 温 度 ;2 生 理 盐 水 的 温 度 ;3 抽 吸 开 始 的 时 间 和 结 束 的 时 间 ;4 卵 母 细 胞 移 入 成 熟 培 养 液 的 时 间 ;5 收 集 的 卵 母 细 胞 数 量 ;3 成 熟 的 方 法, 即
第 13 章 生 殖 生 物 技 术 在 动 物 迁 地 保 护 中 的 应 用 159 所 采 用 的 培 养 液 2. 体 外 授 精 (1) 授 精 当 天 上 午 配 制 5ml 授 精 培 养 液 ( 表 13-13, 表 13-14) 10ml 洗 精 子 培 养 液 ( 表 13-15, 表 13-16) 和 50ml BM-Hepes 培 养 液, 并 打 开 温 玻 台 或 水 浴 箱 开 关, 将 洗 精 子 培 养 液 和 BM-Hepes 进 行 温 育 制 作 授 精 培 养 滴 (60mm 培 养 皿 中 加 22µl 授 精 培 养 液 十 10ml 矿 物 油 十 22µl 授 精 培 养 液 ), 还 需 加 6µl 精 子 及 其 他 物 质, 最 终 培 养 滴 大 小 为 每 滴 50µl 将 授 精 培 养 皿 放 入 培 养 箱 平 衡 (5%CO2 39 )2 小 时 表 13-13 牛 体 外 授 精 培 养 液 原 液
160 遗 传 多 样 性 研 究 的 原 理 与 方 法 表 13-14 牛 体 外 授 精 培 养 液 表 13-15 牛 精 子 清 洗 培 养 液 原 液 注 : 分 别 把 1ml 原 液 A 原 液 B 原 液 D 和 0.1ml 原 液 C 与 6.9ml 水 混 匀 后, 混 合 液 渗 透 压 应 为 290~300Pa
第 13 章 生 殖 生 物 技 术 在 动 物 迁 地 保 护 中 的 应 用 161 表 13-16 牛 精 子 清 洗 培 养 液 (2) 将 卵 母 细 胞 在 成 熟 培 养 基 上 培 养 22~24 小 时 后 再 进 行 授 精 授 精 前 1.5 小 时 从 温 箱 中 取 出 精 子 培 养 基, 倒 1~4ml 至 加 盖 试 管 内 另 从 液 氮 罐 中 取 出 2 支 冻 精 小 管, 迅 速 地 放 入 37 水 浴 箱 中 融 解 1 分 钟 后 取 出, 用 吸 水 纸 将 水 擦 干, 剪 断 封 口, 把 此 端 置 入 4ml 的 加 盖 试 管, 再 剪 断 另 一 端, 使 精 液 全 部 流 出 取 200µl 精 液 放 入 含 有 1ml 洗 精 子 培 养 液 的 试 管 底 部 将 试 管 盖 紧, 放 入 37 水 浴 箱 内 水 浴 1 小 时 (3) 这 段 时 间 内, 将 成 熟 培 养 皿 从 培 养 箱 取 出, 用 消 过 毒 的 drummond 微 量 加 样 枪 把 卵 母 细 胞 从 成 熟 培 养 滴 移 入 含 有 2~3ml 温 育 过 的 BM-Hepes 的 35mm 培 养 皿 内 轻 轻 晃 动 培 养 皿, 清 洗 卵 母 细 胞, 重 复 清 洗 3 次 把 授 精 培 养 皿 从 培 养 箱 取 出, 将 卵 母 细 胞 移 入 授 精 培 养 滴 ( 尽 可 能 少 吸 培 养 液 ) 后, 放 回 培 养 箱 (4)1 小 时 后, 从 水 浴 箱 中 取 出 含 有 精 液 的 试 管 用 pipetman 加 样 枪 从 试 管 中 取 出 800µl 上 清 液 放 入 1 支 15ml 离 心 管 中 离 心 5 分 钟 (1200r/min) 这 时, 可 把 肝 素 ( 20 下 冻 存 ) 和 PHE( 80 下 冻 存 ) 从 冰 箱 取 出 化 冻 (5) 弃 除 离 心 后 的 上 清 液, 加 3ml 温 育 过 的 洗 精 子 培 养 液, 再 离 心 5 分 钟 其 间 准 备 精 子 计 数 板 离 心 完 成 后, 弃 除 上 清 液, 并 把 精 子 混 匀 (6) 从 离 心 后 的 精 液 中 取 出 5µl, 放 入 加 有 95µl 超 纯 水 的 微 量 离 心 管 中 混 匀, 制 成 1: 20 稀 释 浓 度 换 新 的 加 样 枪 头, 分 别 取 10µl 1:20 稀 释 浓 度 的 精 液 加 入 计 数 板 的 两 个 计 数 池, 每 池 计 数 5 个 小 方 格, 将 两 个 池 中 所 得 的 计 数 值 平 均, 再 去 除 7 500, 此 值 为 所 需 精 子 原 液 的 微 升 数 用 300 减 去 所 需 精 子 的 微 升 数, 即 为 加 入 授 精 培 养 液 的 微 升 数, 这 样, 使 稀 释 后 精 子 稀 释 液 总 量 为 300µl 计 算 值 是 根 据 1:20 的 稀 释 度 得 出 的 将 稀 释 后 的 精 液 按 每 2µl 加 入 50µl 授 精 滴 后, 此 时 精 子 的 终 浓 度 为 10 6 个 /ml 例 如 : 计 数 池 1= 138 计 数 池 2= 152 平 均 = 145 7500 145= 51.7µl 精 子 原 液 300 51.7= 248.3µl 授 精 培 养 液 如 果 精 子 原 液 不 够 配 制 成 300µl 稀 释 液, 可 将 上 述 配 制 数 量 减 半, 配 制 成 150µl 精 子 稀 释 液 (7) 按 计 算 出 的 量 将 所 需 授 精 培 养 液 放 入 一 个 已 消 毒 的 小 微 量 离 心 管, 再 按 计 算 值 加 进 精 子 原 液, 混 匀, 并 与 肝 素 和 PHE 一 起 放 于 温 玻 台 上
162 遗 传 多 样 性 研 究 的 原 理 与 方 法 (8) 从 培 养 箱 取 出 授 精 培 养 皿, 放 于 温 玻 台 上, 用 drummond 微 量 加 样 枪 在 每 培 养 滴 中 分 别 加 入 2µl 的 稀 释 精 液 肝 素 和 PHE 随 后 将 培 养 皿 放 回 培 养 箱 清 洁 工 作 台, 记 录 卵 母 细 胞 移 入 授 精 滴 的 时 间 精 子 计 数 稀 释 浓 度 和 精 子 加 入 授 精 培 养 液 的 时 间 3. 体 外 胚 胎 培 养 (1) 合 子 的 出 现 大 约 在 授 精 后 18 小 时 授 精 当 天 配 制 HECM-6 胚 胎 培 养 液, 加 入 11 种 氨 基 酸 ( 表 13-17, 表 13-18;60mm 培 养 皿,25µl 培 养 液 十 矿 物 油, 再 加 1 次 25µl 培 养 液 ), 放 入 培 养 箱 平 衡 (5%CO2 10%O2 39 )2 小 时 再 配 制 20ml BM-Hepes, 迅 速 温 育 表 13-17 HECM-6 培 养 液 注 : 配 制 溶 液 时 必 须 先 加 PVA(polyvinyl alcohol), 待 其 溶 解 2~4 分 钟 后 再 加 其 他 溶 剂 表 13-18 11 种 氨 基 酸 (11AA) 原 液 (100 倍 ) 注 : 将 此 液 分 装 于 4ml 的 试 管 中, 冻 存 于 20 或 80 下 可 保 存 2 个 月 (2) 将 授 精 培 养 皿 从 培 养 箱 取 出, 尽 可 能 将 其 放 于 温 玻 台 上 取 1ml BM-Hepes 液 倒 于 15ml 离 心 管 内, 并 把 受 精 卵 吸 入 管 中, 振 动 2 分 钟, 把 颗 粒 细 胞 打 散, 再 加 入 4ml BM-Hepes 液, 盖 上 离 心 管, 旋 转, 使 之 混 匀 (3) 把 离 心 管 内 容 物 倒 入 30mm 的 培 养 皿 上, 取 出 受 精 卵, 将 其 再 放 入 另 一 个 含 有 3ml
第 13 章 生 殖 生 物 技 术 在 动 物 迁 地 保 护 中 的 应 用 163 新 鲜 BM-Hepes 的 30mm 培 养 皿 上 将 胚 胎 培 养 皿 从 培 养 箱 取 出, 把 受 精 卵 移 入 培 养 滴 10 个 滴, 迅 速 将 培 养 皿 放 回 培 养 箱 (4) 记 录 所 有 培 养 液 和 受 精 卵 放 入 培 养 滴 的 时 间 (5) 授 精 后 第 4 天, 配 制 TCM199+10% 小 牛 血 清 培 养 液 制 作 培 养 滴 (25µl 培 养 液 十 矿 物 油, 再 加 25µl 培 养 液 ), 放 入 培 养 箱 平 衡 2 小 时 迅 速 将 胚 胎 移 至 TCM199 培 养 皿 中, 并 将 培 养 皿 放 回 培 养 箱 记 录 换 液 的 时 间 和 日 期 (6) 授 精 后 第 8 天, 把 胚 胎 培 养 皿 从 培 养 箱 取 出, 记 录 胚 胎 分 裂 和 发 育 情 况 记 录 项 目 如 下 : 1 2 4 8 12 16 个 细 胞 致 密 的 桑 椹 胚 (compact morula,cm) 早 期 囊 胚 (early blastocyst,eb) 囊 胚 (blastocyst,b) 扩 展 囊 胚 (expanded blastocyst,xb) 正 在 孵 出 / 孵 出 的 囊 胚 (hatching/hatched blastocyst,hb) 从 早 期 囊 胚 至 囊 胚 期 按 质 量 好 坏 可 分 为 1~4 个 等 级,1 级 为 发 育 完 好 的 囊 胚 13.4.2.2 非 手 术 法 胚 胎 移 植 通 过 直 肠 把 握 法, 用 Cassou 枪 将 待 移 植 胚 胎 导 入 卵 巢 有 黄 体 侧 的 子 宫 角 内, 将 胚 胎 置 入 子 宫 角 即 完 成 胚 胎 移 植 过 程 3 个 月 后 直 肠 检 查 受 体 牛 的 受 孕 情 况 13.5 单 精 子 注 射 授 精 单 精 子 注 射 授 精 是 利 用 显 微 操 作 技 术, 将 单 个 精 子 注 射 到 围 卵 腔 或 卵 细 胞 质 而 达 到 精 卵 结 合 完 成 授 精 过 程 的 一 项 技 术 此 技 术 是 近 年 来 发 展 起 来 的 一 种 辅 助 授 精 手 段, 在 研 究 授 精 机 制 和 解 决 部 分 雄 性 不 育 问 题 上 起 到 一 定 的 作 用 单 精 子 注 射 授 精 能 有 效 地 利 用 动 物 的 精 子, 在 珍 稀 野 生 动 物 的 保 护 中 也 将 起 到 积 极 作 用 目 前 小 鼠 和 人 的 单 精 子 注 射 授 精 技 术 已 日 趋 成 熟 下 面 以 小 鼠 (Mus musculus) 的 单 精 子 注 射 授 精 为 例 对 此 技 术 加 以 介 绍 (Gordon 1993) 13.5.1 材 料 配 有 Nomarski 微 分 干 涉 系 统 的 倒 置 显 微 镜, 显 微 操 作 系 统, 玻 璃 针 制 作 工 具 细 管 拉 制 仪 (pipette puller), 玻 璃 针 碾 磨 器 (needle grinder) 和 微 锻 造 仪 (microforge), 体 视 显 微 镜 等 所 需 化 学 试 剂 及 配 方 见 表 13-9 13.5.2 方 法 取 外 径 为 1mm 内 径 为 0.8mm, 长 12cm 左 右 的 玻 璃 管, 按 如 下 步 骤 加 工 注 射 用 玻 璃 针 : (1) 在 细 管 拉 制 仪 上 拉 制 成 玻 璃 针 (2) 用 微 锻 造 仪 在 玻 璃 针 尖 端 将 玻 璃 针 端 部 断 成 齐 口, 断 口 位 置 内 径 约 可 允 许 3 个 精 子 同 时 进 入
164 遗 传 多 样 性 研 究 的 原 理 与 方 法 (3) 将 玻 璃 针 固 定 在 碾 磨 器 上, 并 与 碾 磨 器 平 面 呈 30 ~35 的 夹 角, 将 玻 璃 针 断 口 处 加 工 成 斜 面 (4) 将 磨 好 的 玻 璃 针 再 固 定 在 微 锻 造 仪 上, 针 尖 与 微 锻 造 仪 铂 金 丝 上 烧 红 的 玻 璃 球 轻 轻 接 触, 瞬 间 迅 速 离 开, 使 玻 璃 针 尖 端 具 非 常 锋 利 的 端 头 这 样 就 完 成 了 注 射 用 玻 璃 针 的 制 作 过 程 固 定 用 玻 璃 针 按 加 工 注 射 用 针 的 (1) (2) 步 骤 加 工 成 齐 口 ( 断 口 处 内 径 70~100µm) 后, 直 接 通 过 靠 近 微 锻 造 仪 铂 金 丝 上 烧 红 的 玻 璃 球, 使 玻 璃 针 齐 口 处 熔 成 钝 口, 即 成 固 定 用 玻 璃 针 单 精 子 注 射 授 精 常 用 以 下 方 法 : 取 小 鼠 的 附 睾 内 精 子, 在 MCM 培 养 液 ( 配 方 见 表 13-1) 中 获 能 至 少 30 分 钟, 然 后 将 运 动 精 子 放 入 含 甲 基 纤 维 素 (methyl cellulose) 的 M2 培 养 液 滴 内 卵 子 取 自 输 卵 管 壶 腹 部, 用 含 1~2mg/ml 透 明 质 酸 酶 的 M16 培 养 液 去 除 卵 子 周 围 的 卵 丘 细 胞 将 注 射 和 固 定 用 玻 璃 针 连 接 到 倒 置 显 微 镜 的 显 微 操 作 系 统 上 将 具 第 一 极 体 的 卵 子 用 固 定 玻 璃 针 靠 负 压 固 定, 将 运 动 能 力 强 的 精 子 吸 入 注 射 针 随 后 将 注 射 针 穿 过 透 明 带, 将 精 子 注 射 到 卵 周 围 ( 透 明 带 下 精 子 注 射 ), 或 注 射 到 卵 细 胞 质 内 ( 卵 细 胞 质 内 精 子 注 射 ) 注 射 过 程 中 先 用 注 射 针 通 过 透 明 带 在 细 胞 质 上 穿 一 小 洞, 然 后 退 出 注 射 针, 在 注 射 针 的 头 部 吸 一 精 子, 再 从 原 孔 道 进 入 卵 细 胞 质, 将 精 子 注 入 卵 细 胞 质 内 随 后 将 卵 子 移 入 M16 或 小 鼠 授 精 培 养 液 中 培 养 6~8 小 时, 观 察 原 核 的 形 成 13.6 核 移 植 目 前 核 移 植 的 概 念 : 为 将 一 个 早 期 胚 胎 的 细 胞 核 移 植 到 一 去 核 的 卵 母 细 胞 内, 或 另 一 去 核 早 期 胚 胎 的 细 胞 内, 使 新 组 合 的 细 胞 具 继 续 发 育 的 能 力 核 移 植 在 研 究 细 胞 核 和 细 胞 质 相 互 作 用 生 物 医 学 研 究 及 家 畜 育 种 中 都 具 有 很 重 要 的 意 义 下 面 以 牛 (Bos taurus) 的 核 移 植 为 例 介 绍 此 技 术 (Robl 等 1987;Prather 等 1987;Bondioli 等 1990) 13.6.1 材 料 核 移 植 的 材 料 有 : 核 受 体 ( 去 核 卵 母 细 胞 ), 核 供 体 ( 早 期 胚 胎 的 分 裂 球 ) 配 有 Nomarski 微 分 干 涉 系 统 的 倒 置 显 微 镜, 显 微 操 作 系 统, 玻 璃 针 制 作 工 具 细 管 拉 制 仪 (pipette puller), 玻 璃 针 碾 磨 器 (needle grinder) 和 微 锻 造 仪 (microforge), 体 视 显 微 镜, 以 及 胚 胎 培 养 和 胚 胎 操 作 培 养 液 13.6.2 方 法 (1) 移 植 用 针 和 固 定 用 针 的 加 工 : 移 植 用 针 和 固 定 用 针 加 工 法 与 单 精 子 注 射 授 精 用 针 加 工 法 同 移 植 用 针 针 尖 的 外 径 约 为 20µm (2) 采 集 受 体 卵 : 受 体 卵 可 以 采 用 体 内 或 体 外 成 熟 的 卵 子 体 内 成 熟 的 卵 是 通 过 超 数 排 卵 获 得 的 对 牛 体 前 列 腺 素 处 理 后 48 小 时 注 射 500IU 的 hcg,hcg 处 理 后 24~48 小 时, 用 PBS-PVA 缓 冲 液 冲 洗 输 卵 管, 获 得 成 熟 的 牛 卵 卵 还 可 以 从 屠 宰 牛 的 卵 巢 中 获 得, 通 过 体 外 培 养 使 其 成 熟 (3) 采 集 供 体 胚 胎 : 目 前 研 究 显 示,2~32 细 胞 期 胚 胎 的 分 裂 球 均 可 作 核 供 体 供 体 胚 胎
第 13 章 生 殖 生 物 技 术 在 动 物 迁 地 保 护 中 的 应 用 165 主 要 来 自 超 数 排 卵, 也 有 采 用 体 外 授 精 产 生 的 胚 胎 (4) 显 微 操 作 : 显 微 操 作 在 配 有 显 微 操 作 系 统 和 Nomarski 微 分 干 涉 系 统 的 倒 置 显 微 镜 上 在 400 倍 的 放 大 倍 数 下 进 行 步 骤 是 : 将 供 体 胚 胎 自 透 明 带 取 出 后, 用 固 定 针 来 回 吸 打, 使 其 分 裂 球 分 散 将 受 体 卵 子 用 固 定 针 固 定, 用 去 核 针 在 靠 近 卵 子 第 一 极 体 处 吸 取 少 量 卵 细 胞 质, 然 后 用 去 核 针 吸 取 一 核 供 体 一 分 裂 球, 放 置 在 去 核 卵 子 的 围 卵 腔 内 (5) 卵 子 和 核 供 体 分 裂 球 的 融 合 : 去 核 受 体 卵 子 和 核 供 体 之 间 的 融 合 是 通 过 两 个 细 胞 的 细 胞 膜 的 融 合 而 实 现 的 牛 卵 子 和 核 供 体 的 融 合 常 采 用 电 融 合 的 方 法 进 行 电 融 合 仪 常 用 的 是 Zimmermann 细 胞 融 合 仪 (Zimmermann Cell Fusion Instrument,Model,Z1000,GCA/Pre-cision Scientific Group,IL,USA), 它 包 括 一 个 直 流 方 波 发 生 仪 和 一 个 电 融 合 槽 电 融 合 槽 里 有 两 根 相 距 200µm 的 电 极 两 电 极 之 间 为 含 有 0.3mol/dm 3 甘 露 醇,0.05mmol/dm 3 CaCl2,0.1mmol /dm 3 MgSO4 的 Zimmermann 细 胞 融 合 液 进 行 细 胞 融 合 时, 将 待 融 合 的 细 胞 先 放 入 Zimmermann 细 胞 融 合 液 中 平 衡 1 分 钟 在 平 衡 过 程 中 要 使 融 合 部 位 的 膜 与 两 电 极 平 行 然 后 用 600kHz 6V 的 直 流 电 将 卵 子 和 核 供 体 连 在 一 起, 再 在 50µs 内 用 3 次 15V 的 直 流 脉 冲 (750V/cm), 使 两 者 的 膜 融 合, 从 而 使 两 个 细 胞 变 成 一 个 细 胞 (6) 融 合 细 胞 的 体 外 培 养 : 接 受 了 细 胞 核 的 卵 子 要 放 入 50µl 的 培 养 液 滴 ( 常 用 TCM199) 内, 在 39 含 5%CO2 气 体 的 培 养 箱 内 进 行 体 外 发 育 培 养, 待 发 育 到 桑 椹 胚 或 囊 胚 期 胚 胎 时 便 可 用 于 胚 胎 移 植 13.7 转 基 因 动 物 转 基 因 动 物 技 术 是 利 用 显 微 注 射, 将 外 源 基 因 片 段 引 入 动 物 的 种 质 细 胞, 使 外 源 基 因 整 合 到 种 质 细 胞 的 基 因 组 内, 井 在 受 体 动 物 的 胚 胎 和 个 体 发 育 的 一 定 阶 段 进 行 表 达 的 一 项 生 殖 生 物 技 术 现 以 转 基 因 小 鼠 的 产 生 过 程 为 例 介 绍 转 基 因 动 物 技 术 (Gordon 1993) 13.7.1 材 料 配 有 Nomarski 微 分 干 涉 系 统 的 倒 置 显 微 镜, 显 微 操 作 系 统, 玻 璃 针 制 作 工 具 细 管 拉 制 仪 (pipette puller), 玻 璃 针 碾 磨 器 (needle grinder) 和 微 锻 造 仪 (microforge), 体 视 显 微 镜 等 13.7.2 方 法 (1) 制 备 DNA: 目 标 基 因 通 过 质 粒 扩 增 后, 用 特 定 的 限 制 性 内 切 酶 消 化 转 基 因 用 DNA 片 段 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离 目 标 片 段 通 过 苯 酚 - 氯 仿 抽 提 提 纯 后, 再 用 无 水 乙 醇 沉 淀, 沉 淀 物 再 溶 解 在 10mmol/dm 3 Tris-HCl(pH 值 7.5) 及 0.2mmol/dm 3 EDTA(pH 值 7.5) 中, 使 终 浓 度 约 为 2000 拷 贝 /pl(1 µl) 此 溶 液 4 保 存 备 用 (2) 显 微 注 射 用 工 具 的 制 作 : 固 定 用 针 的 制 作 请 参 考 单 精 子 注 射 授 精 的 工 具 制 作 部 分 ; 注 射 用 针 的 可 取 100mm 长, 内 径 为 0.5mm 的 细 玻 璃 管, 在 细 管 拉 制 仪 上 将 玻 璃 管 拉 成 细 端 封 口 的 玻 璃 针 备 用 (3) 受 精 卵 的 获 得 :5 或 6 周 龄 的 雌 性 小 鼠 每 只 腹 腔 注 射 2.5 IU 的 孕 马 血 清 (PMSG),
166 遗 传 多 样 性 研 究 的 原 理 与 方 法 进 行 超 数 排 卵 处 理,48 小 时 后 每 只 小 鼠 腹 腔 注 射 5 IU hcg, 以 诱 导 排 卵 然 后 将 雌 鼠 与 有 生 育 能 力 的 雄 鼠 置 于 同 一 笼 中 过 夜, 第 二 天 检 查 阴 道 栓 以 确 认 是 否 交 配 给 雌 性 小 鼠 注 射 hcg,11~ 12/ 小 时 后 处 死 小 鼠, 在 取 出 的 输 卵 管 壶 腹 部 分 离 出 卵 细 胞 团 卵 细 胞 团 用 含 有 10mg/ml 的 M2 培 养 液 消 化, 以 去 除 卵 丘 细 胞 用 M16 培 养 液 洗 净 卵 子, 选 择 具 明 显 雌 雄 原 核 的 卵 子 移 入 M2 培 养 液 微 滴 内 (4) 显 微 注 射 : 在 注 射 前 将 DNA 贮 藏 液 用 一 小 型 离 心 机 在 4 下 以 12 000~14 000r/min 离 心 15 分 钟, 然 后 将 上 层 80%~90% 的 溶 液 移 入 Eppendorf 管 吸 头 和 Eppendorf 管 需 事 先 用 蒸 馏 水 各 洗 3 次 将 DNA 溶 液 通 过 注 射 针 的 粗 口 端 装 入 管 内 当 溶 液 进 入 注 射 针 的 细 端 后, 用 石 蜡 油 自 尾 端 封 住 待 用 通 过 显 微 操 作 系 统 调 节 注 射 和 固 定 用 针 的 位 置, 使 其 位 于 待 注 射 卵 子 的 周 围 显 微 注 射 用 针 先 与 固 定 用 针 端 部 轻 轻 碰 一 下 以 折 断 其 端 部, 然 后 穿 过 透 明 带 在 围 卵 腔 处 对 注 射 针 施 于 正 压, 当 观 察 到 围 卵 腔 微 微 膨 胀 后, 退 出 注 射 针, 即 完 成 单 个 卵 子 的 显 微 注 射 过 程 对 其 他 卵 子 可 重 复 此 注 射 过 程 待 所 有 卵 子 注 射 完 后, 将 卵 子 移 入 M16 培 养 液 培 养 0.5~l 小 时, 然 后 移 植 到 假 孕 受 体 内 13.8 胚 胎 干 细 胞 培 养 胚 胎 干 细 胞 是 从 早 期 胚 胎 分 离 的 在 体 外 培 养 条 件 下 仍 保 持 其 未 分 化 状 态 具 有 发 育 全 能 性 的 细 胞 胚 胎 干 细 胞 培 养 是 近 年 来 发 展 起 来 的 一 项 新 的 生 殖 技 术 此 技 术 最 初 运 用 于 实 验 动 物 小 鼠 的 胚 胎, 目 前 已 扩 展 到 家 畜 和 灵 长 类 动 物 胚 胎 于 细 胞 广 泛 应 用 于 早 期 分 化 机 理 和 转 基 因 动 物 研 究 现 以 灵 长 类 动 物 中 的 猕 猴 (Macaca mulatta) 胚 胎 干 细 胞 系 的 建 立 方 法 为 例 来 介 绍 此 技 术 (Thomson 等 1995) 13.8.1 材 料 胚 胎 干 细 胞 培 养 所 需 的 材 料 如 下 :15 岁 雌 性 猕 猴, 超 数 排 卵 用 促 性 腺 激 素 FSH LH 等, 手 术 或 非 手 术 方 法 冲 胚 所 需 器 械, 兔 抗 猕 猴 脾 细 胞 抗 血 清, 豚 鼠 补 体 血 清,γ 射 线 源, 改 良 的 杜 氏 恩 格 尔 培 养 液 (Dulbeccos Modified Eagles medium) 等 13.8.2 方 法 在 猕 猴 排 卵 后 第 6 天, 用 手 术 或 非 手 术 方 法 冲 出 囊 胚 期 胚 胎 去 除 胚 胎 透 明 带 后, 用 免 疫 外 科 手 术 去 掉 胚 胎 的 滋 养 外 胚 层 具 体 步 骤 是 先 用 兔 抗 猕 猴 脾 细 胞 抗 血 清 处 理 胚 胎 ( 抗 体 滴 度 决 定 抗 体 用 量 和 处 理 时 间 ), 然 后 再 加 豚 鼠 补 体 血 清 将 内 细 胞 团 从 溶 解 的 滋 养 外 胚 层 中 分 离 出 来 后, 放 在 预 先 用 3 000 rad 射 线 照 射 过 的 小 鼠 胚 胎 成 纤 维 细 胞 单 层 上 培 养 液 为 改 良 的 杜 氏 恩 格 尔 培 养 液, 内 含 4 500mg/dm 3 的 L- 谷 氨 酰 胺, 不 含 丙 酮 酸 钠 培 养 液 中 添 加 20% 胎 牛 血 清,0.1mmol/dm 3 2- 巯 基 乙 醇,1% 的 非 必 需 氨 基 酸 浓 缩 液 (nonessential amino acid stock) 和 1000u/ml 克 隆 的 人 白 血 抑 制 因 子 培 养 16 天 后, 将 形 成 的 中 央 细 胞 团 从 增 生 的 上 皮 层 上 取 出, 用 0.05% 的 胰 蛋 白 酶 -EDTA(trypsin-EDTA) 处 理 3 分 钟, 同 时 用 细 管 轻 轻 地 将 细 胞 团 打 散 将 处 理 完 的 细 胞 重 新 置 于 小 鼠 胚 胎 成 纤 维 细 胞 单 层 上 继 续 培 养 3 个 星 期 用 细 管 吸 取 具 人 胚 胎 瘤 细 胞 特 性 的 细 胞, 放 入 96 孔 的 培 养 板 内, 每 孔 放 一 个 细 胞 以 形 成 克 隆
第 13 章 生 殖 生 物 技 术 在 动 物 迁 地 保 护 中 的 应 用 167 滋 养 层 细 胞 仍 为 小 鼠 胚 胎 成 纤 维 细 胞 单 层 克 隆 细 胞 株 可 以 冷 冻 保 存 或 进 行 继 代 培 养 13.9 动 物 的 无 性 克 隆 13.9.1 一 般 概 念 克 隆 是 指 一 个 细 胞 经 分 裂 而 形 成 的 具 有 相 同 遗 传 组 成 的 细 胞 家 族, 具 体 可 分 为 分 子 克 隆 细 胞 克 隆 和 组 织 克 隆 克 隆 技 术 在 植 物 繁 殖 上 的 运 用 已 较 成 功, 也 广 泛 用 于 花 卉 小 麦 的 培 育 工 作 动 物 克 隆 是 把 供 体 细 胞 核 转 移 到 成 熟 的 去 核 卵 母 细 胞 内, 使 之 发 育 而 产 生 的 动 物 个 体 克 隆 动 物 又 分 为 胚 型 克 隆 动 物 和 无 性 克 隆 动 物 胚 型 克 隆 动 物 是 指 用 早 期 胚 胎 细 胞 核 作 供 体 移 植 克 隆 所 形 成 的 动 物, 其 主 要 方 式 有 胚 胎 分 割 胚 胎 细 胞 核 移 植 胚 胎 干 细 胞 核 移 植 胎 儿 成 纤 维 细 胞 核 移 植 胚 胎 嵌 合 胚 型 克 隆 动 物 其 供 体 所 采 用 的 早 期 胚 胎 细 胞 是 通 过 有 性 过 程, 即 精 子 和 卵 子 受 精 过 程 产 生 原 胚 细 胞, 其 细 胞 核 中 的 基 因 组 双 亲 各 半 无 性 克 隆 是 指 用 动 物 体 细 胞 作 供 体 移 植 克 隆 所 形 成 的 动 物, 无 性 克 隆 动 物 所 采 用 的 供 体 是 成 熟 的 体 细 胞, 其 基 因 组 仅 来 自 于 供 体 自 身 13.9.2 动 物 无 性 克 隆 的 方 法 关 于 胚 型 克 隆 动 物 的 一 些 基 本 方 法, 如 核 移 植 胚 胎 干 细 胞 等 已 在 前 几 节 中 介 绍 过, 本 节 将 介 绍 英 国 罗 斯 林 研 究 所 (Roslin Institute,Edinburgh) 首 次 成 功 报 道 的 无 性 克 隆 绵 羊 (Dorly 羊 ) 的 方 法 原 胚 细 胞 (Embryo-derired cell) 取 自 -Pou Dorser 培 养 9 天 的 胚 胎 胎 盘 (Canyibell 等 1996) 具 体 方 法 如 下 : 将 分 离 的 胚 盘 置 于 鼠 原 代 成 纤 维 细 胞 (PMEF) 的 营 养 层 上 培 养 培 养 液 为 Dulbeccos Modified Eagles medium, 含 10% 胎 牛 血 清 (FSS) 10% 小 牛 血 清 (BCS) 和 加 入 白 血 病 抑 制 因 子 培 养 8 天 后, 将 扩 展 的 胎 盘 细 胞 用 胰 蛋 白 酶 消 化 分 离 转 至 新 的 成 纤 维 细 胞 营 养 层 再 过 7 天 后, 将 一 个 大 的 扁 平 细 胞 群 分 离 出, 在 无 营 养 层 的 培 养 液 中 培 养 在 第 8 代 时, 细 胞 株 染 色 体 数 为 54 这 些 细 胞 在 第 7~9 代 时 可 作 为 核 供 体 胎 儿 细 胞 从 怀 孕 26 天 的 黑 威 尔 土 山 羊 腹 中 得 到 将 胎 羊 头 切 除 后, 把 组 织 剪 成 碎 片, 用 胰 蛋 白 酶 分 离 细 胞, 然 后 再 加 2mmol/dm 3 谷 氨 酰 胺 (L-Glutamine),1mmol/dm 3 丙 酮 酸 钠 和 10% 胎 牛 血 清 的 BHK21(Glsgow MEM;Gibco Life Sciences) 中 培 养 当 细 胞 有 90% 聚 合 时, 即 按 l:2 分 离 传 代, 至 第 4 代 产 生 成 纤 维 状 细 胞 时, 其 染 色 体 数 达 54, 胎 儿 细 胞 在 4~6 代 时 作 为 供 体 细 胞 乳 腺 细 胞 来 自 6 岁 的 怀 孕 3 个 月 Fina Dorset 绵 羊 在 第 3 和 第 6 代, 其 染 色 体 数 达 54 时, 这 些 细 胞 也 作 为 核 供 体 细 胞 核 移 植 方 法 如 下 : 给 苏 格 兰 黑 面 绵 羊 (Scottish blackface ewe) 注 射 促 性 腺 激 素 释 放 激 素 (GnRH),28~33 小 时 后 取 卵, 立 即 去 除 卵 核 将 卵 置 于 无 钙 和 镁 含 1%FCS 的 磷 酸 缓 冲 液 (PBS) 中, 然 后 转 移 至 无 钙 的 含 10%FCS 的 M2 培 养 液 中 (Whittion 等 1968) 核 供 体 细 胞 的 减 数 分 裂 的 休 止 是 将 培 养 液 中 血 清 浓 度 从 10% 降 至 0.5%, 保 持 5 天, 使 细 胞 生 长 停 留 在 Go 期 用 抗 PCNA/cyclin 抗 体 (Immuno Concepto) 染 色, 确 定 上 述 细 胞 是 否 停 留 在 Go
168 遗 传 多 样 性 研 究 的 原 理 与 方 法 期, 可 用 联 络 若 丹 明 (rhodamine) 的 二 抗 体 (Dakopatts) 显 色 核 供 体 细 胞 和 去 核 卵 母 细 胞 的 融 合 和 卵 的 活 化 用 同 样 的 电 脉 冲, 这 一 步 骤 大 约 在 供 体 注 射 GnRH34~36 小 时 后 重 组 的 胚 胎 主 要 在 结 扎 的 输 卵 管 内 培 养, 部 分 胚 胎 在 化 学 成 分 明 确 的 培 养 液 中 培 养 (Gardner 1994) 将 培 养 6 天 后 的 卵 进 行 胚 胎 移 植 用 上 述 方 法, 得 到 了 与 供 体 核 基 因 表 型 完 全 一 致 的 绵 羊