八无细胞蛋白表达系无细胞蛋白表达系统简介 无细胞蛋白表达系统, 含有蛋白合成所需各主要组分 ( 氨基酸 酶 各种因子等 ), 不受细胞核 ( 核酸 DNA/NA) 线粒体 细胞骨架等的干扰, 能够在体外快速 大量表达蛋白 体外无细胞蛋白表达系统分为原核和真核两大类, 原核系统以细菌裂解物为基础, 如大肠杆菌系统 ; 真核系统以真核细胞裂解物为基础, 包括麦胚系统 昆虫系统 兔网织红细胞系统等 这一真正的 开放 系统, 能够特异性表达目的蛋白, 产生的蛋白可用于蛋白质功能检测 结构分析等下游实验 该系统应用至今, 已成功表达超过 2 万种蛋白, 其中包括 13364 个人类的基因 部分数据列表如下 : 拟南芥 蛋白激酶 500 小鼠 蛋白激酶 300 蛋白磷酸化酶 86 转录因子 900 转录因子 750 蛋白酶 180 蛋白酶 50 膜蛋白 180 蛋白激酶 300 自身抗原 240 蛋白磷酸化酶 80 疟原虫 1000 人类 转录因子 900 病毒 70 核受体 38 原核生物 300 蛋白酶 75 (Nature Methods 2008,5,1011-1017) 欲了解人类基因表达的更多详情, 请登录 Human Gene and Protein Database (HGPD) 无细胞蛋白表达系统与传统的细胞内表达系统相比, 无需诱导培养, 大大简化了操作步骤以及下游实验流程, 能够用于高通量以及大量表达的实验 ; 体外表达取消了生理限制, 显著提高具有功能性 可溶性 全长蛋白的总体产量 ; 由于能够实现磷酸化修饰, 并不受蛋白毒性影响, 该系统十分适合激酶 膜蛋白等毒性蛋白的表达 ; 并可通过修饰的 tna, 在特定位点插入非天然氨基酸标记 无细胞蛋白表达系统特点 统 操作简便 : 只需按照说明书添加各种成分即可, 像做 PC 一样简单 需时短 : 只需 2-24 小时即可完成实验 表达量高 : 可实现规模表达, 最大表达量可达 50 mg/10 ml 反应体系 轻松表达困难蛋白 : 突破传统细胞内表达的极限, 实现毒蛋白 膜蛋白 包涵体及不溶蛋白的表达 蛋白共表达 : 可以进行多个模板的同时表达 开放系统 : 能够添加蛋白酶抑制剂 稀有密码子, 进行氨基酸标记等更多信息请参见 : www.tiangen.com 免费电话 : 800-990-6057 400-810-6057 E-mail: people@tiangen.com 无细胞蛋白表达系统与传统细胞表达系统特点比较 特点无细胞蛋白表达传统细胞表达 表达特异性只表达目的蛋白表达总蛋白 ( 细胞内总蛋白, 例如细胞骨架或线粒体等 ) 氨基酸标记可以非常困难 毒蛋白表达可以不可以 高通量表达可以不可以 305
八无细胞蛋白表达系统更多信息请参见 : www.tiangen.com 免费电话 : 800-990-6057 400-810-6057 E-mail: people@tiangen.com 无细胞蛋白表达系列技术简介 CFS 无细胞蛋白表达系列为真核体外无细胞蛋白表达系统, 使用独特的技术去除了翻译抑制物的麦胚提取物 (WEPO ), 能够大量表达可溶性的全长蛋白 该系列产品采用非偶联的转录和翻译系统, 目的蛋白得率与 TS 系列产品相当 1)CFS 无细胞蛋白表达原理 * 非偶联的转录和翻译系统 CFS 系列产品中包括模板构建 转录和翻译反应所需全部试剂 首先构建携带 SP6 启动子 E01 增强子 目的基因的线性模板或质粒, 随后在转录反应液中进行体外转录, 再以获得的 mna 为模板进行翻译反应 翻译反应有三种方法可供选择, 分别为 Bilayer eaction Method epeated Batch Method Filter-and-Feed Method, 这些方法都可以和仪器配合使用, 其中 Bilayer eaction Method 手工操作非常简便, 因此被广泛使用 * 多种翻译系统 对于 WEPO 而言, 前期的模板准备和转录 mna 相同, 不同的是翻译系统, 可以采用以下三种方法进行翻译 Bilayer eaction Method 利用反应液和麦胚裂解物之间的密度差相互渗透, 在液面相交处进行反应, 随着时间的推进, 溶液逐渐由两相变为单一混合物而终止 用移液器混匀后, 即得到包含目的蛋白的溶液 该方法可以与自动化仪 器 (Protemist DT II, GenDecoder ) 配合使用 也可以手工操作 ( 请参见说明书 ) epeated Batch Method 通过离心的方式不断的使反应液通过麦胚裂解物, 从而不断的合成目的蛋白, 该方法既可以手工操作 ( 需要离心机 ), 也可以配合仪器使用 Filter-and-Feed Method 利用 Protemist XE 仪器, 不断供给 mna 和翻译反应液, 并过滤掉翻译反应的副产物, 从而大规模生成目的蛋白 306
八无细胞蛋白表达系2)CFS 系列简要操作流程 3)CFS 系列选购指南 合成克隆 / 非克隆模板 模板生成 质粒模板 (peu-e01 载体 ) 线性模板 (Premium Plus Expression Kit) 体外转录, 获得 mna 体外翻译, 得到目的蛋白扩大蛋白表达规模, 按需对蛋白进行标记 转录反应 翻译反应 扩大规模表达 转录 Mix DNA 模板 SP6 NA 聚合酶 NTP Mix 翻译缓冲液 Nase 抑制物 (Premium Plus Expression Kit) SUB-AMIX: 包含 ATP GTP 和 20 种氨基酸的翻译缓冲液 (Premium Plus Expression Kit) WEPO1240/1240G/1240H WEPO7240/7240G/7240H 4) 注意事项 产品名称 真核系统 统Premium PLUS WEPO1240 系列 WEPO7240 系列 产品参数 Expression Kit 1240 1240H 1240G 7240 7240H 7240G 最大得率 / 反应 40 µg 20 µg 100 µg 500 µg 40 µg 200 µg 1 mg 标准反应体系 226 µl 226 µl 1.2 ml 6 ml 226 µl 1.2 ml 6 ml 模板类型 线性 / 质粒 质粒 质粒 质粒 质粒 质粒 质粒 反应时间 16h 16h 16h 16h 16h 16h 16h 反应温度 15 /26 15 /26 15 /26 15 /26 15 /26 15 /26 15 /26 质粒浓度越高越好, 推荐浓度为 1 µg/µl 纯度 A 260/280 在 1.7-1.85 之间 试剂不宜长期存放于储存干冰的 -80 冰箱中 推荐使用 Nase-Free ddh 2 O 溶解质粒, 避免 Nase 污染 更多信息请参见 : www.tiangen.com 免费电话 : 800-990-6057 400-810-6057 E-mail: people@tiangen.com 307
八无细胞蛋白表达系统更多信息请参见 : www.tiangen.com 免费电话 : 800-990-6057 400-810-6057 E-mail: people@tiangen.com 308 Premium PLUS Expression Kit 用于小量蛋白表达, 单次表达量最高可达 40 µg 目录号 包装 价格 WM7-EDX-PLUS 8 次 8600 元 产品包装 试剂盒组成 自备试剂特异性引物 保存条件 -80 避光保存 含量 peu-e01-mcs(1.0 µg/µl) 5.0 µl peu-e01-dhf(1.0 µg/µl) 5.0 µl SPU(1 µm) 100 µl desp6e01(10 nm) 100 µl Transcription Premix LM 8 x18 µl WEPO 9240 8 x10 µl SUB-AMIX SGC 8 x206 µl Aluminum seal 2 条 产品简介本试剂盒能够通过线性模板或质粒模板实现小规模蛋白表达, 试剂盒中包含麦胚无细胞蛋白表达系统专用质粒 peu-e01-mcs, 线性模板构建所需引物, 全部翻译试剂, 以及 8 次 226 µl 反应体系所需的转录预混反应液和八连管 另外, 提供 peu-01-dhf 质粒作为阳性对照, 利用该阳性对照质粒单次表达量最高可达 20 µg 本试剂盒采用非偶联的转录和翻译方法, 构建线性 / 质粒模板, 并在体外进行转录后, 以获得的 mna 为模板, 利用双层反应法表达目的蛋白 产品特点 多种选择 : 支持线性模板和质粒模板 表达量高 : 单次反应最高表达量可达 40 µg 方法简单 : 采用 Bilayer 反应方法, 不需要特殊仪器 仪器要求金属浴 ( 推荐金属浴 OSE 系列 ) 实验例 peu-e01-mcs 载体图谱及酶切位点 选择合适的酶切位点后, 将带有起始密码子和终止子的 cdna 插入载体, 即可完成表达模板的构建 构建线性模板需进行两步 PC 反应 第一轮 PC 中, 通过携带公共接头的上游引物及特异性下游引物, 扩增目的基因, 获得加入公共接头的目的基因片段 ; 随后在第二轮 PC 过程中, 加入 SP6 启动子和 E01 增强子原件, 获得用于蛋白表达的线性模板
八无细胞蛋白表达系翻译反应采用 Bilayer eaction Method, 该方法通过反应液和麦胚裂解物造成的密度差, 相互渗透, 在液面相交处发生反应, 随着时间的推进, 溶液逐渐由两相变为单一混合物而终止 用移液器混匀后, 即得到包含目的蛋白的溶液 该方法可以与自动化仪器 (Protemist DT II, GenDecoder ) 配合使用, 也可以手工操作 ( 请参见说明书 ) 实验例 DHF 基因克隆入 peu-e01-mcs, 使用 Premium PLUS Expression Kit 表达 DHF 蛋白后, 取 3 µl 样本进行 SDS-PAGE 电泳, 统考马斯亮蓝染色图 A: 分子量蛋白 Marker;B: 阴性对照 ;C:DHF 蛋白更多信息请参见 : www.tiangen.com 免费电话 : 800-990-6057 400-810-6057 E-mail: people@tiangen.com 309
八无细胞蛋白表达系统更多信息请参见 : www.tiangen.com 免费电话 : 800-990-6057 400-810-6057 E-mail: people@tiangen.com 310 WEPO1240/1240H/1240G Expression Kit 真核无细胞体外大规模蛋白表达试剂盒 目录号 包装 价格 WM7-TI-1240 200 次 226 µl/ 32250 元 WM7-TI-1240H 40 次 1.2 ml/ 36650 元 WM7-TI-1240G 8 次 6 ml 36650 元 产品包装 试剂盒组成 实验例 含量 WEPO 1240/ WEPO 1240H/ 2 1 ml WEPO 1240G SUB-AMIX S-1 1.1 ml SUB-AMIX S-2 1.1 ml SUB-AMIX S-3 1.1 ml SUB-AMIX S-4 1.1 ml 5x Transcription Buffer 0.4 ml NTP Mix 0.2 ml SP6 NA Polymerase 30 µl Nase Inhibitor 30 µl Creatine Kinase 20 µl peu-e01-mcs 10 µl peu-e01-dhf 10 µl 自备试剂特异性引物 产品简介 WEPO1240 系列包含三款产品, 根据表达的目的蛋白携带标签不同, 分为 WEPO1240/WEPO1240H/WEPO1240G 各款产品均包含真核体外无细胞蛋白表达系统所需的麦胚裂解物以及转录 翻译试剂, 试剂量足够使用 Protemist DT II 进行 6 次 6 ml 翻译反应或 24 次 1.2 ml 翻译反应, 同时也可以在 6/24/96 孔板中实现手工操作合成目的蛋白 WEPO1240H 是对 WEPO1240 裂解物进行处理后, 去除了能够非特异性吸附 His-tag 亲和纯化树脂的内源性蛋白, 能够用于表达高纯度 His-tag 重组蛋白 ; WEPO1240G 是对 WEPO1240 裂解物进行处理后, 去除了能够非特异性吸附 GST-tag 亲和纯化树脂的内源性蛋白, 用于表达高纯度 GST-tag 重组蛋白 产品特点 选择多 : 三种反应体系可供选择, 满足不同需求 操作简便 : 可以手工操作, 或配合仪器使用 表达量高 : 用于大量蛋白表达 仪器要求 : 手工合成需要恒温装置 ( 推荐金属浴 OSE 系列 ); 自动化合成需要与 Protemist DT II 配合使用 使用 SDS-PAGE 电泳检测 WEPO1240 和 WE- PO1240G 两种试剂盒表达的 GST-tag 重组蛋白的回收纯度 使用 WEPO1240G 表达, 经过亲和法纯化后, 目的蛋白纯度从 67% 增加到 82% S: 亲和纯化标准 WEPO1240 试剂盒表达目的蛋白 ;G: 亲和纯化预处理的 WEPO1240G 试剂盒表达目的蛋白 使用 SDS-PAGE 电泳检测 WEPO1240 和 WE- PO1240H 两种试剂盒表达的 His-tag 重组蛋白的回收纯度 使用 WEPO1240H 表达, 并经过亲和纯化方法纯化后, 目的蛋白纯度从 30% 增加到 70% S: 亲和纯化标准 WEPO1240 试剂盒表达目的蛋白 ;H: 亲和纯化预处理的 WEPO1240H 试剂盒表达目的蛋白
八无细胞蛋白表达系WEPO7240/7240H/7240G Expression Kit 真核无细胞体外大规模蛋白表达优化试剂盒 产品包装 试剂盒组成 含量 WEPO7240/WEPO7240H /WEPO7240G 2x1 ml SUB-AMIX SGC S-1 1.1 ml SUB-AMIX SGC S-2 1.1 ml SUB-AMIX SGC S-3 1.1 ml SUB-AMIX SGC S-4 1.1 ml 5x Transcription Buffer LM 0.4 ml NTP Mix 0.2 ml SP6 NA Polymerase 30 µl Nase Inhibitor 30 µl Creatine Kinase 20 µl peu-e01-mcs 10 µl peu-e01-dhf 10 µl 目录号 包装 价格 WM7-TI-7240 200 次 226 µl/ 42400 元 WM7-TI-7240H 8 次 6 ml/ 47050 元 WM7-TI-7240G 40 次 1.2 ml 47050 元 产品简介 WEPO7240 系列包含三款产品, 根据表达的目的蛋白携带标签不同, 分为 WEPO7240/WEPO7240H/WEPO7240G WEPO7240 系列产品是在 WEPO1240 的基础上去除了干扰蛋白表达的杂蛋白, 得率比 WEPO1240 提高一倍左右 WEPO7240 系列各款产品均包含真核体外无细胞蛋白表达系统所需的麦胚裂解物以及转录 翻译试剂, 试剂量足够使用 Protemist DT II 进行 6 次 6 ml 翻译反应或 24 次 1.2 ml 翻译反应, 同时也可以在 6/24/96 孔板中实现手工操作合成目的蛋白 WEPO7240H 是对 WEPO7240 裂解物进行处理后, 去除了能够非特异性吸附 His-tag 亲和纯化树脂的内源性蛋白, 能够用于表达高纯度 His-tag 重组蛋白 ; WEPO7240G 是对 WEPO7240 裂解物进行处理后, 去除了能够非特异性吸附 GST-tag 亲和纯化树脂的内源性蛋白, 用于表达高纯度 GST-tag 重组蛋白 自备试剂特异性引物 产品特点 选择多 : 三种反应体系可供选择, 满足不同需求 操作简便 : 手工操作, 或配合仪器使用 表达量高 : 用于大量蛋白表达, 表达量是 WEPO1240 系列的两倍 仪器要求 : 手工合成需要孵育装置 ( 推荐金属浴 OSE 系列 ); 自动化合成需要与 Protemist DT II 配合使用 实验例 统更多信息请参见 : www.tiangen.com 免费电话 : 800-990-6057 400-810-6057 E-mail: people@tiangen.com WEPO1240 WEPO7240 GFP 316 µg 610 µg GUS 403 µg 806 µg DHF 218 µg 446 µg p38 365 µg 749 µg Akt1 209 µg 285 µg JNK2 395 µg 753 µg Average 316 µg 608 µg Av.Two-fold increase WEPO1240 和 WEPO7240 试剂盒表达多种蛋白, 亲和法纯化后, 上样 1 µl,sds-page 电泳结果 如图所示,WE- PO7240 试剂盒的表达蛋白纯化后得率是 WEPO1240 的两倍左右 M: 蛋白分子量标准 1: 亲和纯化 WEPO1240 试剂盒表达蛋白纯化后产物 2: 亲和纯化 WEPO7240 试剂盒表达蛋白纯化后产物 311
八无细胞蛋白表达系统更多信息请参见 : www.tiangen.com 免费电话 : 800-990-6057 400-810-6057 E-mail: people@tiangen.com 312 Q&A Q Q 无细胞蛋白表达系统常见问题分析 CFS 系列麦胚无细胞表达系统 peu 质粒特点, 以及对于模板的要求 A-1 A-2 CFS 提供的质粒载体 peu 专门用于麦胚无细胞蛋白表达系统 peu 载体的 5 和 3 序列提高了 mna 转录, 可以生成不含 5 端帽子结构和 poly(a) 尾的 mna 由于取消了 5 端帽子结构和 poly(a) 尾, 麦胚无细胞表达系统不需复杂的 mna 浓度优化 高纯度的质粒 DNA 是 CFS 麦胚无细胞表达系统成功转录和翻译的关键 对模板的要求 质粒纯度 A260/A280 的比值为 1.70-1.85, 浓度为 1 µg/µl 无 Nase 污染 ( 推荐使用无 Nase ddh 2 O 溶解质粒 ) 除 SP6 启动子外, 是否还有其他启动子可以用于 CFS 系列产品 A-1 推荐使用 SP6 启动子的 peu 载体, 包含 T7 启动子的载体也可以在 CFS 系统中进行蛋白表达, 但由于 SP6 和 T7 启动子在 5 转录位点的差异, 同样量的转录本得率可能会较低 部分使用 TIANGEN 无细胞蛋白表达产品发表的文献列表 题目期刊 IF 使用产品单位 Immunoproteomics Profiling of Blood Stage Plasmodium vivax Infection by High-Throughput Screening Assays A simple and high-sensitivity method for analysis of ubiquitination and polyubiquitination based on wheat cell-free protein synthesis Measurement of naturally acquired humoral immune responses against the C-terminal region of the Plasmodium vivax MSP1 protein using protein arrays A Cell-Free Translation and Proteoliposome econstitution System for Functional Analysis of Plant Solute Transporters The initiator caspase, caspase-10β, and the BH-3-only molecule, Bid, demonstrate evolutionary conservation in Xenopus of their pro-apoptotic activities in the extrinsic and intrinsic pathways Efficient production and purification of functional bacteriorhodopsin with a wheatgerm cell-free system and a combination of Fos-choline and CHAPS detergents Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system obotic large-scaleapplication of wheat cell-freetranslationtostructuralstudiesincluding membraneproteins J Proteome es 5.056 CFS 爱媛大学 BMC Plant Biol 4.09 CFS 爱媛大学 Parasitol es 2.852 CFS 国立江原大学 Plant Physiol Biochem 2.775 CFS 爱媛大学 Genes Cells 2.731 CFS 京都大学 Biochem Biophys es Commun 2.406 CFS 爱媛大学 BMC Biotechnol 2.165 CFS 爱媛大学 New Biotechnol 1.706 CFS 威斯康辛大学