120 2016, Vol.37, No.03 食品科学 生物工程 肉鸡生产链中肠炎沙门氏菌耐药性分析及 ERIC-PCR 分型 李楠 1,2, 赵思俊 1, 王娟 1, 赵建梅 1, 李玉清 1, 黄秀梅 1, 王君玮 1, 丁宜宝 3, 刘焕奇 2, *, 曲志娜 1, * (1. 中国动物卫生与流行病学中心, 山东青岛 266032;2. 青岛农业大学动物科技学院, 山东青岛 266109; 3. 中国兽医药品监察所, 北京 100081) 摘要 : 目的 : 了解肉鸡生产链中肠炎沙门氏菌耐药性情况以及各生产环节菌株间亲缘关系, 为临床用药及菌株追踪溯源提供依据 方法 : 采用微量肉汤稀释法对 171 株肠炎沙门氏菌进行 13 种抗菌药物药敏实验 ; 采用肠杆菌基因间重复共有序列 - 聚合酶链式反应 (enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,eric-pcr) 法对 33 株不同生产环节耐药菌株进行分子分型 ; 采用 SPSS 20.0 软件 Gel-Pro Analyer 4.0 和 NTSYS pc 2.1 软件进行分析 结果 :171 株肠炎沙门氏菌对 13 种药物耐药情况不同, 其中对氨苄西林耐药情况最严重, 耐药率高达 90.06%, 对恩诺沙星 氧氟沙星最为敏感, 耐药率均仅为 5.26%; 不同环节间耐药性差异极显著 (P<0.01); 多重耐药率高达 95.32%, 共有 26 种耐药谱型 不同环节的 33 株肠炎沙门氏菌分为 4 种 (Ⅰ~Ⅳ) 基因型, 遗传相似性在 66%~100%,Ⅰ 型为优势基因型 ; 基因型相同的菌株耐药谱不一定相同, 反之, 耐药谱相同的菌株基因型不一定相同 结论 : 肉鸡生产链条中沙门氏菌对多种抗菌药物产生耐药性, 且耐药谱种类繁多 ; 沙门氏菌能够沿着生产链进行水平传播, 肉鸡场环节菌株基因型相对复杂, 菌株基因型与耐药表型之间无明显相关性 关键词 : 肠炎沙门氏菌 ; 肉鸡 ; 耐药性 ; 肠杆菌基因间重复共有序列 - 聚合酶链式反应 Resistance and ERIC-PCR Genotyping of Salmonella enteritidis in Broiler Production Chain LI Nan 1,2, ZHAO Sijun 1, WANG Juan 1, ZHAO Jianmei 1, LI Yuqing 1, HUANG Xiumei 1, WANG Junwei 1, DING Yibao 3, LIU Huanqi 2, *, QU Zhina 1, * (1. China Animal Health and Epidemiology Center, Qingdao 266032, China; 2. School of Animal Science and Technology, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China; 3. China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100081, China) Abstract: Objective: To investigate the antimicrobial resistance and genetic relationship of Salmonella enteritidis in the production chain of broiler, and to provide the basis for clinical treatment and strain traceability. Methods: The susceptibility of 171 Salmonella enteritidis to 13 antimicrobial agents was analyzed by micro-dilution method. The molecular types of 33 strains from different production links associated with resistance were analyzed by ERIC-PCR. The data were analyzed by SPSS 20.0 software, Gel-Pro analyzer 4.0 and NTSYS pc 2.1 software. Results: The resistance degrees of 171 Salmonella enteritidis to 13 antimicrobial agents were different. The resistance rate of these strains to ampicillin was the highest and up to 90.06%, and the resistance rate to ofloxacin was the most sensitive and only 5.26%. The resistance rates of different links were significantly different (P < 0.01). The multidrug resistance rate was 95.32%, and there were 26 kinds of anti-biograms. Totally 33 Salmonella enteritidis were divided into 4 (I IV) different genotypes, and the genetic similarity was 66% 100%, and type I was the dominant genotype. Anti-biograms between the same genotype were also different; conversely, the genotypes between the same antibiogram were different. Conclusion: The Salmonella enteritidis in broiler production chain could generate resistance to many antimicrobial agents, generating many kinds of antibiograms. The Salmonella enteritidis could be spread horizontally along the production chain. The genotypes of broiler farm were relatively complex. There was no significant correlation between genotype and resistant phenotype. 收稿日期 :2015-03-16 基金项目 : 十二五 科技基础性工作专项 (2012FY111000); 农业部 引进国际先进科学技术 重点项目 兽药监管技术引进项目 (2011-G14) 作者简介 : 李楠 (1988 ), 女, 硕士研究生, 研究方向为兽医临床 E-mail:linan5m@126.com * 通信作者 : 刘焕奇 (1970 ), 男, 教授, 博士, 研究方向为兽医临床 E-mail:huanqiliu@126.com 曲志娜 (1970 ), 女, 研究员, 硕士, 研究方向为动物源性食品安全监测与风险评估 E-mail:641117207@qq.com
生物工程食品科学 2016, Vol.37, No.03 121 Key words: Salmonella enteritidis; broiler; antimicrobial resistance; enterobacterial repetitive intergenic consensuspolymerase chain reaction DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603023 中图分类号 :S859.7 文献标志码 :A 文章编号 :1002-6630(2016)03-0120-05 引文格式 : 李楠, 赵思俊, 王娟, 等. 肉鸡生产链中肠炎沙门氏菌耐药性分析及 ERIC-PCR 分型 [J]. 食品科学, 2016, 37(3): 120-124. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603023. http://www.spkx.net.cn LI Nan, ZHAO Sijun, WANG Juan, et al. Resistance and ERIC-PCR genotyping of Salmonella enteritidis in broiler production chain[j]. Food Science, 2016, 37(3): 120-124. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630- 201603023. http://www.spkx.net.cn 沙门氏菌是重要的人畜共患病的病原体, 是引起细菌性食物中毒的主要食源性病原菌 [1] 目前, 沙门氏菌病的预防和治疗主要依靠于抗生素类药物, 但由于抗生素的广泛使用和滥用, 沙门氏菌的耐药性和耐药谱不断变化, 并且在长期进化过程中出现了多重耐药现象, 使其耐药性问题成为世界性的公共卫生问题 [2-3] 沙门氏菌血清型众多, 其中肠炎沙门氏菌能够在禽类及其产品中稳定传播, 而禽类产品为人类日常生活中最常见的肉类食品类型, 相关报道表明 [4-7], 近年来肠炎沙门氏菌引起的食物中毒病例不断上升, 不仅影响养殖业的发展, 还威胁人类健康 肠杆菌基因间重复共有序列 - 聚合酶链式反应 (enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,eric-pcr) 分子分型方法操作简单, 稳定性高, 重复性好, 被广泛应用于菌株的基因分型和溯源等领域 [8-10] 本实验对山东省某地区肉鸡生产链条包括种鸡场 孵化场 肉鸡场 屠宰场以及市场的肠炎沙门氏菌进行了药物敏感性实验, 以了解该地区耐药性情况以及各生产环节间耐药性差异, 通过 ERIC-PCR 分型技术对菌株进行分子分型, 以期为临床用药及追踪溯源提供科学依据 1 材料与方法 1.1 菌株 2014 年分离自泰安的 171 株肠炎沙门氏菌 ( 种鸡场 31 株 孵化场 47 株 肉鸡场 43 株 屠宰场 36 株 市场 14 株, 菌株来自同一批次肉鸡的不同生产环节 ) 和大肠杆菌标准菌株 (ATCC 25922), 由中国动物卫生与流行病学中心动物产品安全监测室提供 1.2 试剂与仪器胰蛋白胨大豆肉汤 MH(Mueller-Hinton) 肉汤 细菌琼脂粉北京陆桥生物技术有限公司 ;GoTaq Green Master Mix 酶 DNA Marker DL2000 日本 TaKaRa 公司 ; 分光光度计上海精科有限责任公司 ; 比浊仪英国 Oxoid 公司 ;PCR 仪 Gel Doc XR 凝胶成像分析仪美国 Bio-Rad 公司 ; 电泳仪北京六一仪器厂 1.3 96 孔药敏板 ( 抗生素 ) 含有青霉素类 ( 氨苄西林 (ampicillin,am) 奥格门丁 (amoxicillin/clavulanic acid,a/c)) 头孢类 ( 头孢噻呋 (ceftiofur,cef)) 氨基糖苷类( 庆大霉素 (gentamicin,gm) 大观霉素(spectinomycin, SPT)) 四环素类( 四环素 (tetracycline,te) 多西环素 (doxycycline,dox)) 氯霉素类( 氟苯尼考 (florfenicol,ffc)) 磺胺类( 磺胺异噁唑 (sulfisoxazole,sf) 新诺明(sulfamethoxazole, SXT)) 喹诺酮类( 恩诺沙星 (enrofloxacin, ENR) 氧氟沙星(ofloxacin,OFL)) 粘杆菌素 (polymyxin E,CLE) 等 13 种药物天津市金章科技发展有限公司 1.4 引物 ERIC-PCR 扩增引物为 ERIC [11] : 5 -AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3, 由生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司合成 1.5 方法 1.5.1 药物敏感性实验按照国际通用标准方法 微量肉汤稀释法 (minimal inhibitory concentration,mic) 测定 171 株肠炎沙门氏菌对 8 类 13 种抗菌药的最小抑菌浓度 首先从 12 ml MH 肉汤中吸取 100 μl 加入药敏板的空白对照孔中, 再挑取新鲜菌落制备 0.5 麦氏浊度的菌液, 吸取 10 μl 菌液加入 12 ml MH 肉汤中混匀, 依次加入药敏板中, 每孔 100 μl, 以大肠杆菌作为质控菌株, 于 37 温箱中培养 16~20 h 在质控菌株的最低抑菌浓度符合规定的前提下进行结果判定, 凡细菌生长的孔内, 呈弥散状混浊或底部有沉淀, 无细菌生长的孔内所含最低抑菌药物浓度即为最低抑菌浓度 1.5.2 ERIC-PCR 分子分型不同环节耐药菌株 ( 种鸡场 Z1~Z7 孵化场 F1~F5 肉鸡场 R1~R8 屠宰场 T1~T8 市场 S1~S5) 共 33 株进行 ERIC-PCR 反应 DNA 模板的制备按煮沸法进行,PCR 反应体系为 25 μl, 反应组分 :
122 2016, Vol.37, No.03 食品科学 生物工程 Go Taq Green Master Mix 12.5 μl;eric 引物 1 μl; 模板 DNA 2 μl; 无核酸水 9.5 μl PCR 反应程序 [12] :94 预变性 5 min;94 变性 1 min,52 退火 1 min,72 延伸 3 min,35 个循环 ;72 延伸 10 min 将扩增产物于 1.3% 的琼脂糖凝胶中进行电泳, 电压 100 V 电泳 30 min, 结束后用凝胶成像系统处理图像 1.6 数据处理运用 SPSS 20.0 软件对实验数据进行统计分析 ; 采用 Gel-Pro Analyzer4.0 和 NTSYS pc 2.1 软件对 ERIC-PCR 结果进行聚类分析 [13] SPT-SXT-AM CL-SPT-SXT-AM 为主导谱型, 共有 26 种耐药谱 不同生产环节菌株多重耐药表现不同, 种鸡场和孵化场出现了 0 耐药菌株,2 株 1 耐菌来自孵化场, 而 3 株 12 耐菌来自肉鸡场和屠宰场 ; 来自市场的菌株表现为 2 耐 3 耐 4 耐 ;7 耐以上菌株主要来自种鸡场 肉鸡场 屠宰场 各生产环节分别有 11 9 9 13 3 种耐药谱, 各环节主导耐药谱不同, 种鸡场和屠宰场为 SPT-AM, 孵化场为 CL-SPT-SXT-AM, 肉鸡场为 TE-SPT-DOX-CEF-SF-SXT-AM-A/C, 市场为 结果见表 2 2 结果与分析 Table 2 表 2 不同生产环节耐药谱统计 Antibiograms of different production chains 2.1 药物敏感性实验结果 2.1.1 耐药结果 171 株肠炎沙门氏菌对 13 种药物耐药情况不同, 其中 90.06% 的菌株对 AM 产生耐药性, 为 13 种抗菌药物中最强 耐 SPT 的菌株比例为 78.95% SXT 为 50.88% CLE 为 42.69% CEF 为 37.43% SF 为 35.67% DOX 为 33.92% TE 为 26.32% A/C 为 23.98% GM 为 11.70% FFC 为 10.53%, 对 OFL 和 ENR 比较敏感, 耐药率均为 5.26% 不同生产环节菌株对 13 种药物耐药情况差异极显著 (P<0.01), 如对 OFL, 来自种鸡场 孵化场和市场的菌株表现为全敏感, 只有肉鸡场和屠宰场的菌株对 13 种药物均产生耐药性 结果见表 1 抗菌药物 表 1 肠炎沙门氏菌耐药率与比较分析 Table 1 Resistance rates of Salmonella enteritidis and comparative analysis 种鸡场 (31 株 ) 孵化场 (47 株 ) 不同环节菌株耐药率 /% 总体 (171 株 ) 肉鸡场 (43 株 ) 屠宰场 (36 株 ) 市场 (14 株 ) 耐药率 /% 敏感率 /% OFL 0.00 0.00 18.60 2.78 0.00 5.26 93.57 0.001 ENR 0.00 0.00 18.60 2.78 0.00 5.26 77.19 0.001 TE 22.58 0.00 58.14 30.56 14.29 26.32 71.35 0.000 CLE 48.39 72.34 2.33 58.33 14.29 42.69 16.96 0.000 GM 45.16 2.13 6.98 5.56 0.00 11.70 86.55 0.000 SPT 80.65 93.62 100.00 63.89 0.00 78.95 11.70 0.000 DOX 16.13 8.51 65.12 47.22 28.57 33.92 42.69 0.000 CEF 51.61 6.38 58.14 50.00 14.29 37.43 59.65 0.000 FFC 3.23 0.00 30.23 11.11 0.00 10.53 89.47 0.000 SF 38.71 2.13 55.81 33.33 85.71 35.67 64.33 0.000 SXT 48.39 70.21 76.74 16.67 0.00 50.88 49.12 0.000 AM 74.19 91.49 100.00 91.67 85.71 90.06 9.94 0.004 A/C 19.35 17.02 58.14 5.56 0.00 23.98 39.77 0.000 2.1.2 多重耐药结果 171 株肠炎沙门氏菌中多重耐药 ( 2 种 ) 菌株高达 95.32%(163/171), 未出现全耐菌株,6 株菌对 13 种药物表现为敏感 以 2 耐 3 耐 4 耐为主, 分别以 SPT-AM P 值 耐药谱型 种鸡场 (31 株 ) 孵化场 (47 株 ) 肉鸡场 (43 株 ) 屠宰场 (36 株 ) 市场 (14 株 ) OFL-ENR-TE-GM-SPT-DOX-CEF-FFC-SF-SXT-AM-A/C 2 1 OFL-ENR-TE-SPT-DOX-CEF-FFC-SF-SXT-AM-A/C 6 TE-CLE-GM-SPT-DOX-CEF-FFC-SF-SXT-AM-A/C 1 TE-CLE-GM-SPT-DOX-CEF-SF-SXT-AM-A/C 2 1 1 TE-SPT-DOX-CEF-FFC-SF-SXT-AM-A/C 4 TE--A/C 2 TE-SPT-DOX-CEF-SF-SXT-AM-A/C 1 11 TE-CLE-DOX-CEF-FFC- 3 3 TE-SPT-DOX-CEF-FFC-AM-A/C 1 TE-CLE-GM-DOX-CEF-SF-SXT 1 CLE-GM-SPT-CEF-SF-SXT 2 1 TE-CLE-DOX-CEF- 2 8 3 CLE-GM-SPT-CEF-AM 3 CLE-SPT-SXT-AM 18 2 TE-DOX- 4 2 SPT-DOX-SXT-AM 2 3 CLE-SPT-CEF-AM 1 2 5 SPT-SXT-AM 3 4 6 2 CLE-SPT-AM 5 2 CLE-DOX-CEF 3 2 SPT-AM 7 4 9 7 1 10 DOX 2 2.2 ERIC-PCR 分子分型结果 如图 1 所示, 来自不同生产环节的 33 株沙门氏菌分 为 4 种 (Ⅰ~Ⅳ) 基因型, 遗传相似性在 66%~100% Ⅰ 型为优势基因型, 共有 23 株, 包括种鸡场 (Z1 Z2 Z3 Z6 Z7)5 株 孵化场 (F1 F2 F4 F5)4 株 肉鸡场 (R1 R4 R5)3 株 屠宰场 (T3 T4 T5 T6 T7 T8)6 株以及市场 (S1 S2 S3 S4 S5) 5 株 Ⅳ 型中只有 2 株菌, 且均来自肉鸡场 基因型相同的菌株耐药谱不一定相同, 如 Ⅰ 型中包含 了 2~11 种药物的耐药谱 ; 耐药谱相同的菌株基因型不一定
食品科学 生物工程 2016, Vol.37, No.03 123 相同 如F2 F3 F5耐药谱均为 了26 种耐药谱型 吴云凤等[20]对分离自肉鸡胴体的沙门 但F2 F5属于Ⅰ型 F3属于Ⅲ型 只有Ⅳ型的两株菌基 氏菌进行药敏实验 对16 种抗菌药物产生了26 种耐药 因型相同 耐药谱也相同 谱 郭云昌等[21]对分离自市场鸡肉的沙门氏菌进行药敏 实验 对30 种药物产生了29 种耐药谱 说明目前沙门氏 ĉ Ċ ċ Č 66 74 83 լᙗ/% CLE-SPT-SXT-AM TE-CLE-DOX-CEF- TE--A/C TE-CLE-GM-SPT-DOX-CEF-SF-SXT-AM-A/C TE--A/C CLE-SPT-SXT-AM TE-SPT-DOX-CEF-FFC-SF-SXT-AM-A/C OFL-ENR-TE-SPT-DOX-CEF-FFC-SF-SXT-AM-A/C TE-CLE-DOX-CEF-FFC- TE-CLE-DOX-CEF- OFL-ENR-TE-SPT-DOX-CEF-FFC-SF-SXT-AM-A/C TE-CLE-DOX-CEF-FFC- TE-CLE-GM-SPT-DOX-CEF-SF-SXT-AM-A/C TE-CLE-DOX-CEF-FFC- TE-SPT-DOX-CEF-FFC-SF-SXT-AM-A/C TE-SPT-DOX-CEF-SF-SXT-AM-A/C TE-SPT-DOX-CEF-SF-SXT-AM-A/C OFL-ENR-TE-GM-SPT-DOC-CEF-FFC-SF-SXT-AM-A/C OFL-ENR-TE-GM-SPT-DOC-CEF-FFC-SF-SXT-AM-A/C 菌能够对多种抗菌药产生耐药性 且耐药谱种类繁多 在生产过程中通过食物链的传递 可能最终影响人类对 抗生素的敏感性 本实验将33 株耐药性相关的菌株分为四大类 Ⅰ Ⅳ 其中Ⅰ型包含了种鸡场 孵化场 肉鸡场 屠宰场和市场的菌株 说明生产链条中相同克隆株能够 沿生产链水平传播 而Ⅱ型包括种鸡场 屠宰场 Ⅲ型 包括种鸡场 孵化场 肉鸡场 与Ⅰ类基因型稍微不 同 Ⅳ型中菌株均来自肉鸡场 而且与其他基因型差异 较大 说明生产链条中克隆株的来源不同 侯小刚[22]对 四川主要肉品生产链中沙门氏菌脉冲场凝胶电泳 pulsed field gel electrophoresis PFGE 分型 在猪肉和鸭肉 生产链中也发现了克隆株水平传播的现象 而鸡肉生产 不同生产环节肠炎沙门氏菌遗传关系聚类树状图 链中 谱型差异较大 说明克隆株的来源较为广泛 陈 Phylogenetic tree of Salmonella enteritidis in different production 玲等 [23]对南方地区食品中沙门氏菌进行了血清学鉴定和 图1 Fig.1 91 Z1 Z7 F1 F2 F5 T3 T8 S1 S2 Z2 Z3 Z6 F4 R1 R4 T4 T5 S5 R5 T6 T7 S3 S4 Z5 T1 T2 Z4 F3 R3 R6 R2 R7 R8 100 chains ERIC-PCR分子分型 发现14 株德尔卑沙门氏菌可分为 5 种基因型别 均在E9簇之中 而13 株鼠伤寒沙门氏菌 3 讨 论 可分为5 种基因型别 却分布在E1 E3 E4 E8之中 同一血清型的菌株基因型可能相同也可能不同 本实验 肠炎沙门氏菌作为一种食源性病原菌 通过食物 链直接或间接感染人类 而抗生素药物在畜牧生产中作 为预防 治疗首选药物而被广泛使用 耐药性的出现使 其治疗和预防成为兽医临床 人医临床的难点 [14-15] 本 实验中各生产环节菌株对氨苄西林的耐药情况都比较严 重 而关文英等 [16]对河北省食品中沙门氏菌进行耐药性 分析 81 株菌对氨苄西林的耐药率为16% 与本实验结 果差异极显著 P 0.01 张秀英等[17]对江西 辽宁 广东三省养殖场的沙门氏菌进行药敏实验发现氨苄西林 总体耐药率为55.6% 而三省间耐药率不同 广东省耐药 最严重 辽宁省表现全敏感 朱冬梅等[18]对四川屠宰场 沙门氏菌的耐药性研究发现 分离株对氨苄西林的耐药 率高达85.90% 以上研究可以看出沙门氏菌对某一抗菌 药物的耐药情况与地域和菌株来源有一定的关系 从各 生产环节耐药率来看 不同生产环节的菌株耐药情况存 在差异 肉鸡场和屠宰场的菌株耐药情况比较严重 孵 化场和市场的菌株耐药情况相对较轻 谢懋英等[19]对肉 鸡生产链中沙门氏菌的耐药性研究也发现了不同环节采 集样品分离菌株的耐药情况表现出差异性 本实验多重 耐药率高达95.32% 7 耐以上菌株主要出现在种鸡场 肉鸡场和屠宰场 不同生产环节的主导耐药谱型也不相 同 说明养殖过程抗菌药物使用所造成的选择压力对耐 药性的产生具有很大的影响 本实验对13 种药物共产生 也发现同一血清型可以被分为不同基因型 而Imen等[24] 利用ERIC-PCR方法对45 株沙门氏菌进行分型 肠炎沙 门氏菌被分为2 种基因型 肯塔基沙门氏菌被分为4 种基 因型 而基因型相同的菌株血清型也相同 所以血清型 不同基因型是否一定不同有待进一步探索 在耐药表型 方面 具有相同基因型的菌株耐药谱不一定相同 具有 相同耐药谱的菌株基因型也不一定相同 只有Ⅳ型的两 株菌基因型相同 耐药谱也相同 说明耐药表型与基因 型没有明显的相关性 Marjo Cado等[25]对分离采自巴西 37 个农场的66 株猪源鼠伤寒沙门氏菌进行PFGE分型 鉴定出12 个谱型 其中具有不同的耐药表型39 株菌株分 属于同一PFGE谱型 虽然分型方法不同 但分型结果也 表明基因型与耐药表型之间没有直接的相关性 综上所述 肠炎沙门氏菌在肉鸡生产链中能够水 平传播且耐药性问题严重 但各生产环节间耐药程度不 同 参考环节间差异可以指导临床治疗 预防用药 通 过ERIC-PCR分子分型可以对肠炎沙门氏菌进行追踪溯 源 且具有简便 高效低成本的优点 在流行病学调查 方面具有重要价值 参考文献 [1] SU L H, CHIU C H, CHU C, et al. Antimicrobial resistance in nontyphoid Salmonella serotypes a global challenge[j]. Clinical Infectious Diseases, 2004, 39(14): 546-551. DOI:10.1086/422726.
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