中 央 研 究 院 高 中 生 命 科 學 資 優 生 培 育 計 畫 專 題 研 究 報 告 阿 拉 伯 芥 抗 高 鹽 逆 境 機 轉 作 者 : 王 思 堯 指 導 教 授 : 中 興 大 學 顏 宏 真 教 授 本 班 學 號 :96091 學 校 : 國 立 臺 中 女 中 0
目 錄 壹 摘 要 02 貳 研 究 動 機 02 參 研 究 目 的 03 肆 研 究 設 備 與 器 材 04 伍 研 究 過 程 與 方 法 05 一 阿 拉 伯 芥 植 株 培 育 06 二 光 合 系 統 II 效 率 06 三 光 合 色 素 含 量 測 定 06 四 元 素 測 定 分 析 07 五 蛋 白 質 電 泳 08 六 二 維 電 泳 09 七 種 子 萌 發 率 測 定 10 陸 結 果 11 柒 討 論 22 捌 結 論 27 玖 未 來 展 望 28 拾 參 考 文 獻 29 1
壹 摘 要 植 株 的 生 長 情 形 會 隨 著 環 境 中 鹽 分 的 種 類 及 含 量 之 差 異 而 有 所 不 同 為 了 瞭 解 植 物 在 高 鹽 逆 境 下 的 生 長 情 形 及 其 體 內 的 應 變 機 制, 我 們 以 阿 拉 伯 芥 為 實 驗 對 象, 配 製 不 同 種 類 及 濃 度 的 鹽 類 溶 液, 並 以 其 澆 灌 阿 拉 伯 芥, 再 進 一 步 觀 察 鹽 類 溶 液 對 植 株 生 長 情 形 的 影 響 藉 由 評 估 光 合 作 用 效 率, 分 析 植 株 的 蛋 白 質 和 元 素 含 量 及 計 算 種 子 萌 發 率, 評 估 植 株 在 不 同 逆 境 處 理 下 的 生 長 情 形 及 被 誘 發 的 抗 鹽 機 制 經 過 實 驗 及 分 析, 發 現 在 NaCl 和 KCl 的 環 境 下, 光 合 作 用 效 率 顯 著 下 降,NaCl 高 鹽 逆 境 甚 至 造 成 種 子 萌 發 率 的 銳 減 另 一 方 面,MgCl2 的 添 加 卻 對 植 株 光 合 作 用 效 率 有 正 面 影 響 此 外, 添 加 225 mm NaCl 溶 液 的 植 株, 其 體 內 則 產 生 了 抗 高 鹽 逆 境 的 蛋 白 質 貳 研 究 動 機 有 一 天, 我 們 在 Discovery 頻 道 看 到 有 關 紅 樹 林 的 報 導, 讓 我 們 發 想, 紅 樹 林 植 物 能 夠 在 高 鹽 度 的 環 境 中 生 長, 演 化 出 屬 於 自 己 的 一 套 抗 逆 境 機 制, 那 麼 在 一 般 自 然 環 境 中 生 長 的 植 物 是 否 有 此 潛 能? 還 是 只 是 尚 未 被 誘 發? 為 了 解 決 我 們 的 疑 惑, 經 過 幾 番 共 同 討 論, 我 們 決 定 使 用 阿 拉 伯 芥 作 為 實 驗 的 研 究 對 象, 並 設 計 了 一 系 列 的 實 驗 來 探 討 高 鹽 逆 境 下 的 植 株 生 理 狀 態 是 否 有 所 變 異 2
參 研 究 目 的 為 了 解 植 物 在 逆 境 下 的 生 理 反 應, 選 定 具 有 豐 富 的 生 理 生 化 及 遺 傳 資 訊 之 模 式 植 物 阿 拉 伯 芥 ( Arabidopsis thaliana ) 進 行 實 驗, 參 閱 文 獻 (Taiz L, Zeiger E. 2006) 後 設 計 出 利 用 四 種 土 壤 中 常 見 鹽 類, 配 合 不 同 濃 度 的 鹽 水 澆 灌 植 株, 分 別 是 NaCl ( 75 mm 150 mm 225 mm 300 mm ) KCl ( 15 mm 30 mm 45 mm 60 mm ) MgCl2 ( 2 mm 5 mm 10 mm ) CaCl2 ( 5 mm 10 mm 15 mm 20 mm ), 觀 察 分 析 其 生 理 反 應, 再 利 用 下 列 指 標 檢 視 高 鹽 逆 境 對 其 生 理 影 響 : 一 光 合 系 統 II 效 率 : 光 合 系 統 II 將 光 能 轉 換 成 化 學 能, 此 為 光 合 作 用 光 反 應 部 分, 故 其 效 率 會 影 響 植 物 行 光 合 作 用 的 能 力, 為 了 解 植 物 在 逆 境 下 光 合 作 用 效 率 的 變 化, 利 用 葉 綠 素 螢 光 儀 測 定 光 合 系 統 II 效 率, 藉 此 觀 察 阿 拉 伯 芥 的 光 合 作 用 是 否 因 逆 境 環 境 造 成 影 響 二 光 合 色 素 含 量 測 定 : 葉 綠 素 a b 類 胡 蘿 蔔 素 為 植 物 主 要 的 光 合 色 素, 此 色 素 含 量 的 多 寡 足 以 影 響 光 合 作 用 速 率 ; 因 此, 進 一 步 測 量 光 合 色 素 含 量 的 改 變, 以 分 析 逆 境 對 光 合 色 素 含 量 和 光 合 作 用 的 影 響 三 元 素 測 定 分 析 : 植 物 的 根 會 從 土 壤 中 吸 收 金 屬 離 子, 以 維 持 植 物 的 正 常 生 理 機 能 ; 於 是 希 望 藉 由 植 株 元 素 含 量 分 析, 了 解 阿 拉 伯 芥 處 於 高 離 子 濃 度 的 環 境 下, 是 否 會 表 現 屬 於 自 己 的 一 套 抗 鹽 機 制, 以 保 持 植 株 離 子 的 正 常 濃 度 四 蛋 白 質 電 泳 分 析 : 為 了 解 植 物 在 逆 境 下 是 否 會 表 現 抗 逆 境 的 蛋 白 質, 進 而 提 高 植 株 對 逆 境 之 耐 受 性, 利 用 蛋 白 質 電 泳, 觀 察 逆 境 下 的 蛋 白 質 表 現 量, 比 較 其 與 正 常 環 境 下 的 蛋 白 質 表 現 量 有 何 不 同 五 蛋 白 質 二 維 電 泳 分 析 : 由 於 細 胞 內 蛋 白 質 種 類 繁 多, 一 維 電 泳 適 合 比 較 多 種 處 理 後 蛋 白 質 表 現 的 差 異, 然 而 其 分 離 效 果 有 限, 所 以 若 要 鑑 定 特 定 蛋 白 質 身 分, 可 進 一 步 利 用 二 維 電 泳 提 高 蛋 白 質 的 分 離 度, 以 找 出 在 逆 境 下 新 表 現 出 的 蛋 白 質 六 種 子 萌 發 率 測 定 : 藉 由 計 算 逆 境 中 阿 拉 伯 芥 產 生 的 種 子 萌 發 的 比 例, 藉 以 了 解 高 鹽 環 境 對 種 子 萌 發 的 影 響 3
肆 研 究 設 備 與 器 材 一 葉 綠 素 螢 光 測 定 儀 PEA ( plant efficiency analyzer, Hanstech Instruments, Ltd. Inc., England ) 二 分 光 光 度 計 Ultrospec ( 2100 pro, Amersham Biosciences, U.S.A. ) 三 分 光 光 度 計 Ultrospec ( UV-1201, Shimadzu Corporation, Japan ) 四 感 應 耦 合 電 漿 離 子 蝕 刻 系 統 ICP ( Inductively Coupled Plasma ) Atomic Emission Spectrometer ( JY138 Ultrace, Instruments SA. Inc., Edison, NJ ) 五 超 音 波 震 盪 器 Ultrasonic Cleaner ( D150H, Delta, Taiwan ) 六 試 管 震 盪 Vortex Genie-2 ( G-560, Scientific Industries, Inc., U.S.A. ) 七 低 溫 離 心 機 Centrifuge ( 5415R, Eppendorf, Germany ) 八 迴 轉 式 振 盪 器 Orbital Shaker ( S-101, Firstek, UK ) 九 高 速 冷 凍 離 心 機 Sorvall Instruments ( RC-5C, Dupont Instruments, Australia ) 十 垂 直 電 泳 槽 Mighty Small II ( SE250, Hoefer Scientific Instruments, U.S.A. ) 十 一 介 質 輔 助 雷 射 脫 附 游 離 - 飛 行 時 間 質 譜 儀 系 統 MALDI-TOF ( Voyager-DEPRO, Applied Brosystems, U.S.A. ) 4
5 不 同 高 鹽 逆 境 處 理 阿 拉 伯 芥 植 物 外 觀 觀 察 光 合 作 用 的 效 能 植 株 元 素 含 量 分 析 蛋 白 質 表 現 量 分 析 種 子 萌 發 率 測 定 葉 部 形 態 變 化 各 種 蛋 白 質 含 量 的 比 較 二 維 電 泳 分 析 光 合 系 統 II 活 性 光 合 色 素 含 量 分 析 蛋 白 質 鑑 定 一 維 電 泳 分 析 II 伍 研 究 過 程 與 方 法
一 阿 拉 伯 芥 植 株 培 育 以 野 生 種 阿 拉 伯 芥 ( Arabidopsis thaliana ) 為 材 料, 種 植 於 盆 中 泥 土 以 蛭 石 : 珍 珠 石 : 泥 炭 土 = 1:1:8 之 比 例 混 合, 置 於 國 立 中 興 大 學 生 命 科 學 大 樓 四 樓 植 物 培 養 室 光 照 100 µmol/m 2 /s, 溫 度 控 制 在 25 o C, 植 株 每 天 均 澆 水 100 ml, 並 給 予 適 當 之 肥 料 ( 花 寶 2 號 ) 至 一 個 月 大 時, 開 始 進 行 不 同 濃 度 的 鹽 類 溶 液 50 ml 處 理, 為 期 共 7 天, 對 照 組 植 株 則 澆 灌 清 水 二 光 合 系 統 II 效 率 ( 一 ) 實 驗 儀 器 : 由 PEA ( plant efficiency analyzer, Hansatech, Ltd, Inc, England ) 葉 綠 素 螢 光 測 定 儀 先 照 射 微 弱 紅 光, 測 出 光 合 系 統 II 效 率 的 基 礎 值, 再 瞬 間 施 予 強 烈 白 光, 測 出 光 合 色 素 受 到 高 能, 激 發 電 子 所 散 發 出 的 螢 光 量, 計 算 其 與 基 礎 值 的 比 值, 就 能 評 估 光 合 色 素 遭 到 破 壞 的 程 度 ( 二 ) 實 驗 步 驟 : 在 澆 灌 鹽 水 後, 於 每 日 早 上 11 點 至 下 午 1 點 進 行 為 期 一 週 的 光 合 系 統 II 效 率 測 定 測 定 前 一 天, 將 對 照 組 搬 入 室 內 暗 處, 供 次 日 測 定 比 對 之 用 測 定 當 日 中 午, 先 將 葉 片 表 面 泥 土 撥 除, 利 用 PEA 葉 綠 素 螢 光 測 定 儀 夾 住 葉 片 特 定 部 分 ( 葉 片 需 完 全 掩 蓋 發 光 孔 ), 以 非 破 壞 性 方 式 測 定 其 葉 綠 素 螢 光 值 ( Fv/Fm ) 三 光 合 色 素 含 量 測 定 ( 一 ) 實 驗 儀 器 : 分 光 光 度 計 ( UV-1201, Shimadzu Corporation, Japan ) 1. 原 理 : The Beer-Lambert Law : A=εbc (Ingle and Crouch, 1988) (A: 吸 光 值 ;ε: 吸 光 係 數 ;b: 光 徑 ;c: 濃 縮 液 濃 度 ) 2. 濃 度 校 正 : 以 70% 酒 精 的 吸 光 值 定 為 分 光 光 度 計 的 零 點 3. 測 量 : 將 樣 本 裝 入 cuvett, 測 量 樣 本 對 波 長 340~700 nm 的 吸 光 值 ( 二 ) 實 驗 步 驟 取 各 種 鹽 類 處 理 一 週 後 的 輪 狀 葉 3 片, 分 裝 成 48 個 樣 本, 加 入 70% 酒 精 1 毫 升, 置 於 黑 暗 4 C 冷 藏 中, 使 色 素 完 全 溶 出 將 色 素 萃 取 液 分 別 放 入 分 光 光 度 計 測 6
定 樣 本 對 波 長 340~700 nm 可 見 光 區 的 吸 收 光 譜 變 化 再 將 OD663 OD645 OD440 的 值 代 入 公 式 ( Wintermans and De Mots, 1965 ), 可 計 算 出 葉 綠 素 a b 和 類 胡 蘿 蔔 素 的 總 量 光 合 色 素 含 量 公 式 : 葉 綠 素 a(mg/g 鮮 重 )= ( 12.7* OD663-2.69* OD645 ) ( V 1000 W ) 葉 綠 素 b(mg/g 鮮 重 )= ( 22.9* OD663-4.68* OD645 ) ( V 1000 W ) 類 胡 蘿 蔔 素 總 量 (mg/g 鮮 重 )Cc=4.695* OD 440-0.268*C ( a+b ) OD 663 : 光 合 色 素 萃 取 液 在 波 長 663 nm 的 吸 光 值 V: 光 合 色 素 萃 取 液 的 總 體 積 ( 本 實 驗 為 1mL) W: 葉 片 的 鮮 重 ( 本 實 驗 因 葉 片 鮮 重 受 鹽 類 處 理 影 響 變 動 頗 大, 故 改 以 每 片 葉 片 之 總 光 合 色 素 含 量 呈 現 ) 四 元 素 測 定 分 析 ( 一 ) 實 驗 原 理 : 1.ICP: 利 用 高 頻 電 磁 感 應 產 生 的 高 溫 氬 氣 電 漿, 使 導 入 電 漿 中 的 樣 品 受 熱, 並 進 行 去 溶 劑 分 解 原 子 ( 離 子 ) 化 及 激 發 等 反 應 其 分 析 的 依 據 是 利 用 被 激 發 的 待 分 析 元 素 之 原 子 ( 離 子 ) 所 發 射 出 的 光 譜 線, 經 由 光 譜 儀 的 分 光 及 偵 測, 進 行 元 素 之 定 性 及 定 量 2. 灰 化 : 將 植 株 灰 化 形 成 灰 分, 以 獲 得 其 體 內 的 無 機 鹽, 同 時 可 使 分 析 物 以 外 的 其 他 物 質 揮 發, 以 減 少 背 景 吸 收 的 問 題 ; 且 不 造 成 待 測 物 的 漏 失 ( 二 ) 實 驗 步 驟 : 將 坩 鍋 以 10% K2Cr2O7 及 10% H2SO4的 酸 性 清 洗 液 浸 泡 30 分 鐘, 後 利 用 熱 水 清 洗 二 至 三 次 接 著 置 放 於 丙 酮 中 浸 泡 15 分 鐘 後, 將 坩 鍋 取 出 風 乾 即 可 備 用 ( 需 徹 底 洗 淨, 確 保 無 雜 質 ) 鹽 處 理 一 週 之 葉 片 置 於 55 C 烘 箱 中 烘 乾 後 磨 碎, 混 合 均 勻 置 放 於 坩 鍋 中, 後 放 入 高 溫 灰 化 爐 內 以 470±5 C 進 行 灰 化 16 小 時, 並 放 置 於 爐 內 自 然 冷 卻 12 小 時 至 7
室 溫 將 灰 化 後 的 葉 子 連 同 坩 鍋 置 放 於 80 C 的 加 熱 板 上, 並 於 坩 鍋 中 加 入 0.2ml 二 次 水 3ml 6M HCl 0.1ml 10N HNO3加 熱 蒸 乾 將 蒸 乾 後 的 結 晶 溶 於 3ml 二 次 水 和 3ml 6M HCl 中, 所 得 為 酸 性 萃 取 液 萃 取 液 以 濾 紙 過 濾 至 試 管 中, 並 再 各 用 3ml 的 二 次 水 清 洗 坩 鍋 三 次, 過 濾 至 試 管 中 最 後 以 二 次 水 定 量 體 積 至 50ml 樣 品 中 鈉 鉀 鎂 鈣 等 四 種 離 子 的 含 量 測 定, 委 託 中 興 大 學 土 壤 調 查 中 心 進 行 元 素 分 析, 利 用 感 應 耦 合 電 漿 離 子 蝕 刻 系 統 ICP ( Inductively Coupled Plasma ) Atomic Emission Spectrometer ( JY138 Ultrace, Instruments SA. Inc., Edison, NJ ) 進 行 測 定 五 蛋 白 質 電 泳 ( SDS-PAGE ) ( 一 ) 實 驗 步 驟 : 本 實 驗 使 用 Hoefer Small Mini-Vertical Electrophoresis SE250 ( Hoefer Scientific Instruments, U.S.A. ) 進 行 分 析 先 配 製 separation gel ( 12.5% acrylamine / bis-acrylamine, 0.375 M Tris-HCl ph8.8, 0.1% SDS, 0.075% ammonia persulfate, 0.05% TEMED ), 以 水 壓 平 膠 體, 待 acrylamine 聚 合 後 再 配 製 stacking gel ( 4% acrylamine / bis-acrylamine, 0.125% Tris-HCl ph6.8, 0.1% SDS, 0.075% ammonia persulfate, 0.05% TEMED ) 蛋 白 質 樣 品 加 入 等 體 積 的 2X sample buffer ( 125 mm Tris-HCl ph6.8, 6% SDS, 15% glycerol, 20% β-mercaptoethanol, 少 許 bromophenol blue ), 於 Dry Bath ( Incubator, Fisher Scientific, U.S.A. ) 95 加 熱 10 分 鐘, 使 蛋 白 質 變 性 12,000 rpm 離 心 10 分 鐘 去 除 雜 質 後, 以 微 量 針 筒 吸 取 液 體 注 入 well 中, 在 直 立 式 電 泳 槽 ( Mighty, Small2 SE 250, Hoefer Scientific Instruments, U.S.A. ) 中 注 入 running buffer ( 25 mm Tris-HCl, 0.1% SDS, 1.44% glycine ), 以 15 ma ( stacking ) 及 25 ma ( separation ) 的 電 流 或 100 V ( stacking ) 及 150 V ( separation ) 的 電 壓 進 行 電 泳 當 蛋 白 質 分 離 至 適 當 位 置 時, 將 膠 體 拆 下 浸 至 stain buffer ( 0.2% coomassie brilliant blue R-250, 50% methanol, 7% acetic acid ) 中, 放 在 Orbital Shaker ( S-101, Firstek, R.O.C. ) 上 以 轉 速 50 rpm 染 色 2 小 時, 再 用 destain buffer ( 50% methanol, 7% acetic acid ) 退 染 至 背 景 透 明 即 可 8
六 二 維 電 泳 ( 一 ) 實 驗 原 理 : 本 實 驗 以 Ettan IPGphor Isoelectric Focusing System ( GE Healthcare, U.K. ) 進 行 等 電 點 聚 焦 ( 二 ) 實 驗 步 驟 : 1. 樣 本 處 理 : 葉 片 蛋 白 質 粗 萃 取 液 加 入 等 體 積 的 water-saturated phenol, 充 分 搖 勻 後 放 置 高 速 冷 凍 離 心 機 ( Sorvall Instruments, RC-5C, Dupont, U.S.A. ) 以 12,000 rpm 20 分 鐘 加 入 四 倍 體 積 ice-cold methanol solution ( 100 mm ammonium acetate, 2% β-mercaptoethanol ) 進 行 沉 澱 至 隔 天 將 沉 澱 的 蛋 白 質 離 心 20 分 鐘, 將 pellet 移 至 eppendorf 中, 以 methanol solution 清 洗 兩 次, 再 用 acetone 清 洗 三 次, 每 次 離 心 12,000 rpm 20 分 鐘, 最 後 風 乾 即 可 得 到 純 蛋 白 質 樣 品 將 該 樣 品 溶 於 125μL rehydration solution ( 8 M urea, 0.5% CHAPS, 0.2% DTT, 0.5% IPG buffer, ph 3-10, 0.002% bromophenol blue ), 離 心 後 取 上 清 液 進 行 覆 水 2. 覆 水 : 將 蛋 白 質 樣 品 注 入 7 公 分 Ettan IPGphor strip holder ( GE Healthcare, U.K. ) 的 凹 槽 中, 自 七 公 分 膠 條 ( Immobiline DryStrip, Ph 3-10 ) ( GE Healthcare, U.K. ) acid end 移 除 保 護 層 後 膠 體 面 朝 下 正 極 朝 向 strip holder 的 尖 端 放 入 strip holder 的 凹 槽, 小 心 避 免 膠 條 與 strip holder 間 帶 有 氣 泡, 加 入 600μL DryStrip cover fluid ( GE Healthcare, U.K. ) 避 免 樣 品 蒸 發 及 urea 結 晶, 蓋 上 蓋 子 將 strip holder 置 於 Ettan IPGphor unit, 於 20 進 行 覆 水 16 小 時 3. 等 電 點 聚 焦 : 以 Ettan IPGphor unit 進 行 等 電 點 聚 焦, 共 同 條 件 為 20 50μV / strip 葉 片 蛋 白 質 樣 品 step1:500 V,30 分 鐘 step2:1000 V,30 分 鐘 step3: 5000 V 持 續 至 7500 V / hr 4.SDS-PAGE: 將 膠 條 置 於 equilibration solution ( 50 mm Tris-HCl ph8.8, 6 M urea, 2% SDS, 30% glycerol, 50 mg DTT, 0.002% bromophenol blue ) 輕 搖 15 分 鐘, 以 SDS running buffer 潤 洗 兩 次 將 膠 條 置 於 stacking gel 上, 在 膠 條 上 加 入 agarose sealing solution ( 0.5% agarose, 0.002% bromophenol blue) 避 免 膠 條 移 動 或 浮 起, 以 100 V stacking 30 分 鐘, 接 著 以 150 V 將 蛋 白 質 分 離 至 適 當 位 置, 後 將 膠 體 拆 下 9
浸 至 stain buffer ( 0.2% coomassie brilliant blue R-250, 50% methanol, 7% acetic acid ) 中, 放 在 Orbital Shaker ( S-101, Firstek, R.O.C. ) 上 以 轉 速 50 rpm 染 色 2 小 時, 再 用 destain buffer ( 50% methanol, 7% acetic acid ) 退 染 至 背 景 透 明 即 可 5. 蛋 白 質 身 分 鑑 定 : 將 特 定 蛋 白 質 由 跑 完 的 電 泳 膠 上 切 除, 經 二 次 水 清 洗 三 次 後, 以 MALDI-TOF 進 行 蛋 白 質 身 分 鑑 定, 委 由 中 興 大 學 生 物 科 技 發 展 中 心 進 行 蛋 白 質 身 分 鑑 定, 所 得 資 料 則 利 用 Matrix Science 網 站 ( http://www.matrixscience.com/ ) 與 阿 拉 伯 芥 蛋 白 資 料 庫 進 行 比 對 七 種 子 萌 發 率 測 定 將 消 毒 後 的 種 子 放 在 同 樣 濕 度 的 濾 紙 上, 置 於 培 養 皿 中, 並 計 算 種 子 總 數 ; 一 週 後, 計 算 發 芽 的 種 子 數 並 比 較 萌 發 率 10
陸 結 果 一 光 合 系 統 II 效 率 澆 灌 不 同 鹽 類 溶 液 之 阿 拉 伯 芥, 光 合 系 統 II 效 率 改 變 之 情 形 如 下 ( 圖 中 曲 線 為 趨 勢 線 ) 0.900 NaC l 0.800 0.700 光 合 作 用 效 率 0.600 0.500 0.400 0.300 對 照 組 NaCl 75 mm NaCl 150 mm NaCl 225 mm NaCl 300 mm 0.200 0.100 0.000 1 2 3 4 5 6 7 時 間 ( 天 ) 11
正 常 生 長 情 況 下, 阿 拉 伯 芥 的 葉 綠 素 螢 光 比 值 維 持 在 0.75 附 近, 在 NaCl 處 理 前 三 天 其 比 值 仍 可 維 持 在 0.75, 第 四 天 起 高 濃 度 NaCl 處 理 組 葉 綠 素 螢 光 比 值 持 續 下 降 到 0.4, 此 代 表 光 系 統 II 已 失 去 大 部 分 激 發 電 子 的 能 力 在 澆 灌 KCl 的 阿 拉 伯 芥 其 光 合 作 用 效 率 亦 有 下 降 的 趨 勢, 而 MgCl2 CaCl2 則 沒 有 明 顯 影 響 ( 其 中 MgCl2 2 mm 雖 然 鹽 分 濃 度 仍 在 正 常 範 圍, 但 趨 勢 線 卻 下 降, 原 因 將 於 後 面 討 論 解 釋 ) 12
實 驗 過 程 中 發 現 即 使 同 一 株 植 物, 不 同 位 置 的 葉 片 所 測 得 之 葉 綠 素 螢 光 比 值 仍 然 差 異 甚 大, 以 下 為 不 同 NaCl KCl 濃 度 處 理 下 光 合 系 統 II 效 率 的 折 線 圖, 由 標 準 差 所 涵 蓋 的 範 圍 顯 示, 在 高 鹽 逆 境 下, 不 同 葉 片 對 逆 境 的 反 應 不 同 ( 個 體 差 異 極 大 ) 13
二 光 合 色 素 含 量 測 定 各 種 鹽 類 溶 液 處 理 各 3 個 樣 本, 取 平 均 繪 製 葉 綠 素 a b 與 類 胡 蘿 蔔 素 含 量 的 長 條 圖 (mg/leaf) 12.00 10.00 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00 NaCl 葉 綠 素 a 葉 綠 素 b 類 胡 蘿 蔔 素 光 合 色 素 含 量 對 照 組 NaCl75mM NaCl 150mM NaCl 225mM NaCl 300mM 圖 一 以 不 同 濃 度 的 NaCl 溶 液 澆 灌 阿 拉 伯 芥 7 天, 發 現 葉 綠 素 a b 的 含 量 皆 比 對 照 組 低, 類 胡 蘿 蔔 素 則 在 高 鹽 225 mm 300 mm 處 理 後 較 對 照 組 高 2.0 1.9 倍 (mg/leaf) 12.00 10.00 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00 KCl 葉 綠 素 a 葉 綠 素 b 類 胡 蘿 蔔 素 光 合 色 素 含 量 對 照 組 KCl 15mM KCl 30mM KCl 45mM KCl 60mM 圖 二 以 不 同 濃 度 的 KCl 溶 液 澆 灌 阿 拉 伯 芥 7 天, 發 現 葉 綠 素 a b 類 胡 蘿 蔔 素 的 含 量 均 較 對 照 組 低 14
(mg/leaf) 12.00 10.00 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00 MgCl2 葉 綠 素 a 葉 綠 素 b 類 胡 蘿 蔔 素 光 合 色 素 含 量 對 照 組 MgCl2 2mM MgCl2 5mM MgCl2 10mM 圖 三 以 不 同 濃 度 的 MgCl2 溶 液 澆 灌 阿 拉 伯 芥 7 天, 發 現 葉 綠 素 a b 與 類 胡 蘿 蔔 素 的 含 量 在 2 mm MgCl2 處 理 組 較 對 照 組 低, 但 將 鎂 離 子 濃 度 提 高 到 5 mm 10 mm 後, 葉 綠 素 a b 的 含 量 反 而 有 回 升 的 趨 勢 (mg/leaf) 12.00 10.00 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00 CaCl2 葉 綠 素 a 葉 綠 素 b 類 胡 蘿 蔔 素 光 合 色 素 含 量 對 照 組 CaCl2 5mM CaCl2 10mM CaCl2 15mM CaCl2 20mM 圖 四 以 不 同 濃 度 的 CaCl2 溶 液 澆 灌 阿 拉 伯 芥 7 天, 發 現 葉 綠 素 a b 與 類 胡 蘿 蔔 素 的 含 量 均 比 對 照 組 低 從 上 表 可 看 出, 經 四 種 鹽 類 處 理 後, 葉 綠 素 a b 的 含 量 均 有 下 降 之 趨 勢, 而 類 胡 蘿 蔔 素 含 量 在 高 濃 度 NaCl 處 理 組 中 有 增 多 的 趨 勢, 伴 隨 著 植 株 葉 片 呈 現 明 顯 黃 化 症 狀 15
三 元 素 含 量 測 定 下 圖 為 根 據 植 株 元 素 含 量 測 定 所 得 的 數 據, 選 取 同 種 鹽 水 中, 以 不 同 濃 度 澆 灌 後, 植 株 元 素 含 量 最 高 者, 將 其 值 相 較 於 對 照 組 計 算 出 比 例 繪 製 而 成 對 照 組 對 照 組 NaCl 300 mm MgCl 2 2 mm KCl 15 mm CaCl 2 15 mm NaCl 150 mm MgCl 2 10 mm KCl 60 mm CaCl 2 15 mm 澆 灌 不 同 鹽 類 溶 液 的 植 株, 其 體 內 相 同 元 素 的 含 量 明 顯 高 於 對 照 組 及 其 他 各 組, 由 此 可 證 明 各 植 物 體 皆 有 確 實 吸 收 澆 灌 到 土 壤 的 鹽 類 以 下 的 結 果 分 析 皆 不 討 論 相 同 元 素 澆 灌 對 植 株 該 元 素 含 量 的 影 響 以 NaCl 澆 灌 的 植 株, 除 了 植 物 體 內 鈉 元 素 增 加 了 近 40 倍 外, 其 體 內 鉀 元 素 含 量 則 降 低 了 7 成, 顯 示 植 株 體 內 鈉 含 量 過 高 會 影 響 鉀 元 素 吸 收 16
對 照 組 對 照 組 NaCl 75 mm KCl 15 mm NaCl 75 mm KCl 30 mm MgCl 2 10 mm CaCl 2 15 mm MgCl 2 10 mm CaCl 2 10 mm 無 論 是 以 何 種 鹽 類 溶 液 澆 灌, 鈣 元 素 的 比 例 在 植 物 體 中 的 變 化 幅 度 皆 不 顯 著 另 外, 以 KCl 及 CaCl2澆 灌 的 植 株, 其 體 內 的 鎂 元 素 含 量 在 與 對 照 組 相 較 之 下, 亦 有 明 顯 增 加 的 情 形 17
四 蛋 白 質 電 泳 ( SDS-PAGE ) ( 一 )SDS-PAGE 下 圖 為 在 不 同 鹽 類 與 濃 度 的 溶 液 處 理 下 的 阿 拉 伯 芥, 葉 片 內 蛋 白 質 表 現 量 電 泳 圖 MW (kda) 116.0 control 75 150 225 300 (mm) MW control 15 30 45 60 (mm) (kda) 116.0 66.2 66.2 45.0 45.0 35.0 35.0 25.0 25.0 NaCl KCl MW (kda) control 5 10 15 20 (mm) MW control 2 5 10 (mm) (kda) 116.0 116.0 66.2 66.2 45.0 45.0 35.0 35.0 25.0 25.0 CaCl2 MgCl2 NaCl 處 理 所 誘 導 之 特 定 蛋 白 質 斑 紋 ( 進 階 做 二 維 電 泳 ) RuBisCO 蛋 白 質 所 在 之 位 置 18
在 各 種 鹽 類 溶 夜 處 理 一 週 後, 除 了 NaCl 處 理 組 外, 其 餘 處 理 之 蛋 白 質 表 現 量 均 無 明 顯 差 異, 在 225 mm NaCl 處 理 後, 對 比 於 對 照 組, 發 現 一 條 約 80 kda 的 特 殊 蛋 白 質 斑 紋 ( 如 左 上 圖 中 紅 圈 所 標 示 ) 推 測 它 是 因 為 植 物 處 於 逆 境, 為 了 使 自 己 能 夠 存 活 下 去, 所 誘 導 出 的 抗 逆 境 蛋 白 質 針 對 此 特 殊 蛋 白 質, 繼 續 進 行 二 維 電 泳, 希 望 能 對 它 有 更 進 一 步 的 了 解 19
五 二 維 電 泳 針 對 SDS-PAGE 觀 察 到 蛋 白 累 積 有 變 化 之 225mM NaCl 處 理 組 的 植 株, 利 用 解 析 度 較 高 的 蛋 白 質 二 維 電 泳 進 行 分 離 MW (kda) 116.0 ph3 ph10 control 66.2 45.0 35.0 25.0 MW (kda) ph3 ph10 225mM NaCl 116.0 3. 4. 66.2 2. 1. 45.0 35.0 25.0 Salt- decreased Salt- induced * 取 編 號 1.2.3.4 蛋 白 質 做 蛋 白 質 鑑 定 20
由 此 二 維 電 泳 的 分 析, 發 現 在 對 照 組 和 加 鹽 處 理 兩 組 樣 本 中 的 蛋 白 質 在 許 多 部 分 都 有 些 微 的 變 化, 我 們 藉 由 參 考 SDS-PAGE 所 鑑 定 之 80 kda 特 殊 斑 紋 所 在 的 位 置, 在 二 維 電 泳 膠 上 挑 選 了 編 號 1 2 3 4 四 個 蛋 白 質 點, 進 行 蛋 白 質 的 身 分 鑑 定 以 下 為 各 蛋 白 質 經 鑑 定 及 比 對 後, 所 推 測 得 到 的 蛋 白 質 種 類 MOWSE # pep MW Score # mat %Cov (Da)/pI Accession # Species Protein Name % mat #1 3584 7/6/18 29.7 38030/6.2 Q9FX85 Peroxidase 10 precursor #2 32156 9/9/17 16.2 76946/6.5 Q6R2K1 Protein STRUBBELIG-RECEPTOR FAMILY 5 precursor #3 1157 5/5/8 17.0 52886/6.1 Q9LX55 Putative F-box/LRR-repeat protein At3g59160 #4 2612 6/6/11 13.8 70564/6.5 Q9FHK7 Probable receptor kinase At5g05160 precursor 六 種 子 萌 發 率 測 定 各 種 鹽 類 溶 液 處 理 一 週 後, 將 植 株 繼 續 培 養 到 收 成 種 子, 進 一 步 測 試 種 子 的 萌 發 率 種 子 萌 發 率 萌 發 率 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 低 1 2 3 4 高 5 相 對 濃 度 NaCl KCl MgCl2 CaCl2 數 據 顯 示, 在 鈉 鹽 處 理 下 的 植 株, 其 種 子 在 鹽 類 溶 液 濃 度 較 高 的 環 境 下, 幾 乎 不 萌 發 而 鉀 鎂 鈣 鹽 處 理 對 種 子 的 萌 發 率, 則 沒 有 明 顯 的 影 響 21
柒 討 論 一 葉 部 形 態 變 化 :( 圖 片 取 各 種 鹽 類 溶 液 最 高 濃 度 ) 澆 灌 NaCl( 左 圖 ) 的 植 株, 其 輪 狀 葉 由 綠 轉 黃 ( 如 圖 中 紅 圈 處 ), 且 有 些 葉 片 萎 縮 澆 灌 KCl( 右 圖 ) 的 植 株, 其 輪 狀 葉 則 無 明 顯 變 化 澆 灌 MgCl2( 左 圖 ) 的 植 株, 其 輪 狀 葉 從 葉 緣 開 始 發 黃 ( 如 圖 中 紅 圈 處 ) 澆 灌 CaCl 2 ( 右 圖 ) 的 植 株, 其 幼 葉 蜷 曲, 且 略 呈 黃 色 ( 如 圖 中 紅 圈 處 ) 二 光 合 系 統 II 效 率 : 結 果 顯 示, 澆 灌 NaCl KCl 之 阿 拉 伯 芥 其 光 合 系 統 II 效 率 有 下 降 的 趨 勢, 但 進 一 步 分 析, 發 現 實 驗 的 誤 差 值 相 互 重 疊, 因 此 不 能 斷 定 其 鹽 類 溶 液 對 光 合 系 統 II 效 率 有 造 成 下 降 的 影 響 其 可 能 造 成 誤 差 原 因 : ( 一 ) 在 澆 灌 鹽 類 溶 液 前, 同 樣 環 境 中 生 長 的 不 同 植 株, 其 生 長 狀 況 仍 然 會 呈 現 個 體 22
差 異, 由 下 圖 照 片 可 看 出, 其 中 有 些 葉 片 仍 然 是 綠 色 有 些 卻 已 經 變 黃 甚 至 萎 縮, 故 會 影 響 到 澆 灌 後 的 光 合 系 統 II 效 率 ( 下 圖 為 以 NaCl 225 mm 的 鹽 類 溶 液 澆 灌 的 植 株 ) ( 二 ) 選 擇 做 光 合 系 統 II 效 率 分 析 的 葉 片 時, 採 用 隨 機 選 取 的 方 式, 每 盆 測 定 五 個 以 上 的 值, 故 測 定 的 葉 片 可 能 因 受 其 它 葉 片 遮 蔽 的 影 響, 未 受 到 光 照 因 而 生 長 不 良, 導 致 其 光 合 系 統 II 效 率 在 同 一 盆 栽 有 所 差 異, 而 使 誤 差 變 大 23
其 中 MgCl2 2 mm 雖 然 鹽 分 濃 度 仍 在 正 常 範 圍, 但 趨 勢 線 卻 下 降, 原 因 可 能 為 不 同 植 株 間 的 個 體 差 異 此 株 植 物 在 開 始 澆 灌 鎂 鹽 前, 靠 近 根 部 的 莖 表 皮 呈 現 與 它 株 相 異 的 紫 紅 色, 代 表 阿 拉 伯 芥 植 株 已 遭 受 逆 境, 進 而 累 積 花 青 素 ( Hsieh et al, 1998 ), 推 測 因 植 物 表 面 被 非 光 合 色 素 掩 蓋, 而 造 成 光 合 色 素 的 吸 光 值 減 少, 所 以 導 致 光 合 系 統 II 效 率 的 減 低 三 植 株 光 合 色 素 含 量 的 改 變 由 於 鎂 元 素 為 葉 綠 素 a b 結 構 中 必 要 的 成 分, 故 針 對 MgCl2 處 理 下 葉 綠 素 a b 的 含 量 變 化, 藉 以 觀 察 阿 拉 伯 芥 是 否 會 增 加 吸 收 鎂 離 子, 並 利 用 鎂 元 素 建 構 更 多 的 葉 綠 素 a b, 使 其 在 高 濃 度 鹽 類 溶 液 中 仍 能 存 活 圖 三 顯 示, 在 MgCl2 2 mm 至 10 mm 的 葉 綠 素 a b 含 量 有 回 升 的 趨 勢, 但 整 體 含 量 還 是 少 於 對 照 組, 因 此 初 步 推 定 葉 綠 素 a b 含 量 仍 較 對 照 組 少 的 原 因 可 能 為 氯 元 素 的 毒 害 為 了 解 鎂 元 素 對 逆 境 下 阿 拉 伯 芥 的 影 響, 選 擇 MgCl2 10 mm 和 CaCl2 10 mm 的 數 據 交 叉 比 對, 挑 選 此 兩 組 作 比 較 乃 是 因 其 氯 元 素 的 體 積 莫 耳 濃 度 相 等, 所 以 氯 元 素 的 毒 害 相 同 在 此 兩 組 數 據 中,MgCl2 10 mm 處 理 下 葉 綠 素 a 含 量 為 8.01 ( mg / leaf ), 葉 綠 素 b 含 量 為 5.50 ( mg / leaf ), 而 CaCl2 10 mm 處 理 下 葉 綠 素 a 含 量 為 5.92 ( mg / leaf ), 葉 綠 素 b 含 量 24
為 3.72 ( mg / leaf ), 顯 示 MgCl2鹽 處 理 組 葉 綠 素 a b 含 量 較 高, 故 可 推 測 鎂 元 素 的 存 在 可 能 對 逆 境 下 的 阿 拉 伯 芥 是 有 益 的 若 要 進 一 步 觀 察 鎂 元 素 在 逆 境 下 扮 演 的 角 色, 未 來 可 以 使 用 MgSO4 來 取 代 MgCl2, 進 行 提 高 鎂 元 素 的 含 量 之 試 驗, 以 消 除 氯 元 素 毒 害 之 疑 慮 四 植 株 內 元 素 的 改 變 當 外 在 環 境 因 素 造 成 植 物 體 內 鈉 元 素 增 加 時, 其 體 內 鉀 元 素 含 量 則 顯 著 下 降 造 成 此 現 象 乃 是 因 鈉 和 鉀 同 為 鹼 金 屬, 彼 此 有 相 互 競 爭 的 關 係 ( Niu et al, 1995 ) 因 此 在 植 株 內 鈉 元 素 與 鉀 元 素 的 含 量 會 相 互 拮 抗 而 造 成 植 株 鈣 元 素 含 量 無 顯 著 差 異 之 因 素, 我 們 認 為 其 原 因 應 是 : 鈣 元 素 是 植 物 體 中 訊 息 傳 遞 的 物 質 及 重 要 的 調 控 機 制, 植 物 體 會 將 體 內 的 鈣 元 素 含 量 控 制 在 一 定 的 範 圍 之 內, 以 讓 訊 息 能 正 常 傳 遞, 同 時 也 可 以 減 緩 高 鹽 環 境 對 本 身 的 傷 害 至 於 澆 灌 KCl 及 CaCl2兩 種 鹽 類 溶 液 對 植 物 體 中 鎂 元 素 含 量 的 影 響, 我 們 推 測 : 鎂 元 素 是 構 成 植 物 體 葉 綠 素 的 唯 一 金 屬 元 素, 同 時 也 是 許 多 酶 的 活 化 劑, 植 物 體 若 缺 乏 鎂 元 素 則 會 阻 礙 植 物 進 行 光 合 作 用, 並 且 造 成 老 葉 葉 脈 間 黃 化, 新 葉 彎 曲 ( Chen et al, 2007 ) 而 高 鹽 逆 境 有 可 能 促 使 植 株 增 加 鎂 離 子 的 吸 收 量, 以 此 增 強 光 合 作 用, 幫 助 植 物 體 對 抗 逆 境 在 另 一 方 面, 圖 表 中 顯 示 以 NaCl 澆 灌 的 植 株, 其 鈉 元 素 含 量 高 出 其 他 組 別 約 十 倍, 其 原 因 除 了 是 植 物 體 本 身 對 鈉 元 素 的 反 應 較 為 顯 著 之 外, 不 排 除 可 能 為 實 驗 進 行 前 未 清 洗 葉 片, 導 致 殘 留 於 葉 片 上 的 藥 品 影 響 實 驗 結 果 五 植 株 內 蛋 白 質 變 化 由 一 維 蛋 白 質 電 泳 結 果 中, 發 現 大 多 數 的 植 株 都 會 隨 著 鹽 類 溶 液 濃 度 增 高 ( 逆 境 由 小 到 大 ), 而 造 成 其 體 內 蛋 白 質 減 少, 尤 其 是 光 合 作 用 相 關 酵 素, 在 光 系 統 無 法 提 供 足 夠 能 量 時, 二 氧 化 碳 的 固 定 速 率 亦 會 下 降, 此 時 RuBisCO 等 酵 素 蛋 白 質 所 需 要 之 量 就 減 少, 多 餘 之 蛋 白 質 可 以 經 由 分 解 而 釋 出 游 離 胺 基 酸, 以 供 逆 境 下 合 成 抗 逆 境 蛋 白 質 依 據 二 維 電 泳 的 檢 測 結 果, 將 挑 選 出 的 四 個 逆 境 誘 導 之 蛋 白 質 做 身 份 鑑 定 後, 推 測 分 別 是 1. Peroxidase 10 25
2. Protein Strubbelig-Receptor family 5 3. Putative F-box/LRR-repeat protein 4. Probable receptor kinase 其 中 Peroxidase( 過 氧 化 氫 酶 ) 的 功 能 應 是 分 解 高 鹽 逆 境 下 所 產 生 之 活 性 氧 ; 一 般 逆 境 常 會 伴 隨 氧 化 逆 境, 當 光 合 作 用 效 率 降 低, 電 子 傳 遞 鍊 無 法 順 利 傳 遞 電 子, 造 成 電 子 附 在 氧 氣 上, 形 成 超 氧 根 離 子 增 加 氧 的 活 性, 攻 擊 細 胞 內 具 分 子 如 脂 肪 酸 及 核 酸 等, 使 植 物 體 加 速 氧 化 故 推 測 誘 導 過 氧 化 氫 酶 來 分 解 高 活 性 的 氧, 減 緩 老 化 速 度 其 他 三 個 蛋 白 質 結 構 及 功 能 均 呈 高 度 相 關 性, 如 2 號 Protein Strubbelig-Receptor family 5 及 3 號 蛋 白 Putative F-box / LRR-repeat protein, 均 含 有 LRR ( leucine rich repeat ) domain;2 號 Protein Strubbelig-Receptor family 5 及 4 號 蛋 白 Probable receptor kinase, 均 含 有 蛋 白 質 激 酶 domain, 屬 於 receptor kinase, 可 能 之 功 能 包 括 參 與 逆 境 下 細 胞 壁 結 構 變 化 加 速 分 解 不 需 要 的 蛋 白 質 將 其 轉 換 為 對 抗 逆 境 所 需 要 的 蛋 白 質, 以 及 藉 由 使 蛋 白 質 磷 酸 化 或 去 磷 酸 化 進 行 訊 息 的 傳 遞, 使 植 物 啟 動 對 抗 高 鹽 逆 境 的 相 關 機 制 六 種 子 萌 發 率 測 定 高 濃 度 NaCl 環 境 下 的 種 子 幾 乎 不 萌 發, 推 測 是 因 其 花 粉 粒 發 育 不 良 使 胚 珠 無 法 受 精, 或 是 孢 子 體 無 法 吸 收 足 夠 養 分 進 而 使 種 子 發 育 不 良 所 導 致, 但 因 阿 拉 伯 芥 的 種 子 顆 粒 太 小, 無 法 以 肉 眼 觀 察 區 別 26
捌 結 論 綜 合 以 上 結 果, 我 們 可 以 得 知 : 1. 鎂 元 素 對 植 物 體 的 光 合 作 用 效 率 可 能 有 正 面 的 影 響 2. 在 各 種 高 鹽 溶 液 環 境 下, 植 物 葉 綠 素 a 葉 綠 素 b 含 量 皆 會 下 降 3. 在 NaCl 225 mm 的 環 境 下, 植 物 會 產 生 對 抗 高 鹽 逆 境 的 蛋 白 質 4. 在 NaCl 的 高 鹽 逆 境 下, 會 造 成 種 子 萌 發 率 銳 減 27
玖 未 來 展 望 透 過 這 次 實 驗, 我 們 觀 察 到 不 同 鹽 處 理 之 下 植 株 的 生 長 情 形, 也 測 得 不 同 鹽 類 溶 液 對 植 物 光 合 作 用 效 率 植 株 元 素 含 量 及 種 子 萌 發 率 的 影 響, 更 進 一 步 分 析 出 受 逆 境 影 響 而 被 誘 發 的 蛋 白 質 讓 我 們 對 於 高 鹽 逆 境 和 植 物 體 之 間 的 關 聯 有 了 更 深 層 的 認 識 若 欲 於 未 來 進 行 相 關 研 究, 可 針 對 以 下 幾 點 進 行 更 深 入 之 探 討 : 一 增 加 鹽 類 溶 液 濃 度 及 種 類, 探 討 於 不 同 逆 境 環 境 下 植 物 體 的 反 應 二 使 用 不 同 種 類 的 植 物 進 行 研 究, 並 比 較 不 同 植 物 與 阿 拉 伯 芥 對 高 鹽 逆 境 的 反 應 之 異 同 三 可 進 一 步 利 用 顯 微 鏡, 釐 清 影 響 種 子 萌 發 率 的 原 因 究 竟 為 何 四 可 以 針 對 因 逆 境 而 改 變 的 蛋 白 質 作 更 深 入 的 研 究, 從 而 更 確 切 了 解 植 物 的 抗 逆 境 機 轉 28
拾 參 考 文 獻 Chen LJ, Lu KT, Liu CT. Effect of bamboo vinegar on promoting the growth of Brassica chinensis ( Linn ). Taiwan J For Sci, 2007 ; 22 ( 2 ) : 149-57. Hsieh M-H, Lam H-M, van de Loo FJ, Coruzzi G A PII-like protein in Arabidopsis: putative role in nitrogen sensing. Proc Natl Acad Sci U.S.A., 1998; 95: 13965 13970 J. D. J. Ingle and S. R. Crouch, Spectrochemical Analysis, Prentice Hall, New Jersey, U.S.A. 1988. Niu X, Bressan RA, Hasegawa PM, Pardo JM. Ion Homeostasis in NaCl Stress Environments. Plant Physiol, 1995 Nov ; 109 ( 3 ) : 735-742. Taiz L, Zeiger E. Plant Physiology, 4th edition, Sinauer Associates, Inc. Publishers, Sunderland, Massachusetts, U.S.A. 2006 Wintermans, J. F. G. M., and A. De Mots. Spectrophotometric characteristics of chlorophylls a and b and their pheophytins in ethanol. Biochimica et Biophysica Acta, 1965 ; 109 : 448-453. 29