第 9 卷第 12 期食品安全质量检测学报 Vol. 9 No. 12 2018 年 6 月 Journal of Food Safety and Quality Jun., 2018 2015 年广东省桶装饮用水中铜绿假单胞菌的污染调查和药敏性分析 曾晓琮, 汪廷彩 *, 周露 *, 丁清龙, 韦云, 钟卫烨, 陈佩虹 ( 广东省食品检验所, 广州 510435) 摘要 : 目的对广东省桶装饮用水中铜绿假单胞菌污染情况进行监测分析, 构建广东省水源性铜绿假单胞 菌种质资源库及药敏风险评估数据库 方法 根据 GB 19298-2014 食品安全国家标准包装饮用水, 对广 东省 20 个城市进行桶装水中铜绿假单胞菌的专项污染调查, 并采用 Kirby-Bauer 纸片扩散法对 81 株分离株进 行药敏实验 结果 758 份样品中共 81 份样品检出铜绿假单胞菌, 铜绿假单胞菌总检出率为 10.7%, 81 份阳 性样品中有 51 份样品铜绿假单胞菌的污染水平在 1~100 CFU/250 ml; 81 株分离株对四环素 (tetracycline, TE) 米诺环素 (minocycline, MH) 磺胺甲基异恶唑/ 甲氧苄氨嘧啶 (sulphamethoxazole with trimethoprim, SXT) 的耐药率分别为 18.5% 60.5% 91.4%, 对另外 13 种抗生素的敏感性几乎 100% 81 株分离株中多重耐药菌株 18 株 结论 本研究初步构建了广东地域性铜绿假单胞菌种质资源库及水源性铜绿假单胞菌药敏风险评估数据 库, 从中发现本次污染调查的水源性铜绿假单胞菌污染率为 10.7%, 且对四环素类和磺胺类抗生素具有较强抗性, 建议相关监管部门进一步增强桶装饮用水食品安全监管 关键词 : 铜绿假单胞菌 ; 桶装饮用水 ; 污染调查 ; 药敏性分析 Pollution survey and antibiotic resistance of Pseudomonas aeruginosa isolates from barreled water in Guangdong province in 2015 ZENG Xiao-Cong, WANG Ting-Cai *, ZHOU Lu *, DING Qing-Long, WEI Yun, ZHONG Wei-Ye, CHEN Pei-Hong (Guangdong Institute of Food Inspection, Guangzhou 510435, China) ABSTRACT: Objective To detect and analyze the Pseudomonas aeruginosa in barreled water in Guangdong province, and establish the strain library and risk assessment database of drug sensitivity of water-borne Pseudomonas aeruginosa in Guangdong province. Methods The contamination state of Pseudomonas aeruginosa in barreled water from 20 cities in Guangdong province was investigated and the antibiotic resistance of the isolates was surveyed by GB 19298-2014 National food safety standard Packaged drinking water, and drug susceptibility 基金项目 : 广东省科技发展专项 (2017B020246069) 广东省食品药品监督管理局科技创新项目(2018ZDZ07) Fund: Supported by the Technology Development Foundation of Guangdong (2017B020246069) and the Science and Technology Innovation Project of Guangdong Food and Drug Administration (2018ZDZ07) * 通讯作者 : 汪廷彩, 硕士, 工程师, 主要研究方向为食品检验与食品安全 E-mail: 82626094@qq.com 周露, 博士, 高级工程师, 主要研究方向为食品生物安全 E-mail: zhoulu1982@sohu.com *Corresponding author: WANG Ting-Cai, Engineer, Guangdong Institute of Food Inspection, Guangzhou 510435, China. E-mail: 82626094@qq.com ZHOU Lu, Ph.D, Senior Engineer, Guangdong Institute of Food Inspection, Guangzhou 510435, China. E-mail: zhoulu1982@sohu.com
2966 食品安全质量检测学报第 9 卷 tests of 81 strains of Pseudomonas aeruginosa were detected by Kirby-Bauer paper dispersion method. Results The pollution rate of barreled water was 10.7% and the contamination levels of 51 positive samples were less than 100 CFU/250 ml. The susceptibility test showed that the resistant detective rates of 81 strains of Pseudomonas aeruginosa to tetracycline (TE), minocycline (MH), and sulphamethoxazole with trimethoprim (SXT) were 18.5%, 60.5%, and 91.4%, respectively. While the susceptible detective rates to the other 13 kinds of antibiotics were almost 100%. Totally 18 strains of 81 Pseudomonas aeruginosa were multi-resistant isolates. Conclusion This study has preliminarily constructed the strain library and risk assessment database of drug sensitivity of water-borne Pseudomonas aeruginosa in Guangdong province. It is found that the pollution rate of Pseudomonas aeruginosa is 10.7%, and it has strong resistance to tetracycline and sulfonamides. It is suggested that the relevant regulatory authorities should further enhance the safety supervision of the barreled drinking water food. KEY WORDS: Pseudomonas aeruginosa; barreled water; pollution survey; antibiotic susceptibility 1 引言 桶装饮用水具有方便快捷的特点, 在越来越多的家庭 公共场所得到广泛的使用 与饮用水中存在的化学物质相比, 微生物以生命体存在, 在水中可以生长繁殖, 更具有不可控制性和不可预见性 饮用水一旦受病原体污染, 可能会引起大规模的感染和疾病暴发 [1,2] 铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) 是一种重要的水源性机会性致病菌, 该菌具有强大的环境适应性和生存能力, 因其能够在低营养的水环境中生存而广泛存在于各类型水中, 一般消毒剂对其无效, 在一定条件下能产生多种致病物质, 如外毒素 肠毒素 致死毒素等, 极易造成食品污染, 给消费者带来危害 [3] [4] [5,6] 该菌能感染拟南芥和窝苣等较高等植物, 能感染新杆状线虫 [7,8] [9] [10] 果蝇和大蜡螟等无脊椎动物 更严重的是, 该菌能感染免疫力低下或缺失的病人 烧伤和手术患者 囊性纤维化病人, 引发炎症和败血症, 还可能定植在人体重要器官如肺部 尿道和肾脏, 危及人的生命 [11] 2013 年我国将该菌加入全国食品污染物和有害因素风险监测网的监测范围, 并于 2015 年 5 月 24 日实施了新的饮用水安全国家标准 -GB 19298-2014 食品安全国家标准包装饮用水 [12] 新标准新增铜绿假单胞菌为唯一的致病菌检测指标, 将铜绿假单胞菌作为评价饮用水微生物安全的重要指标 此外, 研究发现, 由于广谱抗生素的广泛使用, 导致临床多重耐药铜绿假单胞菌感染的情况较为严重 我国 2013 年细菌耐药监测数据显示, 铜绿假单胞菌对碳青霉烯类的耐药率达到了 25% 以上, 出现了多重耐药株 [13] 多重耐药铜绿假单胞菌的出现将给临床感染治疔带来巨大的挑战 本研究通过对广东省桶装饮用水进行抽样检测, 系统性地调查广东省代表性地区桶装水中铜绿假单胞菌的分布情况和污染水平, 分析铜绿假单胞菌的分布规律和污染 水平, 进一步构建铜绿假单胞菌菌种资源库 并通过 KB 法对收集的铜绿假单胞菌进行耐药性分析, 进一步了解我省桶装水来源铜绿假单胞菌的耐药情况, 对预防和控制饮用水中铜绿假单胞菌的污染研究提供借鉴和参考 2 材料与方法 2.1 仪器与试剂 不锈钢多联过滤系统 ( 广东环凯微生物科技有限公司 ); 生物安全柜 ( 新加坡艺思高科技有限公司 ); 超净工作台 ( 中国苏净安泰公司 ); 电热恒温培养箱 ( 上海一恒科学仪器有限公司 ) Mueller-Hinton(MH) 琼脂培养基 假单胞菌琼脂基础培养基 /CN 培养基 营养肉汤 ( 中国广东环凯生物技术有限公司 ); 庆大霉素 头孢他啶 头孢哌酮 / 舒巴坦 (2:1) 环丙沙星 美罗培南 哌拉西林 / 他唑巴坦 四环素 米诺环素 阿米卡星 头孢吡肟 头孢哌酮 安曲南 多粘菌素 B 亚胺培南 哌拉西林 磺胺甲基异恶唑 / 甲氧苄氨嘧啶抗生物素试纸条 ( 英国 Oxid 公司 ) 2.2 实验方法 2.2.1 材料收集根据 GB 19298-2014 食品安全国家标准包装饮用水 于 2015 年 7~9 月采集广东省四大区域, 即粤中 (central Guangdong, CGD, 包括广州 深圳 佛山 东莞 中山 惠州 江门 ) 粤东(east Guangdong, EGD, 包括汕尾 揭阳 潮州 汕头 梅州 河源 ) 粤西 (west Guangdong, WGD, 包括湛江 阳江 云浮 肇庆 茂名 ) 和粤北 (north Guangdong, NGD, 清远 韶关 ) 共 20 个地区 758 份桶装水 ( 含包装饮用水和饮用天然矿泉水 ) 2.2.2 铜绿假单胞菌的分离与鉴定根据 GB/T 8538-2008 饮用天然矿泉水检测方法 ( 注 : GB/T 8538-2008 已于 2016 年被 GB 8538-2016 食品安全
第 12 期曾晓琮, 等 : 2015 年广东省桶装饮用水中铜绿假单胞菌的污染调查和药敏性分析 2967 国家标准饮用天然矿泉水检验方法 替代 ), 将 250 ml 水样通过 0.45 μm 滤膜, 将滤膜放置于 CN 选择培养基上, 36 培养 48 h, 铜绿假单胞菌菌落选择参照表 1, 并将确证的铜绿假单胞菌保存于 70% 的甘油中 80 保存, 用于下一步药敏试验 2.2.3 Kirby-Bauer 纸片扩散法参考美国临床实验室标准化协会 (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI) 抗菌药物敏感性试验 Table 1 表 1 铜绿假单胞菌菌落选择与鉴定 The selection and evaluation of P. aeruginosa colony CN 琼脂上生长的乙酰胺肉汤菌落形态 氧化酶试验 金氏 B 培养是否产荧光 判定 蓝色 / 绿色 NT NT NT Y 产荧光 ( 非蓝 / 绿 ) + NT NT Y 红褐色 + + + Y 其它形态 NT NT NT N 注 : NT: 不用试验 ; Y: 铜绿假单胞菌阳性 ; N: 铜绿假单胞菌阴性 ; 蓝 / 绿 指蓝色或者绿色, 荧光素的颜色, 与菌落特性有关 执行标准推荐的纸片扩散法及判定标准进行铜绿假单胞菌耐药性试验, 16 种临床常用的抗生素测试, 药片浓度和判断标准见表 2, 由于 CLSI 未提供铜绿假单胞菌对米诺环素 复方新诺明 四环素 头孢哌酮及头孢哌酮 / 舒巴坦的折点标准, 故此 5 种药物结果的判读参照肠杆菌科细菌在 CLSI( 米诺环素 复方新诺明 四环素 头孢哌酮 ) 的折点标准 选择标准菌株铜绿假单胞菌 ATCC 27853 为阳性对照, 选择大肠杆菌 ATCC 25922 为质控菌株 具有 3 种或 3 种以上抗生素抗性的菌株定义为多重药耐药性菌株 3 结果与分析 3.1 铜绿假单胞菌的污染情况如表 3 所示, 广东省 20 个城市抽取的 758 份样品中共 81 份样品检出铜绿假单胞菌, 铜绿假单胞菌总检出率为 10.7%, 4 个区域检出率分别为粤中 12.5%, 粤北 8.1%, 粤东 16.8%, 粤西 3.2% 在 81 份检出铜绿假单胞菌的样品中, 51 份样品的铜绿假单胞菌处于 1~100 CFU/250 ml, 11 份样品的铜绿假单胞菌处于 100~300 CFU/250 ml, 有 19 份样品的铜绿假单胞菌大于 300 CFU/250 ml 表 2 铜绿假单胞菌药敏试验抗生素信息 Table 2 Antibiotics used in P. aeruginosa antimicrobial susceptibility tests 编号分类抗生素名称英文名 ( 缩写 ) 药片浓度 /(μg/ 片 ) 抑菌圈直径 /mm 敏感 /S 中介 /I 耐药 /R 1 氨基糖苷类 庆大霉素 gentamicin(cn) 10 15 13-14 13 阿米卡星 amikacin(ak) 30 17 15-16 14 头孢吡肟 cefepime(fep) 30 18 15-17 14 2 头孢类 头孢哌酮 / 舒巴坦 (2:1) cefoperazone/sulbactam 2:1(SCF) 105 21 16-20 15 头孢他啶 ceftazidime(cza) 30 18 15-17 14 头孢哌酮 cefoperazone(cfp) 30 21 16-20 15 3 脂肽类多粘菌素 B polymyxin B Sulfate(PB) 300units 12-11 4 氟喹诺酮类环丙沙星 ciprofloxacin(cip) 5 21 16-20 15 5 单环内酰胺类氨曲南 aztreonam(atm) 30 22 16-21 15 6 碳青霉烯类 7 磺胺类 美罗培南 meropenem(mem) 10 19 16-18 15 亚胺培南 imipenem(ipm) 10 19 16-18 15 磺胺甲基异恶唑 / 甲氧苄氨嘧啶 sulphamethoxazolewith trimethoprim (SXT) 23.75/1.25 16 11-15 10 8 β- 内酰胺 /β- 内酰胺酶抑制复合物 哌拉西林 / 他唑巴坦 piperacillin /tazobactam(tzp) 100 21 15-20 14 9 青霉素类 哌拉西林 piperacillin(prl) 100 21 15-20 14 10 四环素类 米诺环素 minocycline(mh) 30 16 13-15 12 四环素 tetracycline(te) 30 15 12-14 11 注 : R: 耐药, I: 中介, S: 敏感
2968 食品安全质量检测学报第 9 卷 Fig. 1 注 : R: 耐药 ; I: 中介 ; S: 敏感 图 1 81 株铜绿假单胞菌体外药物敏感性 Susceptibility test results of 81 strains of P. aeruginosa isolates in vitro 地点 表 3 铜绿假单胞菌的污染率和污染水平 Table 3 Pollution situation of P. aeruginosa 阳性样品中铜绿假单胞菌的桶装水数量 / 桶污染水平 /(CFU/250 ml) 样品总铜绿假单胞菌 1~100 100~300 300 数量检出率 /% CGD 416 12.5 33 6 13 NGD 86 8.1 5 1 1 EGD 101 16.8 8 4 5 WGD 155 3.2 5 0 0 GD 758 10.7 51 11 19 3.2 铜绿假单胞菌的抗药性测定本研究 81 株铜绿假单胞菌药敏试验结果如图 1 所示, 81 株铜绿假单胞菌对 AK FEP SCF CZA CIP IPM MEM PRL TZP 有 100% 敏感性, 对 ATM CFP CN 分别有 2.5% 1.3% 和 5.0% 中性敏感, 对 PB 有 5.0% 的抗性, 而对 MH SXT 和 TE 的敏感性与其他 13 种抗生素有较大差异, 对 MH SXT 和 TE 的抗性分别为 60.5% 91.4% 18.5%, 中介率为 28.4% 7.4% 42%, 敏感性为 11.1% 1.2% 39.5% 图 2 显示, 81 株分离株中, 无耐药菌株有 5 株, 对一种抗生素有抗性的菌种有 28 株 ( 耐 MH 3 株, 耐 SXT 25 株 ), 对 2 种抗生素有抗性的菌株有 30 株 ( 耐 MH-SXT 29 株, 耐 PB-SXT 1 株 ), 多重耐药有 18 株 ( 耐 MH-SXT-TE 15 株, 耐 PB-MH-SXT 3 株 ) 4 结论与讨论 GB 19298-2014 食品安全国家标准包装饮用水 对铜绿假单胞菌项目的要求为同一批次产品检测 5 份, 5 份样 图 2 81 株铜绿假单胞菌耐药性分布 Fig. 2 Drug-resistance distribution of 81 strains of P.aeruginosa isolates 品均不得检出铜绿假单胞菌 本研究调查在广东省 20 个城市共采集了 758 份样品, 铜绿假单胞菌检出率为 10.7% (81/758), 81 份阳性样品中有 51 份样品铜绿假单胞菌的污染程度在 1~100 CFU/250 ml, 11 份样品的铜绿假单胞菌处于 100~300 CFU/250 ml, 有 19 份样品的铜绿假单胞菌大于 300 CFU/250 ml, 建议相关监管部门进一步针对性增强桶装饮用水食品安全监管 药敏分析结果显示, 81 株分离鉴定的铜绿假单胞菌中无耐药菌株仅有 5 株, 对 1 种抗生素有抗性的菌种有 28 株 ( 耐 MH 3 株, 耐 SXT 25 株 ), 对 2 种抗生素有抗性的菌株有 30 株 ( 耐 MH-SXT 29 株, 耐 PB-SXT 1 株 ), 多重耐药有 18 株 ( 耐 MH-SXT-TE 15 株, 耐 PB-MH-SXT 3 株 ) 查阅相 [14] [15] 关文献, 2012 年李飞及 2013 年魏磊等分别进行了广东省及全国 9 个省的矿泉水和山泉水污染调查, 筛查所得的 79 株铜绿假单胞菌未发现耐药性, 这可能与采样地点为人口稀疏的偏远地区及水源水均为地下水所受外界作用 [16] 较少有关 然而, 2010 年季京淑对临床分离出的 2818 株铜绿假单胞菌开展的耐药性的研究发现 2818 株铜绿假
第 12 期曾晓琮, 等 : 2015 年广东省桶装饮用水中铜绿假单胞菌的污染调查和药敏性分析 2969 单胞菌对磺胺甲基异恶唑 / 甲氧苄氨嘧啶 米诺环素 四环素的耐药率较高, 分别为 92.1% 76.2% 63.8%, 对头孢吡肟等 13 种抗生素耐药率在 4.2%~28.8% 本研究发现, 50 株野生菌株对 MH( 米诺环素 ) 具有耐药性, 73 株野生菌株对 SXT( 磺胺甲基异恶唑 / 甲氧苄氨嘧啶 ) 具有耐药性 可见, 临床分离株和本次分离鉴定的水源性铜绿假单胞菌同样对四环素类和磺胺类抗生素具有较强抗性, 且临床分离株的耐药率普遍高于水源性分离株, 这与医院经常使用抗生素必然相关, 但水源性铜绿假单胞菌对四环素类和磺胺类抗生素的抗性也很接近于临床分离株, 值得高度关注 持续监测桶装饮用水中铜绿假单胞菌的污染情况及耐药情况对保障人们饮水安全具有重要意义 参考文献 [1] 王燕梅, 唐震, 乔昕, 等. 江苏省桶装饮用水中铜绿假单胞菌污染情况调查 [J]. 中国卫生检验检疫, 2015, 25(16): 2019 2020. Wang YM, Tang Z, Qiao X, et al. Survey of Pseudomonas aeruginosa contamination in barreled water in Jiangsu province [J]. Chin J Health Lab Technol, 2015, 25(16): 2019 2020. [2] 闫芳, 隋英杰, 孙静, 等. 桶装饮用水污染引起学生食物中毒的调查分析 [J]. 中国卫生检验杂志, 2011, 21(8): 2082 2084. Yan F, Sui YJ, Sun J, et al. The investigation and analysis of students food poisoning that caused by bottled drinking water pollution [J]. Chin J Health Lab Technol, 2011, 21(8): 2082 2084. [3] 蔡双福, 张琴, 黄耀雄. 食品中铜绿假单胞菌的监测分析 [J]. 中国卫生检验杂志, 2015, 26(3): 875 905. Cai SF, Zhang Q, Huang YX. Monitoring and analysis of Pseudomonas aeruginosa in food [J]. Chin J Health Lab Technol, 2015, 26(3): 875 905. [4] Walker TS, Bais HP, Deziel E, et al. Pseudomonas aeruginosa-plant root interactions-pathogenicity, biofilm formation, and root exudation [J]. Plant Physiol, 2004; 134(1): 320 31. [5] Rahme LG, Stevens EJ, Wolfort SF, et al. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals [J]. Science, 1995; 268(5219): 1899 1902. [6] Rahme LG, Tan MW, Le L, et al. Use of model plant hosts to identify Pseudomonas aeruginosa virulence factors [J]. Proc Nat Acad Sci USA, 1997, 94(24): 13245 13250. [7] Mahajan-Miklos S, Tan MW, Rahme LG, et al. Molecular mechanisms of bacterial virulence elucidated using a Pseudomonas aeruginosa- Caenorhabditis elegant pathogenesis model [J]. Cell, 1999, 96(1): 47 56. [8] Martinez C, Pons E, Prats G, et al. Salicylic acid regulates flowering time and links defence responses and reproductive development [J]. Plant J, 2004, 37(2): 209 217. [9] DArgenio DA, Gallagher LA, Berg CA, et al. Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa infection [J]. J Bacterial 2001; 183(4): 1466 71. [10] Miyata S, Casey M, Frank DW, et al. Use of the Galleria mellondla caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis [J]. Infect Immun. 2003; 71(5): 2404 13. [11] Baltch AL, Smith RP. Pseudomonas aeruginosa: infections and treatment [J]. J Med Microbiol, 1994, (42): 454. [12] GB 19298-2014 食品安全国家标准包装饮用水 [S]. GB 19298-2014 National food safety standard-packaged drinking water [S] [13] 胡付品, 朱德妹, 汪复, 等. 2013 年中国 CHINET 细菌耐药性监测 [J]. 中华感染与化疗杂志, 2014, 14(5): 365 374. Hu FP, Zhu DM, Wang F, et al. CHINET 2013 surveillance of bacteria antimicrobial resistance [J]. Chin J Infect Chemother, 2014, 14(5): 365 374. [14] 李飞. 包装饮用泉水食源性致病菌分布规律和遗传多样性研究 [D]. 广州 : 华南理工大学, 2013. Li F. The distribution regularity and genetic diversity of food-borne pathogens in packaging drinking nature spring water [D]. Guangzhou: South China University of Technology, 2013. [15] 魏磊, 吴清平, 张菊梅, 等. 矿泉水和山泉水中铜绿假单胞菌污染调查及分离菌株毒力基因与耐药性分析 [J]. 微生物通报, 2015, 42(1): 125 132. Wei L, Wu QP, Zhang JM et al. The pollution survey of Pseudomonas aeruginosain mineral water and spring water and the analyses of virulence genes and antibiotic resistance of the isolates [J]. Microbiol China, 2015, 42(1): 125 132. [16] 季京淑. 铜绿假单胞菌 MLST 分型及耐药机制研究 [D]. 杭州 : 浙江大学, 2015 Ji JS. Multilocus sequence typing and drug resistant mechanism study of Pseudomonas aeruginosa [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2015 作者简介 ( 责任编辑 : 姜姗 ) 曾晓琮, 硕士, 工程师, 主要研究方向为食源性致病菌 E-mail: 13920741@qq.com 汪廷彩, 硕士, 工程师, 主要研究方向为食品检验与食品安全 E-mail: 82626094@qq.com 周露, 博士, 高级工程师, 主要研究方向为食品生物安全 E-mail: zhoulu1982@sohu.com