发 明 专 利 请 求 书 073089CN 发 名 明 称 发 明 人 申 姓 名 或 名 称 国 籍 或 居 所 地 国 家 或 地 区 地 址 大 黄 酸 在 防 治 脂 肪 肝 中 的 用 途 (1) 秦 莹 (2) 盛 小 燕 第 一 申 请 人 单 位 代 码 或 个 人 身 份 证 号 邮 政 0031 编 码 地 区 ( 乡 ) 街 道 门 牌 号 中 国 科 学 院 上 海 生 命 科 学 研 究 院 4471-1 中 国 省 自 治 区 直 辖 市 名 称 上 海 市 岳 阳 路 3 号 此 框 内 容 由 专 利 局 填 写 申 请 号 ( 发 明 ) 分 案 提 交 日 申 请 日 费 减 审 批 电 挂 号 号 码 话 市 ( 县 ) 名 称 请 第 二 申 请 人 姓 名 或 名 称 国 籍 或 所 在 地 国 家 或 地 区 邮 政 编 码 地 址 电 话 人 联 系 人 第 三 申 请 人 姓 姓 名 或 名 称 国 籍 或 所 在 地 国 家 或 地 区 邮 政 编 码 名 邮 政 编 码 地 址 地 址 确 定 非 第 一 申 请 人 为 代 表 人 声 明 特 声 明 第 申 请 人 为 申 请 人 的 代 表 人 电 电 话 话 11 代 代 理 机 构 名 称 邮 政 编 码 地 址 上 海 专 利 商 标 事 务 所 有 限 公 司 0233 电 话 64853500 上 海 市 桂 平 路 435 号 代 码 310 理 代 理 人 1 姓 名 工 作 证 号 电 话 徐 迅 31005136.6 64853500 代 理 人 2 姓 名 工 作 证 号 电 话 12 分 案 申 请 原 案 申 请 号 原 案 申 请 日 111 ( 第 1 页 )02.4 Q001
073089CN 13 发 名 明 称 大 黄 酸 在 防 治 脂 肪 肝 中 的 用 途 14 生 物 材 料 样 品 保 藏 保 藏 单 位 地 址 保 藏 日 期 年 月 日 保 藏 编 号 分 类 命 名 16 要 求 优 先 权 声 明 在 先 申 请 国 别 或 地 区 在 先 申 请 日 在 先 申 请 号 申 请 文 件 清 单 18 19 不 宽 丧 限 失 期 新 声 颖 明 性 17 保 密 请 求 附 加 文 件 清 单 已 在 中 国 政 府 主 办 或 承 认 的 国 际 展 览 会 上 首 次 展 出 已 在 规 定 的 学 术 会 议 或 技 术 会 议 上 首 次 发 表 他 人 未 经 申 请 人 同 意 而 泄 露 其 内 容 本 专 利 申 请 可 能 涉 及 国 家 重 大 利 益, 请 求 保 密 处 理 是 否 已 提 交 保 密 证 明 材 料 1. 请 求 书 2 2. 说 明 书 摘 要 2 3. 摘 要 附 图 份 每 份 份 每 份 份 每 份 2 1 页 页 页 费 用 减 缓 请 求 书 1 份 上 级 单 位 出 具 的 减 缓 证 明 1 份 专 利 代 理 委 托 书 1 份 4. 权 利 要 求 书 2 份 每 份 2 页 5. 说 明 书 2 份 每 份 12 页 6. 说 明 书 附 图 2 份 每 份 1 页 权 利 要 求 的 项 数 项 申 请 人 或 代 理 机 构 签 章 21 专 利 局 对 文 件 清 单 的 审 核 07 年 6 月 18 日 年 月 日 111 ( 第 2 页 )02.4 Q001
说 明 书 摘 要 5 本 发 明 提 供 了 大 黄 酸 活 性 物 质 在 制 备 预 防 控 制 或 治 疗 脂 肪 肝 的 组 合 物 中 的 用 途, 所 述 大 黄 酸 活 性 物 质 包 括 : 大 黄 酸 其 生 理 学 上 或 药 学 上 可 接 受 的 盐 或 酯 其 水 合 物 或 它 们 的 混 合 物 此 外, 本 发 明 还 提 供 了 一 种 组 合 物, 所 述 组 合 物 包 括 : 1) 大 黄 酸 ;2) 其 它 脂 肪 肝 防 治 活 性 物 质 ; 和 3) 药 学 上 可 接 受 的 载 体 或 食 品 学 上 可 接 受 的 载 体 本 发 明 的 实 验 表 明, 大 黄 酸 对 脂 肪 肝 有 显 著 的 治 疗 效 果 -1-
权 利 要 求 书 5 30 1. 大 黄 酸 活 性 物 质 的 用 途, 所 述 大 黄 酸 活 性 物 质 包 括 : 大 黄 酸 其 生 理 学 上 或 药 学 上 可 接 受 的 盐 或 酯 其 水 合 物 或 它 们 的 混 合 物, 其 特 征 在 于, 用 于 制 备 预 防 控 制 和 / 或 治 疗 脂 肪 肝 的 组 合 物 2. 如 权 利 要 求 1 所 述 的 用 途, 其 特 征 在 于, 所 述 组 合 物 是 药 物 组 合 物 保 健 品 组 合 物 食 物 组 合 物 或 膳 食 添 加 剂 3. 如 权 利 要 求 2 所 述 的 用 途, 其 特 征 在 于, 所 述 药 物 组 合 物 含 有 : (1) 安 全 有 效 量 的 大 黄 酸 其 药 学 上 可 接 受 的 盐 或 酯 其 水 合 物 或 它 们 的 混 合 物, 作 为 活 性 成 分 ; 以 及 (2) 药 学 上 可 接 受 的 载 体 4. 如 权 利 要 求 1 所 述 的 用 途, 其 特 征 在 于, 所 述 大 黄 酸 活 性 物 质 占 所 述 组 合 物 总 重 量 的 0.001~99.9wt% 5. 如 权 利 要 求 1 所 述 的 用 途, 其 特 征 在 于, 所 述 组 合 物 为 单 位 剂 型 或 多 剂 型, 且 其 中 大 黄 酸 活 性 物 质 的 含 量 为 0.01~00mg/ 剂 6. 如 权 利 要 求 1 所 述 的 用 途, 其 特 征 在 于, 所 述 的 组 合 物 还 用 于 防 治 与 脂 肪 肝 相 关 的 疾 病 或 症 状, 所 述 的 疾 病 或 症 状 选 自 : 肝 功 能 受 损 ALT 升 高 肥 胖 症 糖 尿 病 或 胰 岛 素 抵 抗 7. 如 权 利 要 求 1 所 述 的 用 途, 其 特 征 在 于, 所 述 组 合 物 还 包 括 用 于 改 善 和 治 疗 脂 肪 肝 的 其 它 活 性 物 质, 所 述 的 其 它 活 性 物 质 选 自 下 组 : 抗 氧 化 剂 胰 岛 素 增 敏 剂 保 肝 药 降 脂 药 减 肥 药 激 素 或 它 们 的 组 合 8. 一 种 组 合 物, 所 述 组 合 物 含 有 : (1) 大 黄 酸 活 性 物 质, 其 中 所 述 大 黄 酸 活 性 物 质 包 括 : 大 黄 酸 其 生 理 学 上 或 药 学 上 可 接 受 的 盐 或 酯 其 水 合 物 或 它 们 的 混 合 物 ; (2) 选 自 下 组 的 一 种 或 多 种 预 防 控 制 或 治 疗 脂 肪 肝 的 其 它 活 性 物 质 : 氯 贝 特 类 胆 碱 蛋 氨 酸 烟 酸 类 熊 去 氧 胆 酸 其 它 具 有 降 血 脂 的 作 用 的 中 草 药 或 它 们 的 混 合 物 ; 以 及 (3) 药 学 上 可 接 受 的 载 体 或 食 品 学 上 可 接 受 的 载 体 9. 如 权 利 要 求 8 所 述 的 组 合 物, 其 特 征 在 于, 所 述 活 性 物 质 大 黄 酸 占 组 合 物 总 重 量 的 0.001~99.9wt% -1-
. 如 权 利 要 求 8 所 述 的 组 合 物, 其 特 征 在 于, 所 述 组 合 物 是 药 物 组 合 物 保 健 品 组 合 物 食 物 组 合 物 或 膳 食 添 加 剂 -2-
说 明 书 大 黄 酸 在 防 治 脂 肪 肝 中 的 作 用 5 技 术 领 域 本 发 明 涉 及 生 物 技 术 和 医 药 领 域 更 具 体 而 言, 本 发 明 涉 及 大 黄 酸 在 防 治 脂 肪 肝 中 的 用 途 背 景 技 术 脂 肪 肝 是 指 由 于 各 种 原 因 引 起 的 肝 细 胞 内 脂 肪 堆 积 过 多 的 病 变 正 常 肝 内 脂 肪 占 肝 重 3%-4%, 如 果 脂 肪 含 量 超 过 肝 重 的 5% 即 为 脂 肪 肝, 严 重 者 脂 肪 量 可 达 40%-50% 脂 肪 肝 的 脂 类 主 要 是 甘 油 三 酯 形 成 脂 肪 肝 的 主 要 原 因 有 : 酒 精 ; 长 期 摄 入 高 脂 饮 食 或 长 期 大 量 吃 糖 淀 粉 等 碳 水 化 合 物, 使 肝 脏 脂 肪 合 成 过 多 脂 肪 ; 缺 乏 运 动, 使 肝 内 脂 肪 输 入 过 多 ; 糖 尿 病 ; 肝 炎 ; 某 些 药 物 引 起 的 急 性 或 慢 性 肝 损 害 目 前, 脂 肪 肝 在 我 国 发 病 率 持 续 上 升, 每 4 个 人 中 就 有 一 个 是 脂 肪 肝, 而 且 发 病 年 龄 有 低 龄 化 趋 势, 儿 童 中 不 少 小 胖 子 也 成 为 了 脂 肪 肝 的 患 者 由 于 脂 肪 肝 和 病 因 和 发 病 机 制 较 为 复 杂, 因 此, 迄 今 尚 未 找 到 治 疗 脂 肪 肝 的 特 效 药 大 多 数 降 脂 药 物 对 肝 内 脂 肪 消 除 作 用 有 限, 许 多 降 脂 药 可 以 导 致 肝 细 胞 损 伤, 因 此 降 脂 药 在 脂 肪 肝 治 疗 中 的 作 用 和 地 位 尚 有 争 论 最 新 研 究 发 现 控 制 脂 肪 合 成 的 转 录 因 子 SREBP1(Sterol Regulatory Element Binding Protein 1) 在 脂 肪 肝 形 成 中 起 关 键 作 用,SREBP1 基 因 表 达 的 上 调 直 接 导 致 脂 肪 肝 的 形 成 (Shimomura,I.,Bashmakov,Y. & Horton,J. D. (1999) J Biol Chem 274: 30028-30032.) 大 黄 酸 是 一 种 从 蓼 科 植 物 掌 叶 大 黄 (Rheum palmatum L.) 中 提 取 的 单 体, 是 一 种 黄 色 针 状 晶 体 其 化 学 名 为 4,5- 二 羟 基 蒽 醌 -2- 羧 酸, 分 子 式 为 C H 8 O 6, 分 子 量 为 284.21, 分 子 结 构 如 下 所 示 : -1-
5 30 其 物 理 性 质 包 括 溶 于 碱 和 嘧 啶, 部 分 溶 于 乙 醇 苯 氯 仿 麻 醉 乙 醚, 但 几 乎 不 溶 于 水 并 且 经 大 鼠 急 性 毒 性 实 验 结 果 表 明, 大 黄 酸 的 半 数 致 死 量 (LD 50 ) 为 3.2g/kg, 具 有 低 毒 性 且 药 物 代 谢 研 究 表 明, 大 黄 酸 易 于 被 人 体 吸 收, 服 用 后 血 药 浓 度 维 持 时 间 较 长 因 此, 将 天 然 提 取 物 大 黄 酸 用 作 药 物 具 有 其 优 越 性 目 前 研 究 已 表 明 大 黄 酸 具 有 抗 癌 (Huang,Q.,Lu,G.,Shen,H.M.,Chung, M. C. & Ong,C. N. (06). Med Res Rev.) 治 疗 骨 性 关 节 炎 (Martin,G., Bogdanowicz,P.,Domagala,F.,Ficheux,H. & Pujol,J. P. (03). Inflammation 27: 233-246) 和 抑 制 肝 纤 维 化 (Guo,M. Z.,Li,X. S.,Xu,H. R.,Mei,Z. C., Shen,W. & Ye,X. F. (02) Acta Pharmacol Sin 23: 739-744) 等 作 用 然 而, 现 有 技 术 中 尚 未 有 报 道 表 明 大 黄 酸 具 有 改 善 和 治 疗 脂 肪 肝 的 作 用, 更 尚 未 进 一 步 揭 示 其 作 用 机 理 综 上 所 述, 本 领 域 迫 切 需 要 研 制 出 效 果 显 著 机 理 明 确 的 改 善 和 治 疗 脂 肪 肝 的 药 物 发 明 内 容 本 发 明 正 是 提 供 了 大 黄 酸 活 性 物 质 在 改 善 和 治 疗 脂 肪 肝 中 的 用 途, 并 提 供 了 含 有 所 述 大 黄 酸 活 性 物 质 的 组 合 物 在 本 发 明 的 第 一 方 面, 提 供 了 一 种 大 黄 酸 活 性 物 质 的 用 途, 所 述 大 黄 酸 活 性 物 质 包 括 : 大 黄 酸 其 生 理 学 上 或 药 学 上 可 接 受 的 盐 或 酯 其 水 合 物 或 它 们 的 混 合 物, 其 特 征 在 于, 用 于 制 备 预 防 控 制 和 / 或 治 疗 脂 肪 肝 的 组 合 物 在 本 发 明 的 一 个 优 选 例 中, 所 述 大 黄 酸 活 性 物 质 是 提 取 自 蓼 科 植 物 掌 叶 大 黄 Rheum palmatum L. 或 是 化 学 合 成 的 在 本 发 明 的 另 一 优 选 例 中, 所 述 脂 肪 肝 包 括 酒 精 性 脂 肪 肝 和 非 酒 精 性 脂 肪 肝 在 本 发 明 的 一 个 实 施 方 式 中, 所 述 组 合 物 是 药 物 组 合 物 保 健 品 组 合 物 食 物 组 合 物 或 膳 食 添 加 剂 在 本 发 明 的 另 一 个 实 施 方 式 中, 所 述 药 物 组 合 物 含 有 : (1) 安 全 有 效 量 的 大 黄 酸 其 生 理 学 上 或 药 学 上 可 接 受 的 盐 或 酯 其 水 合 物 或 它 们 的 混 合 物, 作 为 活 性 成 分 ; 以 及 (2) 药 学 上 可 接 受 的 载 体 在 本 发 明 的 另 一 个 实 施 方 式 中, 所 述 大 黄 酸 活 性 物 质 占 所 述 组 合 物 总 重 量 的 -2-
5 30 0.001~99.9wt% 在 本 发 明 的 一 个 优 选 例 中, 大 黄 酸 活 性 物 质 占 组 合 物 总 重 量 的 1~95wt%, 较 优 选 为 5~90wt%, 更 优 选 ~80wt% 在 本 发 明 的 另 一 个 实 施 方 式 中, 所 述 组 合 物 为 单 位 剂 型 或 多 剂 型, 且 其 中 大 黄 酸 活 性 物 质 的 含 量 为 0.01~00mg/ 剂 在 本 发 明 的 一 个 优 选 例 中, 大 黄 酸 活 性 物 质 的 含 量 为 0.01-5.0mg/ 剂, 更 优 选 为 0.05~4.0mg/ 剂, 进 一 步 优 选 含 有 0.1~3.0mg/ 剂 ; 最 优 选 的 含 有 大 黄 酸 活 性 物 质 0.2~2.0mg/ 剂 在 本 发 明 的 另 一 个 优 选 例 中, 大 黄 酸 活 性 物 质 的 含 量 为 5.0~0mg/ 剂 ; 更 优 选 ~0mg/ 剂, 进 一 步 优 选 ~0mg/ 剂, 更 优 选 30~0mg/ 剂 ; 最 优 选 的, 含 有 大 黄 酸 活 性 物 质 40~70mg/ 剂 在 本 发 明 的 另 一 个 优 选 例 中, 大 黄 酸 活 性 物 质 的 含 量 为 0~00mg/ 剂 ; 更 优 选 300~00mg/ 剂, 进 一 步 优 选 500~10mg/ 剂, 更 优 选 750~10mg/ 剂 ; 最 优 选 的, 含 有 大 黄 酸 活 性 物 质 800~00mg/ 剂 在 本 发 明 的 另 一 个 优 选 例 中, 每 天 施 用 1~6 剂 本 发 明 的 组 合 物, 优 选 施 用 1~3 剂 在 本 发 明 的 另 一 个 实 施 方 式 中, 所 述 的 组 合 物 还 用 于 防 治 与 脂 肪 肝 相 关 的 疾 病 或 症 状, 所 述 的 疾 病 或 症 状 选 自 : 肝 功 能 受 损 ALT 升 高 肥 胖 症 糖 尿 病 或 胰 岛 素 抵 抗 在 本 发 明 的 另 一 个 实 施 方 式 中, 所 述 组 合 物 还 包 括 用 于 改 善 和 治 疗 脂 肪 肝 的 其 它 活 性 物 质, 所 述 的 其 它 活 性 物 质 选 自 下 组 : 抗 氧 化 剂 胰 岛 素 增 敏 剂 保 肝 药 降 脂 药 减 肥 药 激 素 或 它 们 的 组 合 在 本 发 明 的 一 个 优 选 例 中, 所 述 其 它 活 性 物 质 选 自 : 维 生 素 E 维 生 素 C 甜 菜 碱 二 甲 双 胍 噻 唑 烷 二 酮 普 罗 布 考 氯 贝 特 类 吉 非 罗 齐 糖 皮 质 激 素 水 飞 蓟 素 奥 利 司 他 黄 连 素 胆 碱 蛋 氨 酸 烟 酸 其 它 具 有 降 血 脂 作 用 的 中 草 药 或 它 们 的 组 合 在 本 发 明 的 另 一 优 选 例 中, 所 述 其 它 具 有 降 血 脂 作 用 的 中 草 药 选 自 : 何 首 乌 丹 参 泽 泻 川 芎 决 明 子 或 山 楂 在 本 发 明 的 第 二 方 面 中, 提 供 了 一 种 组 合 物, 所 述 组 合 物 含 有 : (1) 大 黄 酸 活 性 物 质, 其 中 所 述 大 黄 酸 活 性 物 质 包 括 : 大 黄 酸 其 生 理 学 上 或 药 学 上 可 接 受 的 盐 或 酯 其 水 合 物 或 它 们 的 混 合 物 ; -3-
5 (2) 选 自 下 组 的 一 种 或 多 种 预 防 控 制 或 治 疗 脂 肪 肝 的 其 它 活 性 物 质 : 氯 贝 特 类 胆 碱 蛋 氨 酸 烟 酸 类 熊 去 氧 胆 酸 其 它 具 有 降 血 脂 的 作 用 的 中 草 药 或 它 们 的 混 合 物 ; (3) 药 学 上 可 接 受 的 载 体 或 食 品 学 上 可 接 受 的 载 体 在 本 发 明 的 另 一 优 选 例 中, 所 述 其 它 活 性 物 质 选 自 : 抗 氧 化 剂 胰 岛 素 增 敏 剂 保 肝 药 降 脂 药 减 肥 药 或 它 们 的 组 合 在 本 发 明 的 一 个 优 选 例 中, 所 述 其 它 活 性 物 质 选 自 : 维 生 素 E 维 生 素 C 甜 菜 碱 二 甲 双 胍 噻 唑 烷 二 酮 普 罗 布 考 氯 贝 特 类 吉 非 罗 齐 糖 皮 质 激 素 水 飞 蓟 素 奥 利 司 他 黄 连 素 胆 碱 蛋 氨 酸 烟 酸 或 它 们 的 组 合 在 本 发 明 的 另 一 优 选 例 中, 所 述 其 它 具 有 降 血 脂 的 作 用 的 中 草 药 选 自 : 何 首 乌 丹 参 泽 泻 川 芎 决 明 子 山 楂 在 本 发 明 的 一 个 实 施 方 式 中, 所 述 活 性 物 质 大 黄 酸 占 组 合 物 总 重 量 的 0.001~99.9wt% 在 本 发 明 的 一 个 优 选 例 中, 大 黄 酸 占 组 合 物 总 重 量 的 1~95wt%, 较 优 选 为 5~ 90wt%, 更 优 选 ~80wt% 在 本 发 明 的 另 一 个 实 施 方 式 中, 所 述 组 合 物 是 药 物 组 合 物 保 健 品 组 合 物 食 物 组 合 物 或 膳 食 添 加 剂 附 图 说 明 图 1: 采 用 蛋 白 质 印 迹 法 检 测 大 黄 酸 对 DIO 小 鼠 肝 脏 中 SREBP1 及 其 靶 基 因 FAS ACC 的 蛋 白 表 达 量 的 影 响 其 中 1 2 为 对 照 组,3 4 为 大 黄 酸 组,β- 肌 动 蛋 白 为 内 参 30 具 体 实 施 方 式 本 发 明 人 经 过 广 泛 而 深 入 的 研 究, 首 次 发 现 天 然 中 药 大 黄 中 的 提 取 物 大 黄 酸 对 DIO 小 鼠 ( 饮 食 导 致 的 肥 胖 模 型 鼠 ) 和 db/db 小 鼠 ( 瘦 素 受 体 人 为 缺 失 的 遗 传 性 肥 胖 和 糖 尿 病 模 型 鼠 ) 模 型 可 起 到 改 善 和 治 疗 脂 肪 肝 的 效 果 在 此 基 础 上 完 成 了 本 发 明 具 体 而 言, 发 明 人 使 用 DIO 小 鼠 ( 饮 食 导 致 的 肥 胖 模 型 鼠 ) 和 db/db 小 鼠 ( 瘦 素 受 体 人 为 缺 失 的 遗 传 性 肥 胖 和 糖 尿 病 模 型 鼠 )2 种 小 鼠 作 为 动 物 模 型, 在 经 过 4 周 的 大 黄 酸 的 强 饲 法 喂 食 后,DIO 和 db/db 小 鼠 肝 脏 内 的 甘 油 三 酯 水 平 都 明 显 降 -4-
5 低, 下 降 了 约 41% 左 右, 同 时 DIO 小 鼠 血 清 中 谷 丙 转 氨 酶 ( 代 表 肝 功 能 损 伤 的 标 志 性 酶 ) 水 平 明 显 降 低 此 外, 蛋 白 质 印 迹 检 测 蛋 白 质 水 平 的 变 化 证 明 大 黄 酸 能 明 显 抑 制 SREBP1 的 表 达, 进 而 抑 制 靶 基 因 FAS ACC 的 表 达, 减 少 肝 脏 内 甘 油 三 酯 的 合 成, 从 而 达 到 改 善 和 治 疗 脂 肪 肝 的 目 由 此 证 明 了 大 黄 酸 改 善 和 治 疗 脂 肪 肝 的 显 著 效 果, 并 明 确 了 大 黄 酸 的 作 用 机 制 大 黄 酸 活 性 物 质 如 本 发 明 所 用, 术 语 大 黄 酸 活 性 成 分 和 大 黄 酸 活 性 物 质 可 互 换 使 用, 是 指 具 有 如 下 结 构 式 的 化 合 物 ( 即 大 黄 酸 ) 其 生 理 学 可 接 受 的 或 药 学 上 可 接 受 的 盐 或 酯 水 合 物 或 它 们 的 混 合 物 在 本 发 明 中, 对 于 制 备 大 黄 酸 活 性 物 质 的 方 法 没 有 特 别 的 限 制, 比 如 其 可 以 提 取 自 植 物, 或 者 可 以 采 用 化 学 合 成 的 方 法 来 制 备, 只 要 其 具 有 上 述 结 构 一 种 优 选 的 方 法 是 从 植 物 中 提 取 大 黄 酸 活 性 物 质, 优 选 的 植 物 为 中 药 大 黄 大 黄 酸 活 性 物 质 的 改 善 和 治 疗 脂 肪 肝 的 效 果 及 用 途 大 黄 酸 以 往 的 研 究 集 中 于 抗 癌 治 疗 骨 性 关 节 炎 和 抑 制 肝 纤 维 化 等 方 面 的 研 究, 目 前 还 没 有 关 于 其 在 改 善 和 治 疗 脂 肪 肝 方 面 的 研 究 报 道 本 发 明 的 发 明 人 出 乎 意 料 地 发 现 大 黄 酸 对 于 改 善 脂 肪 肝 血 清 和 肝 脏 生 化 指 标 以 及 调 控 SREBP1 表 达 均 有 显 著 的 效 果, 因 此 可 用 于 改 善 和 治 疗 脂 肪 肝 为 了 研 究 大 黄 酸 活 性 物 质 对 脂 肪 肝 的 防 治 效 果, 发 明 人 对 施 用 大 黄 酸 后 的 DIO 小 鼠 和 db/db 小 鼠 的 血 清 和 肝 脏 生 化 指 标 以 及 SREBP1 表 达 进 行 了 研 究 本 发 明 证 实 了 大 黄 酸 可 以 有 效 降 低 模 型 小 鼠 肝 脏 中 甘 油 三 酯 和 血 清 中 谷 丙 转 氨 酶 的 水 平 由 于 它 是 天 然 植 物 中 含 有 的 物 质, 因 此 安 全 性 高, 可 作 为 一 种 安 全 可 靠 的 防 治 脂 肪 肝 的 活 性 物 质 此 外, 大 黄 酸 对 脂 肪 肝 有 显 著 的 改 善 和 防 治 效 果, 其 还 可 用 于 预 防 治 疗 和 控 制 与 脂 肪 肝 相 关 的 疾 病, 例 如 但 不 限 于 : 谷 丙 转 氨 酶 (ALT) 上 升 肝 损 伤 -5-
5 肥 胖 糖 尿 病 胰 岛 素 抵 抗 等 为 此, 本 发 明 提 供 了 大 黄 酸 活 性 物 质 在 制 备 预 防 控 制 和 治 疗 与 脂 肪 肝 相 关 的 疾 病 或 症 状 的 药 物 组 合 物 食 物 组 合 物 保 健 品 组 合 物 和 / 或 膳 食 添 加 剂 中 的 用 途 下 文 将 对 这 些 组 合 物 进 行 详 细 描 述 此 外, 本 发 明 的 大 黄 酸 活 性 物 质 还 可 用 于 同 时 产 生 预 防 控 制 和 治 疗 脂 肪 肝 和 肥 胖 的 双 重 效 果 30 组 合 物 本 发 明 还 提 供 了 一 种 组 合 物, 所 述 的 组 合 物 含 有 有 效 量 的 大 黄 酸 活 性 物 质, 以 及 食 品 学 或 药 学 上 可 接 受 的 载 体 如 本 文 所 用, 术 语 含 有 或 包 括 包 括 了 包 含 基 本 上 由 构 成 和 由 构 成 如 本 文 所 用, 术 语 药 学 上 可 接 受 的 或 食 品 学 上 可 接 受 的 的 成 分 是 适 用 于 人 和 / 或 动 物 而 无 过 度 不 良 副 反 应 ( 如 毒 性 刺 激 和 变 态 反 应 ) 的, 即 有 合 理 的 效 益 / 风 险 比 的 物 质 如 本 文 所 用, 术 语 本 发 明 的 组 合 物 包 括 药 物 组 合 物 食 物 组 合 物 保 健 品 组 合 物 和 / 或 膳 食 添 加 剂 如 本 文 所 用, 术 语 有 效 量 是 指 可 对 人 和 / 或 动 物 产 生 功 能 或 活 性 的 且 可 被 人 和 / 或 动 物 所 接 受 的 量 如 本 文 所 用, 术 语 药 学 上 可 接 受 的 载 体 指 用 于 治 疗 剂 给 药 的 载 体, 包 括 各 种 赋 形 剂 和 稀 释 剂 该 术 语 指 这 样 一 些 药 剂 载 体 : 它 们 本 身 并 不 是 必 要 的 活 性 成 分, 且 施 用 后 没 有 过 分 的 毒 性 合 适 的 载 体 是 本 领 域 普 通 技 术 人 员 所 熟 知 的 在 雷 明 顿 药 物 科 学 (Remington s Pharmaceutical Sciences,Mack Pub. Co.,N.J. 1991) 中 可 找 到 关 于 药 学 上 可 接 受 的 赋 形 剂 的 充 分 讨 论 本 发 明 的 组 合 物 还 可 作 为 一 种 食 物 或 膳 食 添 加 剂, 直 接 服 用 或 添 加 到 其 它 食 品 中 服 用 优 选 的, 所 述 的 食 品 上 学 可 接 受 的 载 体 选 自 : 填 充 剂 崩 解 剂 润 滑 剂 助 流 剂 泡 腾 剂 矫 味 剂 包 覆 材 料 膳 食 制 品 赋 形 剂 或 缓 / 控 释 剂 在 组 合 物 中 药 学 上 可 接 受 的 载 体 可 含 有 液 体, 如 水 盐 水 甘 油 和 乙 醇 另 外, 这 些 载 体 中 还 可 能 存 在 辅 助 性 的 物 质, 如 填 充 剂 崩 解 剂 润 滑 剂 助 流 剂 泡 腾 剂 润 湿 剂 或 乳 化 剂 矫 味 剂 ph 缓 冲 物 质 等 通 常, 可 将 这 些 物 -6-
5 30 质 配 制 于 无 毒 的 惰 性 的 和 药 学 上 可 接 受 的 水 性 载 体 介 质 中, 其 中 ph 通 常 约 为 5-8, 较 佳 地,pH 约 为 6-8 本 发 明 的 组 合 物 中 可 含 有 大 黄 酸 大 黄 酸 的 生 理 学 可 接 受 的 盐 或 药 学 上 可 接 受 的 盐 水 合 物 或 它 们 的 混 合 物 本 发 明 的 组 合 物 中 大 黄 酸 活 性 物 质 有 效 成 分 占 组 合 物 总 重 量 的 0.001~ 99.9wt%; 优 选 为 组 合 物 总 重 量 的 1~95wt%, 较 优 选 为 5~90wt%, 更 优 选 ~ 80wt% 余 量 为 药 学 上 可 接 受 的 载 体 以 及 其 它 添 加 剂 等 物 质 如 本 文 所 用, 术 语 单 位 剂 型 是 指 为 了 服 用 方 便, 将 本 发 明 的 组 合 物 制 备 成 单 次 服 用 所 需 的 剂 型, 包 括 但 不 限 于 各 种 固 体 剂 ( 如 片 剂 ) 液 体 剂 胶 囊 剂 缓 释 剂 在 本 发 明 的 另 一 优 选 实 施 方 式 中, 所 述 组 合 物 为 单 位 剂 型 或 多 剂 型, 且 其 中 大 黄 酸 活 性 物 质 的 含 量 为 0.01~00mg/ 剂 在 本 发 明 的 一 个 优 选 例 中, 大 黄 酸 活 性 物 质 的 含 量 为 0.01-5.0mg/ 剂, 更 优 选 为 0.05~4.0mg/ 剂, 进 一 步 优 选 含 有 0.1~3.0mg/ 剂 ; 最 优 选 的 含 有 大 黄 酸 活 性 物 质 0.2~2.0mg/ 剂 在 本 发 明 的 另 一 个 优 选 例 中, 大 黄 酸 活 性 物 质 的 含 量 为 5.0~0mg/ 剂 ; 更 优 选 ~0mg/ 剂, 进 一 步 优 选 ~0mg/ 剂, 更 优 选 30~ 0mg/ 剂 ; 最 优 选 的, 含 有 大 黄 酸 活 性 物 质 40~70mg/ 剂 在 本 发 明 的 另 一 个 优 选 例 中, 大 黄 酸 活 性 物 质 的 含 量 为 0~00mg/ 剂 ; 更 优 选 300~00mg/ 剂, 进 一 步 优 选 500~10mg/ 剂, 更 优 选 750~10mg/ 剂 ; 最 优 选 的, 含 有 大 黄 酸 活 性 物 质 800~00mg/ 剂 在 本 发 明 的 另 一 个 优 选 例 中, 每 天 施 用 1~6 剂 本 发 明 的 组 合 物, 优 选 施 用 1~3 剂 ; 最 优 选 的, 每 天 服 用 的 剂 量 为 1 剂 应 理 解, 所 用 大 黄 酸 活 性 物 质 的 有 效 剂 量 可 随 待 施 用 或 治 疗 的 对 象 的 严 重 程 度 而 变 化 具 体 情 况 根 据 对 象 的 个 体 情 况 ( 例 如 对 象 体 重 年 龄 身 体 状 况 所 需 达 到 的 效 果 ) 来 决 定, 这 在 熟 练 医 师 或 营 养 师 可 以 判 断 的 范 围 内 本 发 明 的 组 合 物, 可 以 为 固 态 ( 如 颗 粒 剂 片 剂 冻 干 粉 栓 剂 胶 囊 舌 下 含 片 ) 或 液 态 ( 如 口 服 液 ) 或 其 它 合 适 的 形 状 此 外, 本 发 明 的 组 合 物 中 还 可 含 有 用 于 改 善 和 治 疗 脂 肪 肝 的 其 它 活 性 物 质, 所 述 的 其 它 活 性 物 质 选 自 下 组 : 抗 氧 化 剂 胰 岛 素 增 敏 剂 保 肝 药 降 脂 药 减 肥 药 或 它 们 的 组 合 例 如, 所 述 其 它 活 性 物 质 可 选 自 : 维 生 素 E 维 生 素 C 甜 菜 碱 二 甲 双 胍 噻 唑 烷 二 酮 普 罗 布 考 氯 贝 特 类 吉 非 罗 齐 糖 皮 质 激 素 -7-
水 飞 蓟 素 奥 利 司 他 黄 连 素 胆 碱 蛋 氨 酸 烟 酸 类 等 或 它 们 的 组 合 本 发 明 的 组 合 物 中 还 可 含 有 其 它 降 血 脂 的 中 草 药, 例 如 何 首 乌 丹 参 泽 泻 川 芎 决 明 子 山 楂 等 5 施 用 方 式 本 发 明 的 组 合 物 可 以 通 过 常 规 途 径 施 用, 其 中 包 括 ( 但 并 不 限 于 ): 口 服 肌 注 皮 下 注 射 等 优 选 口 服 施 用 组 合 物 形 式 应 与 施 用 方 式 相 匹 配 本 发 明 组 合 物 的 施 用 量, 按 活 性 物 质 计 算, 通 常 为 每 天 约 0.01-00mg/60kg 体 重 / 天, 较 佳 地 约 0.05~00mg/60kg 体 重 / 天, 更 优 选 为 0.1~00mg/60kg 体 重 / 天, 最 优 选 为 1~500mg/60kg 体 重 / 天 本 发 明 的 组 合 物 可 直 接 使 用, 也 可 与 其 它 治 疗 剂 或 辅 剂 联 合 使 用 在 本 发 明 的 优 选 实 施 方 式 中, 本 发 明 组 合 物 还 可 与 有 效 量 ( 如 0.5-0mg/60kg 体 重 / 天 ; 优 选 的, 为 1-50mg/60kg 体 重 / 天 ) 的 选 自 下 组 的 物 质 联 合 施 用 : 抗 氧 化 剂 胰 岛 素 增 敏 剂 保 肝 药 降 脂 药 减 肥 药 或 它 们 的 组 合 例 如, 其 它 活 性 物 质 可 选 自 : 维 生 素 E 维 生 素 C 甜 菜 碱 二 甲 双 胍 噻 唑 烷 二 酮 普 罗 布 考 氯 贝 特 类 吉 非 罗 齐 糖 皮 质 激 素 水 飞 蓟 素 奥 利 司 他 黄 连 素 胆 碱 蛋 氨 酸 烟 酸 类 等 或 它 们 的 组 合 本 发 明 的 组 合 物 中 还 可 含 有 其 它 降 血 脂 的 中 草 药, 例 如 何 首 乌 丹 参 泽 泻 川 芎 决 明 子 山 楂 等 当 两 种 或 两 种 以 上 的 药 物 联 合 给 药 时, 一 般 具 有 优 于 两 种 药 物 分 别 单 独 给 药 的 效 果 优 选 地, 联 合 施 用 的 药 物 或 其 它 制 剂 不 干 扰 本 发 明 大 黄 酸 活 性 物 质 有 效 成 分 的 治 疗 活 性 30 本 发 明 的 优 点 本 发 明 具 有 以 下 优 点 : 1. 大 黄 酸 是 一 种 植 物 中 天 然 存 在 的 化 合 物, 其 具 有 较 高 的 安 全 性 和 优 良 的 药 物 代 谢 特 性 ; 2. 大 黄 酸 在 以 往 的 研 究 中 已 应 用 于 防 治 癌 症 等 疾 病 的 防 治 中, 因 此 容 易 为 市 场 所 接 受 ; 3. 本 发 明 中 大 黄 酸 改 善 和 治 疗 脂 肪 肝 的 效 果 明 显 机 理 明 确 适 合 作 为 新 型 药 物 食 物 保 健 品 和 / 或 膳 食 添 加 剂 中 的 活 性 物 质 -8-
实 施 例 下 面 结 合 具 体 实 施 例, 进 一 步 阐 述 本 发 明 应 理 解, 这 些 实 施 例 仅 用 于 说 明 本 发 明 而 不 用 于 限 制 本 发 明 的 范 围 下 列 实 施 例 中 未 注 明 具 体 条 件 的 实 验 方 法, 通 常 按 照 常 规 条 件 ( 例 如 可 参 考 通 常 按 照 常 规 条 件 如 Sambrook 等 人, 分 5 子 克 隆 : 实 验 室 指 南 (New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989) 中 所 述 的 条 件 ) 或 按 照 制 造 厂 商 所 建 议 的 条 件 除 非 另 外 说 明, 否 则 百 分 比 和 份 数 按 重 量 计 算 除 非 另 行 定 义, 文 中 所 使 用 的 所 有 专 业 与 科 学 用 语 与 本 领 域 熟 练 人 员 所 熟 悉 的 意 义 相 同 此 外, 任 何 与 所 记 载 内 容 相 似 或 均 等 的 方 法 及 材 料 皆 可 应 用 于 本 发 明 中 文 中 所 述 的 较 佳 实 施 方 法 与 材 料 仅 作 示 范 之 用 实 施 例 1. 大 黄 酸 对 肥 胖 模 型 DIO 鼠 肝 脏 中 甘 油 三 酯 合 成 的 抑 制 作 用 DIO 小 鼠 模 型 ( 饮 食 导 致 的 肥 胖 模 型 鼠 ) 的 建 立 从 上 海 斯 莱 克 动 物 中 心 购 买 C57BL/6J 雌 性 小 鼠 (8 周 龄, 体 重 g) 将 小 鼠 控 制 在 恒 温 (22-23 ) 和 12 小 时 昼 夜 循 环 条 件 下 将 小 鼠 随 机 分 成 高 脂 饲 料 组 和 对 照 饲 料 组, 其 中 给 高 脂 饲 料 组 小 鼠 喂 食 高 脂 饲 料 ( 脂 肪 含 量 60%,Research Diets,New Brunswick,NJ,D12492), 而 给 对 照 饲 料 组 小 鼠 喂 食 对 照 饲 料 ( 脂 肪 含 量 %,Research Diets,New Brunswick, NJ,D12450) 经 过 12 周 的 喂 养, 高 脂 饲 料 组 的 小 鼠 体 重 是 对 照 饲 料 组 的 2 倍, 同 时 血 脂 和 肝 脏 中 脂 肪 含 量 均 明 显 增 高, 血 清 中 ALT 的 含 量 增 加 了 3 倍, 表 明 已 成 功 诱 导 形 成 了 肥 胖 和 脂 肪 肝 模 型 实 验 方 法 将 高 脂 饲 料 组 肥 胖 小 鼠 分 成 2 组 : 一 组 为 对 照 组, 强 饲 法 喂 水 ; 另 一 组 为 大 黄 酸 组, 强 饲 法 喂 食 大 黄 酸 0mg/kg/ 天 连 续 4 周 后, 将 小 鼠 麻 醉 后 心 脏 取 血, 取 肝 脏, 取 一 部 分 称 重 后 用 细 胞 裂 解 液 裂 解, 用 氯 仿 抽 提 后 于 通 风 橱 内 晾 干, 加 0ul 异 丙 醇 溶 解 血 清 和 肝 脏 的 生 化 指 标 用 全 自 动 生 化 分 析 仪 (HITACHI 70) 检 测 30 实 验 结 果 经 过 连 续 4 周 强 饲 法 喂 食 后, 与 对 照 组 肥 胖 小 鼠 相 比, 大 黄 酸 组 肥 胖 小 鼠 -9-
5 肝 脏 中 的 甘 油 三 酯 的 含 量 明 显 减 少, 从 每 毫 克 2.56mmol/L 左 右 降 低 到 每 毫 克 1.49mmol/L 左 右, 减 少 了 42%, 同 时 血 清 中 谷 丙 转 氨 酶 的 含 量 从 138.87IU/L 降 到 了 60.63IU/L, 降 低 了 1.3 倍 实 验 结 果 示 于 下 表 1 中, 表 中 各 缩 写 含 义 如 下 : N-Cont: 对 照 饲 料 组 ;HF-Cont: 高 脂 饲 料 对 照 组 ;HF+RH0: 高 脂 饲 料 + 大 黄 酸 组 ;TG: 甘 油 三 酯 ;TC: 总 胆 固 醇 ;HDL-C: 高 密 度 脂 蛋 白 胆 固 醇 ;LDL-C: 低 密 度 脂 蛋 白 胆 固 醇 ;ALT: 谷 丙 转 氨 酶 表 1. 大 黄 酸 处 理 对 DIO 小 鼠 血 清 和 肝 脏 的 生 化 指 标 的 影 响 (n=5) N-Cont HF-Cont HF+RH0 TG(mmol/L) 0.07±0.01 0.09±0.03 0.21±0.07 TC(mmol/L) 1.62±0.1 3.27±0.52 2.63±0.21* HDL-C(mmol/L) 1.24±0.11 2.78±0.44 2.22±0.17* LDL-C(mmol/L) 0.36±0.02 0.53±0.1 0.35±0.09** ALT(IU/L) 46.77±5.19 138.87±27.62 60.63±.94** 肝 脏 TG(mmol/mg) 0.78±0.36 2.56±0.4 1.49±0.4** 肝 脏 TC(mmol/mg) 0.24±0.1 0.3±0.02 0.23±0.02** *p<0.05 代 表 与 对 照 组 相 比 具 有 显 著 差 异, **p<0.01 代 表 与 对 照 组 相 比 具 有 极 显 著 差 异 结 果 表 明 大 黄 酸 能 显 著 降 低 肥 胖 小 鼠 肝 脏 中 甘 油 三 酯 的 含 量, 减 少 脂 肪 在 肝 脏 中 的 积 累, 且 能 降 低 血 清 谷 丙 转 氨 酶 的 水 平, 明 显 改 善 小 鼠 的 肝 功 能, 可 以 用 于 改 善 和 治 疗 脂 肪 肝 实 施 例 2. 大 黄 酸 对 DIO 小 鼠 肝 脏 中 SREBP1 及 其 靶 基 因 的 蛋 白 表 达 量 的 影 响 实 验 方 法 如 实 施 例 1 所 述 的 方 法 建 立 DIO 小 鼠 模 型 给 药 和 取 样, 将 一 部 分 样 品 用 样 品 缓 冲 液 (sample buffer) 裂 解 后 以 蛋 白 质 印 迹 法 检 测 蛋 白 质 的 表 达 实 验 结 果 蛋 白 质 印 迹 结 果 如 图 1 所 示 与 对 照 组 相 比, 经 过 4 周 大 黄 酸 强 饲 法 喂 食 的 DIO 小 鼠 的 肝 脏 中 控 制 脂 肪 合 成 的 关 键 核 转 录 因 子 SREBP1 及 其 靶 基 因 脂 肪 酸 合 成 酶 (FAS) 乙 酰 辅 酶 A 羧 化 酶 (ACC) 的 蛋 白 表 达 量 均 显 著 减 少 了 --
5 结 果 表 明 大 黄 酸 能 显 著 减 少 DIO 小 鼠 肝 脏 中 SREBP1 及 其 靶 基 因 因 FAS ACC 的 蛋 白 表 达 量 已 知 SREBP-1 控 制 体 内 的 脂 肪 合 成,SREBP-1 基 因 表 达 量 的 上 调 增 加 了 脂 肪 的 合 成, 同 时 也 是 形 成 脂 肪 肝 的 分 子 基 础 大 黄 酸 对 SREBP-1 及 其 靶 基 因 的 表 达 具 有 抑 制 作 用, 因 而 可 由 此 减 少 脂 肪 的 合 成, 改 善 和 治 疗 脂 肪 肝 这 与 实 施 例 1 中 所 得 的 结 果 是 相 符 的 实 施 例 3. 大 黄 酸 对 db/db 小 鼠 肝 脏 中 甘 油 三 酯 合 成 的 抑 制 作 用 db/db 小 鼠 ( 瘦 素 受 体 人 为 缺 失 的 遗 传 性 肥 胖 和 糖 尿 病 模 型 鼠 ) 从 美 国 Jackson 实 验 室 (Bar Harbor, ME 04609) 购 买 db/db (C57BL BKS cg-m+/+ lepr-/-) 小 鼠 将 小 鼠 控 制 在 恒 温 (22-23 ) 和 12 小 时 昼 夜 循 环 条 件 下 繁 殖 后 挑 选 12 周 大 的 db/db 小 鼠 共 12 只, 分 成 2 组, 每 组 6 只 : 一 组 为 对 照 组, 另 一 组 为 大 黄 酸 组 实 验 方 法 各 组 以 普 通 食 物 喂 养, 对 照 组 以 强 饲 法 喂 水, 而 大 黄 酸 组 以 强 饲 法 喂 食 大 黄 酸 0mg/kg/ 天 连 续 4 周 后 将 小 鼠 麻 醉 后 心 脏 取 血, 取 肝 脏, 取 一 部 分 称 重 后 用 细 胞 裂 解 液 裂 解, 用 氯 仿 抽 提 后 于 通 风 橱 内 晾 干, 加 0ul 异 丙 醇 溶 解 血 清 和 肝 脏 的 生 化 指 标 用 全 自 动 生 化 分 析 仪 (HITACHI 70) 检 测 实 验 结 果 经 过 连 续 4 周 强 饲 法 喂 食, 与 对 照 组 相 比, 大 黄 酸 组 db/db 小 鼠 肝 脏 中 的 甘 油 三 酯 的 含 量 明 显 减 少, 从 每 毫 克 1.66mmol/L 左 右 降 低 到 每 毫 克 0.98mmol/L 左 右, 减 少 了 41% 实 验 结 果 示 于 下 表 2 中, 表 中 各 缩 写 含 义 如 下 :Cont: 对 照 组 ;RH0: 大 黄 酸 组 ;TG: 甘 油 三 酯 ;TC: 总 胆 固 醇 ;HDL-C: 高 密 度 脂 蛋 白 胆 固 醇 ;LDL-C: 低 密 度 脂 蛋 白 胆 固 醇 ;ALT: 谷 丙 转 氨 酶 -11-
表 2. 大 黄 酸 处 理 对 db/db 小 鼠 血 清 和 肝 脏 的 生 化 指 标 的 影 响 Cont RH0 TG(mmol/L) 0.37±0.14 0.51±0.1 TC(mmol/L) 2.96±0.48 2.33±0.32 HDL-C(mmol/L) 2.57±0.39 2.02±0.3 LDL-C(mmol/L) 0.21±0.04 0.18±0.03 肝 脏 TG(mmol/mg) 1.66±0.64 0.98±0.41* 肝 脏 TC(mmol/mg) 0.11±0.03 0.07±0.02 *p<0.05 代 表 与 对 照 组 相 比 具 有 统 计 学 上 的 显 著 性 差 异 5 实 验 结 果 表 明 大 黄 酸 也 能 显 著 降 低 蛋 白 db/db 小 鼠 肝 脏 中 甘 油 三 酯 的 含 量, 减 少 脂 肪 在 肝 脏 中 的 积 累, 可 用 于 改 善 和 治 疗 脂 肪 肝 实 施 例 4. 大 黄 酸 盐 或 酯 对 脂 肪 肝 的 改 善 和 治 疗 作 用 用 以 大 黄 酸 重 量 为 基 准 计 等 量 的 大 黄 酸 钠 大 黄 酸 钾 大 黄 酸 乙 酯 代 替 实 施 例 1-3 中 的 大 黄 酸 进 行 实 施 例 1-3 中 的 实 验 实 验 结 果 表 明 大 黄 酸 的 盐 和 酯 具 有 与 大 黄 酸 相 同 或 类 似 的 改 善 和 治 疗 脂 肪 肝 的 作 用 在 本 发 明 提 及 的 所 有 文 献 都 在 本 申 请 中 引 用 作 为 参 考, 就 如 同 每 一 篇 文 献 被 单 独 引 用 作 为 参 考 那 样 此 外 应 理 解, 在 阅 读 了 本 发 明 的 上 述 讲 授 内 容 之 后, 本 领 域 技 术 人 员 可 以 对 本 发 明 作 各 种 改 动 或 修 改, 这 些 等 价 形 式 同 样 落 于 本 申 请 所 附 权 利 要 求 书 所 限 定 的 范 围 -12-
说 明 书 附 图 肌 动 蛋 白 图 1-1-