生物技术通报 Biotechnology Bulletin 20 1 1.1 系统 RNAi 研究概况 在咽部被抑制而在体壁可以表达的个体 在这些个 线虫的系统RNAi 体中 咽部 GFP 的沉默表明细胞自主 RNAi 仍然存在 线虫是最早用来研究 RNAi 的模式生物 系统 而体壁 GFP 的存在

生物技术通报 BIOTECHNOLOGY 综述与专论 BULLETIN 系统 RNA 干扰及在昆虫中的应用 王会冬 龚亮 胡美英 洪鹏 华南农业大学 天然源农药与化学生物学教育部重点实验室 广州 510642 摘 要 系统性是 RNA 干扰 RNA interference RNAi 在植物和线虫中的一个重要特性 即 RNAi 沉默信号可以在细胞和 组织间进行传递 近年来研究发现某些昆虫中也存在系统 RNAi 现象 RNAi 技术对很多领域的发展具有重要的促进作用 包括功 能基因组学和害虫防治等领域 综述线虫 昆虫的系统性 RNAi 研究概况以及 RNAi 在昆虫领域的应用现状 并展望其应用前景 关键词 RNA 干扰 系统性 sid-1 昆虫 Systemic RNA Interference and Its Application in Insect Wang Huidong Gong Liang Hu Meiying Hong Peng Key Laboratory of Natural Pesticide and Chemical Biology Ministry of Education South China Agricultural University Guangzhou 510642 Abstract: A remarkable property of RNA interference RNAi in the nematode and plants is its systemic nature silencing signals can cross cellular boundaries to silence gene expression distant from the site of initiation. In the past years it is found that some insects can also show systemic RNAi. RNAi technology has significant technological advances in diverse fields including functional genomics and agricultural pest control. Here we collected the current status of systemic RNAi in nematode and insects we also introduce the current applications in insects as well as expect its potential applications. Key words: RNA interference Systemic sid-1 Insect RNA 干扰 RNA interference RNAi 是指外源 染 系统 RNAi 指 RNAi 信号从一个细胞传递到另外 或内源双链 RNA double-stranded RNA dsrna 介 一个细胞 或从一种组织传递到同一个体的另外一 导的细胞内 mrna 发生特异性降解 导致靶基因表 种组织 有些研究者称这种现象为非细胞自主 RNAi 1 2 达沉默的现象 RNAi 现象是 Fire 等 偶然发现的 non-cell-autonomous RNAi 并相应地将 dsrna 引 当 Fire 与其同事试图向秀丽隐杆线虫 Caenorhabditis 起的同一细胞内 mrna 降解称之为细胞自主 RNAi elegans 中注射反义 RNA 以抑制相应基因表达时 cell-autonomous RNAi 6 RNAi 具 有 两 个 显 著 的 发现 dsrna 比反义 RNA 具有更强烈的抑制效应 特点 首先是高特异性 可能因此在农业上作为一 此后人们根据这一生物特性 发展了 RNA 干扰技术 种特殊的手段来控制害虫 7 8 其次 RNAi 具有系 并已广泛应用于除模式生物以外的其他物种 统性 例如 在线虫中能够系统性地传播 RNAi 信 RNAi 是生物体保护自身基因组免受外源性 如 号以沉默远离 dsrna 摄入位点的靶基因 在某些昆 病毒 和内源性 如转座元件 序列侵袭的一种免 虫中 如赤拟谷盗 Tribolium castaneum 9 10 也 疫机制 3 RNAi 抵抗病毒最早在植物中发现 但 存在系统性 RNAi 现象 目前的研究结果表明这种抵抗病毒的天然免疫方式 广泛存在 4 5 RNAi 在多细胞生物中需要细胞自主 RNAi 以及系统 RNAi 传播机制来抵抗外来病毒的感 虽然系统 RNAi 现象早在 1997 年就已发现 但 有关系统 RNAi 的作用机制却报道得较少 RNA 沉 默信号可能涉及多种基因及转运机制 收稿日期 : 2012-05-16 基金项目 : 国家自然科学基金项目 31171870 作者简介 : 王会冬, 男, 硕士研究生, 研究方向 : 昆虫分子生物学 ; E-mail: wowhd2011@163.com 通讯作者 : 胡美英, 女, 教授, 研究方向 : 天然源农药, 农药残留与环境保护, 昆虫生理毒理等 ; E-mail: humy@scau.edu.cn

生物技术通报 Biotechnology Bulletin 20 1 1.1 系统 RNAi 研究概况 在咽部被抑制而在体壁可以表达的个体 在这些个 线虫的系统RNAi 体中 咽部 GFP 的沉默表明细胞自主 RNAi 仍然存在 线虫是最早用来研究 RNAi 的模式生物 系统 而体壁 GFP 的存在表明 RNAi 系统传播的缺失 在 RNAi 的很多研究都在线虫中进行 早在 1998 年 进行基因组筛选的过程中 他们鉴定了 3 个系统性 Fire 等在线虫中就发现了系统 RNAi 现象 但并未对 RNAi 缺失 systemic RNA interference defective sid 其作用机制进行深入研究 基因 分别命名为 sid-1 sid-2 和 sid-3 并对 sid-1 2002 年 Winston 等 11 通过一种非常巧妙的方 进行了深入的研究 法鉴定了系统 RNAi 的相关基因 他们构建了一种 研究发现 sid-1 的表达产物 SID-1 是一个具有 特殊的线虫 通过可见的方式显示细胞自主以及非 776 个氨基酸 11 个穿膜结构域 7 个螺旋 高通 细胞自主 RNAi 筛选那些可进行细胞自主 RNAi 而 量表达的跨膜疏水性蛋白 利用 GFP 作报告基因发 不能进行非细胞自主 RNAi 的突变体 他们构建的 现 SID-GFP 主要分布在细胞膜表面 β-半乳糖苷 线虫相关突变品系可在体壁及咽部肌肉表达绿色荧 酶蛋白融合试验证明它的 N-末端位于细胞外 C-末 光蛋白 green fluorescent protein GFP 同时他们 端位于细胞内 在线虫中 分子遗传学的研究表明 又构建了一种以 GFP 为靶标的 dsrna 质粒 这种 sid-1 对 RNAi 的系统诱发具有重要作用 SID-1 能够 质粒仅在咽部表达 当向虫体转染这种质粒时 他 通过不同的动力学方式运输 dsrna sirna 或 RNAi 们发现线虫不仅咽部的 GFP 被抑制 而且体壁肌肉 信号到生物体各个不同的细胞系中 11-13 但有报道 的 GFP 也被抑制 这表明了 RNAi 存在系统性传播 当 RNAi 沉默信号从线虫组织输出时 SID-1 不是必 然后他们对这个品系进行诱变 鉴定其后代中 GFP 须的 14 a b c Cytoplasm SID-2 modifies SID-1 function 图1 d Cytoplasm SID-2 binds dsrna and presents it to SID-1 Cytoplasm SID-2 internalizes dsrna via receptor-mediated endocytosis 线虫肠腔 dsrna 摄取中 SID-1 和 SID-2 的作用模式 15 环境 RNAi environmental RNA interference 是 指物种从环境中摄取 dsrna 并导致特异性基因沉默 的现象 15 sid-2 在线虫中的编码产物 SID-2 蛋白是 一个 311 个氨基酸的膜蛋白 sid-2 主要在中肠表达

王会冬等 系统 RNA 干扰及在昆虫中的应用 在线虫环境 RNAi 中发挥着重要作用 如果线虫缺 失该基因 线虫就不能从环境中吸收 dsrna 环境 1.2 21 昆虫的系统RNAi 果蝇的 RNAi 不具强烈的系统性 也没有发现 RNAi 现象就不会出现 但是在只有 sid-2 的情况下 sid-1 同源基因 19 Feinberg 等 12 将线虫的 sid-1 转 环境 RNAi 也无法发生 单独的 SID-2 无法从肠腔 入 S2 细胞发现 转基因的 S2 细胞具有从培养液中 中摄取 dsrna 因为在缺失 sid-1 的情况下 dsrna 摄取 dsrna 的能力 而且其摄取效率与 dsrna 的 被吸收到中肠细胞后 RNAi 信号不能在下游进行传 长度成正相关 同时他们还证明 sid-1 介导的细胞 递 因 此 sid-1 sid-2 是 环 境 RNAi 所 必 需 的 在 摄取 dsrna 的能力与环境温度及能量供应无关 因 sid-2 突变的情况下 线虫不能发生环境 RNAi 但 此推测 SID-1 蛋白可能作为膜通道促使 dsrna 被动 仍可以通过注射的方法进行系统性 RNAi 16 对于 SID-1 和 SID-2 这两种蛋白之间的关系 目前提出了 15 3 种假设 图 1 还需要对这些模式进行更深入 的研究 扩散进入细胞 研究发现 果蝇 S2 细胞中的 dsrna 是通过一 种受体调节的内吞途径进入细胞的 20 Ulvila 等 21 在果蝇的 S2 细胞中鉴定了两个清除受体 SR-CI 和 17 Tijsterman 等 在研究系统性 RNAi 分子机制时 Eater 并发现 90% 以上的 dsrna 是由这两个受体 通过遗传突变的方法筛选到 30 个与系统 RNAi 有关 运送到 S2 细胞的 Saleh 等 20 发现缺失液泡 H+ATP 的突变并将其命名 RNAi 传播缺失 RNAi spreading 酶的 S2 细胞在内吞小囊泡中累积 dsrna 但是没有 defective rsd 基因 他们将其分为 5 个互补群 出现 RNAi 现象 可以推测液泡 H+ATP 酶在 dsrna rsd-2 rsd-3 rsd-4 rsd-6 rsd-8 研 究 发 现 向 摄取的内吞途径中起到了一种控制作用 rsd-8 突变体中注射任一种 dsrna 均可产生相应的 线虫系统 RNAi 信号传播的相关基因是 sid-1 RNAi 表型 但饲喂针对生殖细胞基因或体细胞基因 然而在果蝇中没有发现 sid-1 同源基因 在赤拟谷 的 dsrna 时 rsd-8 突变体未表现出 RNAi 表型 研 盗 18 基 因 组 中 发 现 了 3 个 sid-1 的 同 源 基 因 在 究发现 rsd-8 与 sid-1 为同一个基因 鉴于 Winston 南 美 沙 漠 蝗 Schistocerca Americana 22 中 也 发 现 等已对该基因进行了深入研究 因此他们着重研究 sid-1 同源基因 赤拟谷盗和南美沙漠蝗中都存在强 了其他几个基因 对于 rsd-2 rsd-3 和 rsd-6 三个突 烈的系统 RNAi 反应 在家蚕 Bombyx mori 中虽 变体 在体细胞中仍然保留着系统 RNAi 但是在生 然发现了 3 个 sid-1 同源基因 但没有强烈的系统 殖细胞系中丧失了系统 RNAi 的能力 RSD-2 不存 RNAi 现象 18 有报道证明 SID-1 蛋白调节 dsrna 在一个可辨别的基序 相反 RSD-6 含有一个 Tudor 进入家蚕细胞 并且可以增强家蚕细胞的沉默效 结构域 该结构域常出现于 RNA 结合蛋白中 说 果 23 24 在同翅目的棉蚜 Aphis gossypii 25 中发 明 RSD-6 可能与 RNA 结合有关 通过酵母双杂交 现了一个 sid-1 同源基因 棉蚜的跨膜蛋白拓扑结构 试验发现 RSD-2 与 RSD-6 有频繁的相互作用 提 分析显示这个基因所编码的蛋白与线虫中的 SID-1 示 RSD-2 与 RSD-6 在系统 RNAi 中可能作为一个复 有很大的相似性 但它在 dsrna 摄取中的作用还需 合体起作用 rsd-3 编码了包含表皮生长因子途径 要进一步研究 蜜蜂 Apis mellifera 的 sid-1 同源 底物蛋白氨基末端同源 ENTH 域的 RSD-3 蛋白 基因的表达量在其目标基因下降之前提高了 说明 ENTH 域经常在细胞内囊泡转运蛋白 表明 RSD-3 sid-1 同源基因参与了 dsrna 的摄取 26 目前在双 可能参与了系统 RNAi 另外 RSD-3 蛋白与线虫 翅目中还没有发现 sid-1 同源基因 推测可能是在长 的 Epn-1 相似 在果蝇 Drosophila melanogaster 中 期的自然进化中双翅目昆虫丢失了 sid-1 同源基因 与其相对应的蛋白 Lqf liquid facets Lqf 参与了 进 一 步 研 究 发 现 昆 虫 的 系 统 RNAi 机 理 可 能 Notch 信号传播 尽管没有报道 Epn-1/Lqf 家族蛋白 与线虫存在差异 赤拟谷盗中没有线虫 RNAi 所需 参与了系统 RNAi 但它们与 RSD-3 的高度相似提 的关键因子 如依赖于 RNA 的 RNA 聚合酶 RNA- 示 Epn-1/Lqf 家族蛋白可能参与了系统 RNAi 18 dependent RNA polymerase RdRP 而且在赤拟谷

生物技术通报 Biotechnology Bulletin 22 盗中通过序列分析发现 3 个 sid-1 同源基因与线虫的 2.2 害虫控制 tag-i30 基因更为相似 但 tag-i30 基因并没有参与系 利用 RNAi 技术来控制害虫的首要问题是怎样 统 RNAi 当把赤拟谷盗的 3 个 sid-1 同源基因中的 使靶标生物能够自动地摄取 dsrna Turner 等 31 说 通过向淡褐苹果蛾 Epiphyas postvittana 幼虫喂食 明 sid-1 同源基因在昆虫中所起到的作用还需要进一 dsrna 了引起了 RNAi Whyard 等 32 设计以液泡 步鉴定 昆虫的系统 RNAi 机理还需要进行更深入 H+ATP 酶为靶标的 dsrna 通过喂食选择性的杀死 的研究 揭示昆虫中系统 RNAi 的分子机制有助于 了目标昆虫 通过喂食小菜蛾具有特定目标序列的 将 RNAi 技术应用于害虫防治 dsrna beta Px1 小 菜 蛾 Plutella xylostella 出 现 18 一个或全部被沉默时 RNAi 没有受到影响 2 2.1 RNAi 在昆虫中的应用 了显著的死亡率 33 即使这样 在实际应用中连续 基因功能分析 喂食 dsrna 的问题仍然没有得到解决 Baum 等 34 RNAi 技术已被应用于完全变态和不完全变态昆 根据编码必需蛋白的基因是 RNAi 导致死亡的最好 虫基因功能的研究 3 通过导入 dsrna 抑制昆虫体 内内源基因的表达 从而根据基因缺失的拟表型研 究该基因的功能 该方法已被很多昆虫研究者所掌 握 多种昆虫的基因功能也逐渐被确定 Kennerdell 等 27 用显微注射的方法将果蝇的与翅形成有关基 因 frizzled 和 frizzled 2 的 dsrna 注入胚胎中 分别 得到这两个基因的缺陷型 首次实现了用 RNAi 技 术来研究昆虫基因的功能 RNAi 技术和 Sindbis 病 靶 标 的 原 则 从 玉 米 根 萤 叶 甲 Diabrotica virgfera virgifera 的 cdna 文库中筛选出 290 个候选靶标基 因 评价这些基因 RNAi 对玉米根萤叶甲的毒性 结果表明最有效的是液泡 ATP 酶基因 并用转基因 玉米去表达以玉米根莹叶甲的液泡 H+ATP 酶为靶标 的 dsrna 以引起虫体内的 RNAi 从而达到控制 害虫的目的 结果表明经过基因改造的玉米根部遭 受的破坏要比未改造的少 50% Mao 等 35 分离了 毒表达系统相结合 成功地鉴定了埃及伊蚊 Aedes 棉铃虫 Heliothis armigera 参与棉毒素解毒的 P450 aegypti 的 卵 黄 蛋 白 原 vitellogenin Vg 的 受 体 基因 用 dsrna 转基因植物喂食棉铃虫幼虫后 细 AaGATAr 的功能 28 Kanginakudru 等 29 将可遗传 胞色素 P450 的 mrna 水平降低 棉铃虫幼虫生长 的 RNAi 应用于家蚕中 成功实现了 early-1 ie-1 迟缓 甚至死亡 此外 RNAi 在一些刺吸式口器害 基因的持续沉默 阻止了家蚕免受病毒的侵染 为 虫防治中也有应用 当向褐飞虱喂食表达 dsrna 的 养蚕业的发展作出了巨大贡献 Ye 等 30 利用 RNAi 水稻材料时 目标基因在转录水平被抑制了 证明 技术沉默水稻中的 COI1 基因从而获得转基因水稻植 了 RNAi 技术在害虫防治领域有很大潜力 36 37 值 株 通过与该基因没有被沉默的野生型植株进行比 得注意的是 dsrna 可能引起脱靶效应 在椎猎蝽 较 发现 COI1 基因沉默显著降低了水稻对咀嚼式口 亚科臭虫猎蝽 Rhodnius prolixus 中两个高度同源 器害虫稻纵卷叶螟 Cnaphalocrocis medinalis 的抗性 的 nitroporin 基因与目标基因 nitroporin2 一起被沉默 但对刺吸式口器害虫褐飞虱 Nilaparvata lugens 的 了 38 随着 RNAi 技术与其他学科的交叉融合 开 抗性没有影响 这项研究阐明了 COI1 基因在水稻茉 发基于害虫靶标基因的特殊杀虫剂将是一个重要的 莉酸信号途径和诱导抗虫中的作用 为利用水稻自 研究方向 身防御机制控制虫害及培育新型水稻抗虫品种提供 2.3 理论依据 RNAi 研究基因功能有其独特的优点 一 新靶标的鉴定 新靶标的鉴定是新农药开发的关键环节之一 是简单易行 容易开展 二是试验周期短 成本低 RNAi 具有高特异性的特点 使它成为新靶标筛选 三 是 RNAi 的 沉 默 效 率 比 反 义 RNA 技 术 更 高 效 的有力工具 利用 RNAi 技术在昆虫细胞或虫体中 果更好 四是可以进行高通量基因功能分析 五是 直接沉默目标基因 可以从分子水平寻找新的药物 1 靶标 Bautista 等 39 发现小菜蛾氯菊酯抗性品系的 功能分析的强有力工具 P450 基因 CYP6BG1 过量表达 通过 RNAi 沉默试 RNAi 具有高度特异性 因此 RNAi 成为昆虫基因

2012 年 第 12 期 王 会 冬 等 : 系 统 RNA 干 扰 及 在 昆 虫 中 的 应 用 23 验 表 明 CYP6BG1 的 过 量 表 达 增 强 了 小 菜 蛾 对 氯 菊 酯 的 抗 性 本 实 验 室 以 小 菜 蛾 甜 菜 夜 蛾 (Spodoptera exigua) 等 鳞 翅 目 害 虫 为 供 试 昆 虫, 利 用 饲 喂 及 注 射 dsrna 的 方 法, 成 功 筛 选 了 昆 虫 沉 默 致 死 靶 标 基 因, 如 线 粒 体 复 合 物 Ⅲ Fe-S 亚 基 基 因 (Rieske iron-sulfur protein), 化 学 感 受 蛋 白 基 因 (Chemosensory protein) 等, 其 昆 虫 沉 默 致 死 率 达 到 70% 以 上, 为 昆 虫 行 为 调 控 及 线 粒 体 电 子 传 递 抑 制 剂 的 研 究 提 供 了 基 础 [40,41] 随 着 RNAi 技 术 的 发 展, 大 规 模, 高 通 量 的 RNAi 技 术 会 逐 渐 应 用 于 昆 虫 领 域, 在 整 个 基 因 组 水 平 上 筛 选 药 物 靶 标, 可 以 发 现 更 多 潜 在 的 药 物 靶 标, 加 快 新 农 药 的 研 发 速 度 3 展 望 随 着 系 统 RNAi 研 究 的 深 入 以 及 和 蛋 白 组 学 等 其 他 技 术 综 合 使 用,RNAi 在 昆 虫 的 功 能 基 因 组 学 基 因 表 达 调 控 害 虫 控 制 新 型 农 药 开 发 等 方 面 发 挥 越 来 越 重 要 的 作 用 在 害 虫 防 治 领 域,RNAi 很 有 可 能 成 为 一 种 新 的 害 虫 防 治 手 段, 利 用 转 基 因 植 物 产 生 dsrna, 对 取 食 它 的 昆 虫 产 生 RNAi 效 应, 导 致 昆 虫 死 亡, 这 使 得 RNAi 技 术 在 防 治 害 虫 的 实 际 应 用 中 变 得 切 实 可 行 但 是, 目 前 只 对 少 数 几 种 昆 虫 进 行 了 探 索, 这 种 技 术 能 否 应 用 到 其 他 昆 虫, 实 验 室 内 的 成 功 能 否 转 为 有 效 的 田 间 害 虫 控 制 技 术, 以 及 如 何 提 高 dsrna 的 摄 取 效 率 以 及 沉 默 效 率, 这 种 方 法 的 长 期 效 应 等 都 需 要 进 一 步 研 究 此 外, 昆 虫 中 系 统 RNAi 的 信 号 扩 增 的 机 制, 冗 余 基 因 的 弥 补 功 能 引 起 的 表 型 不 明 显, 外 界 因 素 的 影 响, 以 及 系 统 性 的 传 递 效 率 等 问 题 都 等 待 我 们 去 研 究 参 考 文 献 [1] 何 正 波, 陈 斌, 冯 国 忠. 昆 虫 RNAi 技 术 及 其 应 用. 昆 虫 知 识, 2009, 46(4):525-532. [2] Fire A, Xu SQ, Montgomery MK, et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 1998, 391 :806-811. [3] 杨 中 侠, 文 礼 章, 吴 青 君, 等. RNAi 技 术 在 昆 虫 功 能 基 因 研 究 中 的 应 用 进 展. 昆 虫 学 报, 2008, 51(10):1077-1082. [4] Blair CD. Mosquito RNAi is the major innate immune pathway controlling arbovirus infection and transmission. Future Microbialogy, 2011, 6(3):265-277. [5] Siu RW, Fragkoudis R, Simmonds P, et al. Antiviral RNA interference responses induced by semliki forest virus infection of mosquito cells: characterization, origin, and frequency-dependent functions of virusderived small interfering RNAs. Journal of Virology, 2011, 85(6): 2907-2917. [6] Voinnet O. Non-cell autonomous RNA silencing. FEBS Letters, 2009, 579(2005):5858-5871. [7] Gordon KH, Waterhouse PM. RNAi for insect-proof plants. Nature Biotechnology, 2007, 25(11):1231-1232. [8] Price DR, Gatehouse JA. RNAi-mediated crop protection against insects. Trends in Biotechnology, 2008, 26(7):393-400. [9] Minakuchi C, Namiki T, Shinoda T. Krüppel homolog 1, an early juvenile hormone-response gene downstream of Methoprene-tolerant, mediates its anti-metamorphic action in the red flour beetle Tribolium castaneum. Dev Biol, 2009, 325(5):341-350. [10] Parthasarathy R, Palli SR. Molecular analysis of juvenile hormone analog action in controlling the metamorphosis of the red flour beetle, Tribolium castaneum. Arch Insect Biochem Physiol, 2009, 70 (1):57-70. [11] Winston WM, Molodowitch C, Hunter CP. Systemic RNAi in C.elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science, 2002, 295(5564):2456-2459. [12] Feinberg EH, Hunter CP. Transport of dsrna into cells by the transmembrane protein SID-1. Science, 2003, 301 :1545-1547. [13] Shih JD, Hunter CP. SID-1 is a dsrna-selective dsrna-gated channel. RNA, 2011, 17(6):1057-1065. [14] Jose AM, Smith JJ, Hunter CP. Export of RNA silencing from C.elegans tissues does not require the RNA channel SID-1. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(7):2283-2288. [15] Whangbo JS, Hunter CP. Environmental RNA interference. Trends in Genetics, 2008, 24(6):297-305. [16] Winston WM, Sutherlin M, Wright AG, et al. Caenorhabditis elegans SID-2 is required for environmental RNA interference. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(25):10565-10570. [17] Tijsterman M, May RC, Simmer F, et al. Genes required for systemic RNA interference in Caenorhabditis elegans. Current Biology, 2004, 14 :111-116. [18] Tomoyasu Y, Mille SC, Tomita S, et al. Exploring systemic RNA interference in insects :a genome-wide survey for RNAi genes in

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