苦参碱对.& 细胞. /! 0. 及端粒酶活性的影响 李海军 王俊明 田亚汀 白美玲 张林西 赵晓霞 摘要 目的 研究苦参碱对人乳腺癌.& 细胞. /! 0. 及端粒酶活性的影响 方法 体外培养人乳腺癌.& 细胞 随机分组 实验组细胞加入苦参碱溶液 对照组或阴性对照组细胞加入等量培养液 阳性对照组细胞加入端粒酶抑制剂莪术油 采用倒置显微镜下观察细胞形态学变化 1 法检测端粒酶活性 免疫细胞化学法检测.& 细胞中. /! 0. 蛋白表达情况 结果 苦参碱对乳腺癌细胞有明显的生长抑制作用和促凋亡作用 不同浓度苦参碱处理.& 细胞 '' & 后 端粒酶活性随苦参碱浓度增加和作用时间延长而逐渐下降 呈剂量 效应正相关和时间 效应正相关 苦参碱能够上调.& 细胞. / 蛋白表达和下调.& 细胞! 0. 蛋白表达 结论 苦参碱对.& 细胞具有明显的生长抑制作用和促凋亡作用 可能是通过上调. / 蛋白表达 抑制端粒酶活性诱导乳腺癌细胞凋亡及通过下调! 0. 蛋白表达 抑制肿瘤血管形成等实现的 关键词 苦参碱 乳腺癌.& 细胞株. /! 0. 端粒酶活性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苦参碱 是从苦参 苦豆子等豆科 基金项目 年度河北省科技支撑计划项目 %"&&&' 作者单位 $ 河北北方学院法医系病理教研室 河北张家口 & $ 张家口市第四医院眼一科 河北张家口 & 通讯作者 李海军 # # '())$*" +, & - '& 槐属植物中提取的一种重要生物活性碱 近来发现 苦参碱对肝癌 肺癌 胃癌 大肠癌等多种癌细胞具有较 强的抑制作用和促凋亡作用 ' 目前 有关苦参碱诱导乳腺癌细胞凋亡等相关报道却较为少见 本实验采用体外实验的方法 观察苦参碱对人乳腺癌.& 细胞. /! 0. 及端粒酶活性的影响 探讨苦参碱抗乳腺癌可能的作用机制 现报道如下
中国中西医结合杂志 年 月第 卷第 期!"#$ %" 材料与方法 材料 细胞株及药物 乳腺癌细胞株.& 由我院实验中心细胞室提供 苦参碱购自北京双鹭药业股份有限公司 批号 使用前用培养液溶解稀释成所需浓度 莪术油注射液购自苏州长征 欣凯制药有限公司 批号 4 & 使用前用培养液溶解稀释成所需浓度 主要试剂及设备 1 ' 培养液购自凯基生物科技发展有限公司 新生胎牛血清购自天津市川页生化制品有限公司 消化液 胰酶加 + 混合 胰酶购自普京康生物制品有限公司 兔抗人. / 抗体 兔抗人! 0. 试剂盒购自博士德生物工程有限公司 端粒酶 1 试剂盒购自北京五洲元业生物工程有限公司 1 扩增仪 为美国产品. ; 酶标仪为美国产品 型, 培养箱购自美国." 公司 实验方法 细胞培养.& 细胞用含. 6- 庆大霉素的 1 ' 培养液 在 &, 培养箱中孵育 每 ' 换液 传代 使用前胰酶消化 倒置显微镜下观察 设实验组和对照组 随机选取对数期生长的.& 细胞分成 份 实验组分别加入苦参碱溶液使其终浓度分别为 7- 对照组加入与实验组等量的培养液 两组孵育 ' 胰酶消化后在倒置显微镜下观察 1 法检测端粒酶活性 设阴性对照组 阳性对照组和实验组 随机选取对数期生长的.& 细胞 份 并调整细胞浓度为 - 实验组分别加入苦参碱溶液使其终浓度分别为 7- 阴性对照组加入与实验组等量的培养液 阳性对照组加入端粒酶抑制剂莪术油溶液使其终浓度为 7- 将各组接种于 孔板内 各设 ' 个复孔 分别作用 ' ' & 后 按照试剂盒说明书对端粒酶活性进行检测 酶标仪分别测定 ' 和 的,+ 值 其差值 ' 则代表端粒酶活性 实验重复 次 ' 免疫细胞化学法检测.& 细胞中. / 蛋白! 0. 蛋白表达 ' 细胞爬片的制备 随机选取对数期生 长的.& 细胞胰酶消化 悬浮后 调整细胞浓度为 ' - 置已放入盖玻片的六孔板内 盖玻片细胞生长 天后 选取细胞生长良好 密度一致的盖片进行分组 实验组分别加入苦参碱溶液使其终浓度分别为 7- 对照组加入与实验组等量的培养液 两组孵育 ' 后进行 ' 多聚甲醛固定 吸去多聚甲醛 换用 9 缓冲液冲洗 浸泡 每天更换冲洗液避免爬片干燥 备用 ' 免疫细胞化学检测 各取实验组和对照组细胞爬片均分别滴加稀释后的 抗. / 及! 0. 兔抗人单克隆抗体 & 恒温箱中孵育 9 缓冲液洗涤 次后分别滴加 抗 再次 & 恒温箱中孵育 后 + 9 显色 苏木素 伊红染色 酒精梯度脱水 透明 封片 同时以已知阳性切片作为阳性对照 用 9 代替一抗作阴性对照 实验重复 次 ' 结果判断 免疫组织化学染色图像处理 用, 8 < 94 显微镜拍照 以乳腺癌.& 细胞浆内和细胞膜出现棕黄色颗粒视为阳性细胞 每张切片随机选择 个高倍视野拍照 对照组及各浓度组用 " * 2 数码医学图像分析系统分别测定. /! 0. 蛋白的平均积分光密度 统计学方法 采用 统计软件 计量数据用 ; / 表示 采用方差分析 = 为差异有统计学意义 结 果 倒置显微镜下观察结果 图 对照组.& 细胞透亮 核大 位于细胞中心 胞浆呈梭形或多突起形 突起较长 实验组乳腺癌细胞出现不同程度突起短缩 胞浆减少 逐渐变圆 随药物浓度的提高改变更加明显 胞浆内可见大小不等的空泡 尤其 7- 苦参碱组最为明显 细胞核固缩 碎裂 呈圆形 卵圆形或肾形 被挤向细胞一侧 实验各组均见细胞膜局部向外膨出 出芽现象 7- 苦参碱组中出芽细胞更为多见 有的呈现典型的玫瑰花环状 提示苦参碱对乳腺癌细胞有明显的生长抑制作用和促凋亡作用 苦参碱对.& 细胞端粒酶活性的影响 表 不同浓度苦参碱组作用.& 细胞 '' & 后 端粒酶活性在各时间段均随苦参碱浓度的增加而逐渐下降 与阴性对照组比较差异均有统计学意义 = 呈剂量 效应正相关 阳性对照组与阴性
注 为对照组 9 为 7- 苦参碱组 为 7- 苦参碱组 + 为 7- 苦参碱组 为 7- 苦参碱组 下图同图 不同浓度苦参碱作用.& 细胞倒置显微镜下观察结果 表 苦参碱对.& 细胞端粒酶活性的影响 端粒酶活性,+ 值 ; / 组别. 值 值 ' ' & 阴性对照 &' ' ' &' 阳性对照 & ' ' & & = 7- 苦参碱 & & & = 7- 苦参碱 &' ' & ' = 7- 苦参碱 & ' ' & & = 7- 苦参碱 ' ' ' & & =. 值 ' ' ' 值 = = = 注 与阳性对照组同期比较 = 与阴性对照组同期比较 = 与本组 ' 比较 = 与本组 ' 比较 = 对照组比较差异有统计学意义 = 并随作用时间的增加对端粒酶的抑制作用增强 = 苦参碱组与阳性对照组比较 除 ' 时间段 7- 苦参碱组和 ' 时间段 7- 苦参碱组与阳性对照组比较 差异无统计学意义外 > 其余各时间段苦参碱各浓度组与阳性对照组比较 差异均有统计学意义 = 苦参碱对.& 细胞. /! 0. 蛋白表达的影响 图 表 不同浓度苦参碱处理.& 细胞 ' 后 乳腺癌细胞. /! 0. 蛋白阳性表达在细胞浆内和细胞膜上呈棕黄色颗粒 随苦参碱浓度的增高. / 蛋白在.& 细胞中表达的数量逐渐增多 棕黄色颗粒颜色也逐渐加深 阳性目标平均积分光密度值呈上升趋势 不同浓度组与对照组比较 差异有统计学意义 = 随苦参碱浓度的增高! 0. 蛋白在.& 细胞中表达的数量则逐渐减少 棕黄色颗粒颜色也逐渐变淡 阳性目标平均积分光密度值呈 下降趋势 不同浓度组与对照组比较 差异有统计学意义 = 乳腺癌细胞. / 蛋白与! 0. 蛋白表达呈负相关? & 讨 论端粒 #" 是存在于染色体末端的 +% 重复序列 其长度随细胞的每一次复制逐渐缩短 细胞复制一定次数后 短缩的端粒使染色体相互融合 导致细胞死亡 端粒酶是端粒专一的逆转录酶 能以自身 1% 组分为模板合成 000 重复序列 并将其加到正在复制的染色体末端以弥补端粒的丢失 而使细胞寿命延长甚至获得永生 近年来研究发现 端粒酶活性在许多肿瘤细胞中都存在异常增高 有人发现端粒酶在乳腺癌中 表现阳性 有淋巴结转移的 端粒酶阳性 高于无淋巴结转移的乳腺癌 && 并认为端粒酶活化在乳腺癌的发生过程中起重要作用 & 抑制端粒酶活力有可能阻止肿瘤细胞
"!" %" () 中国中西医结合杂志!"#$ 年 % 月第 $$ 卷第 % 期 &'()*+!,-./-01-2!"#$! 3456 $$! 74!% 图!%苦参碱处理后 +&F" 8 细胞中 F>G 蛋白的表达#$,K 法 '9""% 图 $%苦参碱处理后 +&F" 8 细胞中 3=HF 蛋白的表达#$,K 法 '9""% 表!%F>G '3=HF 蛋白阳性表达目标平均 积分光密度$Y )G % F>G 蛋白是存在于细胞表面的 " 型跨膜蛋白! 属 于肿瘤坏死因子 $ )7F % 受体家族成员之一 (:) * F>G O F>G 3=HF 介导的细胞凋亡通常由 F>G 与其配体 F>GL 结合所触 对照!! 8#;*<; )$ "%9 88 %:<*9< )< %9# "*!; 0UE0L 苦参碱 "*;" 0UE0L 苦参碱 ;< 8!;*$8 )9 %<8 $ 99 :!<*<8 )9 "#$ $ $!!"#*;< )$ :89 $ 发!F>GL 分子以同三聚体形式和 $ 个 F>G 分子交联 形成 死 亡 诱 导 信 号 复 合 体! 与 &>G.>G- ": 的 前 体 #*"" 0UE0L 苦参碱!*"" 0UE0L 苦参碱!< ;:"*8! )9 #<$ $!< 8""*:< )$ :#< $ 9; "#"*"$ )9 ;98 $ 9: ##$*<$ )<!9: $!"<*"; ; "8$*:$ )<:9 $ # "<<*;8 组别 F值 K值 a"*"; a"*"; ##注#与对照组比较! $K a "* "; FL(&= 相 互 作 用! 经 蛋 白 酶 水 解 后 活 化! 活 化 的 &>G.>G- ": 形 成 异 四 聚 体! 并 剪 切 K24B>G.>G- "$ 等蛋白! 释放并活化 &>G.>G- "$! 诱导细胞凋亡 (%) * 肿瘤的生长有赖于血管的形成! 如无新生血管生成提 供营养!肿瘤细胞就不能继续生长* 研究发现! 3=HF 恶性增殖!这种特性使端粒酶成为当今肿瘤研究的热 是目前发现最强的血管活性因子! 可由肿瘤细胞本身 点* 本研究发现苦参碱能够促进 +&F" 8 细胞凋亡!并 随苦参碱浓度的增加及作用时间的延长端粒酶活性逐 和炎细胞$ 主要是巨噬细胞% 产生* 3=HF 与血管内皮 细胞和成纤维细胞表面的血管生成因子受体结合! 促 渐降低!也就是说苦参碱对端粒酶的抑制作用存在剂 进血管内皮细胞分裂'增殖及毛细血管出芽!形成新生 量+效应和时间+效应的正相关* 这有可能说明! 苦 毛细血管!进而促进肿瘤持续生长'肿瘤基质形成* 参碱能够有效抑制端粒酶活性! 并有可能通过抑制端 本实验发现! 不同浓度苦参碱处理 +&F" 8 细胞 后! 乳腺癌细胞 F>G 蛋白表达明显增高! 并随苦参碱 粒酶活性而诱导乳腺癌细胞凋亡*
浓度的增加. / 蛋白表达也逐渐增高 = 与之相反 乳腺癌细胞! 0. 蛋白表达则明显降低 并随苦参碱浓度的增加! 0. 蛋白表达也逐渐降低 = 因此 本研究认为 苦参碱有可能通过某种途径激活或增强了. / 蛋白活性 触发一系列级联反应 进而诱导乳腺癌细胞凋亡 同时 苦参碱能够抑制! 0. 的活性 抑制新生毛细血管的生成 进一步抑制乳腺癌细胞的生长 浸润和转移 本研究发现 乳腺癌细胞. / 蛋白和! 0. 蛋白表达呈负相关 提示苦参碱可能通过多种或某种途径在激活肿瘤坏死因子受体. / 的同时下调! 0. 蛋白表达 或者上调. / 蛋白后 进而触发! 0. 蛋白的下调 综上所述 苦参碱能够通过多种途径抑制乳腺癌.& 细胞生长 可能通过激活或上调. / 蛋白受体 抑制端粒酶活性诱导乳腺癌细胞凋亡 通过下调! 0. 蛋白表达 抑制肿瘤血管形成 进而抑制乳腺癌细胞增殖 激活. / 蛋白受体 抑制端粒酶活性及! 0. 蛋白表达 有望成为临床治疗乳腺癌的新靶点 苦参碱可能兼具多重攻击这些新靶点的功能 产生联合 协同的效果 诱导乳腺癌细胞凋亡和抑制其生长 苦参碱极有可能成为临床治疗乳腺癌更加有效的化疗药物之一 参考文献 6 : 01$ 26* 2 2 " " "* # #6# * * " 6 # "26* / 2 " # # 2 ' 7 8 : 7 : 0 " 1 #$ " 3 " " #6 7 /)6 "6/ * ## * * " * ; 6 " / / * 3 1 / # & ' ' + : 0 " :: #$ 26* / " "/ / 7 / * * * " * ##/ 3 # " ". /-. / 2 * 3 " " * / / " *"# ' 周喜汉 韦星 黄赞松 等 $ 苦参碱诱导人结肠癌 细胞凋亡及机制探讨 山东医药 ' ' 石嵘 姜立 周珏宇 等 $ 莪术油对乳腺癌.& 细胞端粒酶活性及 +% 损伤反应的调控作用 中药新药与临床药理 ' ' 任妮丽 吴方毅 吴宏杰 等 $ 重组人干扰素 对乳腺癌.& 细胞端粒酶活性的影响 湖北医药学院学报 & 陈亚民 宋蔚青 $ 乳腺癌相关生物学预后因子的研究进展 现代肿瘤医学 & 赵明玄 汪静 邓敬兰 等 $ 放射性碘标记 1 对 ' 1 细胞受体内化及杀伤作用的研究 中华核医学杂志 & & & & 肖钟迪 张玉成 梁春林 等 $ 放射性 粒子植入对裸鼠人乳腺癌细胞移植瘤的抗肿瘤作用 吉林大学学报 医学版 & & & 收稿 & 修回 第八次全国中西医结合男科学术会议在开封召开 第八次全国中西医结合男科学术会议于 月 日在古都开封举行 本次会议由中国中西医结合学会男科专业委员会主办 河南省中医院和河南省中西医结合男科专业委员会共同承办 本次大会收到专题报告课件 个 论文 篇 其中男性不育 篇 前列腺疾病 & 篇 性功能障碍 篇 男性杂病 && 篇 不孕不育 && 篇 本次会议的主题为 @ 传承创新特色疗法 建设中国特色男科 @ 与会专家交流了男科领域近年来的最新技术和中医特色疗法 从而推进我国男科事业又好又快发展 本次会议专题报告内容丰富 热点讨论新颖 多彩纷呈 讨论集聚了国内著名专家的观点 也活跃了学术交流的气氛 与会代表的积极参与 获得了预期效果 本刊讯