MALDI-TOF/TOF MS 基础与应用 微生物研究所 孙树涛 2011-07-21 1
内容概要 质谱技术发展回顾 MALDI-TOF/TOF MS 构造与原理 分析策略和实验流程 样品前处理 数据检索和结果分析 MALDI-TOF/TOF MS 应用 2
质谱技术发展回顾 1906 年,J.J.Thompson 因发明质谱技术并用以研究气体的电导获得诺贝尔物理奖 ; 1922 年,F.W.Aston 因用质谱仪发现了非放射性元素同位素获得诺贝尔化学奖 ; 1980 年,W.Paul 因发明离子阱质谱原理和技术获得诺贝尔物理奖 ; 1996 年,R.E.Smally 等因用质谱发现 C60 获得诺贝尔化学奖 ; 2002 年,J.B.Fenn,K.Tanaka 因发明生物大分子质谱电离技术获得诺贝尔化学奖 3
质谱 样品在离子源内电离, 产生的各种离子经过质量分析器按其质荷比 (m/z) 分离, 并依次被检测器检测并记录下来, 形成一个按顺序记录各种质荷比 (m/z) 离子相对丰度的谱图 特点 Sensitivity Speed Specificity Stoichiometry 灵敏度的比较 分析方法 NMR IR GC UV MS 检测灵敏度 (g) 10-3 ~10-5 10-6 ~10-7 10-6 ~10-13 10-6 ~10-7 10-11 ~10-12 4
质谱仪器基本构造 离子源 质量分析器 离子检测器 进样系统 真空泵 信号处理 m/z 5
离子源 生物大分子的电离 MALDI Matrix-assisted laser desorption/ionization 基质辅助激光解吸离子化 ESI Electrospray ionization 电喷雾电离 6
质量分析器 电磁扇型双聚焦质谱仪 (Magnetic Sector) 飞行时间质谱仪 (TOF, time of flight) 四极杆质谱仪 (Quadrupole) 离子阱质谱仪 (Ion trap) 傅立叶变换离子回旋共振质谱仪 (FT ICR) 静电场轨道阱质谱仪 (Orbitrap) 7
飞行时间质谱 TOF (time of flight) 线性模式 (linear mode), 分辨率较低 ; 反射模式 (reflectron mode), 分辨率高 反射镜片 激光器 衰减镜片 + ++ + + + + + + + + + + + 样品靶 离子源 离子检测器反射模式 反射板飞行管 离子检测器 线性模式 KE= qv = 1/2 mv 2 v = (2qV/m) 1/2 t = L/v =L / (2V/m/q) 1/2 m/z = m/q = 2V t 2 / L 2 8
串级质谱 (MS/MS) 串联质谱是通过对选定某个 m/z 母离子反应产物的分析, 对目标化合物进行断裂机理或结构鉴定等方面的研究 Ion source Detector Selection Activation Mass analysis MS1 Collision Cell MS2 9
基础概念 分辨率 (Resolution) 信噪比 (S/N) R = M Δ M 灵敏度 (Sensitivity) 最低检测限 fmol,amol M M m o 质量精度 (Accuracy) ppm 稳定性 (Stability) 单同位素质量 (Monoisotopic mass) 质荷比 (m/z) M + z z 10
常用基质 a-cyano-4-hydroxycinnamic acid CHCA a- 氰基 -4- 羟基肉桂酸 2,5-Dihydroxybenzoic acid DHB 2,5- 二羟基苯甲酸 Sinapinic acid SA 芥子酸 CHCA 主要用于 20KDa 以下的蛋白质 DHB 和 SA 可用于 20KDa 以上的蛋白质 低质量区 (<700Da) 基质背景信号干扰 11
纳米材料作为基质 七种氨基酸混合溶液的 MALDI 质谱 12
MALDI-TOF/TOF MS 特点 可得到 MS/MS 谱, 得到肽段氨基酸组成信息 分辨率高 ~20000 灵敏度高 ~fmol,amol 分析速度快, 通量高 质量精度高 ~20ppm 分子量测量范围大 ~200000Da 对样品中的盐等杂质有一定的容忍性 13
MALDI-TOF/TOF MS 的应用范围 分子量测定蛋白 多肽 脂类 糖类 寡聚核苷酸 天然产物等 蛋白质鉴定 1D, 2D-GE 单一蛋白溶液酶解液 蛋白质翻译后修饰 (PTM) 研究 疾病诊断 Biomarker 筛选 14
基于质谱的蛋白质组分析策略 获取样品 样品前处理 ( 提取 分离 ) 质谱鉴定 数据检索 评估 整合 得到结果 Cells Tissues Plasma Urine Protein extraction Protein separation Digestion Peptide separation PTM enrichment TOF TOF-TOF Ion trap FT-ICR Orbitrap Databases MASCOT SEQUEST Identification Quantification Function INPUT 15
基于质谱的蛋白质组学实验流程 2D-GE 2D-Gel Electrophoresis Protein Mixture Digestion MutPIT Shotgun In-Gel Digestion Peptide Mixture MALDI-TOF/TOF MS HPLC- MS/MS 2D-HPLC (SCX+RP) -MS/MS Database Search Proteins 16
定量 15 N metabolic label Cell State 1 Cell State 2 15 N/ 14 N combine 14 N unlabeled SILAC Cell Lysis Cell Lysis Chemical tag-d Digestion Tag combine Digestion Chemical tag-h ICAT Chemical tag-d Tag combine Chemical tag-h itraq Relative Abundance 100 80 60 40 20 MutPIT or 2D-GE MS/MS Cell State 1 Cell State 2 5.29 5.38 5.47 5.57 5.66 5.75 Time (min) Label Free 17
样品处理注意事项 用进口的离心管 防止皮肤 头发的角蛋白 ( 戴无粉手套 ), 及 BSA 污染 制备过程中防止发生修饰和降解 水的纯度 : 二次去离子水, 电阻率 18MΩ cm 不希望有钠 钾加合离子 常用溶剂 : 水 乙氰 乙醇 甲醇 丙酮 甲酸 三氟乙酸等 避免使用 SDS Triton CHAPS 等去垢剂, PEG 等聚合物对质谱信号造成严重干扰的物质 18
样品分子量测定 待分析的蛋白样品处于溶解状态或冻干粉, 要求不含盐, 不含去垢剂 提供样品浓度为几十 pm/μl, 一次提供样品 10μL 左右即可 送样要求 : 检测目的, 样品来源 制备方法 溶剂 可能混有成分 分子量范围 蛋白鉴定 单一蛋白, 考染能见的条带 需把蛋白溶液或胶内酶切成 700 3500Da 左右的肽段 染色的样品需先清洗 脱色 还原 烷基化 酶切 送样要求 : 蛋白物种来源 检测目的 制备方法 溶剂 可能混有成分 19
MALDI-TOF MS 可容忍的最高浓度 Urea Guanidine-HCl Glycerol Alkali metal salts Tris buffer 0.05M NH 4 HCO 3 0.05M Phosphate buffer SDS, CHAPS, PEG, Triton 0.5M 0.5M 1% 0.02M 0.01M 需去除 20
去除杂质干扰, 浓缩样品 超滤 较多量样品过固相萃取柱 (SPE) 微量样品过 ZipTip 柱 C18 去除 peptide,protein(<50kda),oligonucletides 样品中盐的干扰及浓缩 C4 蛋白质 (20KDa-100KDa) 除盐及浓缩 SCX 去除样品中去垢剂及浓缩样品 21
数据采集 点靶 记录样品点在靶上位置 A1-H24 选择采集方法 采集数据 导出数据 搜索数据库 分析数据 22
蛋白质鉴定 指纹谱 (PMF, peptide mass fingerprint) 蛋白质经酶切位点专一的蛋白酶水解后得到肽段混合物, 经过质谱分析得到的质谱图 由于组成不同蛋白质的氨基酸序列不同, 酶解后产生的肽段也不相同, 其肽段混合物质量数具有特征性, 所以称肽质量指纹谱 优点 : 是蛋白质鉴定的经典方法, 算法简单, 速度快, 在串联质谱鉴定出现之前应用广泛 缺点 : 质量相近的多肽增加匹配难度, 并且无法实现混合蛋白的鉴定, 不太适合数据库不完整的物种的蛋白质鉴定, 不能分析到翻译后修饰位点 23
PMF 谱图示例 24
二级谱图 (MS/MS) 可提供结构组成信息, 可用于对蛋白分离效果较差的样品 原理 : 对一个或者多个未被解析的肽段 MS/MS 数据进行对数据库比较从而进行蛋白鉴定 优点 : 是目前应用最广的高通量鉴定蛋白质方法, 鉴定准确度更高, 无需人工序列解析, 可以实现混合蛋白的鉴定 缺点 : 增加了一步操作, 对仪器要求更严格 25
MS/MS 谱图示例 26
MS/MS 肽段断裂的碎片命名规则 CID ETD 27
数据库检索 Mascot http://www.matrixscience.com Local Server PMF 数据库搜索时, 将数据库中的蛋白序列理论酶切成肽段, 计算其理论图谱, 与实验图谱进行比对得到结果 扣除基质本底 酶自切和角蛋白污染峰 http://cn.expasy.org/tools/peptide-mass.html 理论酶切选取酶 (700-3500Da) 理论数据与实验谱图进行比对 28
PMF 检索界面 29
MS/MS 检索界面 30
PMF 检索结果示例 (continued) 31
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Mascot PMF 分数算法基于概率, 显著性分析 S = -10*Log(P), P: 比对匹配的一个随机事件的可能性大小 P=E/N,E= 期望值, N= 数据库中蛋白质数目的大小 33
MS/MS 检索结果示例 34
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MS/MS 分数算法 不同于 PMF 打分原则, 将匹配离子打分, 再得到蛋 白分数 算法复杂 41
检索结果分析 一个点鉴定得到多个蛋白的选择 : 一般选择得分最高的蛋白, 但是如果得分最高的蛋白功能不明确 (unknown or hypothetical), 同时得分稍低一些的蛋白与最高分差别不大且功能相对明确, 也可以选择得分稍低一些的蛋白 MS/MS 以 peptide summary 结果为主, 碎片离子可信度高, 再结合 protein summary 分析 看碎片离子峰匹配状况, 匹配越好越可信 鉴定到的蛋白可以结合其它 ( 如 pi, Mw) 等信息 有的鉴定到的结果差别较大 : 很多翻译后修饰 蛋白提取及电泳过程中的人为修饰以及蛋白降解 可变剪切等造成此现象, 与质谱鉴定结果的好坏无关 42
一级质谱鉴定和二级质谱鉴定如何选择 首先, 一级质谱专一性信息少, 只适用于有完整非冗余基因组序列或者蛋白序列的物种鉴定, 对于大库检索 ( 比如哺乳动物总库 ), 随着库容量的增加, 其特异性越差, 结果越不可靠 二级质谱提供的专一性信息多, 即使对于大库检索, 其鉴定结果也很可靠 二级质谱鉴定所有物种 ( 包括有完整基因组信息的测序物种 ) 也是一种质谱鉴定的趋势 43
Denovo 难, 对样品 仪器要求高 解析 MS/MS 谱图要很有经验 44
MALDI-TOF/TOF MS 应用举例 肝癌 / 健康人血清中磷酸化多肽表达的差异分析 45
人肝蛋白糖基化蛋白和位点的鉴定 46
Distinguished groups Ruedi Lab, ETH Zürich the Institute for Systems Biology Mann Lab, University of Southern Denmark Max Planck Institute of Biochemistry Gygi Lab, Harvard University Yates Lab, the Scripps Research Institute Heck Lab, University Utrecht 47
质谱仪器使用选择 48
谢谢大家! 64806023 shutaosun@im.ac.cn 49