第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!"#$## %&'& $& 基础研究 对甲状腺 细胞凋亡及周期的影响 张伟晓 高 蕊 于 燕 郭 坤 刘 岩 喻铭启 杨爱民 西安交通大学医学院 第一附属医院核医学科 公共卫生系 陕西西安 $% 摘要 目的 研究 & 诱导人甲状腺 ' 细胞凋亡 周期阻滞及其与 ()*+ 等基因表达的关系 方法 ' 细胞经 & 照射后, 方法检测细胞存活率 流式细胞仪检测细胞凋亡及周期分布 -.(/0. 及 1#+#! 检测细胞凋亡相关基因 ()*+ 的. 及蛋白表达水平的变化 结果, 结果显示不同放射性活度 $ %, 的 & 作用于 ' 细胞不同时间 $% 后 对 ' 细胞增殖有明显的抑制作用, & 作用于细胞 $ 后 出现明显的细胞凋亡, & 作用细胞 后 2, 期细胞所占百分比增加 实时定量 /0. 及 1#+#! 结果均显示抗凋亡基因 ( 表达降低 促凋亡基因 )*+ 表达增加 结论 & 能够通过诱导 ' 细胞凋亡及 2, 期阻滞抑制细胞增殖 ( 及 )*+ 均参与了 & 诱导 ' 细胞凋亡的过程 关键词 &' 细胞 凋亡 2, 阻滞 ()*+ 中图分类号.$ 文献标志码 文章编号 %$((%( $%!"!##! $%$&'! &%%$$! 3'2 1#(* 24." 56 5*! 2647"! &6 5*! 56,!8( 52(! 9#*#!:"#*,#!##)+:*#'+*,#*;:*!*!86!#+9#*#!:/" '#*,#*;:*!*!86!#+*!$%0!* #""#"### #""#&#( #)*"( ++!#" ### ) "" ( ) # &,-./ " 0( )""#1#" """&"""# $&&"&%!1* #"# (#)" $"% &&"&!1* #""##" "$&& #! #)#"#" )#&!1* " ""$&&"")1#) (""#" && "#( # )#"! &)1#"" "#"( "& () * "!1# 辐射射线可导致严重的 9 损伤 细胞通过细胞修复 周期阻滞或凋亡等非常精密的调控机制对 此作出反应 其中细胞凋亡是电离辐射所致细胞死亡 的主要形式 细胞周期阻滞可以为修复 9 损 收稿日期 (( 修回日期 (( 基金项目 国家自然科学基金资助项目 $ ;"##*!**"*;#!#)"!*!:0!*$ 通讯作者 杨爱民 主任医师 (**!8*!*"#"! 作者简介 张伟晓 $( 女 汉族 在读硕士研究生 研究方向 & 核素治疗 (*#!*+#% 网络出版时间 ($( 网络出版地址!<!#< +#*%.$$!"#"!
张伟晓 高 蕊 于 燕 等 & 对甲状腺 ' 细胞凋亡及周期的影响 % 伤赢得足够的时间 研究较多的细胞周期检测点主要 是 2; 期和 2, 期检测点 若 9 损伤程度严重以致无法成功修复时 机体则启动凋亡通路诱导 细胞凋亡 目前 关于电离辐射诱导细胞凋亡及周期阻滞的研究主要集中于 射线和 射线 而放射性核素 ( 射线的研究报道较少 & 半衰期为 平均射程为 是典型的释放 ( 射线的放射性核素 相对较长的半衰期为核素发挥辐射治疗作用提供了足够的时间 & 以其组织特异性广泛用于甲亢 ( 及分化型甲状腺癌术后清甲治疗 还可标记于特 % 异性抗体用于非霍奇金淋巴瘤等其他肿瘤的治疗 本研究的目的旨在研究 & 发射的 ( 射线诱导甲状腺 ' 细胞凋亡和细胞周期阻滞的作用 并初步探讨其生物学机制 材料与方法 + 实验材料 仪器及主要试剂 人甲状腺 ' 细胞由西安交通大学医学院第一附属医院内分泌实验室侯鹏教授馈赠 放射性核素 & 由广州希埃核医药中心提供 细胞凋亡试剂盒!!#!(=( )64; 为德国.# 公司产品 /0. 引物由上海生工生物工程公司设计合成 ( 及 )*+ 抗体为美国 + 公司产品 内参基因 2/9' 抗体为美国 * 公司产品 型酶标仪为美国 #< 公司产品 )0;0*" 型流式细胞仪为美国 9 公司产品 0)% 实时定量 /0. 仪为美国 (.* 公司产品 +,- 法检测 对 细胞的生长抑制作用 将 ' 细胞制成单细胞悬液 以 > 浓度接种于 % 孔板 每组设 % 个复孔 细胞培养 后 加入不同放射性活度的 &$%, 作用不同时间 $% 每孔加入, 继续培养 每孔加入 9,;4 在摇床上低速震荡! 待结晶充分溶解后 在酶标仪 $! 处测量各孔的吸光值 $ 同时设调零孔及对照孔 按下列公式计算细胞存活率 细胞存活率? 实验组 @ 空白对照 对照组 @ 空白对照 >A + 流式细胞仪检测细胞凋亡率 细胞以合适的浓度 > > 接种于六孔板 培养 后加入, & 对照组加入相同体积的 /; 经 & 处理不同时间 $ 后 将培养基及细胞悬液回收至 离心管 /; 清洗两遍 离心!! 加入!!#(!(=()64; 缓冲液后上机检测 +. 流式细胞仪检测细胞周期的再分布 细胞以 > 浓度接种于六孔板中 培养 后加入, & 对照组加入相同体积的 /; 经 & 处理不同时间 后 弃掉培养基 将细胞悬液回收至 离心管中 细胞经 /; 清洗后加入 $ 乙醇 在 B 冰箱中过夜保存 离心!! 后弃掉乙醇 继续用 /; 清洗细胞 加入 /& 后上机检测 +/ 实时定量 0 检测 $", 及 1 表达水平的变化 用.+.#*8#! 提取细胞. 分光光度计测量. 浓度并计算 % 比值 内参基因为人 (*! 基因 上游引物序列为 C(0( 222020222(C 下游引物序列为 C(22220222220(C( 上游引物序列为 C(22222222000(C 下游引物序列为 C(220200222( 00(C)*+ 上游引物序列为 C(220( 200020(C 下游引物序列为 C(0( 22000220(C 加入!8. >/#;":# 48/( #.*!%#+ 及.*+#:## ' 4 配制成 反应体系 反转程序为 $ B! B + 实时定量 /0. 反应体系如下 ;5., /0. 上游引物 /0. 下游引物 模板 9 溶液 % ' 4 采用两步法 /0. 反应程序 +*!$ 检测 $", 及 1 蛋白表达水平的变化 收集阴性对照组 实验组细胞 用 /; 清洗 加入细胞裂解液裂解细胞 提取总蛋白 测定蛋白含量 灌制 8 的分离胶 8 的浓缩胶的 ;9;( /2 凝胶 每个样品槽内加入 8 总蛋白进行 ;9;(/2 电泳 通过电转印法将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶上转移 /=9) 膜上 /=9) 膜用 8 牛血清白蛋白封闭液 B 封闭 后加入一抗 B 孵育过夜 ; 洗膜后加入二抗 羊抗兔或羊抗鼠 $B 孵育 ; 洗膜 增强化学发光 #!*!# #"!#+#!#0 显影 扫描 用 -"*! 4!# 图像分析系统扫描图像的吸光度 以各组目的蛋白条带吸光度值与内参蛋白 2/9' 吸光度值计算相对比值 + 统计学分析 所有数据以均数 D 标准差 D 表示 采用 ;/;;% 软件对实验数据进行统计分析 实验组细胞存活率与对照组间比较采用两独立样本 检验 多组间细胞凋亡率 2, 期百分比及相关基因. 和蛋白表达水平的比较采用!"#"!
% 西安交通大学学报 医学版 第 卷 单因素方差分析 4!#(*4= 两两比较采用 (;"#!(#*!(7#"+ 检验 为差异有统计学意义, 结 果,+ 对 细胞的生长抑制作用 $ %, & 分别作用于 ' 细胞 $% 后 对细胞有明显的增殖抑制作用 图 而且随 & 活度增加及作用时间延长 细胞存活率逐渐降低 具有时间及剂量依赖性 其中 & 作用 ' 细胞 的半数生长抑制活度为 $$ D, 各实验组间比较 差异无统计学意义 经, & 作用细胞 后 )*+. 相对表达量增加 与对照组比较 差异有统计学意义 各实验组间比较 和 )*+. 表达量均高于 差异有统计学意义 和 )*+. 表达量比较 差异无明显统计学意义 表.+-23 作用于 不同时间后对细胞周期的影响 *:#+:, &! # #:' #::##!#!+ 时间 细胞周期分布 A 22 ; 2, D% $D$% D% $D %D$ $D% %D D D$ %D% $D $D 与对照组 组 比较 图 不同放射性活度 作用于 不同时间后对细胞生长的影响 )8:#+::##!**: &!#8 :' #::##!#!+,+, 诱导 细胞凋亡, & 作用细胞 $ 后 细胞凋亡率分别为 % D%ADA 及 %DA 与对 照组 %D%A 比较 差异有统计学意义 各组两两比较发现 $ 细胞凋亡率显著高于 及 细胞凋亡率显著高于,+ 诱导 细胞,- 期阻滞 由表 可以看出, & 作用细胞 后 2, 期细胞所占百分比逐渐增加 与对照组比较 差异有统计学意义 组间比较结果显示 2, 期细胞所占百分比高于 而 2, 期细胞所占百分比高于 及,+.$", 和 1 表达水平的变化 实时定量 /0. 显示抗凋亡基因 (. 水平降低 促凋亡基因 )*+. 水平升高 图 经, & 作用细胞 后 (. 相对表达量降低 与对照组比较 差异有统计学意义 图,.+-23 作用于 细胞不同时间后 $", 和 1 表达水平的变化 )8(*!)*+.##++!+!' #*:( #, &#*#!::##!#!+ (. 相对表达量 )*+. 相对表达量 与对照组比较,+/$", 和 1 蛋白表达水平的变化 1#+#! 结果显示抗凋亡基因 ( 蛋白表达水平降低 促凋亡基因 )*+ 蛋白表达水平升高 图 对照组!"#"!
张伟晓 高 蕊 于 燕 等 & 对甲状腺 ' 细胞凋亡及周期的影响 % 和经, & 作用不同时间 后细胞 ( 蛋白的相对吸光度值分别为 $$D D%D$ 和 %D$ 多组间比较 差异有统计学意义 两组间比较发现 和 ( 蛋白表达量均低于 差异具有统计学意义 而 ( 蛋白表达量与对照组比较无明显差异 对照组和经, & 作用不同时间 后细胞 )*+ 蛋白的相对吸光度值分别为 D$%D D$ 和 D$ 多组间比较 差异有显著性 两组间比较发现 和 )*+ 蛋白表达量均高于 差异具有统计学意义 而 )*+ 蛋白表达量与对照组相比无明显差异 说明经 & 处理 后 凋亡相关基因表达发生变化 抗凋亡基因 ( 蛋白表达水平降低 促凋亡基因 )*+ 蛋白表达水平升高 这与细胞凋亡的发生时间是一致的 导细胞凋亡及细胞周期阻滞的作用及其细胞 分子生物学机制具有重要意义 电离辐射是放射核素治疗的基础 是射线引起物理 化学和生物学效应的机制之一 电离辐射致 9 损伤的严重程度与射线类型及放射剂量等因素有关 传能线性密度越高 带电粒子的电离作用越强 致 9 损伤越严重 本结果显示 & 对甲状腺细胞 ' 细胞增殖有明显的抑制作用 而且随着 & 放射剂量的增加及作用时间的延长 细胞增殖抑制率增加 说明 & 抑制细胞增殖与其放射剂量及照射时间等因素有关 这就为临床上以合适的放射剂量 适当的时间及作用方式治疗疾病提供了理论依据 放疗及化疗致 9 损伤均可导致细胞凋亡及 $( 细胞周期阻滞 这对于维持基因组的稳定性具有重要意义 研究表明 射线能够诱导细胞 2, 期 阻滞 ;0 发射的 ( 射线亦能够诱导人乳腺癌 细胞 2, 期阻滞 本研究结果表明 & 对 '( 细胞有明显的 2, 期阻滞作用 而且与 & 的作用时间呈正相关 细胞凋亡途径分为线粒体途径及死亡受体途径 线粒体途径主要是由 ( 家族基因调节 ( 家族分为抗凋亡基因如 ( 和促凋亡基因如 *(* 比值决定细胞是否发生 ( 凋亡 )*+ 是死亡受体途径中的重要分子 )*+ 受体与配体结合后可通过启动死亡受体途径诱导细 胞凋亡 本结果显示 经 & 处理后 细胞凋亡率较对照组明显增加 本研究发现 & 作用甲状腺 ' 细胞 后.(/0. 及 1#+#! 结果均显示 ( 基因表达降低 )*+ 基因表达升高 与细胞凋亡发生的时间是一致的 说明 ( 及 )*+ 均参与了 & 诱导 ' 细胞凋亡的过程 而且是通过线粒体途径及死亡受体途径共同实现的 这一结 图.+-23 处理 不同时间后 1 和 $", 蛋白表达水平的变化 )8)*+*!(#!##++!+:' #*:( #, &#*#!::##!#!+ )*+ 和 ( 蛋白 1#+#! 显影 )*+ 和 ( 蛋白质相对吸光度值 与对照组比较 讨 论目前 关于电离辐射诱导细胞凋亡及细胞周期阻滞的研究主要集中于 射线和 射线 而关于放射性核素 ( 射线的研究报道较少 与外照射不同 放射性核素内照射具有辐射作用时间的持续性和作用效应的累积性等特点 因此 研究放射性核素 ( 射线诱 果与报道基本一致 张军宁等在 ; 诱发 7% 癌细胞凋亡放射毒理效应的分子机制的研究中发现 ; 发射的 @ 射线照射 7% 细胞后 细胞凋亡与细胞坏死与对照组相比均有所增加 且 ; 诱导 7% 细胞的凋亡可能是通过 (. 及其蛋白表达降低 (* 比值下降而调控的 邹保民 等报道的.# @ 射线也能诱导前列腺癌 /0( 细胞凋亡 ( 及 * 基因均参与了.# 诱导的细胞凋亡过程 总之 & 能够诱导 ' 细胞凋亡及 2, 期阻滞 ( 及 )*+ 均参与了 & 诱导 ' 细胞凋亡的过程 以上研究为临床应用放射性核素 & 治疗疾病提供了理论依据 下转第 % 页!"#"!
杨锦茹 雷红霞 宋 艳 等 实时超声弹性成像在鉴别诊断甲状腺结节性质中的价值 % ""&"& 123 3!1'$45&"" 崔可飞 滑少华 贺晓 等 & 定量超声弹性成像技术对单发甲状腺 #" " 结节的鉴别诊断 & 郑州大学学报 医学版 %$ &"!"%$$& $& 周萍 詹维伟 任新平 等 & 超声弹性成像诊断甲状腺结节的价值 李萍 宋烨 胡小涛 等 & 超声弹性成像与常规超声诊断甲状腺良 & 中国医学影像学杂志 $%%& 性结节的对照研究 & 同济大学学报 医学版 编辑 卓选鹏 & 上接第 % 页 3.$% 细胞和裸鼠移植瘤组织的诱凋亡作用 & 郑州大学学报 医学版 %& 参考文献 02'.02'2' &" 6/22%3/$!$$3'%2' 3/ 3$$3' 0& "#"( (### 2##)'2"##7" &1"1#$& #&."/#!"%$%$& 3!6/3$&2) "#" 42$2'!112/34&.####7"## &#-$%& &'$%& 62!$'2028!2$2' &/1# 3/4$$6' $,1/2' &/""#"#" "#&!. #&1%$& 1#& 于鹏 宫凤玲 梁永坪 等 & 分化型甲状腺癌清甲治疗后 全身 /64.65/56615&#( 显像与甲状腺球蛋白检测结果的相关性分析 & 吉林大学学 "#")("( 报 医学版 $%%& ###&.#/$%$% 田竹芳 施秉银 赵新 等 & 病患者甲亢性肝损害及其相关 %& 因素分析 & 西安交通大学学报 医学版 张军宁 洪承皎 朱寿彭 $& & $ 诱发 4% 癌细胞凋亡及其相关基因表达研究 %3/4$$6' 16!13/'/3' &" & 中华放射医学与防护杂志 %% "###"## & 邹保民 段小艺 胡国瑛 ) #&.#1/" &/ 诱导前列腺癌 -. 细胞凋亡的实验研究 & & 西安交通大学学报 医学版 %% $2%/464$24/2!!3/-&# %& 编辑 &.$#%%$& 韩维栋 张岚 高冬玲 温洪涛 等 &1# 反义寡核苷酸对食管癌 上接第 % 页.3'&.( #1$. 2'$./33'02 /2.!2' 53&- ## &'/ "-"# # %$& &3%%%& %.3' 82' 8.3' 0&1$ -62/ 52.2$422/02 &. " ""### # 1#"#() #)##1& *#( )"" & $$%%%%& %%& $!23/ $6202!/33!2' &-- 16'.2..213 2!-3/.6 -&/" ##(# #1%#### ##. E #& )#"& $$$$& %$&!2$05582' 0&.".3' 5531&3#(" +###(# ###1&2. E #)## /& 1&2#( 2.!2.255&)(" &. 3' '&/#"##1 )##1&2#( 2. )#"&% $& $& 6.$2/%&( " $4202 &1# &2/-%%& "###&'!"$# /33'02 //33!2'$2/-32&1$ $$& "&2/& 编辑 卓选鹏!"#"!