677 论 著 树 突 状 细 胞 局 部 免 疫 抗 瘤 作 用 的 初 步 研 究 200052 上 海 复 旦 大 学 附 属 中 山 医 院 肿 瘤 内 科 王 志 明, 王 天 浩 1, 刘 天 舒 2 3, 王 凯 峰 摘 要 目 的 : 探 讨 树 突 状 细 胞 (DC) 瘤 内 注 射 的 局 部 免 疫 方 式 对 小 鼠 H22 肿 瘤 的 治 疗 效 果 方 法 : 体 外 诱 导 生 成 树 突 状 细 胞, 经 H22 肿 瘤 裂 解 抗 原 致 敏, 实 验 分 为 对 照 组 DC 组 和 DC+CpG ODN 组, 分 别 与 T 细 胞 共 培 养, 收 获 的 T 细 胞 与 肿 瘤 细 胞 共 培 养, 观 察 其 对 肿 瘤 细 胞 的 杀 伤 体 内 试 验 :BALB/c 小 鼠 皮 下 接 种 H22 肿 瘤 细 胞 制 作 成 荷 瘤 鼠, 第 4 天 时 进 行 局 部 瘤 内 免 疫 治 疗, 分 为 3 组 : 生 理 盐 水 组 DC 组 和 DC+CpG ODN 组, 免 疫 治 疗 10 天 后 处 死 小 鼠, 观 察 其 治 疗 小 鼠 H22 肿 瘤 的 效 果 结 果 : 体 外 实 验 中, 对 照 组 DC 组 和 DC+CpG ODN 组 的 肿 瘤 杀 伤 率 分 别 为 (10 80±3 27)% (38 26±5 60)% 和 (42 66 ±9 00)%, 后 两 组 杀 伤 率 均 高 于 对 照 组 (P<0 01); 体 内 实 验 中, 生 理 盐 水 组 DC 组 和 DC+CpG ODN 组 的 平 均 瘤 重 (g) 分 别 为 1 804±0 422 1 216±0 335 和 0 733±0 191(P<0 01) 结 论 :DC 瘤 苗 局 部 瘤 内 注 射 可 抑 制 小 鼠 H22 肿 瘤 的 生 长, 联 合 应 用 非 甲 基 化 CpG ODN 可 以 明 显 提 高 抑 瘤 效 果 关 键 词 肿 瘤 ; 树 突 状 细 胞 ; 免 疫 治 疗 中 图 分 类 号 :R730 51 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 :1009-0460(2009)08-0677-05 Thepreliminarystudyofantitumorefectsinducedbylocalimmunotherapyofdendriticcels WANGZhi ming,wangtian hao,liutian shu,wangkai feng.departmentofmedicaloncology,zhong shanhospital,fudanuniversity,shanghai200052,china Corespondingauthor:LIUTian shu,e mail:tsliuceu@gmail.com Abstract Objective:Toinvestigatetheantitumorefectsinducedbylocalimmunotherapywithdendriticcels(DCs)injected intotumorsonamodelofh22carcinomainmice.methods:dcswereinducedinvitroandthenpulsedwithtumorantigenfromh22 carcinomacellysates.inthisexperiment,therewere3groups,thecontrolgroup,thedcsgroup,thedcs+cpg ODN(non methyla tedcpgoligonucleotides)group.forinvitroexperiment,thetcelsweremixedseparatelywithnormalsolutiongroup,thedcsstimu lationgroup,thedcscombinedwithcpg ODNstimulationgroup.ThentheTcelswereseparatelyharvestedandtheH22carcinoma celswereco cultured,andtheirkilingactivityonh22carcinomacelsinvitrowereobservedrespectively.forinvivoexperiment,the almicewererandomizedin3groupsonthe4thdayafterbeingimplantedwithh22carcinomacels.inthetumors,normalsolution, thedcsandthedcscombinedwithcpg ODNwereinjected.Onthe10thdayafterlocalimmunotherapy,althemiceweresacrificed toevaluatethetumorweights.results:fortheinvitroexperiment,thekilingratewere(10 80±3 27)%,(38 26±5 60)%, (42 66±9 00)% inthethreegroupsrespectively,andtheratesoflatertwogroupswerehigherthanthefolowgroup(p<0 01).For invivoexperiment,themeanweightsoftumorsinthreegroupswere(1 804±0 422),(1 216±0 335)and(0 733±0 191)grams respectively(p<0 01).Conclusion:ThelocalinjectionofDCsintothetumorscouldinhibitefectivelythegrowthofH22carcinoma inmice,andtheantitumorefectsinducedbylocalimmunotherapyofdcscouldbeenhancedbyusingnon methylatedcpg ODN. KeyWords Tumor; Dendriticcels; Immunotherapy 树 突 状 细 胞 (dendriticcel,dc) 是 体 内 最 强 的 抗 原 提 呈 细 胞 (APC),DC 在 T 细 胞 免 疫 应 答 中 发 挥 重 要 作 用 [1],DC 体 外 培 养 获 得 成 功, 使 其 逐 渐 成 为 免 疫 学 和 肿 瘤 生 物 治 疗 研 究 热 点 应 用 全 细 胞 性 1 200032 复 旦 大 学 附 属 中 山 医 院 全 科 医 学 科 2 通 讯 作 者,E mail:tsliuceu@gmail.com 3 310016 浙 江 大 学 附 属 邵 逸 夫 医 院 肿 瘤 内 科
678 临 床 肿 瘤 学 杂 志 2009 年 8 月 第 14 卷 第 8 期 肿 瘤 抗 原 冲 击 致 敏 DC 的 方 法 来 制 备 DC 疫 苗 不 失 为 一 种 简 便 而 有 实 效 的 方 法 我 们 采 用 瘤 内 注 射 DC 联 合 免 疫 佐 剂 CpG ODN( 包 含 非 甲 基 化 CpG 基 序 的 寡 聚 脱 氧 核 苷 酸 ) 的 方 法 进 行 抗 肿 瘤 免 疫 治 疗, 从 局 部 免 疫 治 疗 角 度 来 研 究 DC 的 抗 肿 瘤 效 果, 为 临 床 应 用 探 索 有 效 的 免 疫 治 疗 途 径 1 材 料 与 方 法 1 1 实 验 动 物 与 细 胞 小 鼠 H22 肿 瘤 细 胞 株 购 于 上 海 医 药 工 业 研 究 院,BALB/c 小 鼠 购 于 复 旦 大 学 上 海 医 学 院 实 验 动 物 中 心 1 2 主 要 材 料 mgm CSF 和 mil 4( 上 海 晶 美 ), RPMI 1640 培 养 液 小 牛 血 清 ( 上 海 创 未 生 物 技 术 有 限 公 司 ),IL 12ELISA 检 测 试 剂 盒 ( 上 海 沃 森 生 物 医 学 科 技 有 限 公 司 ),IL 10 TGFELISA 检 测 试 剂 盒 (R&D), 淋 巴 细 胞 分 离 液 ( 上 海 试 剂 二 厂 ),T 淋 巴 细 胞 分 离 柱 (CEDARLANE), 大 鼠 抗 小 鼠 CD4 + CD8 + 单 克 隆 抗 体 (PharMingen 公 司 ),EnVision 试 剂 盒 (DAKO 公 司 ),TUNEL 试 剂 盒 ( 宝 灵 曼 公 司 ) [2] CpG ODN 的 设 计 : 根 据 文 献 资 料 设 计, 由 上 海 生 工 合 成, 非 甲 基 化 CpG ODN 序 列 :5 TGACT GTGAACGTTCGAGATGA 3, 全 硫 代 磷 酸 化 修 饰, 聚 丙 烯 酰 氨 凝 胶 电 泳 纯 化, 纯 度 >99%, 不 含 有 脂 多 糖 和 内 毒 素,-20 贮 存, 使 用 前 溶 于 生 理 盐 水 并 混 匀, 调 整 浓 度 为 1mg/ml 1 3 DC 的 体 外 培 养 从 6 周 龄 雄 性 BALB/c 小 鼠 骨 髓 取 骨 髓 细 胞, 低 渗 破 坏 红 细 胞 膜, 去 除 不 溶 的 细 胞 膜 碎 片,PBS 洗 涤 3 次, 用 RPMI 1640 培 养 液 ( 含 10% 的 小 牛 血 清 ) 调 节 细 胞 浓 度 至 2~4 10 6, 于 24 孔 细 胞 板 中 培 养, 同 时 加 入 细 胞 因 子 IL 410ng/ml, GM CSF30ng/ml 第 3 天 全 量 换 液, 此 后 每 2 天 半 量 换 液 ( 细 胞 因 子 同 前 ), 共 培 养 6~7 天 1 4 DC 细 胞 的 抗 原 负 载 小 鼠 H22 肿 瘤 细 胞 (1 0 10 7 /ml) 于 液 氮 37 水 浴 反 复 冻 融 3 次, 于 冰 浴 中 超 声 粉 碎 15s 4,0 22μm 过 滤,6500g 离 心 10min, 取 上 清,BCA 法 测 定 蛋 白 浓 度 培 养 6 天 的 DC 细 胞 浓 度 调 整 至 2 0 10 6 /ml, 加 入 可 溶 性 肿 瘤 抗 原 200μg/ml,37 5%CO 2 培 养 18~24h, 使 DC 负 载 抗 原 激 活 1 5 体 外 细 胞 毒 性 实 验 体 外 活 化 的 DC 和 BALB/c 小 鼠 T 淋 巴 细 胞 共 培 养, 激 活 CTL, 使 用 MTT 法 研 究 CTL 体 外 杀 伤 小 鼠 H22 肿 瘤 细 胞 的 作 用 T 细 胞 制 备 :2 只 BALB/c 小 鼠 处 死 后 取 脾 脏 ( 超 净 工 作 台, 无 菌 操 作 ), 研 磨 过 滤, 采 用 Ficol 密 度 梯 度 离 心 法 分 离 外 周 血 单 个 核 细 胞, 再 经 T 淋 巴 细 胞 分 离 柱 分 离 出 T 淋 巴 细 胞 ( 按 照 试 剂 盒 操 作 说 明 书 操 作 ), 再 次 离 心 洗 涤, 完 全 培 养 基 重 悬, 调 整 T 淋 巴 细 胞 浓 度 为 2 0 10 6 /ml, 备 用 实 验 组 分 3 组 进 一 步 培 养 T 淋 巴 细 胞 : 空 白 对 照 组 DC 组 和 DC+CpG ODN 组 ( 浓 度 为 10μg/ml), 其 中 DC T 约 1 20, 各 组 培 养 72h, 上 述 T 淋 巴 细 胞 PBS 洗 涤, 重 悬 于 完 全 培 养 基 中, 调 整 T 淋 巴 细 胞 浓 度 为 2 0 10 6 /ml,t 淋 巴 细 胞 和 肿 瘤 细 胞 按 20 1 加 入 96 孔 培 养 板, 终 体 积 200μl, 培 养 箱 内 孵 育 24h 每 孔 加 入 5mg/mlMTT10μl, 继 续 培 养 4h, 离 心 弃 去 孔 内 上 清, 每 孔 加 入 150μl 二 甲 基 亚 砜 (DMSO) 震 荡 10min, 使 结 晶 充 分 溶 解, 测 各 孔 在 570nm 处 的 吸 光 值 (A 值 ), 同 时 设 空 白 对 照 靶 细 胞 对 照 效 应 细 胞 对 照 每 组 设 5 个 复 孔, 按 下 述 公 式 计 算 CTL 杀 伤 力 CTL 杀 伤 活 性 (%)=[1-( 实 验 组 A 值 - 效 应 细 胞 对 照 组 A 值 )/ 靶 细 胞 对 照 组 A 值 ] 100% 1 6 体 内 局 部 抑 瘤 实 验 24 只 BALB/c 小 鼠 右 前 肢 腋 窝 皮 下 接 种 H22 肿 瘤 细 胞 ( 细 胞 浓 度 调 整 至 约 1 0 10 7 /ml, 每 只 注 射 0 2ml), 在 第 4 天 出 现 可 测 量 到 的 肿 瘤 ( 长 径 约 0 5cm), 随 机 分 为 3 组, 每 组 8 只, 采 用 肿 瘤 内 注 射 的 方 法 进 行 免 疫 治 疗, 分 别 为 阴 性 对 照 组 ( 生 理 盐 水 组 ) DC 组 和 DC+CpG ODN 组 (CpG ODN 每 只 注 入 10μg, 即 100μg/ml 溶 液 0 1ml), 同 前 方 法 培 养 DC 细 胞, 培 养 6 天 的 DC 细 胞 浓 度 调 整 至 2 0 10 6 /ml, 加 入 可 溶 性 肿 瘤 抗 原 200μg/ml,37 5%CO 2 培 养 18~24h,PBS 洗 涤 后 调 整 浓 度 为 2 0 10 6 /ml, 每 只 注 入 0 2ml 治 疗 1 7 指 标 检 测 肿 瘤 接 种 3 周 时 颈 椎 脱 臼 法 处 死 荷 瘤 小 鼠, 收 集 每 只 小 鼠 血 液 标 本, 提 取 血 清 测 IL 10 IL 12 TGF 浓 度 ( 具 体 操 作 按 试 剂 盒 说 明 书 进 行 ); 解 剖 分 离 获 取 肿 瘤 组 织 称 重, 其 中 各 组 取 2 个 治 疗 后 的 肿 瘤 病 理 标 本,TUNEL 法 检 测 肿 瘤 细 胞 凋 亡 ( 操 作 按 试 剂 盒 说 明 书 进 行 ), 免 疫 组 化 检 测 肿 瘤 组 织 中 CD4 + T 细 胞 CD8 + T 细 胞 ( 免 疫 组 化 标 记 采 用 EnVision 二 步 法, 操 作 按 试 剂 盒 说 明 书 进 行 ) 1 8 统 计 学 分 析 采 用 SPSS11 5 统 计 软 件 对 数 据 进 行 处 理, 数 据 以 均 数 ± 标 准 差 表 示, 用 单 因 素 方 差 分 析 比 较 组 间 差 异 以 P<0 05 为 有 统 计 学 意 义
679 2 结 果 2 1 DC 瘤 苗 活 化 的 CTL 对 肿 瘤 细 胞 的 杀 伤 作 用 检 测 各 组 肿 瘤 细 胞 均 出 现 一 定 的 杀 伤 作 用, 其 中 DC 瘤 苗 活 化 的 CTL 对 同 种 肿 瘤 细 胞 具 有 较 强 的 杀 伤 作 用,DC 组 DC+CpG ODN 组 杀 伤 率 高 于 空 白 对 照 组 (P<0 01),DC+CpG ODN 组 虽 高 于 DC 组, 但 无 统 计 学 差 异 (P>0 05) 见 表 1 表 1 3 组 对 肿 瘤 细 胞 的 杀 伤 作 用 ( x±s,%) 珋 分 组 抑 瘤 率 空 白 对 照 组 10 80±3 27 DC 组 38 26±5 60 DC+CpG ODN 组 42 66±9 00 注 : 与 空 白 对 照 组 比 较,P<0 01 2 2 荷 瘤 小 鼠 移 植 瘤 内 注 射 DC 瘤 苗 活 化 的 CTL 的 抑 制 效 果 DC 瘤 苗 瘤 内 局 部 注 射 可 抑 制 小 鼠 皮 下 肿 瘤 的 生 长, 若 联 合 应 用 CpG ODN 可 提 高 抑 瘤 效 果 DC 组 和 DC+CpG ODN 组 平 均 瘤 重 均 低 于 生 理 盐 水 组, 其 中 DC+CpG ODN 组 效 果 更 好 见 表 2 表 2 3 组 对 小 鼠 皮 下 移 植 瘤 的 抑 制 作 用 ( x±s,g) 珋 分 组 n 瘤 重 阴 性 对 照 组 8 1 804±0 422 DC 组 8 1 216±0 335 DC+CpG ODN 组 8 0 733±0 191 注 : 与 阴 性 对 照 组 比 较,P<0 01; 与 DC 组 比 较,P<0 01 2 3 3 组 荷 瘤 小 鼠 外 周 血 指 标 3 组 荷 瘤 小 鼠 外 周 血 血 清 免 疫 因 子 IL 10 IL 12 TGF 浓 度 无 明 显 差 异 (P>0 05) 见 表 3 表 3 3 组 荷 瘤 小 鼠 外 周 血 血 清 IL 10 IL 12 TGF 浓 度 的 检 测 情 况 ( x±s,pg/ml) 珋 分 组 n IL 10 IL 12 TGF 阴 性 对 照 组 8 125 95±30 83 105 29±16 10 1517 91±447 22 DC 组 8 112 98±33 26 112 82±14 44 1430 96±522 42 DC+CpG ODN 组 8 99 17±15 18 115 93±18 43 1298 05±315 30 2 4 3 组 移 植 瘤 组 织 细 胞 的 凋 亡 检 测 情 况 通 过 TUNEL 染 色 可 以 看 出,DC 组 和 DC+CpG ODN 组 肿 瘤 细 胞 凋 亡 水 平 和 凋 亡 比 例 高 于 生 理 盐 水 组 生 理 盐 水 组 仅 见 散 在 个 别 肿 瘤 细 胞 凋 亡 ( 图 1A), 肿 瘤 细 胞 生 长 旺 盛 ;DC 组 和 DC+CpG ODN 组 肿 瘤 细 胞 的 凋 亡 呈 多 个 肿 瘤 细 胞 局 灶 性 分 布 ( 图 1B 1C) 2 5 3 组 移 植 瘤 组 织 内 CD4 + T 细 胞 CD8 + T 细 胞 浸 润 的 情 况 通 过 免 疫 组 化 染 色 可 以 看 出,DC 组 和 DC+CpG ODN 组 的 肿 瘤 组 织 中 散 在 分 布 个 别 CD4 + T 细 胞, 散 在 分 布 局 灶 性 多 个 CD8 + T 细 胞 ( 但 不 适 合 计 数 分 析 ), 生 理 盐 水 组 的 肿 瘤 组 织 中 则 难 以 找 到 CD4 + T 细 胞 和 CD8 + T 细 胞 见 图 2 图 3 3 讨 论 DC 的 功 能 除 摄 取 加 工 呈 递 特 异 性 抗 原 外, 它 是 唯 一 能 刺 激 初 始 (Naive)T 细 胞 增 殖 诱 导 初 次 免 疫 应 答 APC, 具 有 启 动 特 异 性 免 疫 应 答 和 诱 导 免 疫 耐 受 的 双 重 功 能 体 外 利 用 骨 髓 细 胞 加 入 细 胞 因 子 ( 如 IL 4,GM CSF) 培 养, 定 向 培 养 制 备 成 DC( 并 可 负 载 肿 瘤 抗 原 ) 已 成 为 较 成 熟 的 实 验 技 术, 使 其 逐 渐 成 为 免 疫 学 和 临 床 肿 瘤 生 物 治 疗 研 究 热 点 [3] Qiu 等 以 小 鼠 肠 癌 细 胞 冻 融 物 刺 激 DC, 发 现 其 可 促 进 DC 分 泌 IL 12 及 IFN γ, 增 强 DC 的 抗 癌 作 用 [4] Dubsky 等 用 人 类 肿 瘤 细 胞 株 冻 融 物 刺 激 DC 细 [5] 胞, 促 进 DC 的 成 熟 Chi 等 在 晚 期 肝 癌 的 临 床 研 究 中, 采 用 单 剂 量 放 疗 联 合 瘤 体 内 注 射 自 体 未 成 熟 DC, 结 果 显 示 该 疗 法 安 全 且 诱 导 了 特 异 和 非 特 异 性 抗 肿 瘤 免 疫 效 应 有 学 者 对 系 统 免 疫 治 疗 和 局 部 免 疫 治 疗 的 效 果 进 行 了 分 析, 结 果 表 明, 在 生 存 期 复 发 率 和 副 反 应 上, 局 部 免 疫 治 疗 均 好 于 系 统 免 疫 治 疗 对 于 原 发 性 肝 癌 或 转 移 性 肝 癌 来 讲, 局 部 的 免 疫 治 疗 可 能 是 一 个 较 为 有 效 的 手 段 [6] 梁 春 敏 [7] 等 证 实 用 树 突 状 细 胞 对 Hepal 6 肿 瘤 小 鼠 进 行 免 疫 治 疗 时, 不 同 免 疫 方 式 对 疗 效 有 明 显 影 响, 瘤 内 注 射 疗 效 显 著, 而 足 垫 注 射 未 见 疗 效
６８ 临床肿瘤学杂志 ２ ９年 ８月第 １ ４卷第 ８期 Ｃｈ ｎ ｅ ｅｃ ｎ ａ Ｏｎ ｇ Ａｕ ｇ ２ ９ Ｖ １ ４ Ｎ ８ 图 １ ３组移植瘤组织细胞的凋亡情况 ＥｎＶ ｎ ４ 图 ２ ３组移植瘤组织 ＣＤ４ Ｔ细胞的浸润情况 ＥｎＶ ｎ ４ 图 ３ ３组移植瘤组织 ＣＤ８ Ｔ细胞的浸润情况 ＥｎＶ ｎ ４ 我们选择 ＢＡＬＢ 小鼠及其转移型 Ｈ２ ２肝癌细 胞为研究对象 该模型造模方法简便 成功率高 瘤 体大小比较均一 具有肿瘤细胞普遍的增殖 侵袭等 应用 而与免疫刺激剂联合应用也是常用方法 Ａｕｆ 等 ２ 研究报道 非甲基化 ＣｐＧ ＯＤＮ瘤内局部注射 能够通过激活巨噬细胞 诱导胶质细胞瘤免疫排斥 载肿瘤冻融抗原的 ＤＣ在体外能激活 Ｔ淋巴细胞 有效 对 抗 肿 瘤 的 发 展 明 显 抑 制 肿 瘤 生 长 Ｃｈ 等 ８ 在研究小鼠活体抗肿瘤免疫作用时联合 Ｃｐ Ｇ ＯＤＮ局部注射以提高疗效 我们的实验结果也显 对肿瘤细胞具有杀伤作用 联合 ＣｐＧ ＯＤＮ未能提 高 ＤＣ瘤苗活化的 ＣＴＬ对肿瘤细胞的杀伤作用 动 示 ＤＣ联合非甲基化 ＣｐＧ ＯＤＮ瘤内注射可进一步 提高局部抗肿瘤生长作用 小鼠体内有 Ｔ淋巴细胞 适 生物特性 而且 ＢＡＬＢ 合于肿瘤局部免疫研究 本研究体外实验表明 负 物实验提示 在瘤内局部注射的方法具有抑制肿瘤 免疫系统对肿瘤存在特异性和非特异性应答 生长的作用 这种方法可以改变肿瘤局部免疫环境 瘤体内 有 较 多 的 ＣＤ４ Ｔ细 胞 ＣＤ８ Ｔ细 胞 浸 润 ＣＤ８ Ｔ细胞更多见 促进局部肿瘤细胞凋亡 抑 制肿瘤病灶生长 ＤＣ瘤苗单独使用很难取得理想 其机制十分复杂 涉及多种免疫细胞及其分泌的产 ｕｒ ａ ｘ 物 包 括 Ｔ细 胞 ＮＫ 细 胞 ＮＣ ｎａ 的抗肿瘤效果 往往需要与手术 放疗 化疗等联合 胞因子 如 Ｉ Ｌ １ ２ 的抗肿瘤作用 尽管机体有多样 ｅ 细胞和巨噬细胞等免疫细胞介导的特异和非 特异的细胞免疫 抗体介导的体液免疫以及补体 细
681 的 抗 肿 瘤 免 疫 效 应, 但 肿 瘤 仍 在 体 内 进 展, 肿 瘤 细 胞 分 泌 一 些 具 有 免 疫 抑 制 作 用 的 产 物 ( 如 IL 10 TGF), 导 致 机 体 局 部 及 全 身 的 免 疫 功 能 低 下 [9] 本 研 究 中, 我 们 对 荷 瘤 宿 主 血 清 中 的 体 液 免 疫 因 子 进 行 了 有 选 择 的 检 测 (IL 10 IL 12 TGF), 各 组 间 未 有 显 著 差 异, 我 们 考 虑 局 部 免 疫 未 能 改 善 全 身 免 疫 状 态, 也 提 示 瘤 内 局 部 DC 疫 苗 治 疗 在 控 制 局 部 肿 瘤 病 灶 生 长 有 一 定 作 用, 但 可 能 不 能 很 好 地 控 制 肿 瘤 转 移 综 上 所 述, 我 们 认 为 瘤 内 注 射 DC 联 合 非 甲 基 化 CpG ODN 具 有 局 部 抗 肿 瘤 作 用, 主 要 机 制 是 通 过 细 胞 免 疫 而 非 体 液 免 疫 起 到 促 肿 瘤 细 胞 凋 亡 作 用 该 方 法 可 以 改 变 肿 瘤 局 部 免 疫 环 境, 技 术 及 操 作 程 序 较 简 单, 实 用 性 及 可 行 性 强, 具 有 潜 在 临 床 应 用 价 值, 其 疗 效 和 作 用 机 制 值 得 进 一 步 深 入 研 究 参 考 文 献 [1] ShortmanK,CauxC.Dendriticceldevelopment:multiplepath waystonature sadjuvants[j].stemcels,1997,15(6):409-419. [2] AufG,CarpentierAF,ChenL,etal.Implicationofmacropha gesin tumorrejection induced bycpg oligodeoxynucleotides withoutantigen[j].clincancerres,2001,7(11):3540-3543. [3] QiuJ,LiGW,SuiYF,etal.Heat shockedtumorcellysate pulseddendriticcelsinduceefectiveanti tumorimmunere sponseinvivo[j].worldjgastroenterol,2006,12(3):473-478. [4] DubskyP,HaydenH,SachetM,etal.Alogeneictumorlysate canserveasbothantigensourceandproteinsupplementationfor dendriticcelculture[j].cancerimmunolimmunother,2008, 57(6):859-870. [5] ChiKH,LiuSJ,LiCP,etal.Combinationofconformalradio therapyandintratumoralinjectionofadoptivedendriticcelim munotherapyinrefractoryhepatoma[j].journalofimmunothera py,2005,28(2):129-135. [6] KountourasJ,ZavosC,ChatzopoulosD,etal.Locoregionalim munochemotherapyinprimaryandmetastaticliverdisease:meta analysisandreview ofliterature[j].hepatogastroenterology, 2003,50(53):1506-1510. [7] 梁 春 敏, 钟 翠 平, 郑 宁, 等.SLC 基 因 修 饰 树 突 状 细 胞 及 不 同 免 疫 方 式 抗 肿 瘤 作 用 探 讨 [J]. 中 国 免 疫 学 杂 志,2006,22 (8):721-726. [8] ChoJ,LeeYS,KimSH,etal.MHCindependentanti tumorim muneresponsesinducedbyhsp70 enrichedexosomesgenerate tumorregresioninmurinemodels[j].cancerleters,2009 (275):256-265. [9] MeliefC.Cancerimmunotherapybydendriticcels[J].Immuni ty,2008,29:372-383. 收 稿 日 期 :2009-04-14; 修 回 日 期 :2009-06-09