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综 合 性 设 计 性 实 验 指 导 手 册 ( 安 徽 医 科 大 学 卫 生 毒 理 学 系 编 写 ) 引 言 毒 理 学 是 一 门 研 究 外 源 因 素 ( 包 括 物 理 因 素 化 学 因 素 和 生 物 因 素 等 ) 对 机 体 的 损 害 作 用 及 其 机 制, 并 进 行 安 全 性 评 价 和 危 险 度 管 理 的 科 学 毒 理 学 既 是 一 门 基 础 学 科, 也 是 一 门 应 用 学 科 随 着 社 会 生 产 的 发 展, 人 类 使 用 和 接 触 到 的 环 境 有 害 因 素 种 类 繁 多, 总 数 可 能 接 近 1000 万 种 为 了 保 护 环 境 促 进 健 康 和 防 治 疾 病, 目 前 急 需 大 量 的 毒 理 学 实 验 来 研 究 环 境 有 害 因 素 对 机 体 的 损 害 作 用 及 其 生 物 学 机 制 毒 理 学 也 是 一 门 以 动 物 实 验 为 中 心 的 实 验 科 学, 其 中 动 物 实 验 仍 是 当 前 研 究 环 境 有 害 因 素 对 机 体 损 害 作 用 及 其 机 制 的 重 要 方 法, 即 通 过 环 境 有 害 因 素 对 实 验 动 物 的 毒 性 效 应, 然 后 逐 步 向 人 外 推, 以 期 评 估 环 境 有 害 因 素 对 人 体 的 安 全 性 和 危 险 性 所 以, 毒 理 学 动 物 实 验 的 设 计 实 施 结 果 观 察 和 评 价 是 毒 理 学 研 究 的 基 本 功 传 统 毒 理 学 实 验 主 要 由 一 次 次 单 项 实 验 组 成, 大 多 数 实 验 之 间 无 相 互 关 联, 且 这 些 实 验 均 是 在 教 师 精 心 设 计 下, 实 验 员 老 师 在 每 次 试 验 前 充 分 准 备 受 试 动 物 试 剂 和 实 验 器 材, 甚 至 部 分 实 验 的 动 物 染 毒 也 是 由 老 师 负 责 完 成 在 这 些 独 立 实 验 中, 学 生 每 次 在 授 课 教 师 示 教 后 负 责 完 成 每 次 试 验 的 中 间 操 作 过 程, 而 对 每 次 试 验 的 现 实 意 义 和 实 验 的 技 术 要 点 很 难 在 短 时 间 内 领 会, 原 因 是 实 验 前 后 思 考 不 足, 更 有 可 能 是 长 期 的 思 维 定 势 仅 仅 要 求 学 生 模 仿 示 教 动 动 手 即 可, 学 生 整 体 动 脑 内 容 太 少, 学 生 的 学 习 积 极 性 未 能 调 动 起 来, 直 接 后 果 是 不 能 把 枯 燥 的 毒 理 学 基 础 理 论 知 识 和 实 践 内 容 联 系 起 来, 使 学 生 对 毒 理 学 基 础 理 论 的 掌 握 和 理 解 就 很 匮 乏, 更 不 要 说 对 毒 理 学 产 生 兴 趣, 这 也 导 致 学 生 在 近 年 来 考 研 志 愿 填 写 中 不 能 把 毒 理 学 放 在 优 先 选 择 的 位 置 的 可 能 原 因 综 上, 传 统 毒 理 学 实 验 远 远 不 能 满 足 当 前 的 社 会 需 求 为 了 培 养 学 生 发 现 问 题 分 析 问 题 和 解 决 问 题 的 能 力, 熟 悉 毒 理 学 全 套 毒 理 学 动 物 实 验 流 程, 本 学 科 系 决 定 在 预 防 医 学 专 业 优 先 开 设 综 合 性 设 计 性 实 验 教 学 课 程 改 革 1

综 合 性 实 验 是 指 在 学 生 具 有 一 定 基 础 知 识 和 基 本 操 作 技 能 的 基 础 上, 运 用 某 课 程 的 综 合 知 识 对 学 生 实 验 技 能 和 实 验 方 法 进 行 综 合 训 练 的 一 种 复 合 性 实 验, 其 主 要 目 的 是 对 学 生 的 实 验 技 能 进 行 综 合 训 练, 培 养 学 生 的 实 验 动 手 能 力 数 据 处 理 查 阅 资 料 以 及 综 合 分 析 问 题 的 能 力 而 设 计 性 实 验 是 指 给 定 实 验 目 的 实 验 要 求 和 实 验 条 件, 由 学 生 自 行 设 计 实 验 方 案 准 备 实 验 仪 器 和 试 剂 并 加 以 实 现 的 实 验, 其 主 要 目 的 在 于 激 发 学 生 学 习 的 主 动 性 和 创 新 意 识, 培 养 学 生 独 立 思 考 综 合 运 用 知 识 提 出 问 题 和 解 决 复 杂 问 题 的 能 力 本 次 综 合 性 设 计 性 实 验 的 基 本 方 案 如 下 : 1 实 验 准 备 阶 段 : 帮 助 学 生 学 会 毒 理 学 实 验 的 设 计 方 法 和 掌 握 毒 理 学 实 验 的 基 本 技 术, 详 见 实 验 一 ; 2 实 验 实 施 阶 段 : 学 生 自 主 完 成 对 乙 酰 氨 基 酚 的 LD 50 测 定 对 乙 酰 氨 基 酚 诱 导 小 鼠 急 性 肝 损 伤 模 型 的 建 立 小 鼠 血 清 丙 氨 酸 氨 基 转 移 酶 活 力 检 测 小 鼠 肝 脏 组 织 切 片 HE 染 色 及 其 评 价 小 鼠 肝 脏 组 织 还 原 型 谷 胱 甘 肽 含 量 测 定 和 小 鼠 肝 脏 组 织 丙 二 醛 含 量 测 定 等 试 验, 详 见 实 验 二 至 实 验 七 ; 3 实 验 总 结 报 告 : 学 生 及 时 对 以 上 七 项 系 列 试 验 结 果 进 行 整 理 和 统 计 分 析, 评 价 对 乙 酰 氨 基 酚 致 小 鼠 急 性 肝 损 伤 的 剂 量 - 效 应 关 系 以 及 可 能 的 作 用 机 理, 并 撰 写 一 篇 学 术 论 文, 详 见 实 验 八 通 过 本 次 综 合 性 设 计 性 实 验 的 开 展, 可 以 让 学 生 全 面 了 解 对 乙 酰 氨 基 酚 致 小 鼠 急 性 肝 脏 损 伤 及 其 作 用 机 制 探 讨 的 全 过 程, 熟 悉 研 究 设 计 流 程 和 各 种 实 验 的 技 术 要 点, 激 发 学 生 的 学 习 的 主 观 能 动 性, 培 养 学 生 分 析 问 题 和 解 决 问 题 的 能 力, 提 高 学 生 的 实 验 操 作 技 能, 增 强 学 生 的 团 队 协 作 意 识 和 创 新 意 识, 从 而 达 到 综 合 性 和 设 计 性 实 验 开 展 的 多 重 目 的 实 验 一 毒 理 学 实 验 相 关 理 论 知 识 介 绍 和 实 践 指 导 一 毒 理 学 实 验 相 关 理 论 知 识 介 绍 ( 一 ) 实 验 设 计 原 则 1. 随 机 化 : 动 物 实 验 中 通 过 对 实 验 动 物 随 机 化 分 组, 达 到 各 组 动 物 在 处 理 前 各 方 面 均 衡, 以 排 除 处 理 外 因 素 对 实 验 结 果 的 干 扰 一 般 根 据 体 重 蛇 形 分 组, 2

也 可 严 格 按 照 随 机 数 字 表 掷 硬 币 等 方 法 随 机 化 分 组 2. 对 照 : 在 动 物 实 验 中, 要 求 相 互 比 较 的 各 组 间 动 物 的 种 类 性 别 年 龄 和 体 重 等 尽 可 能 一 致 对 照 组 在 毒 理 学 实 验 中 与 实 验 组 同 等 重 要, 两 组 的 动 物 数 应 相 等 一 般 分 阴 性 对 照 组 和 阳 性 对 照 组, 前 者 包 括 空 白 对 照 溶 剂 对 照 或 自 身 对 照 等, 作 用 是 作 为 实 验 组 结 果 的 参 照 和 对 比 ; 后 者 也 称 为 标 准 对 照, 作 用 是 判 断 整 个 实 验 系 统 有 无 问 题 和 动 物 的 敏 感 性 等 3. 重 复 : 要 使 实 验 结 果 正 确 可 靠, 建 议 执 行 重 复 原 则 重 复 的 含 义 包 括 两 个 方 面 : 足 够 大 的 样 本 数 得 出 的 实 验 结 果 ; 不 同 次 实 验 结 果 的 可 重 复 性 4. 盲 法 : 在 毒 理 学 实 验 中, 有 时 也 要 贯 彻 盲 法 原 则, 避 免 实 验 者 主 观 因 素 引 起 实 验 结 果 的 偏 倚 包 括 单 盲 双 盲 和 三 盲, 前 两 者 在 毒 理 学 实 验 中 较 常 用 ( 二 ) 实 验 设 计 内 容 1. 明 确 实 验 目 的 : 按 照 任 务 要 求, 必 须 明 确 要 解 决 的 关 键 问 题, 涉 及 问 题 不 能 太 多 2. 查 阅 文 献 : 查 阅 国 内 外 与 本 实 验 内 容 有 关 的 文 献 专 著, 了 解 有 关 理 论 和 实 验 操 作 方 法, 借 鉴 前 人 经 验 3. 具 体 实 验 设 计 内 容, 包 括 确 定 动 物 品 系 和 数 量, 选 择 实 验 观 察 指 标, 实 验 动 物 如 何 分 组, 选 择 染 毒 方 式 设 计 染 毒 剂 量, 根 据 实 验 设 计 选 择 相 应 的 统 计 学 处 理 方 法 制 定 实 验 计 划 等 4. 进 行 预 实 验 : 通 过 小 样 本 预 实 验, 评 价 观 察 指 标 的 可 行 性, 熟 练 实 验 操 作 技 术, 改 进 实 验 方 法, 初 步 探 索 染 毒 剂 量 大 小 和 反 应 ( 效 应 ) 的 关 系, 以 便 确 定 正 式 实 验 中 可 行 的 剂 量 和 分 组 5. 编 制 实 验 记 录 表, 便 于 后 续 实 验 结 果 的 整 理 和 统 计 分 析 6. 统 计 分 析 和 撰 写 报 告 : 及 时 整 理 实 验 结 果, 进 行 统 计 处 理, 撰 写 论 文 报 告 ( 三 ) 动 物 实 验 的 职 业 道 德 动 物 实 验 管 理 条 例 规 定 对 待 实 验 动 物 必 须 爱 护, 不 得 戏 弄 或 虐 待 进 行 动 物 实 验 须 遵 循 4R 原 则, 即 Replacement 替 代 Reduction 减 少 Refinement 优 化 和 Responsibility 责 任 心 ( 四 ) 动 物 实 验 基 本 操 作 技 术 3

1. 动 物 管 理 : 每 天 写 试 验 记 录, 包 括 动 物 的 饲 养 健 康 状 况 气 候 条 件 ( 气 温 气 湿 光 照 通 风 ) 及 突 发 事 件 的 管 理 等 2. 受 试 物 和 样 品 的 准 备 : 应 了 解 受 试 物 的 纯 度 及 杂 质 成 分, 了 解 受 试 物 的 化 学 结 构 和 理 化 性 质, 特 别 是 其 挥 发 性 ( 熔 点 / 沸 点 ) 溶 解 性 ph 稳 定 性 ( 包 括 受 试 物 在 赋 形 剂 中 的 稳 定 性 ) 受 试 物 在 贮 存 期 内 稳 定 性 和 在 饲 料 中 的 稳 定 性 必 须 进 行 研 究 并 报 告 受 试 物 应 一 次 备 齐 全 部 实 验 的 用 量 所 需 受 试 物 总 量 = (A B C D) 1.2 式 中 :A 为 每 组 动 物 数 ;B 为 各 处 理 组 的 剂 量 和 ( 如 0.1+0.3+1.0mg/kg= 1.4mg/kg);C 为 染 毒 次 数 ( 通 常 为 天 );D 为 动 物 的 平 均 体 重 ; 1.2 为 安 全 因 子, 包 含 损 耗 量 对 水 溶 性 受 试 物, 体 内 试 验 首 选 的 溶 剂 为 水 ( 经 口 染 毒 ) 和 等 渗 盐 水 ( 胃 肠 道 外 染 毒 ); 水 不 溶 性 受 试 物 应 溶 于 或 悬 浮 于 适 当 的 有 机 溶 剂 中, 天 然 植 物 油 ( 如 玉 米 油, 橄 榄 油 ) 混 悬 液 最 常 用 的 赋 形 剂 为 0.5% 羧 甲 基 纤 维 素 钠 或 10% 阿 拉 伯 树 胶 受 试 物 溶 液 应 新 鲜 配 制, 除 非 已 证 明 贮 存 稳 定 3. 动 物 性 别 区 分 :(1) 大 小 鼠 : 最 常 用 方 法 是 根 据 生 殖 器 与 肛 门 的 距 离 大 小, 也 可 由 生 殖 器 大 小 有 无 肛 毛 成 年 雌 鼠 的 乳 房 发 育 情 况 及 成 年 雄 鼠 的 睾 丸 下 降 情 况 ;(2) 家 兔 : 把 生 殖 器 附 近 的 皮 肤 扒 开, 即 可 见 一 圆 孔 中 露 出 圆 锥 形 向 下 弯 曲 的 阴 茎 ( 幼 兔 为 凸 起 物 ), 可 见 一 朝 向 尾 部 的 长 缝, 呈 椭 圆 形 间 隙, 此 为 阴 道 开 口 处 4. 编 号 称 重 及 分 组 :(1) 编 号 : 按 顺 时 针 方 向 由 右 到 左 依 次 是 头 顶 右 前 肢 右 腰 右 后 肢 尾 根 左 后 肢 左 腰 左 前 肢 背 部, 其 中 咖 啡 色 表 示 百 位 红 色 表 示 十 位 黄 色 表 示 个 位 (2) 称 重 : 以 g 为 单 位 (3) 分 组 : 按 照 体 重 大 小 随 机 分 组 5. 动 物 抓 取 及 固 定 :(1) 小 鼠 : 把 小 鼠 尾 中 部 或 基 部 抓 住 提 取, 也 可 用 带 橡 皮 的 镊 子 夹 住 小 鼠 的 尾 部 ; 在 粗 糙 平 面 或 笼 子 上 用 右 手 提 尾 稍 向 后 轻 拉, 用 左 手 大 拇 指 食 指 中 指 抓 住 耳 后 颈 部 皮 肤, 用 左 手 无 名 指 小 指 及 大 鱼 际 肌 夹 住 背 部 皮 肤 和 尾 根, 然 后 调 整 姿 势 使 小 鼠 腹 部 朝 向 操 作 者, 即 可 固 定 操 作 (2) 大 鼠 : 张 开 左 手 虎 口, 把 拇 食 指 插 入 大 鼠 的 腋 下, 虎 口 向 前, 余 三 指 及 掌 心 握 住 大 鼠 身 体 中 段, 使 其 保 持 仰 卧 位, 再 用 左 拇 指 紧 抵 在 下 颌 骨 上 ; 用 拇 指 食 指 捏 住 大 鼠 耳 朵 头 颈 部 皮 肤, 另 外 三 指 紧 捏 住 背 部 皮 肤, 置 于 掌 心, 调 整 姿 势 即 可 4

操 作 (3) 家 兔 : 轻 轻 打 开 笼 门, 右 手 从 兔 头 前 部 把 两 耳 轻 压 于 手 掌 内, 使 其 卧 伏 不 动, 抓 住 颈 背 部 皮 肤 提 起, 并 用 左 手 托 住 兔 腹 部 ; 由 助 手 用 一 只 手 抓 住 颈 背 部 皮 肤, 另 一 只 手 抓 住 两 后 肢, 固 定 在 试 验 台 上, 即 可 进 行 操 作 6. 灌 胃 操 作 : 小 鼠 抓 取 固 定 后, 开 始 进 针, 一 般 深 度 为 从 口 角 至 剑 突 下 ( 大 小 鼠 进 针 深 度 分 别 为 4~6 cm 2.5~4 cm; 给 药 容 积 分 别 为 1~4 ml 0.2~1 ml), 灌 胃 针 头 由 小 鼠 口 角 侧 插 入, 沿 上 腭 壁 缓 慢 滑 入 食 管, 一 旦 感 觉 阻 力 消 失, 可 深 至 胃 部, 给 药 后 缓 慢 拔 出 针 头 若 遇 挣 扎 抵 抗, 则 停 止 进 针 或 拔 出 针 头 关 键 : 固 定 动 物 上 消 化 道 拉 / 压 直 沿 口 角 进 针 7. 静 脉 注 射 : 小 鼠 采 用 尾 静 脉 注 射, 具 体 方 法 为 先 固 定 好 小 鼠 尾 部, 再 通 过 酒 精 擦 浴 或 50 温 水 热 敷 以 充 分 暴 露 静 脉, 然 后 以 20 度 的 角 度 进 针, 进 针 后 回 抽 见 血 即 可 注 射 ; 兔 采 用 外 侧 耳 缘 静 脉 注 射 关 键 是 热 敷 使 血 管 扩 张 固 定 小 鼠 8. 小 鼠 眼 眶 静 脉 丛 取 血 : 固 定 小 鼠 使 眼 球 外 露 后 即 可 用 毛 细 吸 管 从 眼 眶 内 眦 处 以 45 度 角 刺 入, 捻 转 前 进, 右 手 持 容 器 收 集 血 液, 毛 细 管 拔 出 后, 用 干 棉 球 压 迫 止 血 ; 小 鼠 摘 眼 球 取 血 : 抓 取 小 鼠 双 耳 颈 部 皮 肤, 致 眼 球 突 出, 然 后 摘 取 眼 球, 放 血 至 预 先 准 备 的 1.5 ml 离 心 管 中 9. 动 物 的 处 死 方 法 : 颈 椎 脱 臼 法 空 气 栓 塞 法 放 血 法 药 物 法 断 头 法 等 目 的 是 处 理 患 病 动 物, 保 护 健 康 动 物 ; 中 断 试 验 而 淘 汰 动 物 ; 试 验 结 束 后 作 进 一 步 检 查 需 要 原 则 是 减 少 痛 苦 缩 短 致 死 时 间 注 意 试 验 人 员 安 全 方 法 易 操 作 不 能 影 响 动 物 试 验 结 果 10. 解 剖 小 鼠 取 脏 器 并 求 其 脏 器 系 数 : 先 给 小 鼠 称 重, 然 后 用 颈 椎 脱 臼 法 处 死 小 鼠, 再 开 胸 开 腹 取 脏 器 ( 心 肺 胸 腺 肝 肾 脾 肾 上 腺 睾 丸 / 子 宫 ) 并 称 重 ( 五 ) 优 良 实 验 室 规 范 (GLP) GLP, 广 义 上 是 指 严 格 实 验 室 管 理 ( 包 括 实 验 室 建 设 设 备 和 人 员 条 件 各 种 管 理 制 度 和 操 作 规 程, 以 及 实 验 室 及 其 出 证 资 格 的 认 可 等 ) 的 一 整 套 规 章 制 度 GLP 是 针 对 药 品 食 品 添 加 剂 农 药 化 妆 品 及 其 他 医 用 物 品 的 毒 性 评 价 制 订 的 管 理 法 规 根 据 国 际 惯 例,GLP 专 指 毒 理 学 安 全 性 评 价 实 验 室 的 管 理 GLP 的 各 个 环 节 又 可 分 别 称 为 硬 件 ( 建 筑 设 施 仪 器 等 ) 和 软 件 ( 人 员 素 质 5

标 准 操 作 规 程 质 量 保 证 ) GLP 的 要 点 是 : 对 组 织 机 构 和 人 员 的 要 求 ; 对 实 验 设 施 仪 器 设 备 和 实 验 材 料 的 要 求 ; 标 准 操 作 规 程 (SOP); 对 研 究 工 作 实 施 过 程 的 要 求 ; 对 档 案 及 其 管 理 工 作 的 要 求 ; 实 验 室 资 格 认 证 及 监 督 检 查 ( 六 ) 标 准 操 作 规 程 (SOP) SOP 是 为 了 有 效 地 实 施 和 完 成 非 临 床 研 究 而 针 对 每 一 工 作 环 节 或 操 作 制 定 的 标 准 和 详 细 的 书 面 规 程 SOP 种 类 : 受 试 物 及 对 照 物 质 管 理 ; 设 施 内 的 仪 器 或 设 备 的 检 修 维 修 ; 动 物 饲 养 设 施 的 完 善 ; 试 验 动 物 的 饲 养 及 管 理 ; 试 验 动 物 一 般 体 征 等 的 观 察 ; 试 验 动 物 操 作 检 查 测 试 及 分 析 ; 濒 死 及 死 亡 动 物 的 处 理 ; 动 物 的 解 剖 及 尸 体 的 解 剖 检 查 ; 标 本 的 采 集 及 识 别 ; 组 织 病 理 学 检 查 ; 原 始 数 据 的 管 理 ; 质 量 保 证 部 门 的 任 务 ; 试 验 就 业 人 员 的 健 康 检 查 ; 其 它 必 要 的 事 项 ( 七 ) 如 何 获 得 客 观 可 靠 的 真 实 结 果? 1. 实 验 人 员 态 度 端 正, 要 对 实 验 结 果 负 责 任 ; 2. 实 验 过 程 中 贯 彻 随 机 化 对 照 重 复 和 盲 法 原 则 ; 3. 要 熟 悉 和 掌 握 各 种 实 验 操 作 技 能, 避 免 技 术 问 题 影 响 实 验 结 果 ; 4. 排 除 环 境 因 素 化 学 物 因 素 和 机 体 因 素 对 实 验 结 果 的 影 响 ; 5. 不 断 总 结 实 验 细 节 ; 6. 与 重 要 文 献 资 料 或 其 它 实 验 室 结 果 相 比 对, 若 不 一 致, 一 定 要 追 究 其 原 因 ; 7. 下 结 论 要 谨 慎, 毕 竟 动 物 实 验 结 果 外 推 到 人 尚 存 在 一 些 不 确 定 因 素 二 观 摩 教 学 录 像 让 全 体 学 生 观 摩 毒 理 学 试 验 基 本 技 术 和 方 法 教 学 录 像 三 教 师 全 程 辅 助 指 导 和 培 训 本 次 综 合 性 设 计 性 实 验 中, 贯 彻 学 生 为 主 体, 教 师 全 程 仅 辅 助 指 导 学 生, 让 学 生 从 多 项 系 统 的 设 计 实 验 准 备 实 验 实 施 实 验 和 总 结 实 验 等 过 程 中 真 正 发 现 问 题 分 析 问 题 和 最 后 的 解 决 问 题, 而 问 题 解 决 的 方 法 可 以 是 请 教 指 导 教 师 预 实 验 验 证 查 阅 文 献 资 料 和 网 络 论 坛 求 助 等 四 学 生 亲 身 实 践 训 练 6

通 过 教 学 录 像 和 教 师 示 教, 学 生 仅 仅 有 感 性 认 识, 但 要 真 正 掌 握 多 项 动 物 实 验 的 基 本 技 能, 尚 需 要 学 生 积 极 亲 身 实 践 这 些 实 验 技 术, 如 灌 胃 采 血 静 脉 注 射 取 肝 脏 组 织 等 操 作 只 有 掌 握 这 些 毒 理 学 基 本 实 验 操 作 技 术, 才 有 可 能 使 后 续 的 综 合 性 设 计 性 实 验 得 以 顺 利 有 效 开 展 实 验 二 对 乙 酰 氨 基 酚 的 急 性 经 口 LD 50 测 定 一 实 验 目 的 学 习 急 性 经 口 LD 50 的 测 定 方 法 以 及 掌 握 受 试 物 的 急 性 毒 性 分 级 标 准 二 实 验 材 料 1. 动 物 : 成 年 小 鼠 50 只, 雌 雄 各 半 ; 2. 试 剂 : 对 乙 酰 氨 基 酚 苦 味 酸 饱 和 液 和 0.5% 品 红 溶 液 3. 器 材 : 灌 胃 针 注 射 器 吸 管 滴 管 移 液 器 电 子 秤 剪 刀 镊 子 量 筒 容 量 瓶 等 三 实 验 步 骤 ( 一 ) 动 物 选 择 : 物 种 品 系 : 昆 明 种 小 鼠 ; 体 重 / 年 龄 :18~25 g, 体 重 要 求 分 组 前 个 体 与 总 均 重 差 异 不 超 过 20%, 组 内 个 体 间 体 重 差 异 小 于 10%, 组 间 体 重 差 异 小 于 5%; 性 别 : 雄 雌 各 半 ; 健 康 未 孕 的 成 年 小 鼠 ( 二 ) 性 别 辨 认 : 最 常 用 方 法 是 根 据 生 殖 器 与 肛 门 的 距 离 大 小 ; 亦 可 根 据 生 殖 器 大 小 有 无 肛 毛 成 年 雌 鼠 的 乳 房 发 育 情 况 及 成 年 雄 鼠 的 睾 丸 下 降 情 况 等 辅 助 判 断 ( 三 ) 动 物 编 号 称 重 分 组 : 1. 编 号 : 按 顺 时 针 方 向 由 右 到 左 由 小 到 大 依 次 是 头 顶 右 前 肢 右 腰 右 后 肢 尾 根 左 后 肢 左 腰 左 前 肢 背 部 (1 9),10 即 在 头 顶 上 用 红 色 编, 其 中 咖 啡 色 表 示 百 位 红 色 表 示 十 位 黄 色 表 示 个 位 2. 称 重 : 以 g 为 单 位 7

3. 分 组 : 小 鼠 按 体 重 大 小 随 机 分 5 组,10 只 / 组, 雌 雄 各 半 ( 四 ) 受 试 物 及 其 不 同 浓 度 配 置 : 按 等 容 积 稀 释 法, 具 体 配 法 为 : 取 原 液 X=(7.5*50)/(1*1000)ml, 且 定 容 至 50 ml 即 为 该 剂 量 组 溶 液, 依 此 类 推 可 配 出 各 组 不 同 浓 度 的 溶 液, 也 可 按 浓 度 1* 容 积 1= 浓 度 2* 容 积 2 计 算 ( 五 ) 剂 量 设 计 : 一 般 设 置 5 个 剂 量 组, 组 间 剂 量 在 毒 理 学 实 验 中 一 般 呈 等 比 数 列, 最 低 剂 量 可 至 LD 0, 而 最 高 剂 量 可 至 LD 100, 然 后 根 据 组 距 i 可 以 求 出 其 它 组 别 剂 量 ( 六 ) 进 行 灌 胃 : 小 鼠 进 针 深 度 为 2.5~4 cm, 灌 胃 容 积 为 0.2~1 ml 本 次 按 2% 进 行 灌 胃 ( 七 ) 观 察 动 物 死 亡 和 中 毒 体 征 : 密 切 观 察 各 组 动 物 死 亡 情 况 中 毒 体 征 及 其 出 现 时 间, 染 毒 前 后 体 重 改 变, 必 要 时 对 死 亡 小 鼠 行 常 规 病 理 学 检 查 四 结 果 分 析 1. 求 出 LD 50 及 其 95% 的 可 信 区 间 并 讨 论 其 影 响 因 素 : 用 改 进 寇 氏 法 ( 设 5~8 个 剂 量 组, 各 组 动 物 数 相 等 ; 各 组 剂 量 成 等 比 级 数 ; 死 亡 率 呈 正 态 分 布, 最 低 剂 量 组 <20%, 最 高 剂 量 组 >80%), 即 logld 50 =logld 100 -i*( p-0.5),s logld50 =i* (p*q/n) 影 响 因 素 可 能 为 受 试 物 的 性 质, 动 物 的 物 种 和 品 系 年 龄 性 别 喂 饲 环 境 疾 病 状 态 等 所 致 的 敏 感 差 异, 操 作 因 素 ( 剂 量 误 差 技 术 因 素 等 ) 2. 对 受 试 物 进 行 毒 性 分 级 : 经 口 LD 50 (mg/kg) <5 5~ 50~500 >500 级 别 剧 毒 高 毒 中 等 毒 低 毒 8

实 验 三 对 乙 酰 氨 基 酚 诱 导 小 鼠 急 性 肝 损 伤 模 型 的 建 立 一 实 验 原 理 选 择 健 康 未 受 孕 实 验 动 物, 根 据 体 重 按 随 机 化 分 组 方 法, 将 动 物 随 机 分 成 高 中 和 低 3 个 染 毒 剂 量 组 和 1 个 溶 剂 对 照 组, 将 受 试 物 对 乙 酰 氨 基 酚 单 次 给 予 小 鼠 一 定 时 间 后, 了 解 小 鼠 所 产 生 的 急 性 肝 脏 损 伤 情 况 及 其 严 重 程 度, 从 而 建 立 急 性 染 毒 的 小 鼠 肝 损 伤 模 型 建 立 小 鼠 急 性 肝 损 伤 模 型 是 进 一 步 研 究 对 乙 酰 氨 基 酚 引 起 小 鼠 急 性 肝 脏 损 伤 作 用 机 制 的 基 础 二 实 验 目 的 了 解 急 性 毒 性 试 验 中 受 试 物 对 乙 酰 氨 基 酚 剂 量 选 择 依 据 和 掌 握 急 性 动 物 损 伤 模 型 建 立 中 的 基 本 操 作 技 术 三 实 验 步 骤 1 动 物 选 择 : 购 买 48 只 昆 明 种 雄 性 或 雌 性 小 鼠, 体 重 在 18~25 g; 2 动 物 编 号 和 分 组 ; 对 每 只 小 鼠 编 号 后, 再 按 照 体 重 随 机 分 成 四 组, 即 对 照 组, 对 乙 酰 氨 基 酚 低 剂 量 中 剂 量 和 高 剂 量 组 3 受 试 物 对 乙 酰 氨 基 酚 剂 量 设 置 和 配 制 : 根 据 文 献 和 预 实 验 结 果 设 定 对 乙 酰 氨 基 酚 的 剂 量, 尽 可 能 三 组 剂 量 呈 等 比 数 列 4 动 物 染 毒 : 用 经 口 灌 胃 方 式 给 予 小 鼠 受 试 物 或 蒸 馏 水 5 中 毒 体 征 观 察 : 染 毒 前 后 体 重 改 变 有 无 死 亡 以 及 中 毒 体 征 发 生 情 况 ( 中 枢 神 经 系 统 和 神 经 肌 肉 系 统 : 体 位 异 常 叫 声 异 常 不 安 呆 滞 痉 挛 抽 搐 麻 痹 运 动 失 调 对 外 反 应 过 敏 或 迟 钝 ; 植 物 神 经 系 统 : 瞳 孔 扩 大 或 缩 小 流 涎 或 流 泪 ; 呼 吸 系 统 : 鼻 孔 流 液 鼻 翼 煽 动 呼 吸 深 缓 呼 吸 过 速 蜂 腰 ; 泌 尿 生 殖 系 统 : 会 阴 部 污 秽 有 分 泌 物 阴 道 或 乳 房 肿 胀 ; 皮 肤 和 毛 : 皮 肤 充 血 紫 绀 被 毛 蓬 松 污 秽 ; 眼 : 眼 球 突 出 结 膜 充 血 角 膜 混 浊 ; 消 化 系 统 : 腹 泄 厌 食 等 ) 6 生 物 材 料 收 集 处 理 和 保 存 : 实 验 拟 在 对 乙 酰 氨 基 酚 处 理 24 h 后, 采 血 剖 9

杀 取 肝 脏, 全 血 放 于 室 温 2 h 后,5000 r 离 心 10 min, 吸 取 上 清, 然 后 -80 度 保 存 待 用 ; 肝 脏 组 织 一 部 分 立 即 放 入 10% 甲 醛 固 定,24 h 后 送 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 病 理 科 请 求 石 蜡 包 埋 常 规 切 片 等 ; 剩 余 肝 脏 组 织 液 氮 急 冻 后 放 -80 度 保 存 待 用 四 结 果 分 析 1. 收 集 各 组 小 鼠 体 重 改 变 中 毒 体 征 和 死 亡 情 况 2. 本 实 验 拟 选 择 血 清 ALT 活 力 和 肝 脏 组 织 HE 染 色 评 价 结 果 来 作 为 急 性 肝 损 伤 模 型 是 否 建 立 成 功 的 标 准, 即 用 实 验 四 和 实 验 五 结 果 来 验 证 3. 本 次 实 验 中 收 集 的 小 鼠 血 清 拟 在 后 续 实 验 中 测 定 ALT 活 力 ; 收 集 的 小 鼠 肝 脏 一 部 分 病 理 固 定 后 石 蜡 包 埋 和 常 规 切 片, 今 后 行 常 规 HE 染 色, 其 余 肝 脏 放 于 -80 度 保 存, 用 于 今 后 的 肝 脏 组 织 GSH 和 MDA 含 量 检 测 五 注 意 事 项 1. 不 同 受 试 物 其 染 毒 剂 量 不 同, 根 据 文 献 资 料 预 实 验 结 果 受 试 物 的 LD 50 或 其 它 因 素 综 合 考 虑 或 通 过 预 实 验 确 定 染 毒 剂 量 ; 2. 尽 可 能 多 采 集 血 样, 避 免 溶 血, 否 则 会 影 响 血 清 酶 活 性 测 定 结 果 ; 3. 组 织 样 品 最 后 液 氮 急 冻 后, 放 于 -80 度 保 存 待 用 ; 4. 学 生 务 必 掌 握 小 鼠 灌 胃 采 血 和 取 脏 器 等 基 本 技 术, 尤 其 留 取 病 理 的 肝 脏 组 织 不 能 用 镊 子 损 伤 组 织 ; 5. 实 验 中 各 种 小 鼠 染 毒 时 间 处 死 取 材 时 间 要 相 互 协 调 和 统 一 实 验 四 小 鼠 血 清 丙 氨 酸 氨 基 转 移 酶 活 力 检 测 一 实 验 原 理 丙 氨 酸 氨 基 转 移 酶 (ALT) 在 37 及 ph7.4 条 件 下, 作 用 于 丙 氨 酸 及 α- 酮 戊 二 酸 组 成 的 底 物, 生 成 丙 酮 酸 及 谷 氨 酸 反 应 30 min 后 ( 固 定 时 间 ) 加 入 2,4- 二 硝 基 苯 肼 (DNPH) 盐 酸 溶 液, 即 中 止 反 应, 同 时 DNPH 与 酮 酸 中 羰 基 加 成, 生 成 丙 酮 酸 苯 腙 苯 腙 在 碱 性 条 件 下 呈 红 棕 色, 于 505 nm 测 定 吸 光 值 并 计 10

算 酶 活 力, 根 据 ALT 活 力 的 高 低 来 反 映 肝 脏 细 胞 损 伤 的 程 度 反 应 式 如 下 : COOH COOH CH 3 HC NH2 + CO CH 2 ALT CH 3 C O + CHNH 2 CH 2 COOH CH 2 COOH COOH CH 2 COOH 丙 氨 酸 α- 酮 戊 二 酸 丙 酮 酸 谷 氨 酸 NO 2 NO 2 CH 3 C O COOH + H 2 N NH NO 2 NaOH -H 2 O CH 3 C N NH NO 2 COOH 丙 酮 酸 2,4- 二 硝 基 苯 肼 丙 酮 酸 -2,4- 二 硝 基 苯 腙 ( 红 棕 色 ) 二 实 验 目 的 掌 握 血 清 ALT 活 性 测 定 的 临 床 意 义, 且 了 解 血 清 ALT 活 性 测 定 的 原 理 及 测 定 方 法 三 实 验 材 料 1. 小 鼠 血 清 : 来 源 于 实 验 三 中 收 集 的 各 组 小 鼠 血 清 ; 2. 试 剂 ( 由 南 京 建 成 生 物 工 程 研 究 所 ALT 试 剂 盒 提 供 ): (1) ALT 基 质 液 :4 冰 箱 保 存 (2) 2,4- 二 硝 基 苯 肼 (DNPH) 液 : 室 温 避 光 保 存 (3) 4 mol/l NaOH: 用 时 加 蒸 馏 水 稀 释 至 0.4 mol/l, 室 温 保 存 (4) 2 μmol/ml 丙 酮 酸 钠 标 准 液, 室 温 保 存 (5) 0.1 mol/l 磷 酸 盐 缓 冲 液,4 冰 箱 保 存 3. 器 材 : 离 心 机 7 ml 离 心 管 理 想 国 架 移 液 器 分 光 光 度 计 玻 璃 比 色 杯 水 浴 锅 玻 璃 棒 冰 箱 烧 杯 量 筒 等 四 实 验 步 骤 先 对 测 定 管 盒 对 照 管 分 别 编 号, 然 后 按 照 表 1 加 样 11

表 1 血 清 ALT 的 测 定 加 样 顺 序 测 定 管 对 照 管 血 清 (ml) 0.1 基 质 液 (ml,37 已 预 热 5 min) 0.5 0.5 混 匀 后,37 水 浴 30 min 2,4- 二 硝 基 苯 肼 液 (ml) 0.5 0.5 血 清 (ml) 0.1 混 匀 后,37 水 浴 20 min 0.4 mol/l NaOH(ml) 5 5 混 匀, 室 温 放 置 5 min,505 nm 波 长, 蒸 馏 水 调 零, 测 各 管 吸 光 度, 测 定 管 吸 光 度 减 去 对 照 管 吸 光 度 的 差 值, 查 标 准 曲 线, 求 得 相 应 ALT 活 力 单 位 五 结 果 分 析 制 作 标 准 曲 线 : 按 照 表 2 加 样 表 2 标 准 曲 线 加 样 顺 序 0 1 2 3 4 5 0.1mol/L 磷 酸 盐 缓 冲 液 (ml) 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 2µmol/ml 丙 酮 酸 钠 标 准 液 (ml) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 谷 丙 转 氨 酶 基 质 液 (ml) 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 2,4- 二 硝 基 苯 肼 液 (ml) 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 混 匀 后,37 水 浴 20 min 0.4 mol/l NaOH(ml) 5 5 混 匀, 室 温 放 置 10 min,505 nm 波 长, 蒸 馏 水 调 零, 测 各 管 吸 光 度, 结 果 见 表 3, 各 管 吸 光 度 减 去 零 管 吸 光 度 的 差 值 为 纵 坐 标, 相 应 的 卡 门 氏 单 位 为 横 坐 标, 作 坐 标 图, 如 图 1 所 示 12

表 3 标 准 曲 线 制 作 吸 光 度 值 0.267 0.364 0.452 0.543 0.631 0.702 绝 对 吸 光 度 值 0 0.097 0.185 0.276 0.364 0.435 相 当 于 酶 活 力 卡 门 氏 单 位 0 28 57 97 150 200 吸 光 度 植 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 y=0.0028x+0.0104 0 20 40 60 80 100 120 ALT 活 力 单 位 KU 图 1 ALT 标 准 曲 线 及 换 算 公 式 六 注 意 事 项 1. 酶 活 力 超 过 150 单 位 时, 用 盐 水 稀 释 血 清 后 重 测 2. 血 清 ALT 在 室 温 可 保 存 2 天, 在 0~4 可 保 存 1 周, 在 -25 可 保 存 1 个 月 3. 制 备 血 清 时 离 心 速 度 不 可 过 高, 一 般 3000~4000 r (10~15)min 为 宜 吸 上 清 时 不 要 吸 到 沉 淀 实 验 五 小 鼠 肝 脏 组 织 切 片 HE 染 色 及 其 评 价 一 实 验 原 理 苏 木 素 染 液 中 带 正 电 荷 的 蓝 色 色 精 与 细 胞 核 中 带 负 电 荷 的 脱 氧 核 糖 核 苷 通 过 正 负 电 荷 的 极 性 吸 附 而 守 成 染 色 ; 伊 红 是 带 负 电 荷 的 酸 性 染 料, 通 过 渗 透 或 弥 散 作 用 而 使 组 织 着 色 13

二 实 验 目 的 了 解 组 织 常 规 HE 染 色 方 法 和 掌 握 肝 脏 细 胞 坏 死 评 价 标 准 三 实 验 材 料 1. 肝 脏 组 织 石 蜡 切 片 : 实 验 三 中 收 集 的 小 鼠 部 分 肝 脏 置 于 10% 中 性 甲 醛 中 固 定 24 h, 由 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 病 理 科 技 术 员 负 责 脱 水 石 蜡 包 埋 和 切 片 (5 μm); 2. 试 剂 (1) Harris 苏 木 素 液 : 苏 木 素 1 g, 无 水 乙 醇 10 ml, 钾 明 矾 20 g, 蒸 馏 水 200 ml, 氧 化 汞 0.5 g, 乙 酸 8 ml 将 苏 木 素 溶 于 乙 醇 ( 加 热 ) 后 加 入 预 先 已 加 热 溶 解 明 矾 的 蒸 馏 水 中, 煮 沸 1~2 min, 改 用 小 火 加 热, 慢 慢 加 入 氧 化 汞 ( 注 意 防 止 产 生 大 量 气 泡 和 溶 液 溅 出 ) 再 煮 沸 2 min 后 立 即 浸 于 冷 水 中, 冷 却 后 加 入 乙 酸, 过 滤 后 使 用 (2) 0.1% 曙 红 Y 水 溶 液 : 曙 红 Y 0.1 g 蒸 馏 水 100 ml 和 冰 醋 酸 1 滴 (3) 分 化 液 : 盐 酸 1 ml,70% 乙 醇 100 ml (4) 返 蓝 液 : 氨 水 1 ml, 蒸 馏 水 99 ml (5) 梯 度 乙 醇 和 二 甲 苯 3. 器 材 : 染 缸 Marker 笔 标 签 中 性 树 胶 盖 玻 片 镊 子 滴 管 数 支 四 实 验 步 骤 1. 脱 蜡 和 水 化 : 染 色 前, 用 二 甲 苯 脱 去 切 片 中 的 石 蜡, 再 经 由 高 浓 度 到 低 浓 度 酒 精 水 化, 最 后 入 蒸 馏 水 具 体 操 作 如 下 : (1) 二 甲 苯 Ⅰ10 min; (2) 二 甲 苯 Ⅱ10 min; (3)100% 乙 醇 Ⅰ5 min; (4)100% 乙 醇 Ⅱ5 min; (5)95% 乙 醇 2 min; (6)70% 乙 醇 2 min; (7) 蒸 馏 水 水 洗 14

2. 常 规 HE 染 色 步 骤 : (1) 苏 木 精 液 染 色 8 min; (2) 流 水 稍 洗 去 苏 木 精 液 5 min; (3) 1% 盐 酸 乙 醇 30 s; (4) 稍 水 洗 1 min; (5) 促 蓝 液 返 蓝 30-60 s; (6) 流 水 冲 洗 5 min; (7) 95% 乙 醇 浸 洗 ; (8) 0.1% 曙 红 液 染 色 30-60 s; (9) 95% 乙 醇 5 min; (10) 无 水 乙 醇 Ⅰ5 min; (11) 无 水 乙 醇 Ⅱ5 min; (12) 二 甲 苯 Ⅰ5 min; (13) 二 甲 苯 Ⅱ5 min; (14) 中 性 树 胶 封 片 五 结 果 分 析 肝 脏 组 织 细 胞 坏 死 评 价 标 准 : 每 组 至 少 选 择 5 张 不 同 小 鼠 来 源 的 切 片, 在 光 镜 400 下, 每 张 切 片 随 机 选 择 12 个 视 野, 按 照 0 正 常 1 轻 度 坏 死 2 中 度 坏 死 和 3 重 度 坏 死 分 别 评 分, 然 后 计 算 出 每 张 切 片 的 平 均 评 分, 再 用 统 计 方 法 分 析 组 间 评 分 有 无 差 异 六 注 意 事 项 1. 脱 蜡 和 水 化 要 彻 底, 应 定 期 更 换 二 甲 苯 和 梯 度 乙 醇 2. 分 化 时 间 要 恰 当 掌 握, 可 镜 下 观 察 着 色 情 况 3. 封 片 前, 脱 水 和 透 明 要 充 分 15

实 验 六 小 鼠 肝 脏 组 织 还 原 型 谷 胱 甘 肽 含 量 测 定 一 实 验 原 理 二 硫 双 基 苯 甲 酸 (dithio-bis-nitrobenzoicacid, DTNB) 能 被 -SH 基 团 还 原, 产 生 等 克 分 子 的 2- 硝 基 -5- 巯 基 苯 甲 酸, 而 此 苯 甲 酸 阴 离 子 呈 黄 色, 可 在 412 nm 波 长 下 检 测 还 原 型 谷 胱 甘 肽 (glutathione, GSH) 是 一 种 低 分 子 自 由 基 清 除 剂, 它 可 清 除 O 2 H 2 O 2 LOOH GSH 是 蛋 氨 酸 甘 氨 酸 和 半 胱 氨 酸 组 成 的 一 种 小 分 子 肽, 是 组 织 中 主 要 的 非 蛋 白 质 的 巯 基 化 合 物, 并 且 是 谷 胱 甘 肽 过 氧 化 物 酶 (GPX) 和 谷 胱 甘 肽 硫 转 移 酶 (GST) 两 种 酶 类 的 底 物, 为 这 二 种 酶 分 解 氢 过 氧 化 物 所 必 需, 能 稳 定 含 巯 基 的 酶 和 防 止 血 红 蛋 白 及 其 它 辅 因 子 受 氧 化 损 伤 最 近 还 证 明,GSH 也 参 与 使 Vit E 恢 复 到 还 原 态 的 作 用 GSH 测 定 值 的 高 低 可 间 接 反 映 机 体 发 生 氧 化 损 伤 的 程 度 二 实 验 目 的 了 解 组 织 还 原 型 GSH 的 测 定 方 法 和 掌 握 组 织 GSH 含 量 高 低 的 实 际 意 义 三 实 验 材 料 1. 肝 脏 组 织 : 来 源 于 实 验 三 中 收 集 的 肝 脏 组 织 ; 2. 试 剂 : (1) 1 mmol/l 的 GSH; (2) DTNB: 浓 度 为 0.04%(w/v), 用 1% 柠 檬 酸 钠 配 ; (3) 1% 柠 檬 酸 钠 ; (4) 20% 三 氯 醋 酸 ; (5) 0.3 mol/l 磷 酸 氢 二 钠 (Na 2 HPO 4 ) 缓 冲 液 3. 器 材 : 分 光 光 度 计 匀 浆 器 离 心 机 制 冰 机 漩 涡 混 匀 器 枪 头 1.5 ml 离 心 管 滤 纸 7 ml 离 心 管 和 移 液 器 等 四 实 验 步 骤 16

1 样 品 处 理 及 操 作 步 骤 (1) 称 取 适 量 肝 脏 组 织 于 冰 冷 生 理 盐 水 中 漂 洗, 滤 纸 吸 干 水 分, 烧 杯 内 剪 碎 ; (2) 制 备 20% 的 组 织 匀 浆 液 ( 用 生 理 盐 水 4000 g 离 心 10 min 后 取 上 清 液 ; (3) 按 上 清 液 :20% 三 氯 醋 酸 ( 体 积 比 ) 为 2:1 混 合 ( 留 10 μl 上 清 液 测 蛋 白 ); (4) 混 匀,4000 g 离 心 10 min( 此 步 离 心 要 充 分, 可 适 当 提 高 离 心 力 ); (5) 收 集 上 清 液 按 表 2 测 定 2 按 表 1 绘 制 标 准 曲 线 ( 单 位 :ml) 表 1 GSH 标 准 曲 线 测 定 GSH(μmol/L) 0 10 20 30 40 50 1 mmol/l 的 GSH 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 三 蒸 水 0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 磷 酸 盐 缓 冲 液 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 DTNB 试 剂 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 混 匀,5 min 内 于 412 nm 比 色, 以 三 蒸 水 调 零, 以 标 准 GSH 浓 度 为 X 轴, 相 应 吸 光 值 为 Y 轴, 绘 制 标 准 曲 线, 并 求 回 归 方 程 3 按 表 2 操 作 测 定 样 品 GSH( 单 位 :ml) 表 2 Beutler 改 良 法 样 品 测 定 操 作 试 剂 测 定 管 空 白 管 待 测 样 品 液 0.1 0 磷 酸 盐 缓 冲 液 4.4 4.4 DTNB 试 剂 0.5 0.5 三 蒸 水 0 0.1 五 结 果 分 析 测 得 吸 光 值 代 入 标 准 曲 线 方 程, 可 计 算 出 样 品 中 GSH 浓 度 表 3 标 准 曲 线 测 定 结 果 GSH 浓 度 (μmol) 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 A 值 0.000 0.126 0.260 0.394 0.529 0.666 根 据 上 数 据 和 图 1, 可 得 出 标 准 曲 线 方 程 为 :X(μmol)=0.3744898Y+0.0017227 17

( 其 中 Y 为 吸 光 值 ) 0.800 吸 光 度 (A) 0.700 0.600 0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 y = 2.6703x - 0.0046 R 2 = 0.9998 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 GSH 量 (μmol) 图 1 GSH 标 准 曲 线 六 注 意 事 项 1. 样 品 应 冰 上 匀 浆, 所 有 步 骤 尽 量 保 证 低 温 下 操 作, 否 则 结 果 偏 低 ; 2. 所 有 用 水 均 需 三 蒸 水, 否 则 结 果 偏 低 ; 3. 未 经 蛋 白 变 性 处 理 的 样 品 在 -20 不 宜 存 放 ; 4. 反 应 管 内 最 终 PH 值 必 须 保 证 在 8.0~9.0 间, 否 则 结 果 不 稳 定 ; 5. 配 好 的 DTNB 应 在 有 限 期 内 使 用 (4 下 可 存 1 个 月 ); 6. GSH 浓 度 低 时 显 色 快, 消 退 也 快 ; 浓 度 高 时 显 色 慢, 消 退 也 慢, 一 般 反 应 1~5 min 后 测 定 ( 最 好 不 要 超 过 5 min); 7. 反 应 总 体 积 可 调 为 2.5 ml 实 验 七 小 鼠 肝 脏 组 织 丙 二 醛 含 量 测 定 一 实 验 原 理 过 氧 化 脂 质 降 解 产 物 中 的 丙 二 醛 (MDA), 可 与 硫 代 巴 比 妥 酸 (TBA) 缩 合, 形 成 红 色 产 物, 此 红 色 物 质 在 535 nm 波 长 处 有 极 大 吸 收 峰, 可 用 分 光 光 度 法 进 行 定 量 测 定 18

二 实 验 目 的 了 解 组 织 MDA 含 量 测 定 方 法 和 掌 握 MDA 含 量 高 低 的 实 际 意 义 三 实 验 材 料 1. 肝 脏 组 织 : 来 源 于 实 验 三 中 收 集 的 肝 脏 组 织 ; 2. 试 剂 : (1) TBA 试 剂 :0.67%TBA 水 溶 液, 称 取 0.67 g TBA, 用 双 蒸 水 配 成 100 ml (50 水 浴 或 室 温 下 融 解, 静 置, 用 上 清 液 ) (2) 标 准 贮 备 液 :10 μmol/ml 四 乙 氧 基 丙 烷 的 甲 醇 溶 液 准 确 称 取 1,1,3,3- 四 乙 氧 基 丙 烷 110 mg, 以 甲 醇 定 容 至 50 ml (3) 标 准 应 用 液 :10 nmol/ml 四 乙 氧 基 丙 烷 移 取 贮 备 液 0.1 ml, 以 甲 醇 稀 释 成 100 ml (4) 甲 醇 正 丁 醇 混 合 液 : 按 体 积 比 15:85 将 甲 醇 与 正 丁 醇 混 合 (5) 0.05 mol/l 盐 酸 3. 器 材 : 离 心 机 匀 浆 器 制 冰 机 水 浴 锅 离 心 管 移 液 器 枪 头 等 四 实 验 步 骤 1. 标 准 液 或 血 清 或 生 理 盐 水 0.15 ml, 加 入 20% 的 三 氯 醋 酸 (TCA)1.25 ml, 边 加 边 摇, 混 匀 ; 2. 加 入 0.67%TBA 0.5 ml, 再 次 混 匀, 加 盖 ; 3. 沸 水 浴 30 min; 4. 流 水 冷 却 至 室 温 ; 5. 加 入 正 丁 醇 2 ml, 振 荡 或 颠 倒 于 数 次 ; 6. 10000 rpm 离 心 10 min, 吸 取 上 清 液 于 535 nm 比 色 19

表 1 加 样 表 标 准 管 标 准 空 白 管 样 品 管 空 白 对 照 管 10 nmol/l 四 乙 基 丙 烷 0.15 甲 醇 0.15 样 品 0.15 NS 0.15 20% 三 氯 醋 酸 1.25 1.25 1.25 1.25( 边 加 边 摇 匀 ) 0.67%TBA 0.5 0.5 0.5 0.5( 混 匀 加 盖 ) 正 丁 醇 2 2 2 2( 振 荡 ) 五 结 果 分 析 样 品 中 丙 二 醛 的 浓 度 =(f/f) 10 nmol/ml, 其 中 F: 由 标 准 应 用 液 测 得 的 光 密 度,f: 由 样 品 溶 液 测 得 的 光 密 度 六 注 意 事 项 TBA 与 丙 二 醛 生 成 的 有 色 物 质 在 2 h 内 稳 定, 因 其 在 水 中 融 解 的 较 低, 故 用 有 机 溶 剂 抽 提 但 含 量 较 低 时, 也 可 直 接 对 水 溶 液 进 行 测 定 日 光 照 射 可 使 显 色 物 质 变 为 黄 色, 故 应 注 意 避 免 日 光 直 接 照 射, 并 尽 快 测 定 实 验 八 实 验 结 果 总 结 报 告 一 数 据 收 集 和 整 理 本 次 综 合 实 验 可 以 收 集 LD 50 数 据 4 组 小 鼠 血 清 ALT 活 力 肝 脏 组 织 HE 染 色 的 代 表 性 图 片 及 其 细 胞 坏 死 评 分 肝 脏 组 织 还 原 型 谷 胱 甘 肽 和 丙 二 醛 含 量 等 试 验 数 据 一 般 定 量 数 据 在 Excel 文 档 中 整 理, 并 计 算 每 组 均 数 标 准 差 或 标 准 误 组 织 病 理 学 检 查 可 以 在 光 镜 下 拍 成 *.jpg 或 *.tiff 格 式 的 图 片 ( 建 议 100 和 400 ) 二 数 据 统 计 分 析 20

计 数 资 料 用 卡 方 检 验 统 计 分 析, 计 量 资 料 用 方 差 分 析 和 t 检 验 统 计 处 理 三 图 表 制 作 一 部 分 直 方 图 可 以 在 Excel 文 档 中 直 接 制 作, 然 后 拷 贝 到 PPT 中 编 辑 标 识 和 组 合, 而 肝 脏 组 织 HE 染 色 代 表 性 图 片 直 接 拷 贝 到 PPT 中 编 辑 标 识 和 组 合, 最 终 另 存 为 *.jpg 或 *.tiff 格 式 的 图 片 即 可 表 格 一 般 在 word 文 档 中 绘 制 即 可, 其 中 三 线 表 要 求 上 下 粗 线 而 中 间 细 线 四 论 文 撰 写 一 旦 所 有 实 验 图 表 制 作 完 毕, 就 可 以 按 照 我 校 本 科 生 毕 业 论 文 格 式 要 求 撰 写 本 次 实 习 论 文, 即 标 题 作 者 中 文 摘 要 英 文 摘 要 关 键 词 引 言 材 料 与 方 法 结 果 讨 论 参 考 文 献 最 后 要 特 别 提 示 的 是, 因 为 本 科 生 实 验 课 学 时 数 有 限, 本 次 综 合 实 验 仅 仅 初 步 探 讨 急 性 暴 露 对 乙 酰 氨 基 酚 对 小 鼠 肝 脏 的 损 害 作 用 及 其 可 能 作 用 机 制, 在 论 文 中 下 结 论 时, 尚 不 能 完 全 肯 定 氧 化 应 激 在 对 乙 酰 氨 基 酚 致 小 鼠 急 性 肝 脏 损 伤 中 的 作 用, 需 要 进 一 步 用 直 接 的 抗 氧 化 剂 预 处 理 来 看 是 否 对 对 乙 酰 氨 基 酚 致 小 鼠 急 性 肝 脏 损 伤 有 保 护 作 用, 然 后 下 肯 定 结 论 21