第卷第期年月西安交通大学学报医学版!" #$# # %&'&!& 基础研究蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂重组蛋白对小鼠黑色素瘤血管生成拟态的影响及其机制谢群林扬元林丽琳翁剑武林建银福建医科大学分子医学研究中心消化道恶性肿瘤教育部重点实验室福建福州福建省莆田学院基础医学院

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兄隗
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1 第卷第期年月西安交通大学学报医学版 #$## 基础研究蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂重组蛋白对小鼠黑色素瘤血管生成拟态的影响及其机制谢群林扬元林丽琳翁剑武林建银福建医科大学分子医学研究中心消化道恶性肿瘤教育部重点实验室福建福州福建省莆田学院基础医学院福建莆田摘要目的探讨蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂 #$#$ ##$ 重组蛋白对小鼠黑色素瘤血管生成拟态 $#) 形成的影响及相关机制方法建立 )$ 胶肿瘤细胞类血管生成模型分析 ##$ 重组蛋白 * 对 +- 细胞 ) 形成及基质金属蛋白酶.$$ $#)))). 蛋白表达的影响建立 +* 小鼠黑色素瘤实验性肺转移模型经重组蛋白治疗后应用和过碘酸雪夫 $##$ 双重染色法检测肺转移瘤 ) 形成免疫组织化学法检测转移瘤 )))). 表达结果与对照组相比 ##$ 重组蛋白作用后 +- 细胞体外 ) 形成及 )))). 蛋白表达明显减少并呈剂量依赖性两治疗组小鼠肺转移瘤 ) 形成及 )) )). 表达明显下降结论 ##$ 重组蛋白能够抑制 ) 形成下调 )))). 表达是其中的机制之一关键词蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂血管生成拟态黑色素瘤基质金属蛋白酶基质金属蛋白酶. 中图分类号文献标志码文章编号.. # #$#$ * 7$$ * * :$ *:$ *$$$ $##$$#$ )$)-$ )$ #- +$#)$$ $ $ ## # # ### # #### #)* + #-. +## # # #.##$# $ )*#+ ## #.# # #. + # ## #. #. ## #..#.-. )# ###)*# +-.. ) ### # 收稿日期修回日期. 基金项目国家自然科学基金资助项目福建省科技重大资助项目 7 福建省自然科学基金指导性科技计划项目 $$$$- $ $#$- $ -$ 7$$#$- $ -$ 通讯作者林建银教授博士生导师 $ $ 作者简介谢群. 女汉族博士副教授研究方向肿瘤的复发与转移 $ 网络出版时间. 网络出版地址 #$...

2 西安交通大学学报医学版第卷传统观念认为肿瘤血管即内皮依赖性血管是肿瘤获得营养供应的唯一途径更是肿瘤侵袭转移的重要原因自从... 年 ) 等报道了在人眼葡萄膜黑色素瘤中存在由肿瘤细胞围成的管道结构血管生成拟态 $#) 之后不断有研究证实多种恶性肿瘤存在这种与经典肿瘤血管生成途径不同的模式且 ) 与肿瘤的进展和预后紧密相关从而为肿瘤的治疗提供了全新思路蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂 #$# $ ##$ 是从眼镜蛇蛇毒中分离纯化的一种新型小分子蛋白质本室前期通过基因工程合成 ##$ 全基因通过毕氏酵母系统表达并通过固定化金属离子配体亲和层析法 $$ $$) 纯化生产 ##$ 重组蛋白研究发现该重组蛋白可以抑制肿瘤内皮依赖性血管生成为了进一步探讨 ##$ 重组蛋白是否具有抗 ) 作用本研究拟采用 )$ 胶肿瘤细胞类血管生成模型免疫细胞化学染色 +* 小鼠黑色素瘤实验性肺转移模型和过碘酸雪夫 $# 双重染色及免疫组织化学染色等方法探讨 ##$ 重组蛋白对小鼠黑色素瘤 +- 细胞体内外 ) 形成的影响及相关机制为 ##$ 抗肿瘤血管生成作用研究提供实验依据 * 材料与方法 ** 主要材料及试剂胎牛血清 ) 培养基购自美国公司 )$ 胶购自 + 公司 )) 和 )). 抗体为 $$ 公司产品法染色试剂盒为福州迈新生物技术开发有限公司产品试剂盒购自罗基北京生物技术有限公司 +* 小鼠雌性体质量周龄购自上海斯莱克动物实验有限公司其余产品均为国产或进口分析纯 *+ 药物和细胞株 #$ 重组蛋白由本室经系统表达经 ) 纯化获得小鼠黑色素瘤细胞 +- 引自中国典型培养物保藏中心武汉以含 ** 胎牛血清的 ) 培养基进行培养 * 方法 **)$ 胶肿瘤细胞类血管生成模型实验以每孔 * 的 )$ 胶 * 包被. 孔培养板收集对数生长期 +- 细胞以每孔个接种于培养板内融合后分别加入终浓度为和 * 的 ##$ 重组蛋白设立 + 对照组常规培养后镜下每孔选取个视野计算肿瘤细胞类血管样结构即 ) 的数量 *+ 免疫细胞化学染色取上述 )$ 胶肿瘤细胞类血管生成模型实验中作用后的细胞进行免疫细胞化学染色按法进行操作滴加 )))). 第一抗体 > 孵育过夜后以相应的第二抗体室温孵育后 + 显色苏木素复染盐酸酒精分化中性树胶封片后置显微镜下观察肿瘤细胞胞质呈棕黄色为阳性表达采用图像分析系统 *$ 于倍视野下测定阳性染色吸光度值每张切片随机选取个大小相等的视野结果以个视野的平均值表示 *+* 小鼠黑色素瘤实验性肺转移模型 +* 小鼠只随机分为对照组治疗组每次及治疗组每次用 * 的 $ 重悬对数生长期 +- 细胞调整浓度为个 * 组小鼠于尾静脉分别注射 * 瘤细胞悬液两治疗组则分别在注射瘤细胞前注射瘤细胞后及注射瘤细胞后分三次于尾静脉注射相应剂量 ##$ 重组蛋白对照组则同法注射等体积 * 的 $ 后处死小鼠取肺组织计数肺转移灶结节数组织经固定包埋切片与染色镜下观察病理改变 *- 和双重染色取上述组小鼠肺组织进行法免疫组织化学染色镜下观察内皮细胞着色后终止显色反应将切片置于过碘酸溶液氧化蒸馏水冲洗次后置于 # 液中室温下反应经苏木素衬染脱水透明树胶封片 ) 的判定镜下观察肿瘤细胞围成腔隙样结构腔内可见红细胞管壁可见呈樱桃红色的阳性物质围成基底膜样结构将肿瘤细胞和红细胞分开且染色阴性即没有血管内皮细胞环绕便为拟态血管 ) 管壁有阳性的内皮细胞和染色阳性的结构无论腔内有无红细胞则为内皮依赖性血管每张切片随机选取个视野计数取其平均值 *. 免疫组织化学染色组小鼠肺组织进行法免疫组织化学染色第一抗体为 )) 及 )). 参照上述免疫细胞化学染色方法进行肺组织转移瘤细胞胞质呈棕黄色为阳性采用图像分析系统 *$ 于倍视野下测定图像中的阳性染色的吸光度每张切片随机选取个视野结果以个视野的平均值表示 * 统计学分析采用统计软件进行数据分析资料数据以表示多组间比较采用

重组蛋白抑制 :BGJB 细胞体外 LM 的形成在相应时间点观察 A 胶培养 > $$$ O+ O` # $$$ # D` ## $$ D` $$$ #+ D` CD$ 细胞 @A 形成情况重组蛋白作用 # # D 时对照组均可见 CD$ 细胞胞体细长自发首 $$$ #` ##O $$$ F+ D` DF D $$$ D O+

3 #期谢群林扬元林丽琳等 +蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂重组蛋白对小鼠黑色素瘤血管生成拟态的影响及其机制 _ *. LT_@L 进行分析组间差异采用 BMJ 检验以 # $ 为差异有统计学意义 CD$ 细胞排列松数量减少图个剂量组数量及与对照组的比较情况如 C 结果下# # ` $OD $# #` # d $$$ O` D# d $$$ F+ ##` $ CH B. 重组蛋白抑制 :BGJB 细胞体外 LM 的形成在相应时间点观察 A 胶培养 > $$$ O+ O` # $$$ # D` ## $$ D` $$$ #+ D` CD$ 形成情况重组蛋白作用 # # D 时对照组均可见 CD$ 细胞胞体细长自发首 $$$ #` ##O $$$ F+ D` DF D $$$ D O+ $D` D# $$ D 尾相连形成大量血管腔样网状形成数量个$视野分别达 O` # O+ ` ` $ $$$ D#` $#D $$$ #+ # $$$ O` OO $$$各组 ` F # # DD` $D经种浓度重组蛋白作用后的差异均具有统计学意义图 # 图 B. 重组蛋白对 :BGJB 细胞 LM 形成及 MMN CMMN O 表达的影响 MGa$$ R : AAG #) - AAG F) CD$ 形成及 AAG # 蛋白表达情况 # L#LD#对照组 $:>$B 组 #:>$B 组 $:>$B 组 $$:>$B 组 #$$:>$B 组形成及 AAG F 蛋白表达情况 # C#CD#对照组 $:>$B 组 #:>$B 组 $:>$B 组 $$:>$B 组 #$$:>$B 组 d#$$: CH C. 重组蛋白抑制 >FP:Q#G 小鼠黑色素转移瘤 LM 的形成各组小鼠的肺转移率为 $$e 对照组可见大量散在转移灶瘤细胞形状各异核异型性明显两治疗组肺转移灶明显减小减少提示重组蛋白可以抑制小鼠黑色素细胞肺转移 )*图进行 HJ 和 GLM 双重染色方法后如图 L C H 所示对照组中可见小鼠肺转移瘤内存在较多数量的由 CD$ 细胞围成的 GLM 阳性染色但 HJ 染色阴性的管腔样结构形似血管腔内有红细胞外围未图 C 各组 LM 形成数量的比较 : CD$. :. # $ +-对照组 HJ 染色阳性的内皮细胞围成的管腔则为内皮依赖性血形成数量个$视野为 F+ $` # $$***+ $$

西安交通大学学报医学版 # 第卷 d两个治疗组中 @A 形成的数量 D+ D` 的同时应用免疫细胞化学染色检测重组蛋白作用 + `

小鼠肺转移肿瘤组织病理学变化 c ) > : > [ HCB$D: cra$$ L#对照组 C# #:>$7> 组 H# $:>$7> 组 d$$:.

@A : HCB$D: L C H 分别为对照 #:>$7> 和 $:>$7> 各组 @A 及 A@J 形成红色箭头示 @A蓝色箭头示 A@JHJfGLM 双重染色 a$$

$重组蛋白对 :BGJB 细胞 MMN CMMN O表达的影响 \+ R :.$ d与对照组相比两治疗组重组蛋白抑制 AAG #表达 #F` 例数吸光度值 AAG# 吸光度值 AAGF $D #FF` $差异具有统计学意义 # 对照组 #O` $#

4 西安交通大学学报医学版 # 第卷 d两个治疗组形成的数量 D+ D` 的同时应用免疫细胞化学染色检测重组蛋白作用 + ` $ d与对照组相比均明显减少 ## # 后 CD$ 细胞 AAG #AAG F 蛋白表达 AAG #图 LAAG F图 C在种浓度重组蛋差异具有统计学意义图 J 白作用 # 后表达逐渐降低与对照组相比吸光度 CH D. 重组蛋白抑制 :BGJB 细胞体内外 MMN CMMN O 的蛋白表达在进实验值的差异具有统计学意义 # $表图 D 各组 >FP:Q#G 小鼠肺转移肿瘤组织病理学变化 c ) > : > [ HCB$D: cra$$ L#对照组 C# #:>$7> 组 H# $:>$7> 组 d$$:. 重组蛋白对 >FP:Q#G 小鼠黑色素转移瘤图 LM 形成的影响 R : HCB$D: L C H 分别为对照 #:>$7> 和 $:>$7> 各及 A@J 形成红色箭头色箭头示 A@JHJfGLM 双重染色 a$$ d$$: J#各组 HCB$D 小鼠肺转移数量比较 # d $$$# $ d# )) $$ +-对照组$# $ $$$ +-对照组表 B. 重组蛋白对 :BGJB 细胞 MMN CMMN O表达的影响 \+ R :. ) AAG #- AAG F CD$ # 通过 MG 法检测小鼠黑色素转移瘤 AAG AAG F 蛋白表达如图所示#对照组 AAG #蛋白表达呈强阳性 F` $ d与对照组相比两治疗组重组蛋白抑制 AAG #表达 #F` 例数吸光度值 AAG# 吸光度值 AAGF $D #FF` $差异具有统计学意义 # 对照组 #O` $# FO` $$F $图 D 中显示对照组 AAG F蛋白呈强阳性表重组蛋白 $:>$B OO` $ D` $$F 达 ` $ d与对照组相比两治疗组重组蛋白抑制 AAG #表达 #F` $# #D` 组别重组蛋白 #:>$B D` $ ` $$O 重组蛋白 $:>$B ` $$F D` $$O 重组蛋白 $$:>$B #` $$F #` $$ 重组蛋白 #$$:>$B $` $# $` $ # $ +- 对照组AAG ##)) d+ $$$AAG F# F$F $$$ d+ )) $# d差异具有统计学意义 # $ D 讨论肿瘤的生长和转移依赖于血管高度恶性肿瘤快速生长仅依赖于经典的内皮细胞依赖性血管无法 $$***+ $$

) AAG # HCB$D: L C H 分别为对照 #:>$7> 和 $:>$7> 组 AAG #表达情况 MGa$$ d$$: J#各组 HCB$D 小鼠 AAG #表达的比较))

) AAG F HCB$D: L C H 分别为对照组 #:>$7> 和 $:>$7> 组 AAG F表达情况 MGa$$ d$$: J#各组 HCB$D 小鼠 AAG F表达的比较

小鼠黑色素瘤实验性肺转移模型的转移瘤灶内也发现 CD$ 细胞彼此间相连形成网络状结管肿瘤细胞通过自身变形及与细胞外基质相互作

重组蛋白治疗后瘤结节变小用模拟血管壁结构形成由一层肿瘤细胞而不是内皮细胞被覆管腔内可见血细胞有时可见一层 GLM

重组蛋白具有抑制黑色素瘤侵袭转移作用且能够抑制 @A 的形成瘤微循环为肿瘤生长转移提供更为充足的血液供结合前期实验已发现.

5 #期谢群林扬元林丽琳等 +蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂重组蛋白对小鼠黑色素瘤血管生成拟态的影响及其机制. 重组蛋白对 >FP:Q#G 小鼠黑色素肺转移图 F 瘤 MMN C 表达的影响 R :. ) AAG # HCB$D: L C H 分别为对照 #:>$7> 和 $:>$7> 组 AAG #表达情况 MGa$$ d$$: J#各组 HCB$D 小鼠 AAG #表达的比较)) D $$$# $ dd $$$ +-对照组. 重组蛋白对 >FP:Q#G 小鼠黑色素肺转移图 G 瘤 MMN O 表达的影响 DR :. ) AAG F HCB$D: L C H 分别为对照组 #:>$7> 和 $:>$7> 组 AAG F表达情况 MGa$$ d$$: J#各组 HCB$D 小鼠 AAG F表达的比较 $$$ # $ d )) $$$ +-对照组就是最初在黑色素瘤这种恶性肿瘤组织中发现的一种由肿瘤细胞环绕形成的拟态血 HCB$D 小鼠黑色素瘤实验性肺转移模型的转移瘤灶内也发现 CD$ 细胞彼此间相连形成网络状结管肿瘤细胞通过自身变形及与细胞外基质相互作构腔内可见红细胞证实的存在而经两个不同剂量. 重组蛋白治疗后瘤结节变小用模拟血管壁结构形成由一层肿瘤细胞而不是内皮细胞被覆管腔内可见血细胞有时可见一层 GLM 数量显著减少说明. 重组蛋白具有抑制黑色素瘤侵袭转移作用且能够抑的形成瘤微循环为肿瘤生长转移提供更为充足的血液供结合前期实验已发现. 重组蛋白能够抑制应 ) D* 现已在卵巢癌肝癌胃癌等多种高度恶性肿瘤组织中发现 ) O* 本实验中将 CD$ 细胞进行 : 胶三维 > 培养制作肿瘤细胞类血管生成模型实验中发现. 重组蛋白能够抑制 CD$ 细胞类管腔样结形成且抑制作用呈剂量依赖进而在内皮细胞增殖黏附体外血管生成和微血管密度 ) * : -. 能.A@J 证实够同时抑制血管内皮依赖性血管和拟态血管提示. 作为一种作用广泛而全面的肿瘤血管生成抑制剂在抗肿瘤血管生成等方面具有较大的应用开发潜能 $$***+ $$

6 西安交通大学学报医学版第卷血管生成拟态的形成机制目前尚不清楚主要认为与肿瘤细胞的可塑性相关肿瘤细胞能够模仿内皮细胞的生物学行为表达 -) 等. 多种与内皮细胞相关的基因 ) 是一组 C D 依赖性肽酶可以降解多种细胞外基质和基底膜中的胶原成分在肿瘤侵袭转移及血管生成中起重要作用其中又以 )) 和 )). 最为重要近年来许多学者发现 )))). 参与了 ) 的形成本室前期研究也发现转染 ##$ 基因可以抑制 )))). 的活性提示 ) 可能是 ##$ 的作用靶酶本实验中发现重组蛋白抑制 +- 细胞体内外 )))). 表达与 ) 形成受抑制的结果相一致推测重组蛋白抑制 ) 的作用可能与降低 ) 的表达有关 # #$ 通过抑制 )))). 表达导致其对细胞外基质的降解减少减少 ) 形成进而抑制肿瘤侵袭转移总之 ##$ 重组蛋白能够抑制肿瘤细胞体内外 ) 形成从而阻断恶性肿瘤特殊的血液供应方式间接抑制转移瘤形成是抗肿瘤血管生成的重要途径下调 )))). 表达则可能是其抑制 ) 形成的机制之一研究结果将为 ##$ 重组蛋白作为抗肿瘤侵袭转移药物的进一步研制和开发应用提供理论依据和实验数据而 ) 也将有望成为高血行转移恶性肿瘤治疗的新靶点参考文献 $*) $$## # ###... 张熙郭世文尉春艳星形细胞瘤中血管生成拟态的鉴定及其临床意义西安交通大学学报医学版 $ #. #. 7 # #+)* #. # -# 7 # ## ++**** ## $* $$$* # ## # #.#. 7) 7### #. -###. ####$..$ ### +.# ### #.. $ +## # ##+..+ # #). )$7$ # #. ## #. )$*$.. ###.#. #$.. $ #+ ### #-. # 7. # -. ##.#. # #. 编辑韩维栋

材料方法统计学分析体外作用对细胞增殖的影响

材料方法统计学分析体外作用对细胞增殖的影响生物技术通报罗春燕官涛王红宁杨艳姜蓉胡晓舒华自森王建伟旨在探讨人参总皂苷对细胞表达的影响法显示对细胞增殖抑制程度呈剂量与时间依赖性增加且呈正相关关系流式细胞术表明能阻止细胞从期向期移行激光共聚焦显微镜观