产品信息 Thermo Scientific Maxima 第一链 cdna 合成试剂盒 ( 适用于 RT-qPCR) #K1641,#K1642 www.thermoscientific.com/onebio 1
分析证书 经验证, 在两步法 RT-qPCR 中, 对于不同起始量 (5 ng-0.5 fg) 的 RNA 逆转录产物, 使用 Thermo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qpcr 预混液进行 qpcr 扩增 其反应效 率在 90-110% 之间, 曲线斜率在 -3.09 和 -3.58 之间, 且相关系数 >0.99 质量授权人 : Jurgita Zilinskiene 2
目录 页码 试剂盒组分... 4 贮存条件... 4 产品描述... 4 重要提示... 5 RT-qPCR 实验方案... 6 对照反应... 6 疑难解答... 7 参考文献... 8 3
试剂盒组分 Maxima 第一链 cdna 合成试剂盒 ( 适用于 RT-qPCR) #K1641 50 次 #K1642 200 次 Maxima Enzyme Mix 100 μl 400 μl 5 反应混合液 200 μl 800 μl 无核酸酶的水 1.25 ml 4 1.25 ml 贮存条件 所有试剂盒成分都应贮存于 -20 C 产品描述 Thermo Scientific Maxima 第一链 cdna 合成试剂盒是合成 cdna 第一链的方便系统, 适用于两步法实时定量 RT-PCR(RT-qPCR) 中的 cdna 合成 试剂盒采用先进的 Maxima 反转录酶 (RT), 该酶源自 M-MuL V 逆转录酶的体外进化 这种酶相比 M-MuL V 逆转录酶热稳定性高, 扩增效果强劲且具有更高的 cdna 合成效率 Maxima 第一链 cdna 合成试剂盒能够在较高温度下 (55-65 ), 在很宽的总 RNA 量范围内 ( 从 1 pg 到 5 μg) 合成 cdna 合成反应能在 15-30 分钟内完成 Maxima 第一链 cdna 合成试剂盒的各组分经预混合, 以节约时间和减少移液错误 试剂盒由 Maxima Enzyme Mix 5 反应混合液 无核酸酶的水三部分组成 Maxima Enzyme Mix 包含 Maxima 反转录酶和 Thermo Scientific Ribolock RNase 抑制剂 重组的 Ribolock RNase 抑制剂能有效保护 RNA 模板在高于 55 时不被 RNase A B 和 C 降解 5 反应混合液包含剩余的反应组分 : 反应缓冲液 dntps Oligo(dT) 18 和随机引物 无核酸酶的水用于反应体系的配制和 RNA 样本的溶解 已通过相关检验证明其中不含脱氧核糖核酸内切酶 脱氧核糖核酸外切酶 核糖核酸酶和磷酸酶 4
重要提示 避免核糖核酸酶污染 RNA 的纯度和完整性对于合成全长 cdna 至为重要 RNA 能够被 RNase A 降解, 而在任何实验环境中都能发现这种稳定的污染物 本试剂盒中所有成分都经过严格检测, 确保其不含 RNase 为了避免污染, 实验环境以及所准备的试剂溶液都必须不含 RNase 避免 RNase 污染的一般建议 : 使用确保无核酸酶的实验器具, 或者用 DEPC 水处理 cdna 合成中所用到的反应管和枪头等 整个实验过程中请戴手套, 因为皮肤是 RNA 酶的一个常见来源 同时实验过程中注意经常更换手套 使用无核酸酶的试剂, 包括高纯度的水 ( 如无核酸酶的水,#R0581) 未使用试剂盒时请严格密封保存 在反转录过程中, 所有反应管要确保扣严 模板 RNA 通过标准方法分离的总细胞 RNA 适用于该试剂盒 纯化的 RNA 需确保不含盐分 金属离子 乙醇和苯酚, 以防其抑制 cdna 合成反应 对于 RT-PCR, 模板 RNA 需确保没有 DNA 污染 在 cdna 合成之前, 可先用无核酸酶的 DNase I(#EN0521) 去除痕量 DNA 实验中需要逆转录酶负对照反应 该反应含有除 Maxima Enzyme Mix 以外的所有其他 RT 反应组分 RNA 样本质量 在合成 cdna 之前需对 RNA 的完整性进行评估 真核生物总 RNA 能够通过琼脂糖凝胶电泳后进行 EB 染色来分析检测 如果总 RNA 电泳后有 18S 和 28S rrna 的锐利条带, 可认为 RNA 是完整的 28S RNA 条带的亮度大约为 18S rrna 条带的两倍 rrna 条带出现任何拖尾现象都表示 mrna 存在降解 如果这种情况发生, 需重新制备总 RNA 样品 另外, 也可用生物分析仪器 ( 如 Agilent 2100) 分析总 RNA, 该仪器能对 RNA 样本的大致状况,RNA 的完整数 (RIN)(2) 进行定量 内参基因 / 目的基因 3 :5 完整性分析 (3) 也能用于检测 RNA 样本的完整性 引物 Maxima 第一链 cdna 合成试剂盒包含 Oligo(dT) 18 引物和随机引物, 以引导第一链 cdna 的合成 该引物混合物可确保检测低拷贝转录物时的高灵敏性 5
RT-qPCR 实验方案 开始前请阅读本手册的重要提示部分 ( 第 5 页 ) 第一链 cdna 合成第一链 cdna 合成反应可以以单个反应进行, 而对于不同的 RNA 模板, 也可以进行一系列的平行反应 因此, 反应混合液既可以通过将各组分溶液单独混合, 也可以将 RT 反应中除了 RNA 模板外的所有组分制成预混液 解冻后, 轻轻涡旋并短暂离心试剂盒所有组分 冰上放置 1. 在冰上, 将以下试剂按标明的顺序加入到无菌的 无 RNase 的反应管中 5 反应混合液 4 μl Maxima Enzyme Mix 2 μl RNA 模板 1 pg-5 μg 无核酸酶的水 to 20 μl 总体积 20 μl 2. 轻轻混匀并离心 3. 25 孵育 10 分钟, 之后再 50 孵育 15 分钟 注 : 若 RNA 模板量大于 1 μg, 则延长反应时间至 30 分钟 若 RNA 模板富含 GC 或含有大量的二级结构, 可将反应温度提高至 65 4. 85 加热 5 分钟以终止反应 该反转录反应产物能够直接用于 qpcr, 或者在 -20 条件下存放一周 如需长时间贮存, 推荐贮存于 -70 另外应避免 cdna 的反复冻融 qpcr 第一链 cdna 合成的产物能够直接用于 qpcr 加入的合成的 cdna 第一链产物体积不应超过 PCR 反应总体积的 1/10 通常情况下, 在 25 μl 体系的 qpcr 反应中加入 2 μl 合成的 cdna 第一链作为模板 Maxima 第一链 cdna 合成试剂盒适于和 Maxima qpcr master mixes (#K0221 #K0231 #K0241 #K0251 #K0261) 搭配使用 对照反应 实验中应利用如下负对照来确认第一链 cdna 合成的结果 Reverse transcriptase minus(rt-) 负对照 :RT-PCR 和 RT-qPCR 中应利用此负对照来检验 RNA 样本中基因组 DNA 的污染情况 此负对照 RT- 反应含有除 Maxima Enzyme Mix 以外的所有组分 无模板负对照 (NTC): 此负对照用来检验试剂污染情况 NTC 反应含有除模板以外的所有组分 6
疑难解答 问题没有 qpcr 产物或者 qpcr 产物出现很晚在 RT-minus 对照中出现 RT-qPCR 产物 可能的原因及解决方案 RNA 模板不完整 RNA 的纯度和完整性对于 cdna 的合成和定量至关重要 cdna 合成之前需检测 RNA 的完整性 ( 见第 5 页 ) 按照所给的建议, 避免 RNA 污染 ( 第 5 页 ) 及弃掉低质量 RNA 使用新鲜制备的 RNA 不推荐使用多次反复冻融的 RNA 样本也不建议多次冻融合成的 cdna 模板纯度低 (RNA 样本中存在抑制剂 ) RNA 纯化过程中的残留试剂可能保留在溶液中, 抑制第一链的合成, 如 SDS EDTA 胍盐 磷酸盐 焦磷酸盐 聚胺 亚精胺 为去除残留污染物, 重新用乙醇沉淀 RNA 并用 75% 乙醇冲洗 模板量不足在第一链合成反应中按照推荐的水平增加 RNA 模板量 在 DNase I 处理后, 在存在 EDTA( 结合 Mg 2+ ) 条件下通过加热使酶失活, 以此来终止反应 若无螯合剂加入, 加热时 RNA 会发生水解 模板 GC 含量高若 RNA 模板富含 GC 或含有大量的二级结构, 可将反应温度提高至 65 qpcr 中加入过量的 cdna 减少 qpcr/pcr 中 cdna 的量 加入的合成的 cdna 产物体积不应超过 PCR 反应总体积的 1/10 RNA 模板存在 DNA 污染在负对照中出现 PCR 产物意味着反应中存在 DNA 污染 为了避免基因组 DNA 参与扩增, 在外显子 - 外显子边缘设计引物, 或者在反转录前用 DNase I 消化 7
参考文献 1. Wiame, I., et al., Irreversible heat inactivation of DNaseI without RNA degradation, BioTechniques, 29, 252-256, 2000. 2. Fleige, S., Pfaffl, M.W., RNA integrity and the effect on the real-time qrt-pcr performance, Mol. Aspects Med., 27, 126-139, 2006. 3. Nolan, T., et al., Quantification of mrna using real-time RT-PCR, Nat. Protoc., 1, 1559-1582, 2006. 注 : 本产品或使用本产品都必须遵守美国专利申请 US20110251080A1 及相应的副本 购买本产品包括购买非转让许可, 以便买方可将本产品用于其内部研究 本产品的所有其他商业用途, 包括但不限于诊断用途 原装或改装转售或利用产品提供商业服务, 均需要一份单独的许可证 欲了解更多关于许可申请的信息, 请联系 ltvil.info@thermofisher.com 产品使用限制本产品的开发 设计及销售专供研究和体外试验使用 本产品不得用于诊断试验或药物开发, 也不适合向人或动物注射 了解本产品的材料安全数据表, 请浏览 www.thermoscientific.com/onebio 2012 Thermo Fisher Scientific 公司, 版权所有 所有其他商标均归 Thermo Fisher Scientific 公司或其子公司所有 8