权 利 要 求 书 1/2 页 1. 一 种 RAMOSA2 多 肽 或 其 编 码 基 因 或 RAMOSA2 多 肽 的 调 节 剂 的 用 途, 用 于 调 节 植 物 株 高 穗 表 型 或 支 梗 长 度 ; 所 述 RAMOSA2 多 肽 选 自 : (a)seq ID NO :2 所

(19) 中 华 人 民 共 和 国 国 家 知 识 产 权 局 (12) 发 明 专 利 申 请 *CN103305524A* (10) 申 请 公 布 号 CN 103305524 A (43) 申 请 公 布 日 2013.09.18 (21) 申 请 号 201210060208.3 (22) 申 请 日 2012.03.08 (71) 申 请 人 中 国 科 学 院 上 海 生 命 科 学 研 究 院 地 址 200031 上 海 市 徐 汇 区 岳 阳 路 319 号 (72) 发 明 人 时 振 英 卢 寰 黎 凌 王 江 张 景 六 李 琳 (74) 专 利 代 理 机 构 上 海 专 利 商 标 事 务 所 有 限 公 司 31100 代 理 人 陈 静 (51)Int.Cl. C12N 15/29 (2006.01) C07K 14/415 (2006.01) C12N 15/82 (2006.01) C12N 15/84 (2006.01) A01H 5/00 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) G01N 33/68 (2006.01) 权 利 要 求 书 22 页 说 明 书 11 11 页 页 序 列 表 33 页 附 图 5 页 5 页 (54) 发 明 名 称 作 物 穗 型 调 节 基 因 及 其 应 用 (57) 摘 要 本 发 明 涉 及 一 种 作 物 穗 型 调 节 基 因 及 其 应 用, 揭 示 了 一 种 对 于 调 节 植 物 株 高 穗 表 型 或 支 梗 长 度 有 用 的 基 因, 该 基 因 可 应 用 于 植 物 杂 交 育 种, 获 得 株 型 改 变 或 品 种 改 良 的 植 物 CN 103305524 A

权 利 要 求 书 1/2 页 1. 一 种 RAMOSA2 多 肽 或 其 编 码 基 因 或 RAMOSA2 多 肽 的 调 节 剂 的 用 途, 用 于 调 节 植 物 株 高 穗 表 型 或 支 梗 长 度 ; 所 述 RAMOSA2 多 肽 选 自 : (a)seq ID NO :2 所 示 氨 基 酸 序 列 的 多 肽 ; (b) 将 SEQ ID NO :2 所 示 氨 基 酸 序 列 经 过 一 个 或 多 个 氨 基 酸 残 基 的 取 代 缺 失 或 添 加 而 形 成 的, 且 具 有 (a) 多 肽 功 能 的 由 (a) 衍 生 的 多 肽 ; 或 (c) 与 SEQ ID NO :2 所 示 氨 基 酸 序 列 具 有 80% 以 上 相 同 性, 且 具 有 (a) 多 肽 功 能 的 由 (a) 衍 生 的 多 肽 2. 如 权 利 要 求 1 所 述 的 用 途, 其 特 征 在 于, 所 述 的 RAMOSA2 多 肽 或 其 编 码 基 因 用 于 : 矮 化 植 物 株 型 ; 使 植 物 的 穗 呈 现 密 穗 表 型 ; 或 缩 短 植 物 支 梗 长 度 3. 如 权 利 要 求 1 所 述 的 用 途, 其 特 征 在 于, 所 述 的 RAMOSA2 多 肽 的 调 节 剂 是 其 下 调 剂, 用 于 : 使 植 物 的 穗 呈 现 稀 穗 表 型 ; 或 延 长 植 物 支 梗 长 度 4. 如 权 利 要 求 3 所 述 的 用 途, 其 特 征 在 于, 所 述 的 RAMOSA2 多 肽 的 下 调 剂 是 特 异 性 干 扰 RAMOSA2 基 因 转 录 的 干 扰 分 子 5. 如 权 利 要 求 4 所 述 的 用 途, 其 特 征 在 于, 所 述 的 干 扰 分 子 是 以 RAMOSA2 多 肽 的 编 码 基 因 或 其 转 录 本 为 抑 制 或 沉 默 靶 标 的 dsrna 反 义 核 酸 小 干 扰 RNA 微 小 RNA, 或 能 表 达 或 形 成 所 述 dsrna 反 义 核 酸 小 干 扰 RNA 微 小 RNA 的 构 建 物 ; 较 佳 地, 所 述 的 干 扰 分 子 是 以 SEQ ID NO :1 作 为 沉 默 靶 标 的 dsrna 或 构 建 物 6. 如 权 利 要 求 5 所 述 的 用 途, 其 特 征 在 于, 所 述 的 干 扰 分 子 是 构 建 物, 含 有 式 (I) 所 示 的 结 构 : Seq 正 向 -X-Seq 反 向 式 (I), 式 (I) 中, Seq 正 向 为 SEQ ID NO :1 中 第 173-332 位 所 示 的 多 核 苷 酸,Seq 反 向 为 与 Seq 正 向 互 补 的 多 核 苷 酸 ; X 为 位 于 Seq 正 向 和 Seq 反 向 之 间 的 间 隔 序 列, 并 且 所 述 间 隔 序 列 与 Seq 正 向 和 Seq 反 向 不 互 补 7. 一 种 调 节 植 物 株 高 穗 表 型 或 支 梗 长 度 的 方 法, 包 括 : 调 节 植 物 中 RAMOSA2 多 肽 的 表 达 或 活 性 ; 其 中 所 述 RAMOSA2 多 肽 选 自 : (a)seq ID NO :2 所 示 氨 基 酸 序 列 的 多 肽 ; (b) 将 SEQ ID NO :2 所 示 氨 基 酸 序 列 经 过 一 个 或 多 个 氨 基 酸 残 基 的 取 代 缺 失 或 添 加 而 形 成 的, 且 具 有 (a) 多 肽 功 能 的 由 (a) 衍 生 的 多 肽 ; 或 (c) 与 SEQ ID NO :2 所 示 氨 基 酸 序 列 具 有 80% 以 上 相 同 性, 且 具 有 (a) 多 肽 功 能 的 由 (a) 衍 生 的 多 肽 8. 如 权 利 要 求 7 所 述 的 方 法, 其 特 征 在 于, 所 述 方 法 包 括 : 上 调 植 物 中 RAMOSA2 多 肽 的 表 达 或 活 性, 从 而 矮 化 植 物 株 型 使 穗 呈 现 密 穗 表 型 或 缩 短 支 梗 长 度 9. 如 权 利 要 求 8 所 述 的 方 法, 其 特 征 在 于, 所 述 方 法 包 括 : 将 RAMOSA2 多 肽 的 编 码 基 因 2

权 利 要 求 书 2/2 页 转 入 植 物 中 10. 如 权 利 要 求 9 所 述 的 方 法, 其 特 征 在 于, 所 述 方 法 包 括 : (1) 提 供 携 带 表 达 载 体 的 农 杆 菌, 所 述 的 表 达 载 体 含 有 RAMOSA2 多 肽 的 编 码 基 因 ; 和 (2) 将 植 物 细 胞 或 组 织 或 器 官 与 步 骤 (1) 中 的 农 杆 菌 接 触, 从 而 使 RAMOSA2 多 肽 的 编 码 基 因 转 入 植 物 11. 如 权 利 要 求 7 所 述 的 方 法, 其 特 征 在 于, 所 述 方 法 包 括 : 下 调 植 物 中 RAMOSA2 多 肽 的 表 达 或 活 性, 从 而 使 穗 呈 现 稀 穗 表 型 或 延 长 支 梗 长 度 12. 如 权 利 要 求 11 所 述 的 方 法, 其 特 征 在 于, 所 述 方 法 包 括 : 将 特 异 性 干 扰 RAMOSA2 基 因 转 录 的 干 扰 分 子 转 入 植 物 中 13. 如 权 利 要 求 12 所 述 的 方 法, 其 特 征 在 于, 所 述 的 方 法 包 括 : (a) 提 供 携 带 表 达 载 体 的 农 杆 菌, 所 述 的 表 达 载 体 含 有 干 扰 RAMOSA2 基 因 转 录 的 干 扰 分 子 ; 和 (b) 将 植 物 细 胞 或 组 织 或 器 官 与 步 骤 (a) 中 的 农 杆 菌 接 触, 从 而 使 干 扰 RAMOSA2 基 因 转 录 的 干 扰 分 子 转 入 植 物 14. 一 种 RAMOSA2 多 肽 或 其 编 码 基 因 的 用 途, 用 作 鉴 定 植 物 的 株 高 穗 表 型 或 支 梗 长 度 的 标 记 物 15. 如 权 利 要 求 1-14 任 一 所 述 的 用 途 或 方 法, 其 特 征 在 于, 所 述 的 植 物 是 禾 本 科 植 物 ; 更 佳 地, 所 述 的 植 物 是 水 稻 3

说 明 书 1/11 页 作 物 穗 型 调 节 基 因 及 其 应 用 技 术 领 域 [0001] 本 发 明 属 于 生 物 技 术 以 及 植 物 学 领 域 ; 更 具 体 地, 本 发 明 涉 及 一 种 作 物 穗 型 调 节 基 因 及 其 应 用 背 景 技 术 [0002] 水 稻 是 世 界 上 最 重 要 的 粮 食 作 物 之 一, 世 界 上 有 一 半 人 口 以 大 米 为 主 食, 中 国 稻 谷 年 消 耗 量 和 产 量 占 世 界 总 量 的 三 分 之 一 中 国 是 人 口 大 国, 一 直 非 常 重 视 水 稻 的 生 产 和 科 研, 随 着 可 耕 地 面 积 的 减 少 和 人 口 的 增 加, 提 高 粮 食 产 量 成 为 重 大 的 社 会 问 题 80 年 代 末, 科 学 家 提 出 了 水 稻 理 想 株 型 与 优 势 利 用 相 结 合 的 水 稻 超 高 产 育 种 理 论 水 稻 株 型 的 构 成 包 括 植 株 高 度 分 蘖 数 目 分 蘖 角 度 以 及 穗 型 等 诸 多 因 素, 穗 型 是 水 稻 理 想 株 型 研 究 的 重 要 内 容 之 一 在 分 子 水 平 上 研 究 和 应 用 影 响 穗 型 的 基 因, 不 仅 对 于 深 入 了 解 水 稻 穗 的 发 育 机 制 有 理 论 意 义, 而 且 对 于 指 导 生 产 中 应 用 分 子 标 记 辅 助 选 择 筛 选 适 度 密 穗 表 型 的 株 系 增 加 产 量 具 有 实 际 意 义 目 前, 水 稻 中 已 有 很 多 影 响 穗 型 发 育 的 基 因 被 克 隆 FZP 基 因 通 过 抑 制 小 穗 分 生 组 织 内 腋 生 分 生 组 织 的 过 度 生 长, 来 维 持 从 小 穗 到 花 序 的 特 征 转 换 FZP 在 玉 米 中 的 同 源 基 因 是 BD1, 通 过 调 控 花 序 结 构 中 的 侧 生 器 官 的 分 生 特 性 影 响 穗 型 发 育 LAX 基 因 在 穗 发 育 过 程 中 通 过 调 节 侧 生 分 生 组 织 的 发 育 调 节 穗 中 枝 梗 的 发 育, 从 而 影 响 穗 型 RCN1 和 RCN2 基 因 分 别 是 拟 南 芥 中 TFL1-like 基 因 和 金 鱼 草 的 CEN 基 因 在 水 稻 中 的 同 源 基 因 RCN1 和 RCN2 超 表 达 的 转 基 因 植 株 主 要 通 过 延 迟 分 枝 结 构 的 生 长 点 向 小 花 结 构 的 生 长 点 的 转 换, 增 多 二 级 以 及 二 级 以 上 枝 梗 数 来 增 加 籽 粒 数 目, 体 现 在 穗 型 上 就 是 密 穗 表 型 [0003] 研 究 影 响 穗 型 的 基 因 的 功 能 不 仅 对 于 深 入 理 解 水 稻 穗 的 发 育 有 理 论 意 义, 而 且 对 于 指 导 生 产 中 应 用 分 子 标 记 辅 助 选 择 筛 选 密 穗 表 型 的 株 系 具 有 实 际 意 义 因 此, 本 领 域 有 必 要 深 入 研 究 和 发 掘 影 响 水 稻 穗 表 型 的 基 因 发 明 内 容 [0004] 本 发 明 的 目 的 在 于 提 供 一 种 作 物 穗 型 调 节 基 因 及 其 应 用 [0005] 在 本 发 明 的 第 一 方 面, 提 供 一 种 RAMOSA2 多 肽 或 其 调 节 剂 的 用 途, 用 于 调 节 植 物 株 高 穗 表 型 或 支 梗 ( 包 括 各 级 枝 梗, 如 一 级 枝 梗 二 级 支 梗 ) 长 度 ; 所 述 RAMOSA2 多 肽 选 自 : [0006] (a)seq ID NO :2 所 示 氨 基 酸 序 列 的 多 肽 ; [0007] (b) 将 SEQ ID NO :2 所 示 氨 基 酸 序 列 经 过 一 个 或 多 个 ( 如 1-20 个 ; 较 佳 地 1-10 个 ; 更 佳 地 1-5 个 ; 更 佳 地 1-3 个 ) 氨 基 酸 残 基 的 取 代 缺 失 或 添 加 而 形 成 的, 且 具 有 (a) 多 肽 功 能 的 由 (a) 衍 生 的 多 肽 ; 或 [0008] (c) 与 SEQ ID NO :2 所 示 氨 基 酸 序 列 具 有 80% ( 较 佳 地 88% ; 更 佳 地 90% ; 更 佳 地 95% ; 更 佳 地 99% ) 以 上 相 同 性, 且 具 有 (a) 多 肽 功 能 的 由 (a) 衍 生 的 多 肽 [0009] 在 一 个 优 选 例 中, 所 述 的 植 物 是 禾 本 科 植 物 ; 更 佳 地, 所 述 的 植 物 是 水 稻 [0010] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 的 RAMOSA2 多 肽 是 来 源 于 水 稻 的 RAMOSA2 多 肽 4

说 明 书 2/11 页 [0011] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 RAMOSA2 多 肽 编 码 基 因 为 编 码 上 述 多 肽 的 多 核 苷 酸 序 列 或 其 互 补 序 列 [0012] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 的 RAMOSA2 多 肽 的 编 码 基 因 具 有 SEQ ID NO :1 所 示 的 核 苷 酸 序 列, 或 其 互 补 序 列 [0013] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 的 RAMOSA2 多 肽 用 于 : [0014] 矮 化 植 物 株 型 ; [0015] 使 植 物 的 穗 呈 现 密 穗 表 型 ; 或 [0016] 缩 短 植 物 支 梗 长 度 [0017] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 的 RAMOSA2 多 肽 的 调 节 剂 是 其 下 调 剂, 用 于 : [0018] 使 植 物 的 穗 呈 现 稀 穗 表 型 ; 或 [0019] 延 长 植 物 支 梗 长 度 [0020] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 的 RAMOSA2 多 肽 的 下 调 剂 是 下 调 RAMOSA2 基 因 转 录 多 肽 表 达 或 多 肽 活 性 的 物 质 ; 较 佳 地, 所 述 的 RAMOSA2 多 肽 的 下 调 剂 是 特 异 性 干 扰 RAMOSA2 基 因 转 录 的 干 扰 分 子 [0021] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 的 干 扰 分 子 是 以 RAMOSA2 多 肽 的 编 码 基 因 或 其 转 录 本 为 抑 制 或 沉 默 靶 标 的 dsrna 反 义 核 酸 小 干 扰 RNA 微 小 RNA, 或 能 表 达 或 形 成 所 述 dsrna 反 义 核 酸 小 干 扰 RNA 微 小 RNA 的 构 建 物 ; 较 佳 地, 所 述 的 干 扰 分 子 是 以 SEQ ID NO :1 或 其 转 录 本 作 为 沉 默 靶 标 的 dsrna 或 构 建 物 [0022] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 的 干 扰 分 子 是 构 建 物, 含 有 式 (I) 所 示 的 结 构 : [0023] Seq 正 向 -X-Seq 反 向 式 (I), [0024] 式 (I) 中, [0025] Seq 正 向 为 SEQ ID NO :1 中 第 173-332 位 所 示 的 多 核 苷 酸,Seq 反 向 为 与 Seq 正 向 互 补 的 多 核 苷 酸 ; [0026] X 为 位 于 Seq 正 向 和 Seq 反 向 之 间 的 间 隔 序 列, 并 且 所 述 间 隔 序 列 与 Seq 正 向 和 Seq 反 向 不 互 补 [0027] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 的 间 隔 序 列 (X) 本 身 不 构 成 互 补 双 链 结 构, 其 长 度 是 200-2000nt ; 较 佳 地 500-1500nt ; 更 佳 地 1000-1200nt( 如 约 1163nt) [0028] 在 本 发 明 的 另 一 方 面, 提 供 一 种 调 节 植 物 株 高 穗 表 型 或 支 梗 长 度 的 方 法, 包 括 : 调 节 植 物 中 RAMOSA2 多 肽 或 其 编 码 基 因 的 表 达 或 活 性 ; 其 中 所 述 RAMOSA2 多 肽 选 自 : [0029] (a)seq ID NO :2 所 示 氨 基 酸 序 列 的 多 肽 ; [0030] (b) 将 SEQ ID NO :2 所 示 氨 基 酸 序 列 经 过 一 个 或 多 个 ( 如 1-20 个 ; 较 佳 地 1-10 个 ; 更 佳 地 1-5 个 ; 更 佳 地 1-3 个 ) 氨 基 酸 残 基 的 取 代 缺 失 或 添 加 而 形 成 的, 且 具 有 (a) 多 肽 功 能 的 由 (a) 衍 生 的 多 肽 ; 或 [0031] (c) 与 SEQ ID NO :2 所 示 氨 基 酸 序 列 具 有 80% ( 较 佳 地 88% ; 更 佳 地 90% ; 更 佳 地 95% ; 更 佳 地 99% ) 以 上 相 同 性, 且 具 有 (a) 多 肽 功 能 的 由 (a) 衍 生 的 多 肽 [0032] 在 一 个 优 选 例 中, 所 述 方 法 包 括 : 上 调 植 物 中 RAMOSA2 多 肽 或 其 编 码 基 因 的 表 达, 从 而 矮 化 植 物 株 型 使 穗 呈 现 密 穗 表 型 或 缩 短 支 梗 长 度 [0033] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 方 法 包 括 : 将 RAMOSA2 多 肽 的 编 码 基 因 转 入 植 物 中 [0034] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 方 法 包 括 : 5

说 明 书 3/11 页 [0035] (1) 提 供 携 带 表 达 载 体 的 农 杆 菌, 所 述 的 表 达 载 体 含 有 RAMOSA2 多 肽 的 编 码 基 因 ; [0036] (2) 将 植 物 细 胞 或 组 织 或 器 官 与 步 骤 (1) 中 的 农 杆 菌 接 触, 从 而 使 RAMOSA2 多 肽 的 编 码 基 因 转 入 植 物 [0037] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 方 法 包 括 : 下 调 植 物 中 RAMOSA2 多 肽 或 其 编 码 基 因 的 表 达, 从 而 使 穗 呈 现 稀 穗 表 型 或 延 长 支 梗 长 度 [0038] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 方 法 包 括 : 将 下 调 RAMOSA2 基 因 转 录 多 肽 表 达 或 多 肽 活 性 的 下 调 剂 转 入 植 物 中 ; 较 佳 地, 所 述 的 下 调 剂 是 特 异 性 干 扰 RAMOSA2 基 因 转 录 的 干 扰 分 子 [0039] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 的 方 法 包 括 : [0040] (a) 提 供 携 带 表 达 载 体 的 农 杆 菌, 所 述 的 表 达 载 体 含 有 干 扰 RAMOSA2 基 因 转 录 的 干 扰 分 子 ; [0041] (b) 将 植 物 细 胞 或 组 织 或 器 官 与 步 骤 (a) 中 的 农 杆 菌 接 触, 从 而 使 干 扰 RAMOSA2 基 因 转 录 的 干 扰 分 子 转 入 植 物 [0042] 在 本 发 明 的 另 一 方 面, 提 供 一 种 植 物, 其 由 前 面 任 一 所 述 的 调 节 植 物 株 高 穗 表 型 或 支 梗 长 度 的 方 法 制 备 获 得 [0043] 在 本 发 明 的 另 一 方 面, 提 供 一 种 RAMOSA2 多 肽 或 其 编 码 基 因 的 用 途, 用 作 鉴 定 植 物 的 株 高 穗 表 型 或 支 梗 长 度 的 标 记 物 [0044] 本 发 明 的 其 它 方 面 由 于 本 文 的 公 开 内 容, 对 本 领 域 的 技 术 人 员 而 言 是 显 而 易 见 的 附 图 说 明 [0045] 图 1 OsRAMOSA2 基 因 超 表 达 转 基 因 植 株 的 RT-PCR 检 测 其 中 1 2 3 为 随 机 的 3 株 超 表 达 转 基 因 植 株, 检 测 用 的 组 织 为 叶 片 [0046] 图 2 OsRAMOSA2 基 因 超 表 达 植 株 (OsRAMOSA2OE, 简 称 OsRA2OE) 的 株 高 和 穗 型 [0047] 图 3 OsRAMOSA2 基 因 编 码 的 蛋 白 的 亚 细 胞 定 位 [0048] 图 4 OsRAMOSA2 基 因 在 水 稻 不 同 组 织 部 位 的 表 达 情 况 检 测 [0049] 图 5 OsRAMOSA2 基 因 在 水 稻 穗 发 育 过 程 中 的 表 达 (bar = 100μm) A 一 级 支 梗 原 基 ;B 一 级 支 梗 原 基 ;C 二 级 支 梗 原 基 ;D 颖 花 原 基 [0050] 图 6 OsRAMOSA2 基 因 在 RNAi 转 基 因 植 株 中 的 表 达 分 析, 其 中 1-5 为 转 基 因 植 株 [0051] 图 7 野 生 型 中 花 11 OsRAMOSA2 基 因 超 表 达 转 基 因 植 株 (OsRA2OE) 和 RNAi 转 基 因 植 株 (OsRA2RNAi) 的 穗 型 [0052] 图 8 野 生 型 中 花 11 OsRAMOSA2 基 因 超 表 达 转 基 因 植 株 (OsRA2OE) 和 RNAi 转 基 因 植 株 (OsRA2RNAi) 的 支 梗 长 度 [0053] 图 9 p1301-35snos 表 达 载 体 的 结 构 图 谱 [0054] 图 10 p1301rnai 质 粒 图 谱 具 体 实 施 方 式 [0055] 本 发 明 人 经 过 广 泛 的 研 究, 找 到 一 种 对 于 调 节 植 物 株 高 穗 表 型 或 支 梗 长 度 有 用 的 基 因, 本 发 明 人 将 之 称 为 作 物 穗 型 调 节 基 因 (RAMOSA2 基 因 ) 本 发 明 的 基 因 可 应 用 于 植 物 杂 交 育 种, 获 得 株 型 ( 特 别 是 穗 型 ) 改 变 或 品 种 改 良 的 植 物 6

说 明 书 4/11 页 [0056] 本 发 明 中, 对 于 适 用 于 本 发 明 的 植 物 ( 或 作 物 ) 没 有 特 别 的 限 制, 只 要 其 适 合 进 行 基 因 的 转 化 操 作, 如 各 种 农 作 物 花 卉 植 物 或 林 业 植 物 等 所 述 的 植 物 比 如 可 以 是 ( 不 限 于 ) : 双 子 叶 植 物 单 子 叶 植 物 或 裸 子 植 物 更 具 体 地, 所 述 的 植 物 包 括 ( 但 不 限 于 ) : 小 麦 大 麦 黑 麦 水 稻 玉 米 高 梁 甜 菜 苹 果 梨 李 桃 杏 樱 桃 草 莓 木 莓 黑 莓 豆 扁 豆 豌 豆 大 豆 油 菜 芥 罂 粟 齐 墩 果 向 日 葵 椰 子 蓖 麻 油 植 物 可 可 豆 花 生 葫 芦 黄 瓜 西 瓜 棉 花 亚 麻 大 麻 黄 麻 柑 桔 柠 檬 葡 萄 柚 菠 菜 苘 苣 芦 笋 洋 白 菜 大 白 菜 小 白 菜 胡 萝 卜 洋 葱 土 豆 西 红 柿 青 椒 鳄 梨 桂 皮 樟 脑 烟 叶 坚 果 咖 啡 茄 子 甘 蔗 茶 叶 胡 椒 葡 萄 树 蚝 麻 草 香 蕉 天 然 橡 胶 树 和 观 赏 植 物 等 [0057] 作 为 一 种 优 选 方 式, 所 述 的 植 物 包 括 但 不 限 于 本 科 植 物 比 如, 禾 本 科 的 水 稻, 小 麦, 大 麦, 黑 麦, 高 粱, 玉 米 较 佳 地, 所 述 的 植 物 是 水 稻 [0058] 本 发 明 的 多 肽 可 以 是 重 组 多 肽 天 然 多 肽 合 成 多 肽, 优 选 的 是 重 组 多 肽 本 发 明 的 多 肽 可 以 是 天 然 纯 化 的 产 物, 或 是 化 学 合 成 的 产 物, 或 使 用 重 组 技 术 从 原 核 或 真 核 宿 主 ( 例 如, 细 菌 酵 母 高 等 植 物 昆 虫 和 哺 乳 动 物 细 胞 ) 中 产 生 [0059] 本 发 明 还 包 括 RAMOSA2 多 肽 的 片 段 衍 生 物 和 类 似 物 如 本 文 所 用, 术 语 片 段 衍 生 物 和 类 似 物 是 指 基 本 上 保 持 本 发 明 的 RAMOSA2 多 肽 相 同 的 生 物 学 功 能 或 活 性 的 多 肽 本 发 明 的 多 肽 片 段 衍 生 物 或 类 似 物 可 以 是 (i) 有 一 个 或 多 个 保 守 或 非 保 守 性 氨 基 酸 残 基 ( 优 选 保 守 性 氨 基 酸 残 基 ) 被 取 代 的 多 肽, 而 这 样 的 取 代 的 氨 基 酸 残 基 可 以 是 也 可 以 不 是 由 遗 传 密 码 编 码 的, 或 (ii) 在 一 个 或 多 个 氨 基 酸 残 基 中 具 有 取 代 基 团 的 多 肽, 或 (iii) 成 熟 多 肽 与 另 一 个 化 合 物 ( 比 如 延 长 多 肽 半 衰 期 的 化 合 物, 例 如 聚 乙 二 醇 ) 融 合 所 形 成 的 多 肽, 或 (iv) 附 加 的 氨 基 酸 序 列 融 合 到 此 多 肽 序 列 而 形 成 的 多 肽 ( 如 前 导 序 列 或 分 泌 序 列 或 用 来 纯 化 此 多 肽 的 序 列 或 蛋 白 原 序 列, 或 融 合 蛋 白 ) 根 据 本 文 的 定 义 这 些 片 段 衍 生 物 和 类 似 物 属 于 本 领 域 熟 练 技 术 人 员 公 知 的 范 围 [0060] 在 本 发 明 中, 术 语 RAMOSA2 多 肽 (RAMOSA2 蛋 白 ) 指 具 有 调 节 植 物 株 高 穗 表 型 或 支 梗 长 度 的 功 能 的 SEQ ID NO :2 序 列 的 多 肽 该 术 语 还 包 括 具 有 调 节 植 物 株 高 穗 表 型 或 支 梗 长 度 功 能 的 SEQ ID NO :2 序 列 的 变 异 形 式 这 些 变 异 形 式 包 括 ( 但 并 不 限 于 ) : 若 干 个 ( 通 常 为 1-20 个, 更 佳 地 1-10 个, 还 更 佳 如 1-8 个 或 1-5 个 ) 氨 基 酸 的 缺 失 插 入 和 / 或 取 代, 以 及 在 C 末 端 和 / 或 N 末 端 添 加 或 缺 失 一 个 或 数 个 ( 通 常 为 20 个 以 内, 较 佳 地 为 10 个 以 内, 更 佳 地 为 5 个 以 内 ) 氨 基 酸 例 如, 在 本 领 域 中, 用 性 能 相 近 或 相 似 的 氨 基 酸 进 行 取 代 时, 通 常 不 会 改 变 蛋 白 质 的 功 能 又 比 如, 在 C 末 端 和 / 或 N 末 端 添 加 或 缺 失 一 个 或 数 个 氨 基 酸 通 常 也 不 会 改 变 蛋 白 质 的 功 能 该 术 语 还 包 括 RAMOSA2 多 肽 的 活 性 片 段 和 活 性 衍 生 物 [0061] 多 肽 的 变 异 形 式 包 括 : 同 源 序 列 保 守 性 变 异 体 等 位 变 异 体 天 然 突 变 体 诱 导 突 变 体 在 高 或 低 的 严 紧 度 条 件 下 能 与 RAMOSA2 多 肽 的 DNA 杂 交 的 DNA 所 编 码 的 多 肽 以 及 利 用 抗 RAMOSA2 多 肽 的 抗 血 清 获 得 的 多 肽 或 蛋 白 本 发 明 还 提 供 了 其 他 多 肽, 如 包 含 RAMOSA2 多 肽 或 其 片 段 的 融 合 多 肽 除 了 几 乎 全 长 的 多 肽 外, 本 发 明 还 包 括 了 RAMOSA2 多 肽 的 可 溶 性 片 段 通 常, 该 片 段 具 有 RAMOSA2 多 肽 序 列 的 至 少 约 20 个 连 续 氨 基 酸, 通 常 至 少 约 30 个 连 续 氨 基 酸, 较 佳 地 至 少 约 50 个 连 续 氨 基 酸, 更 佳 地 至 少 约 80 个 连 续 氨 基 酸, 最 佳 地 至 少 约 100 个 连 续 氨 基 酸 [0062] 本 发 明 还 提 供 RAMOSA2 多 肽 的 类 似 物 这 些 类 似 物 与 天 然 RAMOSA2 多 肽 的 差 别 可 7

说 明 书 5/11 页 以 是 氨 基 酸 序 列 上 的 差 异, 也 可 以 是 不 影 响 序 列 的 修 饰 形 式 上 的 差 异, 或 者 兼 而 有 之 这 些 多 肽 包 括 天 然 或 诱 导 的 遗 传 变 异 体 诱 导 变 异 体 可 以 通 过 各 种 技 术 得 到, 如 通 过 辐 射 或 暴 露 于 诱 变 剂 而 产 生 随 机 诱 变, 还 可 通 过 定 点 诱 变 法 或 其 他 已 知 分 子 生 物 学 的 技 术 类 似 物 还 包 括 具 有 不 同 于 天 然 L- 氨 基 酸 的 残 基 ( 如 D- 氨 基 酸 ) 的 类 似 物, 以 及 具 有 非 天 然 存 在 的 或 合 成 的 氨 基 酸 ( 如 β γ- 氨 基 酸 ) 的 类 似 物 应 理 解, 本 发 明 的 RAMOSA2 多 肽 并 不 限 于 上 述 例 举 的 代 表 性 的 多 肽 [0063] 修 饰 ( 通 常 不 改 变 一 级 结 构 ) 形 式 包 括 : 体 内 或 体 外 的 多 肽 的 化 学 衍 生 形 式 如 乙 酰 化 或 羧 基 化 修 饰 还 包 括 糖 基 化 修 饰 形 式 还 包 括 具 有 磷 酸 化 氨 基 酸 残 基 ( 如 磷 酸 酪 氨 酸, 磷 酸 丝 氨 酸, 磷 酸 苏 氨 酸 ) 的 序 列 还 包 括 被 修 饰 从 而 提 高 了 其 抗 蛋 白 水 解 性 能 或 优 化 了 溶 解 性 能 的 多 肽 [0064] 在 本 发 明 中, RAMOSA2 多 肽 保 守 性 变 异 多 肽 指 与 SEQ ID NO :2 的 氨 基 酸 序 列 相 比, 有 至 多 20 个, 较 佳 地 至 多 10 个, 更 佳 地 至 多 5 个, 最 佳 地 至 多 3 个 氨 基 酸 被 性 质 相 似 或 相 近 的 氨 基 酸 所 替 换 而 形 成 多 肽 这 些 保 守 性 变 异 多 肽 最 好 根 据 表 1 进 行 氨 基 酸 替 换 而 产 生 [0065] 表 1 [0066] 氨 基 酸 残 基 代 表 性 的 取 代 优 选 的 取 代 Ala(A) Val ;Leu ;Ile Val Arg(R) Lys ;Gln ;Asn Lys Asn(N) Gln ;His ;Lys ;Arg Gln Asp(D) Glu Glu Cys(C) Ser Ser Gln(Q) Asn Asn Glu(E) Asp Asp Gly(G) Pro ;Ala Ala His(H) Asn ;Gln ;Lys ;Arg Arg Ile(I) Leu ;Val ;Met ;Ala ;Phe Leu Leu(L) Ile ;Val ;Met ;Ala ;Phe Ile Lys(K) Arg ;Gln ;Asn Arg [0067] 8

说 明 书 Met(M) Leu ;Phe ;Ile Leu 6/11 页 Phe(F) Leu ;Val ;Ile ;Ala ;Tyr Leu Pro(P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr(T) Ser Ser Trp(W) Tyr ;Phe Tyr Tyr(Y) Trp ;Phe ;Thr ;Ser Phe Val(V) Ile ;Leu ;Met ;Phe ;Ala Leu [0068] 本 发 明 还 提 供 了 编 码 本 发 明 RAMOSA2 多 肽 或 其 保 守 性 变 异 多 肽 的 多 核 苷 酸 序 列 [0069] 本 发 明 的 多 核 苷 酸 可 以 是 DNA 形 式 或 RNA 形 式 DNA 形 式 包 括 cdna 基 因 组 DNA 或 人 工 合 成 的 DNA DNA 可 以 是 单 链 的 或 是 双 链 的 DNA 可 以 是 编 码 链 或 非 编 码 链 编 码 成 熟 多 肽 的 编 码 区 序 列 可 以 与 SEQ ID NO :1 所 示 的 编 码 区 序 列 相 同 或 者 是 简 并 的 变 异 体 如 本 文 所 用, 简 并 的 变 异 体 在 本 发 明 中 是 指 编 码 具 有 SEQ ID NO :2 的 多 肽 或 其 衍 生 多 肽, 但 与 SEQ ID NO :1 任 一 所 示 的 编 码 区 序 列 有 差 别 的 核 酸 序 列 [0070] 编 码 SEQ ID NO :2 的 成 熟 多 肽 的 多 核 苷 酸 包 括 : 只 编 码 成 熟 多 肽 的 编 码 序 列 ; 成 熟 多 肽 的 编 码 序 列 和 各 种 附 加 编 码 序 列 ; 成 熟 多 肽 的 编 码 序 列 ( 和 任 选 的 附 加 编 码 序 列 ) 以 及 非 编 码 序 列 [0071] 术 语 编 码 多 肽 的 多 核 苷 酸 可 以 是 包 括 编 码 此 多 肽 的 多 核 苷 酸, 也 可 以 是 还 包 括 附 加 编 码 和 / 或 非 编 码 序 列 的 多 核 苷 酸 [0072] 本 发 明 还 涉 及 上 述 多 核 苷 酸 的 变 异 体, 其 编 码 与 本 发 明 有 相 同 的 氨 基 酸 序 列 的 多 肽 或 多 肽 的 片 段 类 似 物 和 衍 生 物 此 多 核 苷 酸 的 变 异 体 可 以 是 天 然 发 生 的 等 位 变 异 体 或 非 天 然 发 生 的 变 异 体 这 些 核 苷 酸 变 异 体 包 括 取 代 变 异 体 缺 失 变 异 体 和 插 入 变 异 体 如 本 领 域 所 知 的, 等 位 变 异 体 是 一 个 多 核 苷 酸 的 替 换 形 式, 它 可 能 是 一 个 或 多 个 核 苷 酸 的 取 代 缺 失 或 插 入, 但 不 会 从 实 质 上 改 变 其 编 码 的 多 肽 的 功 能 [0073] 本 发 明 还 涉 及 与 上 述 的 序 列 杂 交 且 两 个 序 列 之 间 具 有 至 少 80%, 更 佳 地 至 少 88% 相 同 性 的 多 核 苷 酸 本 发 明 特 别 涉 及 在 严 格 条 件 下 与 本 发 明 所 述 多 核 苷 酸 可 杂 交 的 多 核 苷 酸 在 本 发 明 中, 严 格 条 件 是 指 :(1) 在 较 低 离 子 强 度 和 较 高 温 度 下 的 杂 交 和 洗 脱, 如 0.2 SSC,0.I% SDS,60 ; 或 (2) 杂 交 时 加 有 变 性 剂, 如 50% (v/v) 甲 酰 胺,0.1% 小 牛 血 清 /0.1% Ficoll,42 等 ; 或 (3) 仅 在 两 条 序 列 之 间 的 相 同 性 至 少 在 80% 以 上, 较 好 至 少 90% 以 上, 更 好 是 95% 以 上 时 才 发 生 杂 交 并 且, 可 杂 交 的 多 核 苷 酸 编 码 的 多 肽 与 SEQ ID NO :2 所 示 的 成 熟 多 肽 有 相 同 的 生 物 学 功 能 和 活 性 [0074] 本 发 明 也 涉 及 包 含 本 发 明 的 多 核 苷 酸 的 载 体, 以 及 用 本 发 明 的 载 体 或 RAMOSA2 多 肽 编 码 序 列 经 基 因 工 程 产 生 的 宿 主 细 胞, 以 及 经 重 组 技 术 产 生 本 发 明 所 述 多 肽 的 方 法 [0075] RAMOSA2 多 肽 多 核 苷 酸 序 列 可 插 入 到 重 组 表 达 载 体 中 术 语 重 组 表 达 载 体 指 本 9

说 明 书 7/11 页 领 域 熟 知 的 细 菌 质 粒 噬 菌 体 酵 母 质 粒 植 物 细 胞 病 毒 哺 乳 动 物 细 胞 病 毒 或 其 他 载 体 总 之, 只 要 能 在 宿 主 体 内 复 制 和 稳 定, 任 何 质 粒 和 载 体 都 可 以 用 表 达 载 体 的 一 个 重 要 特 征 是 通 常 含 有 复 制 起 点 启 动 子 标 记 基 因 和 翻 译 控 制 元 件 本 领 域 的 技 术 人 员 熟 知 的 方 法 能 用 于 构 建 含 RAMOSA2 多 肽 编 码 DNA 序 列 和 合 适 的 转 录 / 翻 译 控 制 信 号 的 表 达 载 体 [0076] 包 含 上 述 的 适 当 DNA 序 列 以 及 适 当 启 动 子 或 者 控 制 序 列 的 载 体, 可 以 用 于 转 化 适 当 的 宿 主 细 胞, 以 使 其 能 够 表 达 蛋 白 质 宿 主 细 胞 可 以 是 原 核 细 胞, 如 细 菌 细 胞 ; 或 是 低 等 真 核 细 胞, 如 酵 母 细 胞 ; 或 是 高 等 真 核 细 胞, 如 植 物 细 胞 代 表 性 例 子 有 : 大 肠 杆 菌, 链 霉 菌 属 农 杆 菌 ; 真 菌 细 胞 如 酵 母 ; 植 物 细 胞 等 [0077] 编 码 RAMOSA2 多 肽 的 基 因 在 高 等 真 核 细 胞 中 表 达 时, 如 果 在 载 体 中 插 入 增 强 子 序 列 时 将 会 使 转 录 得 到 增 强 增 强 子 是 DNA 的 顺 式 作 用 因 子, 通 常 大 约 有 10 到 300 个 碱 基 对, 作 用 于 启 动 子 以 增 强 基 因 的 转 录 [0078] 本 领 域 一 般 技 术 人 员 都 清 楚 如 何 选 择 适 当 的 载 体 启 动 子 增 强 子 和 宿 主 细 胞 [0079] 用 重 组 DNA 转 化 宿 主 细 胞 可 用 本 领 域 技 术 人 员 熟 知 的 常 规 技 术 进 行 转 化 植 物 可 使 用 农 杆 菌 转 化 或 基 因 枪 转 化 等 方 法, 例 如 叶 盘 法 水 稻 幼 胚 转 化 法 等 对 于 转 化 的 植 物 细 胞 组 织 或 器 官 可 以 用 常 规 方 法 再 生 成 植 株, 从 而 获 得 性 状 发 生 改 变 的 植 物 [0080] 本 发 明 提 供 了 所 述 的 RAMOSA2 多 肽 或 其 编 码 基 因 的 用 途, 用 于 调 节 植 物 株 高 穗 表 型 或 支 梗 长 度 在 一 种 方 式 下, 上 调 RAMOSA2 多 肽 的 表 达 或 活 性 可 用 于 矮 化 植 物 株 型 ; 使 植 物 的 穗 呈 现 密 穗 表 型 ; 或 缩 短 植 物 支 梗 长 度 在 另 一 种 方 式 下, 下 调 RAMOSA2 多 肽 的 表 达 或 活 性 可 使 植 物 的 穗 呈 现 稀 穗 表 型 ; 或 延 长 植 物 支 梗 长 度 [0081] 因 此, 可 基 于 RAMOSA2 多 肽 对 于 植 物 的 上 述 影 响 作 用 来 改 变 植 物, 从 而 达 到 根 据 实 际 生 产 需 要 改 良 植 物 品 质 的 目 的 较 佳 地, 所 述 的 植 物 是 禾 本 科 植 物 ; 最 佳 地, 所 述 的 植 物 是 水 稻 [0082] 本 发 明 还 涉 及 RAMOSA2 多 肽 或 其 编 码 基 因 的 上 调 剂 或 下 调 剂 ( 如 反 义 的 RAMOSA2 基 因, 或 sirna,mirna,shrna, 反 义 核 苷 酸 ) 及 其 用 途 由 于 RAMOSA2 的 上 调 剂 或 下 调 剂 可 调 节 RAMOSA2 的 表 达 和 / 或 调 节 RAMOSA2 的 活 性 等, 因 此, 所 述 的 RAMOSA2 的 上 调 剂 或 下 调 剂 可 通 过 对 RAMOSA2 的 影 响 来 调 节 植 物 的 表 型 ( 包 括 株 高 穗 表 型 以 及 枝 梗 长 度 ), 从 而 达 到 改 良 植 物 的 目 的 [0083] 任 何 可 调 节 RAMOSA2 多 肽 的 活 性 调 节 RAMOSA2 多 肽 的 稳 定 性 促 进 或 抑 制 RAMOSA2 基 因 的 表 达 延 长 或 减 少 RAMOSA2 多 肽 有 效 作 用 时 间 或 促 进 或 降 低 RAMOSA2 基 因 的 转 录 和 翻 译 的 物 质 均 可 用 于 本 发 明, 作 为 可 用 于 调 节 植 物 的 表 型 ( 包 括 株 高 穗 表 型 以 及 枝 梗 长 度 ) 的 有 效 物 质 [0084] 本 发 明 还 涉 及 一 种 调 节 植 物 株 高 穗 表 型 以 及 枝 梗 长 度 的 方 法, 该 方 法 包 括 调 节 所 述 植 物 中 RAMOSA2 多 肽 的 表 达 [0085] 一 方 面, 本 发 明 提 供 了 一 种 矮 化 植 物 株 型 使 穗 呈 现 密 穗 表 型 或 缩 短 支 梗 长 度 的 方 法, 所 述 的 方 法 包 括 : 上 调 植 物 中 RAMOSA2 多 肽 或 其 编 码 基 因 的 表 达 [0086] 另 一 方 面, 本 发 明 还 提 供 了 一 种 使 穗 呈 现 稀 穗 表 型 或 延 长 支 梗 长 度 的 方 法, 所 述 的 方 法 包 括 : 下 调 所 述 植 物 中 RAMOSA2 多 肽 的 表 达 ( 包 括 使 RAMOSA2 多 肽 不 表 达 或 低 表 达 ) 一 级 和 二 级 支 梗 的 长 度 的 延 长 可 以 为 小 穗 和 籽 粒 的 发 育 提 供 了 更 加 充 分 的 空 间 结 构, 从 而 为 增 加 作 物 产 量 方 面 提 供 了 空 间 将 支 梗 长 度 延 长 的 植 物 与 产 量 高 的 植 物 进 行 杂 交, 10

说 明 书 8/11 页 有 望 获 得 产 量 进 一 步 增 加 的 植 物 所 述 的 植 物 较 佳 地 为 禾 本 科 植 物, 更 佳 地 为 水 稻 [0087] 在 得 知 了 所 述 的 RAMOSA2 多 肽 的 用 途 后, 可 以 采 用 本 领 域 人 员 熟 知 的 多 种 方 法 来 调 节 所 述 的 RAMOSA2 多 肽 的 表 达 比 如 可 通 过 一 定 的 途 径 将 携 带 RAMOSA2 编 码 基 因 的 表 达 单 位 ( 比 如 表 达 载 体 或 病 毒 等 ) 递 送 到 靶 点 上, 并 使 之 表 达 活 性 的 RAMOSA2 多 肽 此 外, 也 可 以 采 用 本 领 域 人 员 熟 知 的 多 种 方 法 来 降 低 RAMOSA2 多 肽 的 表 达 或 使 之 缺 失 表 达, 比 如 将 携 带 反 义 RAMOSA2 基 因 的 表 达 单 位 ( 比 如 表 达 载 体 或 病 毒 等 ) 递 送 到 靶 点 上, 使 得 细 胞 或 植 物 组 织 不 表 达 或 降 低 表 达 RAMOSA2 多 肽 或 将 下 调 RAMOSA2 基 因 转 录 多 肽 表 达 或 多 肽 活 性 的 下 调 剂 转 入 植 物 中 ; 例 如, 所 述 的 下 调 剂 是 特 异 性 干 扰 RAMOSA2 基 因 转 录 的 干 扰 分 子 [0088] 作 为 本 发 明 的 一 种 实 施 方 式, 将 RAMOSA2 多 肽 的 编 码 基 因 通 过 常 规 的 方 法 克 隆 到 适 当 的 载 体 中, 将 所 述 的 带 有 外 源 基 因 的 重 组 载 体 导 入 到 可 表 达 所 述 RAMOSA2 多 肽 的 植 物 细 胞 中, 使 所 述 的 植 物 细 胞 表 达 RAMOSA2 多 肽 可 通 过 将 所 述 植 物 细 胞 再 生 成 植 物, 获 得 过 量 表 达 RAMOSA2 多 肽 的 植 物 [0089] 优 选 的, 一 种 矮 化 植 物 株 型 使 穗 呈 现 密 穗 表 型 或 缩 短 支 梗 长 度 的 方 法 包 括 : [0090] (1) 提 供 携 带 表 达 载 体 的 农 杆 菌, 所 述 的 表 达 载 体 含 有 与 表 达 载 体 正 向 连 接 的 RAMOSA2 的 编 码 基 因 ; [0091] (2) 将 植 物 细 胞 组 织 或 器 官 与 步 骤 (1) 中 的 农 杆 菌 接 触, 从 而 使 RAMOSA2 的 编 码 基 因 转 入 植 物 细 胞 ; [0092] (3) 选 择 出 转 入 了 RAMOSA2 的 编 码 基 因 的 植 物 细 胞 组 织 器 官 ; 和 [0093] (4) 将 步 骤 (3) 中 的 植 物 细 胞 组 织 器 官 再 生 并 选 出 转 基 因 植 物, 即 为 所 需 的 转 基 因 植 物 [0094] 优 选 的, 一 种 使 穗 呈 现 稀 穗 表 型 或 延 长 支 梗 长 度 的 方 法 包 括 : [0095] (s1) 提 供 携 带 表 达 载 体 的 农 杆 菌, 所 述 的 表 达 载 体 含 有 RAMOSA2 基 因 的 干 扰 分 子 ( 包 括 但 不 限 于 dsrna 反 义 核 酸 小 干 扰 RNA 微 小 RNA, 或 能 表 达 或 形 成 所 述 dsrna 反 义 核 酸 小 干 扰 RNA 微 小 RNA 的 构 建 物 ) ; [0096] (s2) 将 植 物 细 胞 组 织 或 器 官 与 步 骤 (s1) 中 的 农 杆 菌 接 触, 从 而 使 所 述 RAMOSA2 基 因 的 干 扰 分 子 转 入 植 物 细 胞 ; [0097] (s3) 选 择 出 转 入 了 RAMOSA2 基 因 的 干 扰 分 子 的 植 物 细 胞 组 织 器 官 ; 和 [0098] (s4) 将 步 骤 (s3) 中 的 植 物 细 胞 组 织 器 官 再 生 并 选 出 转 基 因 植 物, 即 为 所 需 的 转 基 因 植 物 [0099] 如 本 文 所 用, 所 述 的 正 向 连 接 是 指 :RAMOSA2 的 编 码 基 因 与 表 达 载 体 的 连 接 是 正 义 的 连 接, 即 编 码 基 因 按 照 5 3 的 方 向 连 接 于 载 体 上 通 常,RAMOSA2 的 编 码 基 因 位 于 表 达 载 体 中 启 动 子 的 下 游, 也 即 启 动 子 的 3 端 下 游 连 接 该 编 码 基 因 的 5 端 所 述 的 编 码 基 因 是 可 操 作 性 地 连 接 到 表 达 载 体 上 的 所 述 的 操 作 性 连 接 或 可 操 作 地 连 于 指 这 样 一 种 状 况, 即 线 性 DNA 序 列 的 某 些 部 分 能 够 调 节 或 控 制 同 一 线 性 DNA 序 列 其 它 部 分 的 活 性 例 如, 如 果 启 动 子 控 制 序 列 的 转 录, 那 么 它 就 是 可 操 作 地 连 于 编 码 序 列 [0100] 可 采 用 任 何 适 当 的 常 规 手 段, 包 括 试 剂 温 度 压 力 条 件 等 来 实 施 所 述 的 方 法 其 它 增 加 RAMOSA2 表 达 的 方 法 是 本 领 域 周 知 的 例 如, 可 通 过 用 强 启 动 子 驱 动 从 而 增 强 RAMOSA2 的 表 达 或 者 通 过 增 强 子 来 增 强 该 RAMOSA2 基 因 的 表 达 适 用 于 本 发 明 方 法 的 强 启 动 子 包 括 但 不 限 于 :35s 启 动 子 水 稻 玉 米 的 Ubi 启 动 子 等 11

说 明 书 9/11 页 [0101] RAMOSA2 多 肽 的 编 码 基 因 的 另 一 个 应 用 作 为 鉴 定 植 物 株 高 穗 表 型 或 支 梗 长 度 的 分 子 标 记 可 通 过 分 析 待 测 植 物 ( 如 植 物 的 种 子 或 幼 苗 ) 中 RAMOSA2 多 肽 的 表 达 情 况, 来 判 断 其 株 高 穗 表 型 或 支 梗 长 度 例 如, 鉴 定 到 植 物 中 RAMOSA2 多 肽 的 表 达 低 或 无, 则 该 植 株 可 呈 现 稀 穗 表 型 或 支 梗 长 度 延 长 的 表 型 ; 而 若 鉴 定 到 RAMOSA2 多 肽 的 较 高 表 达 ( 过 量 表 达 ), 则 该 植 株 可 呈 现 株 型 矮 化 密 穗 表 型 或 支 梗 长 度 缩 短 的 表 型 [0102] 下 面 结 合 具 体 实 施 例, 进 一 步 阐 述 本 发 明 应 理 解, 这 些 实 施 例 仅 用 于 说 明 本 发 明 而 不 用 于 限 制 本 发 明 的 范 围 下 列 实 施 例 中 未 注 明 具 体 条 件 的 实 验 方 法, 通 常 按 照 常 规 条 件 如 J. 萨 姆 布 鲁 克 等 编 著, 分 子 克 隆 实 验 指 南, 科 学 出 版 社,2002 中 所 述 的 条 件, 或 按 照 制 造 厂 商 所 建 议 的 条 件 除 非 另 外 说 明, 否 则 百 分 比 和 份 数 按 重 量 计 算 [0103] 除 非 另 行 定 义, 文 中 所 使 用 的 所 有 专 业 与 科 学 用 语 与 本 领 域 熟 练 人 员 所 熟 悉 的 意 义 相 同 此 外, 任 何 与 所 记 载 内 容 相 似 或 均 等 的 方 法 及 材 料 皆 可 应 用 于 本 发 明 中 文 中 所 述 的 较 佳 实 施 方 法 与 材 料 仅 作 示 范 之 用 [0104] 实 施 例 1 水 稻 中 OsRAMOSA2 基 因 的 克 隆 [0105] 水 稻 中 OsRAMOSA2 基 因 在 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 中 基 因 序 列 号 为 NC_008394, 在 tigr(www.tigr.org) 中 的 序 列 号 为 LOC_Os01g07480 其 cdna 序 列 如 SEQ ID NO :1 所 示, 多 肽 序 列 如 SEQ ID NO :2 所 示 [0106] 实 施 例 2 水 稻 中 OsRAMOSA2 基 因 超 表 达 的 表 型 分 析 [0107] 用 PCR 的 方 法, 以 水 稻 基 因 组 为 模 板, 以 引 物 gggatccaaatggcatcctcgtcgagcacc( SEQ ID NO :3) 和 gggtacccatcaaggccaaagcgcagat(seq ID NO :4) 扩 增 得 到 OsRAMOSA2 基 因 组 全 长 序 列 片 段, 克 隆 到 超 表 达 载 体 p1301-35snos( 图 9) 的 BamHI/KpnI 位 点 内, 用 农 杆 菌 (EHA105) 介 导 的 方 法 转 化 野 生 型 水 稻 中 花 11(Zh11) [0108] 随 机 选 取 了 三 株 转 基 因 植 株 (OsRAMOSA2OE), 以 引 物 cgcagaagttcgccaacgtc(seq ID NO :5) 和 atcaaggccaaagcgcagat(seq ID NO :6) 进 行 RT-PCR 检 测, 证 实 转 基 因 植 株 中 OsRAMOSA2 基 因 的 表 达 被 明 显 上 调, 如 图 1 [0109] 观 察 转 基 因 植 株 的 表 型 变 化, 转 基 因 植 株 呈 现 出 矮 化 和 密 穗 的 表 型 将 转 基 因 植 株 的 T1 代 种 植 于 海 南 大 田 (2010 年 冬 天 ), 选 取 有 密 穗 表 型 的 单 株 进 行 农 艺 性 状 统 计, 结 果 如 表 2 转 基 因 植 株 明 显 矮 于 对 照 ( 图 2A) ; 转 基 因 植 株 的 一 级 支 梗 和 二 级 支 梗 的 长 度 明 显 短 于 对 照, 这 些 因 素 造 成 了 转 基 因 植 株 非 常 明 显 的 密 穗 表 型 ( 图 2B-C) [0110] 表 2 OsRAMOSA2 基 因 超 表 达 转 基 因 植 株 的 部 分 农 艺 性 状 统 计 12

说 明 书 10/11 页 [0111] [0112] [0113] 实 施 例 3 OsRAMOSA2 基 因 编 码 蛋 白 的 亚 细 胞 定 位 分 析 [0114] 用 PCR 的 方 法, 以 水 稻 基 因 组 为 模 板, 以 引 物 gggatccaaatggcatcctcgtcgagcacc (SEQ ID NO :3) 和 gggtacccatcaaggccaaagcgcagat(seq ID NO :4) 扩 增 得 到 OsRAMOSA2 基 因 的 全 长 序 列 片 段, 然 后 通 过 BamHI 和 KpnI 酶 切, 克 隆 到 蛋 白 表 达 载 体 pa7-gfp 中 的 XhoI 和 SpeI 位 点 内 上, 并 转 化 到 拟 南 芥 (Col) 原 生 质 体 中, 通 过 激 光 扫 描 共 聚 焦 显 微 镜 (Confocol) 检 测 融 合 蛋 白 的 亚 细 胞 定 位 情 况 [0115] 表 达 载 体 pa7-gfp 的 建 立 : 将 CaMV 35S-MCS-GFP-MCS-Nos3 cassette(hindiii/ EcoRI fragment) 插 入 到 质 粒 puc18(new England Biolabs,Frankfurt Am Main,Germany) 中 CaMV 35S-MCS-GFP-MCS-Nos3 是 利 用 HindIII/EcoRI 从 p35s-gfp-jfh1(hong et al., 1999,Identification of a calmodulin-regulated Ca2+-ATPase in the endoplasmatic reticulum.plant Physiol.119,1165-1175) 酶 切 获 得 [0116] 检 测 显 示, 蛋 白 定 位 在 细 胞 质 中, 如 图 3 [0117] 实 施 例 4 OsRAMOSA2 基 因 在 水 稻 生 长 发 育 过 程 中 的 表 达 谱 [0118] 在 水 稻 生 长 发 育 的 不 同 时 期, 取 不 同 的 组 织 部 位, 以 引 物 cgcagaagttcgccaacgtc(seq ID NO :5) 和 atcaaggccaaagcgcagat(seq ID NO :6), 进 行 RT-PCR 的 实 验, 检 测 了 OsRAMOSA2 基 因 在 水 稻 不 同 组 织 部 位 和 时 期 的 表 达 谱, 结 果 如 图 4 OsRAMOSA2 基 因 在 水 稻 不 同 组 织 部 位 均 有 表 达, 其 中 在 茎 穗 生 长 点 和 小 花 中 的 表 达 比 较 13

说 明 书 11/11 页 强 [0119] 为 深 入 揭 示 OsRAMOSA2 基 因 对 穗 型 发 育 的 作 用, 本 发 明 人 对 穗 发 育 过 程 中 OsRAMOSA2 基 因 的 表 达 进 行 了 原 位 杂 交 的 分 析, 结 果 显 示 OsRAMOSA2 基 因 主 要 在 一 级 支 梗 原 基 ( 图 5A B) 二 级 支 梗 原 基 ( 图 5C) 及 颖 花 原 基 部 位 ( 图 5D) 表 达, 可 见 在 一 级 支 梗 原 基 和 二 级 支 梗 原 基 部 位 的 表 达 比 较 强, 在 颖 花 原 基 部 位 表 达 比 较 弱 [0120] 实 施 例 5 OsRAMOSA2 基 因 的 RNAi 转 基 因 分 析 [0121] 本 发 明 人 选 取 OsRAMOSA2 基 因 的 一 个 比 较 特 异 的 片 段 (SEQ ID NO :1 中 第 173-332 位 ), 以 pcambia1301( 购 自 Cambia 公 司 ) 为 骨 架, 构 建 了 OsRAMOSA2 基 因 的 RNAi 载 体 pcambia1301rnai( 图 10), 利 用 引 物 gggagctcggatccgaaatggcatcctcgtcgagcacc(seq ID NO :7) 和 gggactagtggtaccgcgggaagtaaggagcgaacacg(seq ID NO :8) 扩 增 获 得 包 含 SEQ ID NO :1 中 第 173-332 位 的 片 段, 插 入 到 的 pcambia1301rnai 的 BamHI 和 KpnI 位 点 中, 然 后 用 SpeI 和 SacI 反 向 插 入 该 片 段 发 夹 结 构 的 环 结 构 是 存 在 于 质 粒 上 的 一 个 不 相 关 片 段 [0122] 通 过 农 杆 菌 (EHA105) 介 导 的 遗 传 转 化 方 法, 将 前 段 获 得 的 重 组 质 粒 转 化 到 野 生 型 水 稻 中 花 11 中 目 前 已 经 得 到 转 基 因 植 株, 随 机 选 取 了 5 株 转 基 因 植 株, 通 过 RT-PCR 的 方 法, 证 实 了 其 中 OsRAMOSA2 基 因 的 表 达 被 下 调, 如 图 6 [0123] 观 察 转 基 因 植 株 的 表 型, 发 现 OsRAMOSA2RNAi 转 基 因 植 株 的 整 体 表 型 为 稀 穗 表 型, 与 野 生 型 相 比,OsRAMOSA2RNAi 转 基 因 植 株 的 一 级 和 二 级 支 梗 明 显 延 长, 如 图 7-8 而 OsRAMOSA2 基 因 超 表 达 转 基 因 植 株 的 二 级 支 梗 明 显 缩 短, 如 图 7-8 [0124] 结 论 [0125] 综 上, 超 表 达 OSRAMOSA2 基 因 造 成 了 非 常 明 显 的 密 穗 表 型, 分 析 原 因 是 一 级 和 二 级 支 梗 的 缩 短 造 成 的 ; 同 时, 本 发 明 人 对 OSRAMOSA2 基 因 进 行 了 RNAi 功 能 下 调 研 究, 发 现 转 基 因 植 株 的 穗 出 现 一 级 和 二 级 支 梗 延 长 的 表 型, 从 而 整 体 体 现 为 相 对 稀 穗 的 表 型 OSRAMOSA2 蛋 白 定 位 在 细 胞 质 中 ; 与 穗 型 发 育 的 功 能 相 适 应,OSRAMOSA2 基 因 在 茎 穗 生 长 点 和 小 花 中 的 表 达 比 较 强 可 以 认 为 :OSRAMOSA2 基 因 的 RNAi 由 于 延 长 了 一 级 和 二 级 支 梗 的 长 度, 从 而 为 小 穗 和 籽 粒 的 发 育 提 供 了 更 加 充 分 的 空 间 结 构, 从 而 在 增 加 产 量 方 面 具 有 潜 力, 对 于 增 加 作 物 产 量 具 有 重 要 意 义 [0126] 在 本 发 明 提 及 的 所 有 文 献 都 在 本 申 请 中 引 用 作 为 参 考, 就 如 同 每 一 篇 文 献 被 单 独 引 用 作 为 参 考 那 样 此 外 应 理 解, 在 阅 读 了 本 发 明 的 上 述 讲 授 内 容 之 后, 本 领 域 技 术 人 员 可 以 对 本 发 明 作 各 种 改 动 或 修 改, 这 些 等 价 形 式 同 样 落 于 本 申 请 所 附 权 利 要 求 书 所 限 定 的 范 围 14

序 列 表 1/3 页 [0001] [0002] 15

序 列 表 2/3 页 [0003] 16

序 列 表 3/3 页 17

说 明 书 附 图 1/5 页 图 1 图 2 18

说 明 书 附 图 2/5 页 图 3 图 4 图 5 19

说 明 书 附 图 3/5 页 图 6 图 8 图 7 20

说 明 书 附 图 4/5 页 图 9 21

说 明 书 附 图 5/5 页 图 10 22