P3 膠體電泳法

Polyacrylamide Gel Electrophoresis 聚 丙 烯 醯 胺 膠 体 電 泳 莊 榮 輝 3.1 電 泳 原 理 帶 電 分 子 在 電 場 中 能 夠 移 動, 稱 作 泳 動, 泳 動 的 程 度 稱 為 泳 動 率 (mobility).. 泳 動 率 ~ ( 所 外 加 電 壓 mv) ( 分 子 之 淨 電 荷 ) 分 子 與 介 質 間 之 摩 擦 力 上 述 之 摩 擦 力, 決 定 於 此 分 子 之 大 小 形 狀 分 子 量 大 者 摩 擦 力 大, 泳 動 率 小 ; 球 形 分 子 摩 擦 力 較 小, 泳 動 率 大 而 分 子 在 環 境 ph 的 影 響 下, 可 能 帶 不 同 淨 電 荷 : 當 環 境 ph = 分 子 之 pi 時, 此 分 子 之 淨 電 荷 為 零 (pi 為 等 電 點 ); 當 環 境 ph < 分 子 之 pi 時, 此 分 子 之 淨 電 荷 為 正 ; 當 環 境 ph > 分 子 之 pi 時, 此 分 子 之 淨 電 荷 為 負 電 泳 系 統 中, 電 子 由 負 極 流 向 正 極 ; 帶 負 電 的 分 子 往 正 極 跑, 帶 正 電 的 分 子 往 負 極 跑, 不 帶 電 者 則 不 動 大 部 分 電 泳 系 統 的 ph 定 在 8.3, 在 此 ph 下 凡 是 pi 小 於 8.3 的 分 子 均 帶 負 電 荷, 都 可 以 往 正 極 跑 3.1.1 電 泳 的 發 展 電 泳 需 有 一 介 質, 作 為 電 泳 之 場 所 最 早 是 在 溶 液 中 進 行, 但 因 在 溶 液 擴 散 現 象 嚴 重, 故 改 用 固 相 的 濾 紙 ; 但 又 因 濾 紙 與 分 子 間 摩 擦 力 太 大, 後 來 多 改 用 半 固 態 的 膠 体, 如 聚 丙 烯 醯 胺 膠 体 (polyacrylamide gel) 洋 菜 醣 (agarose) 或 澱 粉 (starch) 蛋 白 質 電 泳 以 聚 丙 烯 醯 胺 膠 体 應 用 最 廣, 其 中 又 以 膠 体 有 無 加 入 SDS, 分 為 SDS-PAGE 及 non-denaturing PAGE ( 原 態 電 泳 ) SDS 為 一 種 介 面 活 性 劑, 會 破 壞 分 子 構 形, 並 在 分 子 表 面 均 勻 塗 佈 一 層 SDS 負 電 分 子, 蛋 白 質 分 子 不 論 原 來 帶 正 或 負 電, 均 可 往 正 極 跑, 泳 動 率 與 分 子 量 成 反 比 因 此 SDS-PAGE 可 用 來 測 定 蛋 白 質 的 分 子 量, 但 所 測 得 的 是 變 性 狀 態 (denatured) 之 分 子 量, 與 原 態 (native) 分 子 量 可 能 不 同 不 加 SDS 之 non-denaturing PAGE, 則 泳 動 率 與 其 分 子 之 電 荷 分 子 大 小 分 子 形 狀 等 均 有 關 係, 較 難 預 測 生 物 化 學 實 驗 -1

3.1.2 聚 丙 烯 醯 胺 膠 体 1) 膠 体 組 成 之 主 要 成 分 : 聚 丙 烯 醯 胺 膠 体 的 形 成, 是 由 單 体 分 子 經 聚 合 反 應, 成 為 高 分 子 聚 合 物, 並 以 架 橋 分 子, 交 錯 連 結 成 三 次 元 的 半 固 体 膠 体 a) 單 体 (monomer): 丙 烯 醯 胺 (acrylamide),ch 2 =CH-CO-CH 2 b) 架 橋 (bridge):bis, [N, N'-methylene-bis(acrylamide)] 可 看 作 兩 個 丙 烯 醯 胺 單 体 分 子 連 結 在 一 起, 可 形 成 分 叉 點, 以 構 成 立 體 結 構 c) 自 由 基 (free radical) 產 生 者 : 過 硫 酸 銨 (ammonium persulfate, APS) 或 riboflavin ( 即 維 生 素 BB2) d) 催 化 劑 :TEMED (tetramethylenediamine) 幫 助 自 由 基 電 子 的 傳 遞 2) 鑄 膠 (gel casting): 是 一 種 自 由 基 的 聚 合 反 應, 大 致 有 下 列 幾 個 反 應 a) 自 由 基 形 成 : 靠 上 述 游 基 產 生 者 自 動 生 成 游 基, 再 引 發 連 鎖 反 應 b) 聚 合 反 應 : 單 体 分 子 首 尾 相 接, 以 連 鎖 反 應 形 成 大 分 子 的 長 鏈 c) 交 錯 連 結 : 若 架 橋 分 子 Bis 加 入 聚 合 反 應, 則 可 形 成 網 狀 三 次 元 結 構 3) 膠 体 的 一 些 性 質 : 構 成 的 網 狀 三 次 元 結 構 膠 体, 因 為 其 中 所 含 單 体 與 架 橋 分 子 濃 度 的 不 同, 而 有 各 種 不 同 孔 隙 的 膠 体 蛋 白 質 分 子 在 膠 体 中 的 泳 動 率, 會 受 膠 体 孔 隙 大 小 的 影 響 在 孔 隙 中 的 空 間, 則 由 緩 衝 液 填 充, 除 了 維 持 ph 外, 更 作 為 電 流 之 傳 導 媒 介 3.1.3 電 泳 系 統 的 解 析 1) 以 化 學 組 成 看 來, 電 泳 系 統 可 分 為 五 個 部 分 : 表 -1 電 泳 系 統 的 組 成 電 泳 系 統 緩 衝 液 ph 膠 体 濃 度 1 上 層 ( 負 極 ) 緩 衝 液 Tris-Gly 8.3 無 2 樣 本 溶 液 Tris-Gly 8.3 無 3 膠 焦 集 膠 体 Tris-HCl 6.9 4% 4 体 分 離 膠 体 Tris-HCl 8.9 5~20% 5 下 層 ( 正 極 ) 緩 衝 液 Tris-Gly 8.3 無 只 有 3, 4 兩 部 分 是 膠 体 ; 各 層 的 緩 衝 液 種 類 不 盡 相 同, 其 ph 也 有 點 差 異 注 意 (3) 膠 集 膠 体 的 ph 較 低 (ph 6.9, 是 Gly 的 pi) 這 些 差 異 造 成 一 個 很 重 要 的 效 果 : 在 樣 本 通 過 焦 集 膠 体 時, 產 生 焦 集 作 用, 使 原 本 体 積 相 當 大 的 樣 本 溶 液, 聚 集 成 一 薄 層, 可 增 加 解 析 度 2) 以 傳 統 的 直 立 式 柱 狀 膠 体 電 泳 為 例, 電 泳 膠 柱 如 圖 -1 所 組 成, 玻 璃 管 內 的 下 方 為 分 離 膠 体 (4), 其 上 則 為 焦 集 膠 体 (3) 焦 集 膠 体 上 方 的 空 間 (2), 可 供 灌 注 樣 本 溶 液 ; 膠 柱 上 下 兩 端, 分 別 接 兩 極 的 緩 衝 液 槽 (1 及 5) 連 接 電 源 除 -2 Biochemistry Laboratory

柱 狀 電 泳 外 尚 有 平 板 式 電 泳, 可 分 直 立 式 或 水 平 式 應 用 在 蛋 白 質 時, 以 直 立 平 板 式 的 聚 丙 烯 醯 胺 膠 体 為 多 ; 在 核 酸 則 以 水 平 平 板 式 洋 菜 醣 膠 体 較 普 遍 3) 焦 集 膠 体 的 焦 集 作 用 及 其 作 用 機 理 : 參 閱 附 圖 -2 - + Upper chamber - (1) Sample (2) Stacking gel (3) Cooling water Lower chamber + + (5) Running gel (4) Gel tube 圖 -1 直 立 式 柱 狀 電 泳 裝 置 與 膠 柱 組 成 直 立 式 柱 狀 膠 體 電 泳 是 最 早 的 電 泳 方 式 之 一, 在 玻 璃 管 中 分 別 注 入 分 離 膠 體 與 焦 集 膠 體, 右 下 角 為 膠 柱 的 組 成 方 式 a) 樣 本 分 子 能 被 焦 集 成 一 薄 層, 注 意 下 面 三 種 分 子, 在 電 泳 時 的 表 現 : (1) Glycine: 圖 中 以 深 色 圓 點 ( 當 環 境 ph >6.9 時 Gly 帶 負 電 ) 或 白 色 圓 點 ( 當 環 境 ph = 6.9 時 為 不 帶 電 之 zwitterion) 表 示 (2) 樣 本 分 子 ( 有 兩 種 蛋 白 質, 分 別 以 大 小 兩 種 乳 酪 圖 案 表 示 ) (3) 氯 離 子, 以 斜 線 部 分 代 表 b) 注 意 上 述 電 泳 的 五 個 部 分 中, 膠 体 的 緩 衝 液 含 氯 離 子, 沒 有 Gly; 然 而 樣 本 溶 液 中 含 Gly, 沒 有 氯 離 子 c) 再 看 樣 本 溶 液 - 焦 集 膠 体 - 分 離 膠 体 三 段 的 ph 是 不 連 續 的, 其 ph 分 別 為 8.3-6.9-8.9, 注 意 Gly 的 pi 恰 為 6.9 d) 當 電 泳 一 開 始 時,Gly 越 入 焦 集 膠 体 後, 立 刻 變 成 不 帶 電 的 的 分 子 ( 白 點 ), 泳 動 率 變 小 ; 同 時 氯 離 子 則 很 快 的 往 正 極 泳 動, 因 此 在 氯 離 子 與 Gly 之 間 有 一 段 缺 乏 離 子 的 空 間, 電 壓 很 高 e) 然 而 兩 電 極 之 間, 一 定 要 有 負 離 子 來 帶 動 電 流, 此 時 只 有 利 用 蛋 白 質 分 子 來 傳 導, 而 焦 集 膠 体 中 的 孔 隙 又 較 疏, 於 是 蛋 白 質 分 子 在 此 離 子 缺 乏 空 生 物 化 學 實 驗 -3

間, 快 速 往 正 極 泳 動, 一 直 碰 到 氯 離 子 的 尾 端, 而 聚 集 於 斯, 成 一 薄 層, 由 側 面 觀 之 則 成 一 細 線 f) Gly 分 子 慢 慢 通 過 焦 集 膠 体, 又 變 回 負 離 子, 離 子 缺 乏 空 間 瓦 解 ; 樣 本 蛋 白 質 泳 動 到 分 離 膠 体, 膠 体 為 正 常 濃 度, 依 其 分 子 量 電 荷 等 因 素 泳 動 A B C 樣 本 焦 集 膠 体 8.3 6.9 離 子 缺 乏 空 間 分 離 膠 体 8.9 + + 圖 -2 焦 集 膠 體 的 作 用 原 理 由 於 不 連 續 膠 體 能 夠 產 生 一 段 離 子 缺 乏 的 空 間, 使 得 樣 本 分 子 快 速 泳 動, 並 且 擠 在 氯 離 子 界 限 的 尾 端, 因 而 焦 聚 成 一 條 直 線, 產 生 焦 集 的 效 果 3.1.4 實 驗 大 綱 膠 體 電 泳 法 鑄 膠 電 泳 染 色 脫 色 P1 Trypsin 脫 色 焦 集 膠 體 樣 本 處 理 染 色 分 離 膠 體 電 泳 進 行 取 出 膠 體 圖 -3 原 態 膠 體 電 泳 檢 定 的 進 行 流 程 -4 Biochemistry Laboratory

3.2 實 驗 方 法 兩 組 共 同 鑄 造 兩 片 平 板 原 態 電 泳 膠 片, 進 行 各 組 trypsin 及 CHOM 的 樣 本 分 析 3.2.1 儀 器 用 具 a) 鑄 膠 套 件 ( 含 電 泳 玻 片 及 氧 化 鋁 片 ) b) 間 隔 條 (spacer, 0.75 mm) 及 樣 本 梳 (comb, 10 well) c) 垂 直 迷 你 電 泳 槽 (Hoefer SE-250 平 板 式 垂 直 電 泳 槽 ) d) 電 源 供 應 器 (Pharmacia Biotech EPS 200) e) 微 量 針 管 (Hamilton 80465) 或 電 泳 樣 本 專 用 吸 管 頭 f) 染 色 脫 色 方 盒 3.2.2 藥 品 試 劑 a) A 液 (T 30%, C 2.6%): 注 意! 本 溶 液 有 毒 性! 丙 烯 醯 胺 溶 液 acrylamide Bis (N,N -methylene-bis-acrylamide) 加 水 至 50 ml, 若 難 溶 則 稍 微 加 熱 助 溶 之, 儲 存 於 4 14.6 g 0.4 g b) B 液 ( 分 離 膠 體 緩 衝 液 ): Tris TEMED (N,N,N,N -tetramethyl-ethylenediamine) 18.2 g 0.36 ml 用 60 ml 水 溶 解 後, 以 HCl 調 ph 至 8.8 後 加 水 至 100 ml, 儲 存 於 4 c) C 液 ( 焦 集 膠 體 緩 衝 液 ): Tris 0.6 g TEMED 40 μl 用 8 ml 水 溶 解 後, 以 HCl 調 ph 至 6.8 後 加 水 至 10 ml, 儲 存 於 4 d) 通 用 電 泳 緩 衝 液 (5 ): Tris 90 mm 5 54.5 g EDTA 2Na 2.5 mm 5 4.7 g Boric acid 80 mm 5 24.8 g 加 水 800 ml 溶 解, 以 NaOH 調 ph 至 8.4 後, 加 水 至 1,000 ml, 室 溫 保 存 使 用 前 要 以 蒸 餾 水 稀 釋 五 倍 e) APS 溶 液 (ammonium persulfate, 10%): 取 0.1 g 溶 於 1 ml 水, 要 確 實 溶 解 完 全 ; 使 用 前 新 鮮 配 置, 過 夜 者 不 再 用 f) 異 丙 醇 g) 追 蹤 染 料 :Bromophenol Blue (BPB) 1 mg 加 5 ml 水 及 5 ml 甘 油 生 物 化 學 實 驗 -5

h) CBR 染 色 液 :Coomassie Brilliant Blue R-250 1.5 g 加 入 250 ml 水 後 再 加 250 ml 甲 醇 及 50 ml 醋 酸, 過 濾 去 掉 不 溶 物, 置 於 排 煙 櫃 中 公 用 要 回 收 i) 脫 色 液 : 甲 醇 (20%) 及 醋 酸 (10%) 的 水 溶 液, 置 於 排 煙 櫃 中 公 用 3.2.3 鑄 膠 ( 原 態 膠 體 ) 表 -2 各 種 膠 體 溶 液 的 濃 度 ( 單 位 ml) 分 離 膠 体 7.5% 10.0% 12.5% 15.0% 焦 集 膠 體 4% A 液 2.5 3.4 4.2 5.0 A 液 0.7 B 液 2.5 2.5 2.5 2.5 C 液 1.3 水 4.9 4.0 3.2 2.4 水 2.9 APS 0.1 0.1 0.1 0.1 APS 0.1 Total 10.0 10.0 10.0 10.0 Total 5.0 分 離 膠 體 每 支 約 需 2~3 ml, 故 一 組 配 製 10 ml 即 可 1) 將 電 泳 玻 片 及 氧 化 鋁 片 清 洗 淨 後 擦 乾, 再 以 玻 璃 清 潔 劑 擦 拭 乾 淨, 選 擇 所 需 厚 度 間 隔 條 (spacer) 組 裝 於 鑄 膠 套 件, 本 課 程 由 助 教 事 先 準 備 架 好 2) 依 表 -2 所 列 的 各 溶 液 比 例, 選 擇 所 需 的 分 離 膠 體 濃 度, 本 次 實 驗 使 用 12.5% 膠 體 配 置 膠 體 溶 液 時, 其 中 APS 溶 液 必 須 最 後 加 入, 小 心 混 合 均 勻, 並 避 免 氣 泡 產 生, 然 後 以 微 量 吸 管 小 心 注 入 鑄 膠 套 件 3) 膠 體 約 佔 玻 片 的 2/3 至 3/4 高 度, 加 完 後 儘 快 在 膠 體 液 面 上 方 小 心 加 入 100 μl 異 丙 醇 ( 或 蒸 餾 水 ), 以 壓 平 膠 體 液 面 4) 約 30 min 至 1 h 後 ( 天 冷 須 更 久 ), 凝 膠 完 成, 倒 出 上 層 的 異 丙 醇 5) 配 製 焦 集 膠 體 溶 液, 先 準 備 好 所 需 之 樣 本 梳 (comb), 加 入 溶 液 後 立 刻 插 入, 整 個 過 程 必 須 在 5 min 完 成, 約 30 min 可 完 成 凝 膠 6) 拆 下 膠 片 並 清 理, 將 多 餘 的 凝 膠 去 除, 鑄 好 的 膠 片 可 置 封 口 袋 中 於 4 保 存, 但 要 加 入 少 量 蒸 餾 水 防 止 膠 片 乾 裂, 使 用 期 限 約 兩 週 一 組 使 用 一 片 3.2.4 電 泳 1) 若 膠 片 是 在 4 中 保 存, 須 先 取 出 回 復 室 溫 同 時 將 稀 釋 成 一 倍 的 通 用 電 泳 緩 衝 液, 倒 入 電 泳 槽 底 部 然 後 把 膠 片 以 45 度 架 到 電 泳 槽 上, 避 免 附 著 氣 泡 ; 當 電 泳 夾 夾 妥 後, 在 電 泳 玻 片 組 合 的 上 方 槽 內, 加 入 電 泳 緩 衝 液 電 泳 前, 先 以 微 量 針 管 清 洗 各 樣 本 槽, 避 免 有 凝 膠 不 完 全 的 殘 餘 物 留 在 樣 本 槽 內 膠 片 一 定 要 等 回 復 室 溫 後 才 能 架 到 電 泳 槽, 否 則 玻 片 會 因 熱 漲 而 撐 破 2) 取 出 trypsin 樣 本 20 μl, 因 其 中 含 甲 酸 溶 液, 先 加 入 2 μl 1 N NaOH 中 和 之, 然 後 再 加 10 μl 追 蹤 染 料, 混 合 均 勻 後 備 用 CHOM 取 20 μl 只 要 加 入 10 μl -6 Biochemistry Laboratory

追 蹤 染 料 混 合, 不 須 中 和 3) 依 圖 -4 配 置, 以 微 量 針 管 小 心 注 入 樣 本 ( 要 記 錄 體 積 ), 避 免 氣 泡 陷 入 每 個 樣 本 槽 最 多 容 納 20 μl 樣 本,trypsin 樣 本 較 稀, 儘 量 注 入 多 量, 而 CHOM 極 濃, 每 槽 注 入 1~3 μl 即 可 若 有 多 餘 的 樣 本 槽, 可 注 入 不 同 濃 度 比 較 4) 蓋 上 電 泳 槽 的 蓋 子, 確 認 正 負 電 極 裝 置 正 確 ( 由 負 極 往 正 極 跑 ), 連 接 上 電 源 供 應 器, 定 電 壓 以 100~150 V 進 行 電 泳, 約 需 1 h 5) 待 追 蹤 染 料 跑 到 底 部, 關 掉 電 源, 取 出 膠 片, 以 解 剖 刀 截 去 右 上 角 做 記 號 6) 膠 片 接 著 進 行 蛋 白 質 染 色 及 脫 色 如 下 小 節 M T T C P P C T T M 圖 -4 樣 本 的 配 置 方 式 T 為 trypsin ( 可 能 有 不 同 來 源 的 樣 本 ),C 為 CHOM,P 為 胰 臟 抽 取 液,M 為 標 準 蛋 白 質 ; 左 右 兩 半 膠 片 可 以 加 入 不 同 量 的 樣 本, 以 便 適 當 呈 色 跑 完 電 泳 後 去 除 焦 集 膠 體 後, 在 右 上 角 切 角 做 記 號 ( 箭 頭 虛 線 ), 然 後 進 行 CBR 染 色 3.2.4 染 色 及 脫 色 1) 將 電 泳 膠 片 浸 入 CBR 染 色 液 中, 染 色 液 用 量 只 要 覆 蓋 過 膠 片 即 可, 一 定 要 蓋 上 蓋 子, 置 於 平 台 震 盪 器 上 搖 盪 30 min 2) 倒 出 染 色 液 回 收, 膠 片 用 自 來 水 沖 洗 後 加 入 脫 色 液, 脫 色 液 也 一 樣 蓋 過 膠 片 即 可 ; 約 10 min 換 第 一 次 脫 色 液, 然 後 一 直 定 時 換 新 到 背 景 清 澈 透 明 為 止 3) 若 蛋 白 質 濃 度 較 低, 染 色 時 間 可 加 長 (1 h) 以 增 加 色 帶 深 度 4) 脫 色 完 成 的 膠 片, 可 以 用 玻 璃 紙 三 明 治 乾 燥 之, 經 護 貝 後 可 永 久 保 存 生 物 化 學 實 驗 -7

3.3 結 果 與 報 告 3.3.1 實 驗 結 果 a) 膠 體 染 色 結 果 讓 你 目 睹 樣 本 中 所 含 的 各 種 蛋 白 質, 雖 然 所 有 的 蛋 白 質 都 被 染 成 藍 色, 但 仍 依 照 各 自 分 子 量 及 帶 電 荷 的 大 小 不 同, 在 其 泳 動 率 上 有 所 差 異 b) 請 記 錄 下 色 帶 的 位 置, 可 以 掃 描 或 照 相, 作 為 記 錄 及 報 告 之 用 c) 請 注 意 可 以 看 得 到 幾 條 色 帶? 其 泳 動 率 如 何? d) 若 有 不 同 來 源 的 trypsin, 則 在 電 泳 上 的 差 異 如 何? 3.3.2 附 註 說 明 a) Non-denaturing PAGE 與 SDS-PAGE 的 電 泳 機 制 不 一 樣, 因 此 同 一 種 樣 品, 在 這 兩 種 電 泳 的 結 果 會 完 全 不 同 ; 我 們 在 S2 免 疫 轉 印 法 才 會 進 行 SDS-PAGE 以 trypsin 實 驗 為 例, 圖 -5 說 明 此 現 象, 注 意 圖 中 C 與 D 之 比 較 討 論 電 泳 結 果, 並 判 斷 所 得 到 的 trypsin 是 否 純 質 b) CBR 染 色 法 可 染 大 部 分 蛋 白 質, 約 可 偵 測 數 μg 量 ; 另 有 硝 酸 銀 染 色 法, 其 靈 敏 度 約 提 高 一 百 倍 ; 而 以 Periodic acid-schiff's (PAS) 試 劑 可 染 出 醣 類 ( 呈 洋 紅 色 ), 用 來 偵 測 醣 蛋 白, 但 其 靈 敏 度 比 CBR 染 色 低 十 倍 Disc SDS A B C D 圖 -5 電 泳 分 析 結 果 -8 Biochemistry Laboratory

3.3.3 複 習 問 題 a) 決 定 蛋 白 質 分 子 的 淨 電 荷 為 正 電 或 負 電, 受 那 些 因 素 影 響? b) 那 些 因 素 會 影 響 蛋 白 質 分 子, 在 電 場 中 的 泳 動 速 率? c) 膠 體 溶 液 的 成 分 有 那 些? 各 有 什 麼 作 用? 那 一 種 有 毒 性? d) 焦 集 膠 體 如 何 使 樣 品 蛋 白 質 焦 聚 成 一 薄 層? e) 是 否 所 有 蛋 白 質 分 子 均 由 負 極 向 正 極 泳 動? 在 什 麼 情 況 下 會 有 例 外? f) 電 泳 進 行 時 會 發 熱, 有 無 必 要 通 冷 水 冷 卻 之? 在 何 種 情 況 下 有 此 必 要? g) 樣 品 中 若 有 大 量 的 鹽 分, 對 電 泳 會 有 什 麼 影 響? h) SDS-PAGE 與 non-denaturing PAGE 在 原 理 與 應 用 上, 有 何 異 同? 3.4 參 考 文 獻 莊 榮 輝 主 編 (2000) 酵 素 化 學 實 驗 台 灣 大 學 農 化 系 頁 147, 205 莊 榮 輝 蘇 仲 卿 (1987) 蛋 白 質 膠 體 電 泳 檢 定 法 電 泳 分 離 技 術 研 討 會 論 文 集 頁 69-77 曾 義 雄 等 人 主 編 研 討 會 專 集 ( 九 ) 國 科 會 生 物 中 心 Juang RH et al. (1984) Oven-drying method for polyacrylamide gel slab packed in cellophane sandwich, Anal. Biochem. 141: 348-350 Nelson DL, Cox MM (2005) Lehninger Principles of Biochemistry (4th ed) p.92-96 Scopes RK (1994) Protein purification - Principles and practice, 3rd ed, Springer-Verlag 生 物 化 學 實 驗 -9