放 射 性 碘 标 记 在 RIA 中, 标 记 抗 原 质 量 的 优 劣, 直 接 影 响 测 定 结 果, 必 须 制 备 比 放 射 性 强 纯 度 高 的 标 记 抗 原, 并 保 持 免 疫 活 性 不 受 丧 失 一 同 位 素 的 选 择 同 位 素 有 稳 定 性 和 放 射 性 两 种 放 射 性 同 位 素 可 利 用 其 衰 变 时 放 出 的 放 射 线 进 行 测 量, 这 种 测 量 较 灵 敏 而 方 便, 故 多 用 放 射 性 同 位 素 标 记 抗 原, 常 用 的 放 射 性 同 位 素 有 3 H 14 C 131 I 和 I 等 在 使 用 上 各 有 其 优 缺 点, 可 根 据 所 进 行 的 放 射 免 疫 分 析 的 类 型 特 点, 标 记 物 制 备 和 供 应 情 况 以 及 实 验 室 设 备 条 件 等 作 14 适 当 的 选 择 ( 表 8-1) 大 多 数 抗 原 分 子 中 都 含 有 C H 等 原 子, 所 以 用 C 或 3 H 标 记 不 改 变 抗 原 的 结 构 14 及 其 免 疫 学 活 性, 且 C 3 H 半 衰 期 长, 所 标 记 的 抗 原 长 时 间 放 置 后 仍 可 使 用, 这 都 是 其 优 点 14 C 或 3 H 标 记 的 不 足 之 处 是 操 作 较 繁 琐, 并 难 以 获 得 高 比 放 射 性 的 标 记 物 ; 3 14 H 及 C 放 出 的 都 是 弱 β 射 线, 需 用 较 昂 贵 的 液 体 闪 烁 计 数 器 方 能 获 得 较 高 效 率 的 测 量, 且 测 定 操 作 也 较 麻 烦 但 某 些 抗 原 用 放 射 性 碘 标 记 容 易 丧 失 免 疫 化 学 或 生 物 学 活 性 者, 则 仍 以 采 用 3 14 H 或 C 标 记 物 为 佳 表 8-1 标 记 抗 原 常 用 的 放 射 性 同 位 素 及 其 性 质 放 射 性 元 素 半 衰 期 射 线 种 类 及 能 量 ( 百 万 电 子 伏 特 ) β γ 14 C 5720 年 0.155-3 H 12.5 年 0.0189 - I 60 天 - 0.035 131 I 8.05 天 0.608,0.335,0.250 0.364,0.637,0.722 大 多 数 抗 原 分 子 中 是 不 含 碘 的, 引 入 碘 原 子 就 改 变 了 抗 原 的 分 子 结 构, 往 往 容 易 损 伤 抗 原 的 免 疫 化 学 活 性 ; 且 放 射 性 碘 的 半 衰 期 较 短, 标 记 物 放 置 后 因 衰 变 使 放 射 性 降 低, 因 而 需 要 经 常 制 备 标 记 物 或 要 求 能 定 期 提 供 放 射 性 碘 标 记 都 能 适 用, 放 射 性 碘 放 出 γ 射 线, 用 一 般 晶 体 闪 烁 计 数 器 就 能 获 得 较 高 效 率 而 精 确 的 测 量, 测 量 操 作 也 很 简 单 由 于 这 些 突 出 的 优 点, 目 前 在 放 射 免 疫 分 析 中, 使 用 放 射 性 碘 标 记 物 最 多 从 应 用 角 度 来 看, 131 I 和 I 又 各 有 其 优 缺 点, 可 根 据 实 验 的 要 求 仪 器 的 条 件 和 放 射 性 碘 制 剂 的 规 格 等 条 件 合 理 选 用 但 相 对 而 言, I 有 较 多 的 优 点, 一 是 半 衰 期 适 中, 允 许 标 记 化 合 物 的 商 品 化 及 贮 存 应 用 一 段 时 间 ; 二 是 它 只 发 射 28keV 能 量 的 X 射 线 和 35keV 能 量 的 γ 射 线, 而 无 β 粒 子, 因 而 辐 射 自 分 解 少, 标 记 化 合 物 有 足 够 的 稳 定 性 放 射 性 碘 适 用 于 放 射 免 疫 分 析 许 多 对 象 ( 包 括 蛋 白 质 肽 类 固 醇 类 核 酸 类 以 及 环 型 核 苷 酸 衍 生 物 等 ) 的 标 记, 且 操 作 简 单, 一 般 实 验 室 都 不 难 做 到
二 蛋 白 质 与 多 肽 激 素 的 放 射 性 碘 标 记 要 制 备 高 比 度 高 纯 度 与 免 疫 化 学 活 性 好 的 标 记 物, 首 先 要 有 高 纯 度 良 好 免 疫 活 性 的 抗 原 用 作 放 射 标 记 加 网 免 疫 分 析 的 特 异 性, 所 以 若 用 纯 度 不 高 的 抗 原 作 标 记, 则 标 记 后 必 须 采 取 适 当 的 步 骤 除 去 杂 质, 以 获 得 高 纯 度 的 标 记 物 标 记 对 象 的 纯 化 应 尽 量 采 用 温 和 的 方 法, 否 则 在 纯 化 操 作 中 已 受 潜 在 性 损 伤 的 蛋 白 质 ( 这 时 表 面 上 活 性 可 能 还 是 良 好 的 ), 再 经 标 记 反 应 时 所 受 的 损 伤, 活 性 就 会 显 著 降 低, 影 响 以 后 的 放 射 分 析 结 果 有 了 好 的 纯 抗 原, 还 要 采 用 适 当 方 法 加 以 标 记, 尽 量 获 取 高 比 放 射 性 而 又 能 保 持 良 好 的 特 异 免 疫 化 学 活 性 的 标 记 物 这 些 都 是 放 射 免 疫 分 析 能 取 得 高 特 异 性 和 高 灵 敏 度 的 关 键 问 题 多 肽 激 素 与 蛋 白 质 多 用 碘 标 记, 最 常 用 的 是 I 碘 化 反 应 的 基 本 过 程 如 下 : 通 过 氧 化 剂 的 作 用, 使 碘 化 物 ( I - ) 氧 化 成 的 碘 分 子 ( I2), 再 与 多 肽 激 素 蛋 白 质 分 子 中 的 酪 氨 酸 残 基 发 生 碘 化 作 用 所 以 不 管 采 用 哪 一 种 放 射 性 碘 标 记 法, 标 记 的 化 合 物 内 部 必 须 有 碘 原 子 可 结 合 的 基 团, 即 结 构 上 要 含 有 酪 胺 基 或 组 织 胺 残 基 凡 蛋 白 质 肽 类 等 抗 原, 在 结 构 上 含 有 上 述 基 团 的 可 直 接 用 放 射 性 碘 进 行 标 记 如 不 含 上 述 基 团 的, 放 射 性 碘 无 法 标 记, 必 须 在 这 些 化 合 物 的 结 构 上 连 接 上 述 基 团 后 才 能 进 行 碘 标 记 因 此 影 响 蛋 白 质 多 肽 碘 化 效 率 的 因 素, 主 要 决 定 于 蛋 白 质 多 肽 分 子 中 酪 氨 酸 残 基 的 数 量 及 它 们 在 分 子 结 构 中 暴 露 的 程 度 ; 此 外, 碘 化 物 的 用 量 反 应 条 件 (ph 温 度 反 应 时 间 等 ) 及 所 用 氧 化 剂 的 性 质 等 也 有 影 响 常 用 的 标 记 方 法 有 : ( 一 ) 氯 胺 T 法 氯 胺 T 法 标 记 效 率 高 重 复 性 好 试 剂 便 宜 易 得, 是 目 前 使 用 最 多 的 碘 标 记 方 法 1. 原 理 氯 氨 T(Chloramine--T) 是 一 种 温 和 的 氧 化 剂, 在 水 溶 液 中 产 生 次 氯 酸, 可 使 碘 阴 离 子 氧 化 成 碘 分 子 这 活 性 碘 可 取 代 肽 链 上 酪 氨 酸 苯 环 上 羟 基 位 的 一 个 或 两 个 氢, 使 之 成 为 含 有 放 射 性 碘 化 酪 氨 酸 的 多 肽 链 2. 方 法 以 I AVP 的 制 备 为 例
(1) 碘 化 反 应 :AVP5μg+0.5mol/l PB50μl(pH7.5)+ 1800μCi, 混 合 后, 加 入 新 配 置 的 Ch t 30μ g/15μl(0.05mol/l PB, ph7.5) 迅 速 振 荡 混 匀, 室 温 下 反 应 40s (2) 终 止 碘 化 反 应 : 加 入 还 原 剂 偏 重 亚 硫 酸 钠 40μg/20μl(0.05mol/l PB, ph7.5), 以 终 止 碘 化 反 应 (3)Bio Gel P2 层 析 纯 化 : 将 碘 化 反 应 混 合 液 注 入 Bio Gel P2 柱, 用 0.1n HAC 溶 液 洗 脱, 分 部 收 集, 每 2min 收 集 一 管, 共 收 集 60 管 (4) 放 射 性 测 量 : 测 定 各 收 集 管 的 放 射 性, 出 现 两 个 峰, 第 一 峰 为 I AVP, 第 二 峰 为 游 离 碘 盐 峰 第 一 个 峰 中 计 算 最 高 的 几 管, 留 下 备 用 为 了 解 标 记 抗 原 的 质 量, 每 次 碘 标 记 后 应 计 算 出 碘 的 利 用 率, 标 记 上 多 少 放 射 性 碘, 以 及 每 微 克 抗 原 结 合 上 多 少 放 射 性 碘 (5) 标 记 抗 原 的 贮 存 : 经 纯 化 与 检 查 后 的 标 记 物 加 入 1/8 体 积 的 异 丙 醇, 分 成 若 干 小 份, 置 于 铅 罐 中, 在 -20 以 下 的 冰 箱 中 贮 存 备 用, 应 避 免 反 复 冻 融 标 记 抗 原 在 贮 存 中 是 不 稳 定 的, 这 是 因 为 : 一 是 脱 碘, 标 记 的 碘 从 原 来 位 置 上 脱 落, 变 成 游 离 碘 ; 二 是 蛋 白 损 伤 变 性, 成 为 聚 合 大 分 子 或 断 键 成 小 分 子 碎 片 由 于 上 述 原 因, 使 B/F 明 显 降 低, 标 准 曲 线 斜 率 变 小, 以 致 不 能 使 用, 故 需 分 离 纯 化, 其 方 法 是 用 S ephadex G100 长 柱 (40~80cm ) 过 柱, 洗 脱 后 出 现 3 个 峰 第 1 个 峰 分 子 量 大, 是 蛋 白 变 性 的 聚 合 的 大 分 子, 尚 保 留 部 分 抗 原 决 定 簇, 免 疫 活 性 弱 ; 第 2 个 峰 是 纯 抗 原 的 蛋 白 峰, 免 疫 活 性 好 ; 第 3 个 峰 是 游 离 I 或 小 分 子 碎 片, 不 具 备 免 疫 活 性 收 集 到 的 第 2 个 纯 抗 原 蛋 白 峰, 免 疫 活 性 好 ; 第 3 个 峰 是 游 离 I 或 小 分 子 碎 片, 不 具 备 免 疫 活 性 收 集 到 的 第 2 个 纯 抗 原 蛋 白 峰, 其 性 能 类 似 于 新 鲜 标 记 的 抗 原 分 离 纯 化 的 方 法 解 决 了 标 记 抗 原 的 贮 存 长 期 使 用 问 题, 特 别 对 来 之 不 易 的 抗 原 更 显 得 重 要 2. 注 意 事 项 131 (1) 放 射 性 碘 源 的 选 用 : 无 载 体 的 I 或 I 均 可 用 于 碘 化 标 记, 但 应 尽 量 选 用 新 鲜 的 比 放 射 强 度 高 的 含 还 原 剂 量 少 的 放 射 性 碘 源 碘 源 的 比 放 射 强 度 最 好 50~100mCi/ml, 至 少 也 要 >30mCi/ml, 否 则 加 入 碘 源 的 容 量 要 增 加, 随 着 带 入 碘 源 中 含 有 的 还 原 剂 ( 为 放 射 性 碘 源 运 输 保 存 所 需 加 入 ) 量 也 增 加, 这 将 会 显 著 降 低 碘 利 用 率 及 标 记 蛋 白 比 放 射 强 度 放 置 较 久 和 放 射 性 碘 源, 一 方 面 因 衰 变 致 比 放 射 强 度 降 低, 131 另 一 方 面 因 水 的 辐 射 化 学 产 物 增 多 ( 主 要 是 I 源 ), 都 会 降 低 标 记 时 的 碘 利 用 率 放 射 性 碘 源 含 还 原 剂 ( 如 Na2S2O5 等 ) 量 多 时, 会 抵 消 氯 胺 T 的 作 用, 降 低 碘 利 用 率, 甚 至 导 致 标 记 完 全 失 败 放 射 性 碘 源 要 用 无 载 体 的, 标 记 所 用 全 部 用 具 和 试 剂 必 须 不 含 碘 ; 只 要 有 极 少 量 的 碘 的 污 染, 非 放 射 性 碘 就 会 稀 释 放 射 性 碘, 使 放 射 性 碘 利 用 率 显 著 降 低 为 了 便 于 放 射 性 防 护 和 除 污 染, 以 及 减 少 射 线 对 蛋 白 质 分 子 的 损 伤, 标 记 投 入 的 放 射 碘 量 不 宜 过 大, 一 般 以 <5mCi 为 宜 (2) 放 射 性 碘 与 多 肽 蛋 白 质 用 量 的 比 例 : 这 比 例 对 标 记 结 果 的 影 响 很 大 如 上 述 原 因, 一 般 标 记 时 放 射 性 投 入 量 不 宜 过 多, 示 踪 实 验 室 中 常 规 每 次 只 用 1~2mCi, 因 而 放 射 性 碘 与 多 肽 蛋 白 质 用 量 的 比 值 主 要 靠 标 记 时 投 入 的 多 肽 蛋 白 质 用 量 来 控 制 当 投 入 的 放 射 碘 量 一 定 时, 多 肽 蛋 白 质 用 量 多 ( 即 I/ 多
肽 蛋 白 质 比 值 低 ), 能 获 得 高 碘 利 用 率, 但 所 得 标 记 蛋 白 比 放 射 强 度 低 ; 相 反 多 肽 蛋 白 质 用 量 少 ( 即 I/ 多 肽 蛋 白 质 比 值 高 ), 则 碘 利 用 率 降 低, 但 所 得 标 记 多 肽 蛋 白 比 放 射 性 随 此 比 值 变 化 都 有 较 大 的 变 动 ; 而 当 此 比 值 <1 后, 则 碘 利 用 率 再 下 降 的 幅 率 较 小, 标 记 多 肽 蛋 白 比 放 射 性 也 不 会 再 增 加 多 少 (3) 氯 胺 T 与 偏 重 亚 硫 酸 钠 的 用 量 及 碘 化 反 应 时 间 : 氧 化 碘 化 标 记 法 中, 会 导 致 失 活 的 最 主 要 原 因 是 氧 化 还 原 氯 胺 T 是 氧 化 剂, 早 期 用 氯 胺 T 法 作 碘 化 标 记 时 氯 胺 T 用 量 都 比 较 大, 或 碘 化 反 应 时 间 较 长, 结 果 导 致 蛋 白 质 结 构 和 活 性 的 严 重 损 伤 氯 胺 T 用 量 大, 或 长 时 间 进 行 碘 化 反 应, 结 果 并 不 能 使 碘 利 用 率 和 标 记 多 肽 蛋 白 质 比 放 射 强 度 提 高 多 少, 反 而 使 标 记 多 肽 蛋 白 活 性 下 降 当 用 不 含 还 原 剂 或 还 原 剂 很 少 的 放 射 性 碘 源 时, 试 以 各 种 蛋 白 质 ( 包 括 白 蛋 白 球 蛋 白 ACTH 胰 岛 素 等 ) 作 微 量 标 记, 当 氯 胺 T 用 量 为 20μg/0.1ml 反 应 液 0~20 C 反 应 20s, 碘 利 用 率 都 已 接 近 或 达 到 最 大 峰, 再 加 大 氯 胺 T 用 量 和 延 长 反 应 时 间 是 没 有 必 要 的 随 放 射 性 碘 源 中 还 原 剂 增 多, 氯 胺 T 用 量 也 应 增 加, 以 达 到 预 期 的 碘 利 用 率, 但 决 不 应 盲 目 加 大 氯 胺 T 用 量 和 延 长 碘 化 反 应 时 间 ( 通 常 反 应 时 间 不 要 超 过 1min), 否 则 会 导 致 标 记 多 肽 蛋 白 质 严 重 失 活, 不 能 用 于 实 验 当 然, 减 少 氯 胺 T 用 量 要 在 了 解 放 射 性 碘 源 还 原 剂 含 量 的 基 础 上, 否 则 碘 源 中 还 原 剂 量 较 多, 双 盲 目 减 少 氯 胺 T 用 量, 就 会 使 标 记 失 败 一 般 用 I 标 记 时, 氯 胺 T 用 量 要 适 当 加 大 加 入 氯 胺 T 后 必 须 迅 速 混 匀, 以 防 标 记 不 均 匀 氯 胺 T 与 偏 重 亚 硫 酸 钠 溶 液 要 新 配 制 的 氯 胺 T 用 量 减 少 了,Na2S2O5 用 量 也 就 可 以 随 之 减 少 为 保 证 按 时 终 止 碘 化 反 应, 实 验 时 加 入 Na2S2 O 5 一 般 都 是 过 量 的 氯 胺 T 用 量 大 时, 加 入 Na 2S 2O 5 的 剩 余 量 也 就 会 随 之 增 加, 这 就 可 能 加 重 某 些 对 还 原 剂 敏 感 的 蛋 白 质 或 多 肽 生 物 活 性 的 损 伤 为 此,Na2S2O5 用 量 也 不 应 过 多 只 要 药 品 没 有 变 质 试 剂 是 新 配 的, 以 重 量 计 算 Na2S2O5 加 入 量 与 氯 胺 T 相 同 就 足 以 保 证 终 止 碘 化 反 应 ( 按 反 应 克 分 子 浓 度 计 算,Na2 S2O5/ 氯 胺 T 重 量 比 约 0.4), 不 要 盲 目 加 大 用 量, 并 应 迅 速 将 标 记 多 肽 蛋 白 质 从 反 应 液 中 分 离 出 来, 以 尽 量 减 少 多 肽 蛋 白 质 活 性 的 损 伤 某 些 蛋 白 质 或 多 肽 对 氯 胺 T 较 敏 感, 还 可 进 一 步 减 少 氯 胺 T 用 量 缩 短 碘 化 反 应 时 间 降 低 反 应 温 度, 以 保 护 蛋 白 质 的 活 性 这 对 一 些 较 容 易 丧 失 活 性 蛋 白 质 或 多 肽 的 碘 标 记 十 分 重 要 (4) 碘 化 反 应 体 积 : 系 指 加 入 Na 2S 2O 5 终 止 反 应 前 液 体 的 总 量 碘 化 反 应 体 积 愈 小, 局 部 反 应 物 浓 度 愈 高, 所 得 碘 利 用 率 和 标 记 多 肽 蛋 白 比 放 射 强 度 就 愈 高 所 以, 标 记 应 采 用 比 放 射 标 记 效 果 当 反 应 液 量 少 (<0.2~0.3ml) 时, 反 应 体 积 对 碘 利 用 率 和 标 记 多 肽 蛋 白 质 比 放 射 强 度 的 高 低 影 响 较 大 ; 当 反 应 液 量 大 (>0.5~1.0ml) 时 则 影 响 较 小 微 量 氯 胺 T 法 放 射 碘 标 记 时, 一 般 多 控 制 碘 化 反 应 体 积 <100μl (5) 碘 化 反 应 温 度 : 温 度 升 高, 碘 化 反 应 速 度 加 快, 碘 利 用 率 有 所 增 加 但 总 的 来 看, 反 应 温 度 的 影 响 不 很 大, 一 般 从 0 到 20 碘 利 用 率 相 差 不 过 百 分 之 几, 故 一 般 在 室 温 下 进 行 标 记 操 作 就 可 能 获 得 重 复 性 好 的 结 果 有 些 蛋 白 质 或 肽 类 极 易 丧 失 活 性, 则 可 在 0 进 行 碘 化 反 应 (6) 碘 化 反 应 的 ph 值 : 受 氧 化 剂 氧 化 生 成 的 活 性 碘, 对 多 肽 链 的 酪 氨 酸 基 苯 环 羟 基 邻 位 的 碘 化 作 用, 最 适 ph 是 7.3~7.8 之 间 当 ph 变 化 时, 碘 化 位 置 也 会 发 生 变 化, 例 如 ph 值 较 高 时, 组 氧 酸 的 咪 唑 环 也 可 被 碘 化 ; 当 ph4~5 时, 活 性 碘 能 迅 速 氧 化 色 氨 酸 基 生 成 羟 基 吲 哚, 导 致 肽 链 断 裂 这 些 都 会 影 响 蛋 白
质 或 多 肽 的 放 射 性 碘 化 反 应, 或 引 起 降 解 或 失 活 因 此 作 放 射 性 碘 化 标 记 时, 除 放 射 性 碘 源 外, 所 有 的 试 剂 都 应 用 适 当 的 缓 冲 液 配 制, 保 证 碘 化 反 应 在 最 佳 ph 条 件 下 进 行 (7) 微 量 蛋 白 质 或 多 肽 的 吸 附 损 失 : 界 面 的 吸 附 损 失, 在 使 用 大 量 蛋 白 质 或 多 肽 类 时 是 可 以 忽 略 的, 但 作 微 量 法 标 记 时 投 入 的 蛋 白 质 或 多 肽 类 只 在 微 克 甚 至 毫 克 甚 至 毫 微 克 水 平, 界 面 吸 附 导 致 的 损 失 就 不 能 131 忽 略 例 如 制 备 I ACTH 时, 所 用 ACTH 浓 度 低 到 50Pg/ml 时, 因 表 面 吸 附 可 损 失 10%~30%, 甚 至 高 达 75% 改 变 ph 加 入 非 特 异 性 载 体 蛋 白 或 使 用 聚 苯 乙 烯 聚 乙 烯 容 器 时, 能 减 少 吸 附, 但 不 能 完 全 消 除 一 般 残 留 在 反 应 管 和 滴 管 上 的 放 射 性 为 投 入 总 放 射 性 的 2%~8% 残 留 在 层 析 柱 上 折 占 5%~10 % 残 留 量 随 标 记 蛋 白 比 放 射 性 强 度 而 直 线 增 减, 残 留 者 几 乎 全 部 都 是 标 记 蛋 白 由 此 可 见, 微 量 蛋 白 质 或 多 肽 受 吸 附 而 损 失 的 量 是 不 容 忽 略 的 由 于 微 量 蛋 白 质 多 肽 会 被 显 著 吸 附 而 丢 失, 所 以 标 记 时 投 入 蛋 白 质 多 肽 量 过 微 ( 如 <2μg) 也 是 不 适 宜 的, 否 则 标 记 蛋 白 质 多 肽 的 收 回 率 会 太 低, 并 在 计 算 上 会 造 成 较 大 的 误 差 (8) 不 同 蛋 白 质 多 肽 碘 化 标 记 的 差 别 : 由 于 不 同 的 蛋 白 质 和 多 肽 分 子 中 含 有 的 酪 氨 酸 数 目 不 同, 而 且 其 空 间 结 构 也 不 相 同, 分 子 中 的 酪 按 酸 残 基 有 的 容 易 发 生 碘 化 反 应, 有 的 就 不 容 易 碘 化, 因 此 同 样 条 件 下 进 行 碘 化 标 记, 不 同 蛋 白 质 或 多 肽 对 碘 的 利 用 率 是 不 相 同 的 不 同 蛋 白 质 经 碘 化 标 记 后 生 物 活 性 受 损 的 情 况 也 各 不 相 同 例 如 ACTH 促 性 腺 激 素 释 放 激 素 (GRH) 促 黄 体 激 素 释 放 激 素 (LRH) 等 多 肽, 碘 化 标 记 后 容 易 丧 失 激 素 活 性 或 与 受 体 结 合 的 活 性 ; 而 AFP 及 人 绒 毛 膜 促 性 腺 激 素 (HCG) 等 的 碘 化 标 记, 则 较 容 易 保 存 良 好 的 免 疫 化 学 活 性 尽 管 不 同 多 肽 蛋 白 度 的 碘 化 标 记 结 果 有 所 差 别, 但 上 述 讨 论 的 因 素 对 不 同 多 肽 蛋 白 质 碘 化 标 记 的 影 响 有 共 同 的 规 律 掌 握 了 这 些 因 素, 就 容 易 成 功 地 获 得 合 格 的 标 记 物 不 同 多 肽 蛋 白 质 的 分 子 量 大 小 理 化 性 质 各 不 相 同, 放 射 碘 化 标 记 反 应 后, 可 根 据 具 体 情 况 采 取 不 同 的 方 法 将 标 记 蛋 白 质 ( 或 多 肽 ) 与 未 反 应 的 游 离 放 射 性 碘 及 受 损 伤 的 标 记 物 分 开, 常 用 的 方 法 有 凝 胶 过 滤 离 子 交 换 层 析 吸 附 层 析 各 种 电 泳 法 等 ( 二 ) 乳 过 氧 化 物 酶 法 (LPO LPO) 本 法 反 应 温 和, 对 抗 原 抗 体 免 疫 活 性 影 响 小, 已 被 广 泛 应 用 缺 点 是 标 记 率 较 低, 一 般 为 20~40% 1. 原 理 此 法 是 利 用 乳 过 氧 化 物 酶 (Lactoperoxidase) 有 促 进 微 量 过 氧 化 氢 对 I - 的 氧 化 作 用, 生 成 1 25 I +, 并 标 记 在 多 肽 蛋 白 质 酪 氨 酸 分 子 上 2. 方 法 以 标 记 蛋 白 质 抗 原 为 例 (1) 反 应 液 组 成 : 蛋 白 质 2~5μg 溶 于 磷 酸 缓 冲 液 10~25μl 中, 加 入 Na i 1m Ci(10μl) 乳 过 氧 化 物 酶 溶 液 25ng(10μl) H 2O 2200ng(10μl);
(2) 在 室 温 保 温 7min; (3) 加 入 H2O2200ng(10μl); (4) 过 7min 再 加 入 H2O2(3μl); (5) 保 温 7min 后, 加 入 0.5ml 10mmol/L 巯 基 乙 醇 以 停 止 反 应 ; (6)10min 后 加 入 NaI 载 体 溶 液 1ml ; (7) 按 常 规 方 法 分 离 纯 化 3. 注 意 事 项 (1)LPO 质 量 好 坏, 可 直 接 影 响 标 记 率,LPO 应 在 使 用 前 新 鲜 配 制, 以 防 酶 活 性 降 低 (2)LPO 用 量 应 小 于 总 蛋 白 质 用 量 的 1%, 以 减 少 酶 自 身 碘 化 而 带 入 的 放 化 杂 质 (3) 碘 化 反 应 速 率 分 析 表 明, 酶 的 催 化 速 度 很 快 (4) 碘 化 反 应 在 ph4.0~8.5 较 宽 范 围 内 均 可 进 行, 最 适 ph 值 应 依 据 蛋 白 质 本 身 性 质 而 定 (5)H 2O 2 应 保 持 低 浓 度, 如 高 于 0.1mmol/L, 对 酶 的 活 性 将 有 抑 制 作 用 ( 三 )Iodogen 碘 化 法 此 法 具 有 标 记 率 高 反 应 体 积 小 (3ml 水 平 ) 可 用 低 浓 度 的 I 原 料 对 多 肽 激 素 和 蛋 白 质 的 免 疫 活 性 损 失 小 稳 定 等 优 点, 系 常 规 的 碘 化 方 法 之 一 1. 原 理 用 Iodogen 为 氧 化 剂, 对 蛋 白 质 和 多 肽 抗 原 进 行 碘 化 标 记, 把 I 直 接 引 进 分 子 中 的 酪 氨 酸 残 基 上 标 记 过 程 中 被 标 记 样 品 不 与 Iodogen 混 合, 标 记 后 取 出 样 品 即 停 止 反 应, 不 使 用 任 何 还 原 剂 2. 方 法 (1) 标 记 之 前, 先 把 Iodogen 溶 于 有 机 溶 剂, 涂 于 管 底, 并 使 之 干 燥 (2) 标 记 时, 将 蛋 白 质 溶 液 10~20μg/10μl(0.5mol/L,pH7.5PB) 置 于 反 应 管 中, 反 应 管 置 于 冰 浴 中 碘 化 时, I 与 蛋 白 质 克 分 子 之 比 例 为 1~1.2 反 应 时 间 在 温 和 的 连 续 的 搅 拌 下 可 达 10min, 从 反 应 管 中 转 移 出 反 应 混 合 液, 使 其 反 应 停 止 反 应 液 转 移 到 含 有 200μl0.01mol/L ph7.2pb 和 0.15mol/L NaCl 溶 液 中, 层 析 分 离 前 再 放 置 5min, 使 其 未 标 记 的 碘 离 子 还 原 成 分 子 碘, 以 避 免 在 带 有 缓 冲 液 的 柱 中 使 白 蛋 白 碘 化
3. 注 意 事 项 (1) 涂 有 Iodogen 的 反 应 管, 有 氮 气 中 密 封, 并 贮 存 在 -20 条 件 下, 至 少 可 用 3 个 月 打 开 管, 使 用 时 间 很 短 (2) 碘 化 反 应 时 间,7min 时 标 记 率 达 最 高,10min 时 略 有 减 少 PH6.0~8.5 时, 标 记 率 最 高 (3)Iodogen 与 蛋 白 质 的 比 率 是 标 记 率 的 函 数 最 大 的 标 记 率 是 1 克 分 子 的 Iodogen 与 8 克 分 子 或 再 多 量 之 比 ( 四 ) 酰 化 试 剂 (Bolton 和 Hunter 试 剂 ) 法 1. 原 理 这 个 方 法 用 酰 化 剂 3--(4- 羟 苯 基 ) 丙 酸 N 琥 珀 酰 胺 酯 (Bolton Hunter 试 剂 ) 做 连 接 试 剂, 将 I 标 记 在 羟 苯 基 的 2,5 位 置 上, 再 将 琥 珀 酰 胺 酯 水 解, 通 过 一 个 酰 氨 键 将 3--(4 羟 基 5 I 苯 基 ) 接 在 蛋 白 或 多 肽 的 末 端 氨 基 上 2. 方 法 I Bolton Hunter 试 剂 可 用 氯 胺 T 法 自 行 制 备, 出 已 有 该 试 剂 的 苯 溶 液 作 为 商 品 出 售 使 用 时 取 一 定 量 的 标 记 酯 (μmol 蛋 白 用 3~5μmol 标 记 酯 ), 用 氮 气 吹 除 苯, 投 入 欲 标 记 蛋 白 5~10μg 及 缓 冲 液 10~50μl,pH8.0~8.5 为 宜, 在 冰 浴 中 反 应 15~30min 后, 加 入 多 量 氨 基 酸 ( 如 甘 氨 酸 ), 使 过 量 标 记 酯 消 耗 掉 以 终 止 反 应 此 法 避 免 了 蛋 白 质 与 氧 化 剂 的 接 触, 又 避 免 了 与 放 射 性 碘 原 子 的 直 接 接 触, 可 防 止 碘 源 中 有 害 物 质 对 蛋 白 质 的 损 伤, 适 用 于 标 记 缺 乏 酪 氨 酸 的 蛋 白 质 或 酪 氨 酸 在 活 性 中 心, 引 入 碘 原 子 后 会 引 起 蛋 白 质 的 失 活 其 缺 点 是 标 记 技 术 比 较 复 杂, 需 要 接 触 较 多 的 放 射 性, 经 二 步 反 应, 碘 标 记 率 比 较 低 一 般 认 为 此 法 不 宜 标 记 短 肽, 而 适 于 分 子 量 大 于 1 万 的 蛋 白 质 三 放 射 性 标 记 化 合 物 的 纯 化 与 鉴 定 ( 一 ) 纯 化 标 记 化 合 物 的 常 用 方 法 不 论 使 用 何 种 制 备 方 法, 要 获 得 合 格 的 标 记 化 合 物, 都 必 须 将 反 应 物 经 过 仔 细 的 分 离 纯 化 另 外, 一 些 标 记 化 合 物, 经 过 一 定 时 间 的 存 放 后, 往 往 会 出 现 不 纯 物, 而 需 再 纯 化 如 碘 标 记 生 长 激 素 ( --HG H), 在 刚 标 记 的 第 2 天, 从 Sephadex G-100 过 滤 谱 上 可 见, 几 乎 所 有 的 碘 化 HGH 都 集 中 在 峰 II; 保 存 1 个 月 后, 峰 II 组 份 减 少, 峰 I 和 峰 III 成 分 明 显 增 加, 峰 I 是 集 聚 的 标 记 生 长 激 素, 而 峰 III 是 不 具 有 免 疫 活 性 的 放 射 性 化 学 杂 质 ( 图 8--3)
图 8-3 I HGH 的 Sephadex G-100 过 滤 谱 实 线 : 新 鲜 制 备 的 I HGH 虚 线 : 保 存 1 个 月 的 I HGH 标 记 化 合 物 的 纯 化 方 法, 除 制 备 比 活 度 低 而 化 学 量 又 较 多 的 标 记 物 可 用 重 结 晶 蒸 馏 萃 取 等 常 规 方 法 外, 一 般 需 用 微 量 分 离 技 术, 较 方 便 的 是 层 析 法 离 子 交 换 法 凝 胶 过 滤 及 高 效 液 相 层 析 法 等 现 以 碘 标 记 蛋 白 为 例, 说 明 以 上 各 种 方 法 的 适 用 情 况 1. 凝 胶 过 滤 法 常 用 的 是 Sephadex G 系 列, 也 有 Biogel P 系 列 分 离 标 记 蛋 白 与 无 机 碘 时, 通 常 用 Sephadex G 25 或 G 50, 然 后 用 G 100 进 一 步 纯 化 2. 离 子 交 换 法 一 般 是 制 成 离 子 交 换 层 析 柱, 用 于 分 离 纯 化 短 肽 标 记 物 3. 透 析 法 能 将 标 记 蛋 白 与 小 分 子 化 合 物 很 好 地 分 离 4. 电 泳 法 可 用 来 分 离 单 碘 化 多 碘 化 及 已 受 损 伤 的 蛋 白 质 5. 亲 和 层 析 法 利 用 蛋 白 质 与 其 特 异 抗 体 或 受 体 的 结 合 来 分 离 纯 化 标 记 蛋 白 质 此 法 特 异 性 强, 保 持 生 物 活 性 好, 但 操 作 较 复 杂 6. 高 效 液 相 层 析 法 此 法 最 大 优 点 是 分 离 效 果 好 快 速, 但 需 特 殊 设 备 7. 伴 刀 豆 球 蛋 白 A(ConA) 吸 附 法 ConA 是 一 种 植 物 凝 集 素, 对 糖 蛋 白 有 良 好 吸 附 能 力, 因 此 适 于 分 离 标 记 糖 蛋 白 吸 附 的 标 记 糖 蛋 白 可 用 含 0.2mol/L 甲 基 α- 吡 喃 葡 萄 糖 苷 的 PBS 洗 脱 ( 二 ) 标 记 化 合 物 的 主 要 质 量 指 标
作 为 示 踪 剂 及 分 析 试 剂 的 标 记 化 合 物, 应 具 有 比 一 般 非 标 记 化 合 物 更 高 的 质 量 要 求 标 记 化 合 物 的 质 量 指 标 包 括 : 放 射 性 核 纯 度 放 射 化 学 纯 度 放 射 性 比 活 度 生 物 活 性 和 免 疫 活 性 以 及 标 记 位 置 和 定 量 分 布 情 况 等 1. 放 射 性 核 纯 度 及 其 检 查 方 法 (1) 放 射 性 核 纯 芳 可 用 下 式 表 示 : 放 射 性 核 纯 度 (%)= 所 需 放 射 性 核 素 的 活 度 / 样 品 的 总 放 射 性 活 度 100 (2) 放 射 性 核 纯 度 的 检 查 方 法 : 每 一 种 核 素 都 有 它 的 特 征, 即 物 理 半 衰 期 及 射 线 能 量, 故 可 通 过 半 衰 期 及 射 线 能 量 的 测 定 来 鉴 别 所 需 放 射 性 核 的 纯 度 1 测 定 半 衰 期 法 : 如 短 半 衰 期 放 射 性 核 素, 一 般 可 采 用 时 间 跟 踪 法, 每 隔 一 定 时 间 测 量 放 射 性 一 次, 共 测 3~5 个 半 衰 期, 以 每 次 测 得 的 放 射 性 计 数 为 纵 座 标, 时 间 为 横 座 标, 在 半 对 数 纸 上 作 图, 并 通 过 分 析, 可 求 出 该 放 射 性 核 素 的 纯 度 2 测 定 射 线 能 量 法 : 利 用 每 一 放 射 性 核 素 的 特 征 射 线 谱 来 检 查 放 射 性 核 纯 度 γ 发 射 体 可 用 γ 能 谱 仪, 如 检 测 57 Co 和 58 Co 的 核 纯 度 : 纯 β- 发 射 体 可 用 液 闪 仪, 调 节 道 宽 及 淬 火 校 正 后, 对 如 3 H 14 C 32 P 的 核 纯 度 进 行 测 量 ; 而 β γ 混 杂 垓 素, 则 用 吸 收 法 测 量, 如 99mr Tc 中 母 体 杂 质 99m Mo 的 含 量 测 量, 是 通 过 适 当 厚 度 的 铅 屏 蔽, 将 99m Tc 发 射 的 能 量 为 141ke V 的 γ 射 线 减 弱 后, 测 定 99 Mo 发 射 的 能 量 为 739Kev 的 γ 射 线 2. 放 射 化 学 纯 度 及 放 化 纯 度 鉴 定 (1) 放 射 化 学 纯 度 : 放 射 性 核 素 标 记 化 合 物 都 是 以 一 定 的 化 学 形 态 存 在 的, 所 以 : 放 射 化 学 纯 度 (%) 特 定 化 学 形 态 的 放 射 性 活 度 / 样 品 总 放 射 性 活 度 100 放 射 化 学 纯 度 受 制 备 方 法 及 原 料 的 化 学 纯 度 产 物 存 放 条 件 等 影 响, 一 般 放 化 纯 度 控 制 在 95% 以 上 (2) 放 射 化 学 纯 度 的 测 定 方 法 : 原 则 是 高 效 的 化 学 分 离 与 灵 敏 的 放 射 性 测 量 相 结 合 常 用 下 列 方 法 : 1 放 射 层 析 法, 又 称 放 射 色 谱 法 : 本 法 是 利 用 色 谱 技 术 使 混 合 物 中 各 组 份 分 离, 然 后 测 定 各 组 份 的 放 射 性 活 度 它 具 有 选 择 性 高 分 离 效 果 好 操 作 简 便 等 优 点, 在 放 化 纯 度 鉴 定 中 是 一 种 重 要 的 分 析 方 法 最 常 用 的 是 放 射 性 纸 层 析 法 和 放 射 性 薄 层 层 析 法 2 放 射 性 高 效 液 相 层 析 法 : 它 对 分 离 纯 化 标 记 化 合 物 及 鉴 定 标 记 化 合 物 的 放 化 纯 度 都 有 很 大 潜 力, 具 有 分 析 速 度 快 分 离 效 率 高 适 用 范 围 广 等 特 点 ( 几 乎 80% 的 有 机 化 合 物 均 可 应 用 ) 关 键 是 要 选 择 合 适 的 固 定 相 和 流 动 相, 使 产 品 与 杂 质 分 离 在 流 动 相 中, 被 分 析 物 各 组 份 的 浓 度 变 化 可 用 紫 外 或 荧 光 检 测 器
检 测, 而 其 放 射 性 活 度, 可 同 时 由 放 射 性 探 测 仪 测 定 放 射 性 活 度 测 定 最 简 单 的 一 种 办 法, 是 将 洗 脱 液 分 部 收 集, 然 后 在 γ 仪 或 液 闪 仪 上 进 行 测 量 ; 另 一 种 较 理 想 的 是 连 续 测 量, 在 洗 脱 液 流 通 池 外 包 围 一 个 固 体 闪 烁 探 头, 进 行 γ 计 数 或 在 流 通 池 前 加 一 个 三 通 混 合 室, 用 另 一 个 泵 混 入 闪 烁 液, 测 定 软 β 射 线 可 以 与 紫 外 控 测 器 的 扫 描 图, 同 步 描 绘 出 放 射 性 的 分 布 图 3 放 射 性 核 素 反 稀 释 法 : 取 一 定 量 (W1) 已 测 定 比 活 度 (SO) 的 标 记 化 合 物 ( 约 0.1~10mg), 用 > 1000 倍 化 学 量 (W2) 的 纯 载 体 稀 释, 充 分 混 匀 后 反 复 纯 化 到 比 活 度 恒 定 不 变 (Sp), 此 标 记 化 合 物 的 放 化 纯 度 值 应 为 : 有 时 该 值 >100% 时, 往 往 是 由 于 所 用 载 体 化 学 纯 度 不 够 因 本 法 操 作 要 求 严 格, 一 般 不 作 常 规 放 化 纯 度 鉴 定 用 3. 化 学 纯 度 及 化 学 量 的 测 定 标 记 化 合 物 中 的 非 放 射 性 化 学 杂 质 虽 一 般 不 会 对 示 踪 结 果 带 来 直 接 干 扰, 然 而 这 种 杂 质 的 含 量 越 多 对 标 记 化 合 物 在 使 用 存 放 过 程 中 分 解 变 性 的 影 响 就 越 大 此 外, 也 已 发 现 某 些 标 记 化 合 物 的 化 学 杂 质 会 给 使 用 带 来 直 接 影 响 如 用 氚 标 记 类 固 醇 作 放 射 免 疫 分 析 试 剂, 其 中 的 化 学 杂 质 会 影 响 标 记 抗 原 与 抗 体 的 结 合 率, 使 分 析 灵 敏 度 降 低 因 此, 对 标 记 化 合 物 的 化 学 杂 质 含 量, 同 样 必 须 加 以 控 制 要 制 得 化 学 纯 度 的 标 记 化 合 物, 最 好 是 对 可 能 产 生 的 杂 质 加 以 防 止 这 要 在 冷 试 验 中 解 决 因 为 冷 试 验 所 得 产 品 是 非 放 射 性 的, 其 化 学 纯 度 可 用 常 规 方 法, 如 溶 点 沸 点 测 定,NMR 红 外 紫 外 谱 分 析 等 手 段 加 以 鉴 定, 得 到 合 格 产 品 后, 再 按 同 样 方 法 及 条 件 进 行 标 记 制 备 对 于 标 记 化 合 物 的 化 学 含 量, 则 必 需 在 标 记 反 应 及 一 定 纯 化 步 骤 后 进 行, 由 于 需 要 高 比 活 度 的 标 记 化 合 物, 往 往 样 品 的 放 射 性 很 强, 而 化 学 量 极 微 ( 如 某 氘 标 记 化 合 物, 分 子 量 为 300, 每 分 子 上 标 记 2 个 氘 原 子, 氘 的 同 位 素 活 度 为 99.8%, 则 理 论 上 每 25mCi(925MBq) 的 化 学 量 还 不 足 (130μg), 所 以 需 用 微 量 分 析 法 才 能 测 定 其 含 量 一 般 而 言, 各 种 常 规 微 量 分 析 技 术 均 可 应 用 目 前 大 多 用 紫 外 分 光 荧 光 光 度 等 进 行 含 量 测 定 4. 放 射 性 比 活 度 及 其 测 定 (1) 放 射 性 比 活 度 简 称 比 活 度, 过 去 也 称 比 放 射 性 比 活 度 = 放 射 性 活 度 / 单 位 化 学 量 (2) 比 活 度 的 理 论 值 计 算 : 每 种 放 射 性 核 素 有 一 个 比 活 度 理 论 值, 取 决 于 该 核 素 的 半 衰 期 和 衰 变 常 数 若 N 是 1 毫 克 原 子 (1mA) 的 总 原 子 数, 衰 变 常 数 λ( 单 位 时 间 衰 变 的 %), 则
任 何 元 素 每 1mA 的 原 子 数 都 相 同, 等 于 阿 伏 加 德 罗 常 数, 即 6.023 10 20 个, 故 若 T1/2min 为 单 位, 则 上 式 的 活 度 单 位 为 dpm/ma, 进 行 单 位 换 算 后 为 : 根 据 上 式, 可 计 算 出 每 种 放 射 性 核 素 比 活 度 的 理 论 值 ( 常 用 放 射 性 核 素 的 比 活 度 理 论 值 见 表 8-2) 如 果 标 记 化 合 物 每 分 子 接 上 一 个 放 射 性 核 素 原 子, 则 以 上 原 论 值 亦 为 该 标 记 化 合 物 的 比 活 度 ( 每 毫 摩 尔 的 活 度 ) 理 论 值 表 8-2 一 些 常 用 放 射 性 核 素 的 比 活 度 理 论 值 ( 亦 即 每 分 子 一 接 一 个 该 放 射 性 核 素 原 子 的 标 记 化 合 物 的 经 活 度 理 论 值 ) 放 射 性 核 素 半 衰 期 比 活 度 理 论 值 ( 每 ma 或 mmol 的 活 度 ) 14 C 5730 年 0.0624 Ci (2.3 GBq) 3 H 12.33 年 29.0 Ci(1073 GBq) 45 Ca 165 天 793 Ci (29.3 TBq) 75 Se 118.5 天 1100 Ci(40.7 TBq) 35 S 87.4 天 1494 Ci (55.2 TBq) I 60.2 天 2196 Ci(80.3 TBq) 131 I 8.04 天 16240 Ci (600 TBq) (3) 放 射 性 比 活 度 测 定 方 法
1 直 接 测 定 计 算 法 : 将 标 记 产 品 经 分 离 纯 化 后, 配 成 合 适 的 溶 液, 测 定 每 毫 升 的 放 射 性 活 度 ( 如 mci /ml) 及 含 量 (μg/ml) 从 而 计 算 其 比 活 度 对 于 高 经 活 度 的 标 记 物, 化 学 含 量 甚 低, 一 般 需 用 光 谱 法, 如 紫 外 分 光 光 度 法 测 定 其 含 量 2 层 析 扫 描 面 积 计 算 法 : 一 般 应 用 纸 层 析 或 薄 层 层 析, 将 反 应 结 果 尚 未 分 离 的 反 应 液 点 样 展 层, 然 后 在 扫 描 仪 上 描 绘 放 射 性 分 布 图, 根 据 描 绘 的 面 积 来 进 行 计 算, 如 图 8-4 图 8-4 放 射 层 析 扫 描 面 积 计 算 比 活 度 示 意 图 1 为 标 记 物 峰 面 积 : S2S3 为 杂 质 峰 及 放 射 性 原 料 峰 面 积 先 计 算 标 记 率 : 放 射 性 比 活 度 的 计 算 : 若 投 入 的 待 标 记 物 重 量 为 W, 且 100% 转 化 为 标 记 物, 则 比 活 度 =A Y/W, 其 中 A 为 投 入 的 总 放 射 性 如 果 层 析 扫 描 仪 有 紫 外 监 测 器 和 放 射 性 活 度 计 数 率 仪 可 同 步 测 定 扫 描, 则 直 接 可 给 出 比 活 度 3 自 身 取 代 计 算 法 : 这 是 间 接 测 定 标 记 物 比 活 度 的 方 法 所 测 定 的 标 记 物, 需 是 分 离 纯 化 后 可 用 于 RI A 或 RRA 标 记 试 剂 方 法 的 原 理 是 : 作 一 条 常 规 的 RIA( 或 RRA) 标 准 曲 线, 另 作 一 条 不 加 非 标 记 标 准 品, 只 加 抗 体 和 不 同 量 标 记 试 剂 的 自 身 取 代 曲 线 两 者 用 同 一 种 抗 体, 且 抗 体 用 量 完 全 相 同 若 反 应 平 衡 后 测 定 结 合 部 分 的 放 射 性, 掏 算 成 所 加 总 放 射 性 ( 注 意 : 对 标 准 曲 线 总 说 总 放 射 性 各 管 相 同, 对 自 身 取 代 曲 线 来 说 各 管 不 同, 需 分 别 换 算 ) 的 百 分 数, 即 结 合 率 B 由 于 两 条 曲 线 所 用 抗 体 的 质 和 量 严 格 相 同, 标 记 物 与 非 标 记 标 准 品
与 抗 体 亲 和 力 也 相 同, 故 B 的 大 小 就 完 全 取 决 于 各 管 中 标 记 物 和 非 标 记 标 准 品 的 总 量 亦 即 若 从 两 标 准 曲 线 上 取 一 点 相 同 的 B, 则 ( 标 记 物 + 标 准 品 ) 标 准 曲 线 =( 标 记 物 ) 自 身 取 代 曲 线 比 活 度 故 由 此 便 可 直 接 计 算 标 记 试 剂 的 化 学 含 量 并 进 一 步 求 得 比 活 度 为 求 准 确 度 高, 可 取 我 点 B 求 出 平 均 用 自 身 取 代 法 测 定 标 记 化 合 物 的 比 活 度, 只 适 用 于 RIA 的 标 记 抗 原 及 受 体 的 标 记 配 基 使 用 时 应 注 意 : 1 标 记 物 与 未 标 记 物 对 抗 体 ( 受 体 ) 的 亲 和 力 应 相 同 ;2 非 特 异 性 结 合 应 较 小, 且 计 算 时 应 扣 除 ;3 制 备 标 准 曲 线 与 自 身 取 代 曲 线 时, 操 作 步 骤 应 相 同, 特 别 是 B 与 F 分 离 的 条 件 要 一 致 5. 生 物 活 性 免 疫 活 性 测 定 (10) 生 物 活 性 免 疫 活 性 测 定 的 重 要 性 : 放 射 性 标 记 化 合 物 作 为 示 踪 剂 用 于 生 物 体 内 的 示 踪 研 究, 或 作 为 分 析 试 剂 用 于 生 物 活 性 物 质 分 析, 都 要 求 标 记 化 合 物 不 改 变 其 原 有 的 生 物 活 性 和 免 疫 活 性 当 给 化 物 引 入 放 射 性 原 子, 即 使 同 位 素 标 记 大 多 需 经 过 原 子 交 换 或 化 学 反 应 及 分 离 纯 化 等 物 理 化 学 处 理, 有 可 能 造 成 光 学 构 型 及 立 体 构 型 的 改 变 而 使 标 记 物 改 变 性 质 非 同 位 素 标 记, 如 蛋 白 质 分 子 中 引 入 碘 原 子, 则 更 易 引 起 蛋 白 质 失 活 变 性 故 测 定 放 射 性 标 记 化 合 物 的 生 物 活 性 和 免 疫 活 性, 对 保 证 使 用 效 果 十 分 必 要 (2) 生 物 活 性 和 免 疫 活 性 测 定 的 要 求 : 需 根 据 使 用 要 求 而 定, 因 为 同 一 标 记 物 其 生 物 活 性 的 变 化 与 免 疫 活 性 的 变 化 不 一 定 相 关 ; 同 一 标 记 激 素, 其 与 受 体 结 合 能 力 的 改 变 与 抗 体 结 合 能 力 的 改 变 也 不 一 定 平 行 (3) 测 定 方 法 : 测 定 标 记 蛋 白 质 或 多 肽 的 生 物 活 性 和 免 疫 活 性 常 用 的 方 法 有 下 述 几 种 : 1 物 理 化 学 方 法 : 可 用 电 泳 法 吸 附 法 及 凝 胶 过 滤 法 等 物 理 化 学 方 法 来 测 定 标 记 蛋 白 质 的 结 构 改 变 情 况, 如 标 记 后 受 损 全 伤 的 蛋 白 质 在 电 泳 时 泳 动 性 减 少, 碘 化 受 损 的 多 肽 激 素 在 血 红 蛋 白 涂 碳 上 的 吸 附 性 质 也 有 改 变, 而 蛋 白 质 变 性 聚 合 时 大 分 子 聚 合 体 将 在 凝 胶 过 滤 时 不 停 留 在 凝 胶 柱 上 这 些 测 定 虽 较 快 速 方 便, 但 对 标 记 物 的 生 物 活 性 和 免 疫 活 性 的 严 格 判 定 来 说, 还 是 很 不 够 的 2 特 异 结 合 试 验 : 根 据 放 射 性 标 记 化 合 物 用 于 放 射 免 疫 分 析 等 不 同 要 求, 分 别 与 其 相 应 抗 体 或 受 体 进 行 特 异 性 结 合 试 验 以 放 射 免 疫 分 析 试 剂 为 例, 测 定 其 免 疫 活 性 的 方 法 是 : 先 观 察 标 记 物 与 抗 体 的 结 合 率, 如 果 结 合 率 高, 说 明 抗 原 的 免 疫 活 性 较 好 进 一 步 观 察 标 记 抗 原 与 非 标 记 对 抗 体 亲 合 力 是 否 一 致, 做 法 之 一 是 用 不 同 稀 释 度 的 抗 体, 分 别 与 标 记 抗 原 及 与 标 记 抗 原 加 非 标 记 抗 原 的 混 合 物 进 行 特 异 结 合, 其 中 混 合 物 抗 原 总 浓 度 要 和 单 独 使 用 放 射 性 抗 原 的 浓 度 相 同 如 单 独 使 用 标 记 抗 原 1.0ng, 而 混 合 抗 原 的 总 浓 度 亦 为 1.0ng, 其 中 标 记 抗 原 为 0.1ng, 非 标 记 抗 原 为 0.9ng, 比 较 两 者 的 结 合 率, 如 果 基 本 相 同, 说 明 标 记 抗 原 保 持 其 原 来 的 亲 和 力, 在 标 记 等 操 作 过 程 中 未 受 到 明 显 损 伤 如 图 8-5 中,A 线 与 B 线 基 本 平 行 ; 如 果 标 记 抗 原 免 疫 活 性 已 有 降 低, 则 如 C 线 所 示
图 8-5 标 记 蛋 白 的 免 疫 活 性 测 定 A; 为 标 记 抗 原 与 血 清 的 滴 度 曲 线 B: 为 非 标 记 抗 原 ( 加 入 少 量 标 记 抗 原 ) 的 滴 度 曲 线 ;C: 与 A 相 同, 但 标 记 抗 原 免 疫 活 性 已 有 降 低 3 生 物 特 性 测 定 : 如 I 纤 维 蛋 白 原, 可 用 凝 血 酶 测 定 其 可 凝 能 力, 与 非 标 记 物 相 比, 视 是 否 有 改 变 使 用 何 种 生 物 特 性 测 定, 根 据 标 记 物 的 生 物 性 质 而 定 另 外, 上 述 特 异 性 结 合 试 验, 如 果 受 体 作 异 结 合 剂, 也 是 检 验 用 作 RRA 或 RBA 分 析 试 剂 的 标 记 物 生 物 活 性 情 况 的 有 效 方 法 </P< p>