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1 高效液相色谱-质谱联用技术 在药物分析中的应用 2011年4月23日 北京培训

2 讲座内容 一 质谱法原理二 2010 年版 中国药典 收录的相关方法三 高效液相色谱 - 质谱 (HPLC-MS) 联用技术四 HPLC-MS 在药物分析中的应用 (1) 药物的定性鉴别及有关物质分析 (2) 药物代谢及生物利用度分析 (3) 生物化学样品分析 (4) 液质联用分析谱库的建立 (5) 液质联用仪的操作及检定

3 一 质谱法原理 质谱法 (Mass Spectrometry) - 通过将被测物质分子离子化, 利用电磁学原理, 荷电分子或亚分子碎片依其质量和电荷的比值 ( 质荷比,m/z) 进行分离和分析的方法

4 一 质谱法原理 - 质谱法测量的对象是必须是带电离子 质谱仪分析标准程序 : (1) 样品的导入 (2) 样品的离子化 (3) 被测离子进入电场或磁场 (4) 离子按质荷比 (m/z) 进行分析 (5) 按质荷比 m/z. 进行检测

5 一 质谱法原理 Spectrometry T Spectroscopy Spectroscopy n. 光谱学, 波谱学, 光谱仪 Spectrometry n. 度谱术, 质谱计 Spectrometry : Spectrometer Abbreviated to: Mass spec. or MS

6 一 质谱法原理质谱法的特点 质谱不属波谱范围 质谱图与电磁波的波长和分子内某种物理量的改变无关 质谱是分子离子及碎片离子的质量与其相对强度的谱, 谱图与分子结构有关 质谱法进样量少, 灵敏度高, 分析速度快 质谱是唯一可以给出分子量, 确定分子式的方法, 而分子式的确定对化合物的结构鉴定是至关重要的

7 一 质谱法原理 质谱用于结构分析有点像 : 花瓶 打碎 将碎片拼起来 复原后的花瓶 碎片 ( 不可看到它的形状和质地 ) ( 可以看到它的形状和质地 ) 电子轰击 有机分子 (M) 分子离子 ( M ) (-e) 开裂 + 碎片离子 分离 收集 记录 质谱 由分子结构与裂解方式的经验规律, 根据分子离子和各种碎片离子的质荷比及其相对丰度, 就可以进行结构分析

8 一 质谱法原理质谱图 以荷质比 m/z 为横座标, 以对基峰 ( 最强离子峰, 规定相对强度为 100%) 相对强度为纵座标所构成的谱图

9 一 质谱法原理 乙醇的质谱图 相对丰度 31 乙醇 m/e 相对丰度 (R A ) 以图中最强的离子峰 ( 基峰 ) 高为 100%, 其它峰的峰高则用相对于基峰的百分数表示

10 一 质谱法原理 m/z = 质荷比 = mass (amu or daltons) charge ( ) 例 : CH 3 -CH 2 -CH 3 + e - CH 3 -CH 2 -CH e - m z 44 amu 1 44 CH 3 -CH 2 -CH 3 + e - CH 3 -CH 2 -CH e - m z 44 amu 2 22

11 一 质谱法原理 因质谱技术获诺贝尔奖的五位科学家 * 1912年第一台质谱仪 1943年第一台商用质谱仪用于石化分析

12 一 质谱法原理 质谱仪的分类 : (1) 有机质谱仪 : * 气 - 质联用 * 液 - 质联用 * 傅立叶质谱仪 * 激光解吸飞行时间质谱仪 (2) 无机质谱仪 * ICP-MS * 同位素质谱仪

13 二 2010 版 中国药典 质谱法 * 收录原则 (2005 版二部附录 IXJ ): 质谱是物质的固有特 性之一, 不同的物质除一些异构体外, 均有不同的质谱, 利用这一性质可进行定性分析 ( 包括分子质量和相关结构信息 ); 质谱谱峰的强度与其代表的物质的含量成正比, 据此可进行定量分析 真空系统 GC HPLC 样品导入 离子源 质量分析 检测器 放大记录 ICP 计算机控制系统

14 二 2010 版 中国药典 质谱法 真空系统 - 质谱分析都在较高的真空状态下进行 离子源和质量分析器的压力在 10 4 ~ 10 5 Pa 和 10 5 ~ 10 6 Pa 或 10-6 ~10-7 mmhg 和 10-7 ~10-8 mmhg * 仪器类型 : 机械泵 + 涡轮分子泵 High Vacuum System Inlet Ion source Mass Analyzer Detector Data System

15 二 2010 版 中国药典 质谱法 * 质谱需要高真空的理由 : (1) 质谱是检测带电粒子, 带电粒子在电磁场的作用下, 加速运动 如果有空气, 带电粒子可能和空气中的其他分子发生碰撞, 使离子很快淬灭而达不到检测器, 并引起额外的离子 - 分子反应, 改变裂解模型, 谱图复杂化, 影响分离及检测 (2) 低真空度下存在氧分子会使发射电子的热灯丝迅速氧化而损坏, 就像白炽灯中的钨丝怕见空气被氧化一样 ; (3) 低真空度下, 用作加速离子的几千伏高压会引起放电

16 二 2010 版 中国药典 质谱法 进样系统 - 现代质谱仪有多种进样系统, 可根据供试品的性质 状态和纯度合理选择 一般可分分为直接进样通过接口两种方式将供试品导入质谱仪 High Vacuum System Inlet Ion Source Mass Analyzer Detector Data System HPLC Flow injection

17 二 2010 版 中国药典 质谱法 * 质谱进样的基本方式 : (1) 不破坏真空度的情况下, 样品进入离子源 (2) 气体可通过储气装置进入离子源 (3) 易挥发的液体, 在进样系统内汽化后进入离子源 (4) 难挥发的液体或固体样品, 通过探针直接送入离子源

18 二 2010 版 中国药典 质谱法 * 直接进样技术 : (1) 气态或液态成分 : a. 可调喷口装置, 以中性流的形式导入离子源 b. 吸附在固体上或溶解在液体中的挥发性物质可通过顶空分析器进行富集, 利用吸附柱捕集, 再采用程序升温的方式使之解吸, 经毛细管导入质谱仪 (2) 对于固体供试品 : 常用进样杆直接导入, 这种方法可与电子轰击电离 化学电离以及场电离结合, 适用于热稳定性差或者难挥发物的分析

19 二 2010 版 中国药典 质谱法 * 接口进样技术 : - 目前质谱进样系统发展较快的是多种液相色谱 / 质谱联用的接口技术, 用以将色谱流出物导入质谱, 经离子化后供质谱分析, 可用于多组分化合物的分离分析 主要接口技术包括各种喷雾技术 ( 电喷雾 热喷雾和离子喷雾 ) 传送装置 ( 粒子束 ) 和粒子诱导解吸 ( 快原子轰击 ) 等

20 二 2010 版 中国药典 质谱法 * 喷雾接口 (1) 电喷雾接口 : 色谱流动相通过一个带有数千伏高压的针尖喷口喷出, 生成带电液滴, 经干燥气除去溶剂后, 带电离子通过毛细管或者小孔直接进入质量分析器 (2) 热喷雾接口 : 存在于挥发性缓冲液流动相 ( 加乙酸铵溶液 ) 中的待测物, 由细径管导入离子源, 同时加热, 溶剂在细径管中除去, 待测物进入气相 (3) 离子喷雾接口 : 液体样品利用气体辅助进行喷雾, 电喷雾和离子喷雾技术中使用的流动相体系含有的缓冲液必须是挥发性的

21 二 2010 版 中国药典 质谱法 * 喷雾接口 (4) 离子束接口 : 将色谱流出物转化为气溶胶, 在脱溶剂室中先脱去溶剂, 得到的中性待测分子导入离子源, 使用电子轰击或者化学电离的方式将其离子化, 获得的质谱为经典的电子轰击电离或者化学电离质谱图 (5) 解吸附技术 : 流动相须加入微量难挥发液体 ( 如甘油 ), 混合液本通过一根毛细管流到置于离子源中的金属靶上, 经溶剂挥发后形成的液膜被高能原子或者离子轰击而离子化 得到的质谱图与快原子轰击 ( 或液相二次离子质谱 ) 的质谱图类似, 但是本底却大大降低

22 二 2010 版 中国药典 质谱法 离子源 - 质谱的心脏, 将进样系统引入的样品分子转化成离子, 离子源的性能决定了离子化效率, 决定了质谱仪的灵敏度 High Vacuum System Inlet Ion Source Mass Analyzer Detector Data System EI,CI,FAB,FI, ESI,APCI, MALDI

23 二 2010 版 中国药典 质谱法 离子源 电子轰击电离 化学离子化 Electron Impact Ionization, EI Chemical Ionization, CI 场电离, 场解吸 Field Ionization FD, Field Desorption FD 快原子轰击 Fast Atom Bombardment, FAB 基质辅助激光解析电离 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization, MALDI 电喷雾电离 Electrospray Ionization, ESI 大气压化学电离 Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI

24 二 2010 版 中国药典 质谱法 * 电子轰击电离 EI - 电子轰击电离又称为电子轰击, 或电子电离, 是应用最普遍, 发展最成熟的电离方法 气化后的样品分子进入离子化室后, 受到由钨或铼灯丝发射并加速的电子流的轰击产生正离子, 轰击电压 50-70eV, 有机分子的电离电位一般为 7-15eV 可提供丰富的结构信息有较好的重现性, 其裂解规律的研究也最为完善, 已经建立了数万种有机化合物的标准谱图库可供检索 其缺点在于不适用于难挥发和热稳定性差的样品, 有些化合物的分子离子不出现或很弱

25 二 2010 版 中国药典 质谱法 * 电子轰击电离 EI 使用高能电子束从试样分子中撞出一个电子而产生正离子, 即 M+e M + +2e 式中 M 为待测分子,M + 为分子离子或母体离子 电子束产生各种能态的 M + 若产生的分子离子带有较大的内能 ( 转动能 振动能和电子跃迁能 ), 可以通过碎裂反应而消去, 如 M + M + 1 M+ 3 M + 2 M+ 4 式中 M + 1,M+ 2 为较低质量的离子

26 二 2010 版 中国药典 质谱法 * 电子轰击电离 EI 图

27 二 2010 版 中国药典 质谱法 化学电离 (Chemical Ionization,CI) 离子室内的反应气 ( 甲烷等 ;10~100Pa, 样品的 10 3 ~10 5 倍 ), 电子 (100~240eV) 轰击, 产生离子, 再与试样分离碰撞, 产生准分子离子 最强峰为准分子离子 ; 谱图简单 ; 不适用难挥发试样 ; 气体分子 + + 试样分子 + 准分子离子电子 (M+1) + ;(M+17) + ;(M+29) + ;

28 二 2010 版 中国药典 质谱法 化学电离 (Chemical Ionization,CI) 小分子如 CH 4, (CH 3 ) 2 CH 等 以 CH 4 为例 CH 4 + e CH e (46%) CH 3+ (39%) CH 2 + (7%) 初级离子 : CH 4 +, CH 3+, CH 2 + CH CH 4 CH 5+ + CH 3 (48%) CH 3+ + CH 4 C 2 H 5+ + H 2 (41%) CH CH 4 C 3 H H 2 (6%) CH 5+, C 2 H 5+, C 3 H 5 + 等为稳定的次级离子

29 二 2010 版 中国药典 质谱法 化学电离 (Chemical Ionization,CI) 准分子离子 [QM] + M + CH 5+ [MH] + + CH 4 M + C 2 H 5+ [MH] + + C 2 H 4 M + C 2 H 5+ [M H] + + C 2 H 6 特点 : 电离能小, 质谱峰数少, 图谱简单 ; 准分子离子 (M+1)+ 峰大, 可提供分子量这一种要信息

30 二 2010 版 中国药典 质谱法 大气压电离 (Atmospheric-pressure Ionization,API) -API 是液相色谱 / 质谱联用仪最常用的离子化方式 常见的大气压电离有三种 : 大气压电喷雾 (APESI,ESI), 大气压化学电离 (APCI) 和大气压光电离 (APPI) ESI APCI

31 二 2010 版 中国药典 质谱法 ESI 原理 Charged Droplets Rayleig h Limit Reache d Evaporation Analyte Ions Solvent Ion Clusters Salts/Ion pairs eutrals 准分子离子 + 其他离子试样离子 APESI 是从去除溶剂后的带电液滴形成离子的过程, 适用于易在溶液中形成离子的供试品或极性化合物 因有多电荷能力, 所以其分析的分子量范围很大, 既可用于小分子分析, 又可用于多肽 蛋白质和寡聚核甘酸分析

32 二 2010 版 中国药典 质谱法 ESI 特点 * 电喷雾电离是最软的电离技术, 通常只产生分子离子峰,[M+H] +,[M+a] + 或 [M-H] - 单电荷离子, 因此可直接测定混合物, 并可测热不稳定的极性化合物 通过调节离子源电压控制离子的碎裂 ( 源内 CID) 测定化合物结构

33 二 2010 版 中国药典 质谱法 ESI 原理 电喷雾产生多电荷离子, 相对分子质量 Mr 计算 : 选相邻峰, 电荷 n, n +1 m 1 =(Mr + n)/2 m 2 =(Mr + n+1)/ (n+1)

34 二 2010 版 中国药典 质谱法 * 大气压化学电离 (APCI) - 大气压下利用电晕放电来使气相供试品和流动相电离的一种离子化技术, 要求供试品有一定的挥发性, 适用于非极性或低 中等极性的化合物 由于极少形成多电荷离子, 分析的分子量范围受到质量分析器质量范围的限制 - 大气压化学电离也是软电离技术, 只产单电荷峰, 适合测定质量数小于 2000Da 的弱极性的小分子化合物 ; 适应高流量的梯度洗脱 / 高低水溶液变化的流动相 ; 通过调节离子源电压控制离子的碎裂

35 二 2010 版 中国药典 质谱法 * 电喷雾与大气压化学电离的比较 - 电离机理 : 电喷雾采用离子蒸发, 而 APCI 电离是高压放电发生了质子转移而生成 [M+H] + 或 [M-H] - 离子 - 样品流速 :APCI 源可从 0.2 到 2 ml/min; 而电喷雾源允许流量相对较小, 一般为 ml/min. - 断裂程度 :APCI 源的探头处于高温, 对热不稳定的化合物就足以使其分解. - 灵敏度 : 通常认为电喷雾有利于分析极性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物, 而 APCI 更适合于分析极性较小的化合物 - 多电荷 :APCI 源不能生成一系列多电荷离子

36 二 2010 版 中国药典 质谱法 质谱离子源的选择 200,000 ESI 分子量 15,000 1,000 APCI GC-EI 10 非极性 高极性

37 二 2010 版 中国药典 质谱法 * 基质辅助激光解吸离子化 Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) MALDI 可使热敏感或不挥发的化合物由固相直接得到离子 待测物质的溶液与基质的溶液混合后蒸发, 使分析物与基质成为晶体或半晶体, 用一定波长的脉冲式激光进行照射时, 基质分子能有效的吸收激光的能量, 使基质分子和样品分子进入气相并得到电离 MALDI 适用于生物大分子, 如肽类, 核酸类化合物 可得到分子离子峰, 无明显碎片峰 此电离方式特别适合于飞行时间质谱计

38 二 2010 版 中国药典 质谱法 * 基质辅助激光解吸离子化 Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) 将溶于适当基质中的供试品涂布于金属靶上, 用高强度的紫外或红外脉冲激光照射可实现供试品的离子化 此方式主要用于分子量的 以上的大分子分析, 仅限于作为飞行时间分析器的离子源使用

39 二 2010 版 中国药典 质谱法 质量分析器 - 质量分析器将带电离子根据其质荷比进行分离, 用于记录各种离子的质量数和丰度 质量分析器的两个主要技术参数是所能测定的质荷比的范围 ( 质量范围 ) 和分辨率 根据结构的差异, 质量分析器包括扇形磁场分析器 四极杆分析器 离子阱分析器 飞行时间分析器和傅里叶变换分析器等

40 二 2010 版 中国药典 质谱法 扇形磁场分析器 ( Magnetic Sector Mass Analyzer ) 离子束经加速后飞入磁极间的弯曲区, 由于磁场作用, 飞行轨道发生弯曲 只有一扇形磁场的质量分析器又称为磁分析器 加速后离子具有一定的动能 : ( 1 mv 2 2 ), 该动 能是由离子在加速电场获得的电势能 (zv) 转化的 mv zv

41 二 2010 版 中国药典 质谱法 单聚焦磁场分析器 磁场方向聚焦 ; 相同质荷比, 入射方向不同的离子会聚 ; S 1 S 2 R 分辨率不高 离子源 B 收集器

42 二 2010 版 中国药典 质谱法 双聚焦分析器 方向聚焦 : 相同质荷比, 入射方向不同的离子会聚 ; 能量聚焦 : 相同质荷比, 速度 ( 能量 ) 不同的离子会聚 ; + - S 1 S 2 离子源 收集器 磁场 质量相同, 能量不同的离子通过电场和磁场时, 均产生能量色散 ; 两种作用大小相等, 方向相反时互补实现双聚焦 ;

43 二 2010 版 中国药典 质谱法 * 四级杆分析器 ( Quadrupole Mass Analysers ) 四级杆分析器由四根平行的棒状电级组成 离子束在与棒状电极平行的轴上聚焦, 一个直流固定电太 (DC) 和一个射频电压 (RF) 作用在棒状电级上, 两对电级之间的电位相反 对于给定的直流和射频电压, 特定质荷比的离子在轴向稳定运动, 其他质荷比的离子则与电极碰撞湮灭 将 DC 和 RF 以固定的斜率变化, 可以实现质谱扫描功能 四级杆分析器对选择离子分析具有较高的灵敏度

44 二 2010 版 中国药典 质谱法 * 四级杆分析器

45 二 2010 版 中国药典 质谱法 * 离子阱分析器 (Ion Trap Mass Analysers ) - 由两个端盖电极和位于它们之间的类似四极杆的环电极构成 端盖电极施工加直流电压或接地, 环电极施加射频电压 (RF), 通过施加适当电压就可以形成一个势能阱 ( 离子阱 ) 根据 RF 电压的大小, 离子阱就就可捕获某一质量范围的离子 离子阱可以储存离子, 待离子累积到一定数量后, 升高环电极上的 RF 电压, 离子按质量从高到低的次序依次离开离子阱, 被电子倍增器检测 目前离子阱分析器已发展到可以分析质荷比高达数千的离子 离子阱在全扫描模式下仍然具有较高灵敏度, 而且单个离子阱通过时间序列的设定就可以实理财多级质谱 (MSn) 的功能

46 二 2010 版 中国药典 质谱法 * 离子阱分析器

47 二 2010 版 中国药典 质谱法 * 飞行时间分析器 (Time-of-Flight (TF) Mass Analyzers) - 具有相同动能但不同质量的离子, 因其飞行速度不同而分离 如果固定离子飞行距离, 则不同质量离子的飞行时间不同, 质量小的离子飞行时间短而首先到达检测器 各种离子的飞行时间与质荷比的平方根成正比 离子以离散包的形式引入质谱仪, 这样可以统一飞行的起点, 依次测量飞行时间 离子包通过一个脉冲或者一个栅系统连续产生, 但只在一特定的时间引入飞行管 新发展的飞行时间分析器具有大的质量分析范围和较高的质量分辩率, 尤其适合蛋白质等生物大分子分析

48 二 2010 版 中国药典 质谱法 * 飞行时间分析器

49 二 2010 版 中国药典 质谱法 * 串联质谱分析器 - 两个或更多的质谱连接在一起, 称为串联质谱 - 空间串联 :QQQ Q-Trap Q-TF TF-TF - 时间串联 :Ion Trap rbitrap FT-MS 离子阱质谱 Ion Trap MS 三重四级杆质谱 Triple Quadrupole MS 四极杆飞行时间质谱 Q-TF MS

50 二 2010 版 中国药典 质谱法 * 串联质谱的功能 (1)MS1 中的母离子和 MS2 中的子离子间的联系 : 如子离子扫描 母离子扫描和中性碎片丢失扫描 母离子的碎裂可以通过以下方式实现 ; 碰撞诱导解离 表面诱导解离和激光诱导解离 不用激发即可解离则称为亚稳态分解 (2) 混合物分析 : 在质谱与色谱联用时, 即使色谱未能将物质完全分离, 也可以进行鉴定 MS/MS 可从供试中选择母离子进行分析, 而不受其他物质干扰 (3) 子离子扫描可获得药物主要成分 杂质和其他物质的母离子的定性鉴别, 也可用于肽和蛋白质氨基酸序列的鉴别 (4) 在药物代谢动力学研究中, 对生物复杂基质中低浓度供试品进行定量分析, 可用多反应监督模式 (Multiple Reaction Monitoring, MRM) 消除干扰

51 二 2010 版 中国药典 质谱法 * 联用技术 色谱可作为质谱的供试品导入装置, 并对供试品进行初步分离纯化, 因此色谱 / 质谱联用技术可对复杂体系进行分离分析 因为色谱可得到化合物的保留时间, 质谱可给出化合物的分子量和结构信息, 故对复杂体系或混合物中化合物的鉴别和测定非常有效 在这些联用技术中, 气相色谱 / 质谱联用和液相色谱 / 质谱联用等已经广泛用于药物分析 * 联用技术类型 GC-MS,LC-MS,CE-MS,SFC-MS,LC-ICPMS

52 二 2010 版 中国药典 质谱法 检测器及数据处理 * 检测器通常为光电倍增强或电子倍增器, 将离子流转化为电流, 所采集的信号经放大并转化为数字信号, 通过计算机处理后得到质谱图 * 在质谱仪测定的质量范围内, 由离子的质荷比和其相对丰度构成质谱图 在 LC/MS 和 GC/MS 中, 常用各分析物质的色谱保留时间和由质谱得到其离子的相对强度组成色谱总离子流图 也可固定某质荷比, 对整个色谱流出物进行选择离子检测 (Selected Ion Monitoring, SIM), 得到选择离子流图

53 二 2010 版 中国药典 质谱法 * 质谱一些技术指标 A: 分辨率 ( 分辨本领, 质量分辨,Resolution) Rp m m m 2 m1 m2 m=m 2 -m 1 R p =7200 通常, 仪器的分辨率规定为两峰间峰谷高度为峰高 10% 时的测定值, 也就是两峰各以 5% 的高度重叠 对于低 中 高分辨率的质谱, 分别是指分辨率在 100~ ~10000 和 以上

54 二 2010 版 中国药典 质谱法 * 质谱一些技术指标 B: 质量范围 (Mass Range): 指能够测量质谱的最大质量数, C: 灵敏度 (Sensitivity): 在额定分辨率下, 质谱仪能给出定性质谱的最小样品量. 如串联质谱以利血平作为指标,MS/MS 全扫描,1pg,S>50 D: 扫描速度 (Scan Speed): 单位时间获得谱图的数目 E: 质量精度 (Accuracy):Mcal = , Mexp =

55 二 2010 版 中国药典 质谱法 色谱 ( 光谱 )~ 质谱 ( 波谱 ) 技术 GC-FTIR GC-MS HPLC-MS HPLC-MR HPCE-MS

56 二 2010 版 中国药典 质谱法 离子源 LC/MS 接口 样品与溶剂脱离及电离 ESI APCI 质量分析器 离子识别 Quadrapole Ion Trap Time of Flight Fourier Transform 检测离子 离子检测数据系统 HPLC MS

57 二 2010 版 中国药典 质谱法 * 总离子流与质量色谱图 质量色谱图 总离子流图

58 二 2010 版 中国药典 质谱法 2010 年版 中国药典 一部收录三个品种 - 川楝子及苦楝皮中的川楝素进行含量测定 川楝素 (Toosendanin): C30H3811 MW 反相 C18 体系, 乙腈 -0.01% 甲酸溶液 (31:69) 为流动相, 采用单级四级杆质谱检测器, 电喷雾离子化 (ESI) 负离子模式下选择质荷比 (m/z) 为 573 的离子进行检测 理论塔板数按川楝素计算应不低于 8000 通过外标法, 以川楝素两个峰面积之和计算川楝素的含量

59 二 2010 版 中国药典 质谱法 2010 年版 中国药典 一部收录三个品种 - 千里光中的阿多尼弗林碱进行了杂质检查 阿多尼弗林碱 Adonifoline C18H237,MW= 365 具有细胞毒性 反相 C18 体系, 乙腈 -0.5% 甲酸溶液 (7:93) 为流动相, 采用单级四级杆质谱为检测器, 电喷雾离子化 (ESI) 正离子模式下选择质荷比 (m/z) 为 366 离子进行检测 理论塔板数按阿多尼弗林碱计算应不低于 8000 以百合碱为内标, 计算校正因子, 测定阿多尼弗林碱的含量

60 二 2010 版 中国药典 质谱法 USP32 - 血管升压素 (Vasopressin ): ESI+,1084( 单电荷 ) 和 543( 双电荷 ); - 人重组血清白蛋白 (Recombinant Albumin Human): 585 个氨基酸组成, 分子量 66,438 Da,ESI+ 多电荷质谱图去卷积, 20Da 之内误差 ; - 醋酸去氨加压素 (Desmopressin Acetate): ESI+, m/z 1069,MS/MS,m/z 和 995 子离子

61 三 高效液相色谱 - 质谱 (HPLC-MS) 联用技术 * 质谱法可以进行有效的定性分析, 但对复杂有机化合物分析就无能为力了, 而且在进行有机物定量分析时要经过一系列分离纯化操作, 十分麻烦 而色谱法对有机化合物是一种有效的分离和分析方法, 特别适合进行有机化合物的定量分析, 但定性分析则比较困难, 因此两者的有效结合必将为化学家及生物化学家提供一个进行复杂化合物高效的定性定量分析的工具 这种将两种或多种方法结合起来的技术称为联用技术 (Hyphenated Method), 如气相色谱一质谱 (GC-MS) 液相色谱一质谱 (LC-MS) 毛细管电泳一质谱(CE-MS) 等, 其主要问题是如何解决与质谱相连的接口及相关信息的高速获取与贮存等问题

62 三 高效液相色谱 - 质谱 (HPLC-MS) 联用技术 HPLC-MS: H: High P: Performance (Pressure) L: Liquid C: Chromatography MS is mass spectrometry MS/MS is mass tandem mass spectrometry GC/MS 12% LC/MS 3% HPLC 15% GC/MS 5% HPLC 85% LC/MS 80% * AMAS2002 药物研发中的分析方法

63 三 高效液相色谱 - 质谱 (HPLC-MS) 联用技术 * HPLC-MS 的特点 : (1) 扩大 MS 真空系统的抽气容量 (2) 在引入真空系统之前除去溶剂 (3) 牺牲灵敏度分流流出物 (4) 流动相含挥发性酸 碱 盐 (5 ) 使用可在较低流量下有效工作的微型 LC 柱

64 三 高效液相色谱 - 质谱 (HPLC-MS) 联用技术 高效液相色谱 - 串联质谱联用仪 - 高效液相色谱 - 离子阱质谱联用仪 Agilent 6300 Series ThermoElectron LXQ Bruker Esquire HCT Varian 高效液相色谱 - 三重四级杆串联质谱联用仪 ThermoElectron TSQ Waters Preimer XE Agilent 6410 API 4000

65 三 高效液相色谱 - 质谱 (HPLC-MS) 联用技术 * HPLC-Electrospray Interface 电喷雾接口

66 三 高效液相色谱 - 质谱 (HPLC-MS) 联用技术 LC-MS 分析条件的选择和优化 1. 接口的选择 : * ESI 适合于中等极性到强极性的化合物分子, 特别是那些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子 ( 如蛋白质 ) * APCI 不适合可带多个电荷的大分子, 其优势在于弱极性或中等极性的小分子的分析

67 三 高效液相色谱 - 质谱 (HPLC-MS) 联用技术 LC-MS 分析条件的选择和优化 2. 正 负离子模式的选择 : 选择的一般原则为 : 正离子模式 : 适合于碱性样品, 可用乙酸或甲酸对样品加以酸化 样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式 负离子模式 : 适合于酸性样品, 可用氨水或三乙胺对样品进行碱化 样品中含有较多的强伏电性基团, 如含氯 含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式

68 三 高效液相色谱 - 质谱 (HPLC-MS) 联用技术 LC-MS 分析条件的选择和优化 3. 流动相的选择 : a. 常用的流动相为甲醇 乙腈 水和它们不同比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液, 如甲酸铵 乙酸铵等, 还可以加入易挥发酸碱如甲酸 乙酸和氨水等调节 ph 值 b. LC/MS 接口避免进入不挥发的缓冲液, 避免含磷和氯的缓冲液, 含钠和钾的成分必须 <lmmol/l ( 盐分太高会抑制离子源的信号和堵塞喷雾针及污染仪器 ) 含甲酸 ( 或乙酸 )<2 % 含三氟乙酸 0.5% 含三乙胺 <l% 含醋酸铵 <10~50 mmol/l c. 送样前摸好 LC 条件, 可基本分离, 缓冲体系符合 MS 要求

69 三 高效液相色谱 - 质谱 (HPLC-MS) 联用技术 LC-MS 分析条件的选择和优化 将现有的 HPLC 方法用于 LC/ESIMS 时应注意 : 1. 硫酸盐 磷酸盐和硼酸盐等非挥发性缓冲剂, 需用挥发性缓冲剂, 如乙酸铵 甲酸铵 甲酸 乙酸 氨水等代替 2. ph 值, 当用挥发性酸 碱, 如甲酸 乙酸和氨水等代替非挥发性酸 碱时,pH 值通常应保持不变 3. 有机溶剂, 大多数 LC 用的溶剂, 尤其是 RPLC, HILIC 流动相与 ESIMS 相匹配

70 三 高效液相色谱 - 质谱 (HPLC-MS) 联用技术 LC-MS 分析条件的选择和优化 4. 流量和色谱柱的选择 a. 不加热 ESI 的最佳流速是 1 50ul/min, 应用 4.6 mm 内径 LC 柱时要求柱后分流, 目前大多采用 l 2.1 mm 内径的微柱, ESI 源最高允许 lml/min, 建议使用 ul/min b. APCI 的最佳流速 ~lml/min, 常规直径 4.6mm 柱最合适 c. 为了提高分析效率, 常采用 < 100 mm 的短柱 ( 此时 UV 图上并不能获得完全分离, 由于质谱定量分析时使用 MRM 的功能, 所以不要求各组分没有完全分离 ) 这对于大批量定量分析可以节省大量的时间

71 三 高效液相色谱 - 质谱 (HPLC-MS) 联用技术 LC-MS 分析条件的选择和优化 5. 辅助气体流量和温度的选择 a. 雾化气对流出液形成喷雾有影响, 干燥气影响喷雾去溶剂效果, 碰撞气影响二级质谱的产生 b. 操作中温度的选择和优化主要是指接口的干燥气体而言, 一般情况下选择干燥气温度高于分析物的沸点 20 左右即可 对热不稳定性化合物, 要选用更低的温度以避免显著的分解 c. 选用干燥气温度和流量大小时还要考虑流动相的组成, 有机溶剂比例高时可采用适当低的温度和流量小一点的

72 三 高效液相色谱 - 质谱 (HPLC-MS) 联用技术 LC-MS 分析样品预处理 为什么要进行样品的预处理 : (1) 从保护仪器角度出发, 防止固体小颗粒堵塞进样管道和喷嘴, 防止污染仪器, 降低分析背景, 排除对分析结果的干扰 (2) 要求获得最佳的分析结果, 从 ESI 电离的过程分析 :ESI 电荷是在液滴的表面, 样品与杂质在液滴表面存在竞争, 不挥发物 ( 如磷酸盐等 ) 防碍带电液滴表面挥发, 大量杂质防碍带电样品离子进入气相状态, 增加电荷中和的可能

73 三 高效液相色谱 - 质谱 (HPLC-MS) 联用技术 LC-MS 分析样品预处理方法 a) 超滤 b) 溶剂萃取 / 去盐 c) 固相萃取 d) 灌注 (Perfusion) 净化 / 去盐 e) 色谱分离 反相色谱分离 亲和技术分离 f) 甲醇或乙腈沉淀蛋白 g) 酸水解, 酶解 h) 衍生化

74 三 高效液相色谱 - 质谱 (HPLC-MS) 联用技术 LC-MS 分析样品鉴别 一级全扫描方式 (Q1 扫描 ) 全扫描数据采集可以得到化合物的准分子离子, 从而可判断出化合物的分子量, 用于鉴别是否有未知物, 并确认一些判断不清的化合物, 如合成化合物的质量及结构 子离子分析 ( MS/MS ) 子离子, 用于结构判断 ( 得到化合物的二级谱图即碎片离子 ) 和选择离子对作多种反应监测 (MRM) 子离子谱图与锥体电压断裂谱图 ( 源内 CID) 可能十分相似, 所不同的是子离子质谱图已知只有一种质量通过 MS1, 因此也已知所有碎片离子都是由我们所选定的母离子所产生的, 所以我们更相信由 MS/MS 产生的谱图的纯度

75 三 高效液相色谱 - 质谱 (HPLC-MS) 联用技术 LC-MS 大气压电离质谱仪可得到分子量信息 正离子方式常出现如下离子 : -a 22 Da. higher than M+H -K 38 Da. higher than M+H -Li 6 Da. higher than M+H -H4 17 Da. higher than M+H -AC 40 Da. higher than M+H 2M+H,2M+a 等负离子方式常出现如下离子 : -TFA 114 Da. higher then M-H (113 and 227 background) -Acetate 60 Da. higher then M-H -Formic 46 Da. higher then M-H -Cl 36 Da. higher than M-H

76 三 高效液相色谱 - 质谱 (HPLC-MS) 联用技术 LC-MS 影响分子量测定的因素 1)pH 的影响 : 正离子方式 ph 要低些, 负离子方式 ph 要高些, 除对离子化有影响外, 还影响 LC 的峰形 2) 气流和温度 : 当水含量高及流量大时要相应增加 3) 溶剂和缓冲液流量 : 流速适当高可以提高出峰的灵敏度 4) 溶剂和缓冲液的类型 : 通常正离子用甲醇好, 负离子乙腈好些 5) 选择合适的液相色谱类型 : 正相 反相 选择合适的色谱柱 6) 合适的电压 :DP 电压高时, 样品在源内分解或碎裂 ; 高 DP 电压时回使多电荷离子比例低, 多聚体也减少 7) 样品结构和性质 8) 杂质的影响 : 溶剂的纯度 水的纯净程度等 当成分复杂, 杂质太多时, 竞争使被测物离子化不好, 同时使 LC 分离不好 9) 样品浓度不够, 有时需要浓缩

77 三 高效液相色谱 - 质谱 (HPLC-MS) 联用技术 LC-MS 常见本底离子 m/z , 溶剂离子,[(H 2 ) n H +,n= 3-112] m/z 102, H+ 乙腈 + 乙酸, C 4 H 7 2 H +, m/z149, 管路中邻苯二甲酸酯的酸酐, C 8 H 4 3 H +, m/z 288, 2mm 离心管的产生的特征离子 m/z 279, 管路中邻苯二甲酸二丁酯 C 16 H 22 4 H +, m/z 316, 2mm 离心管的产生的特征离子 m/z 384, 瓶的光稳定剂产生的离子 m/z 391, 管路中邻苯二甲酸二辛酯, C 24 H 38 4 H +, m/z 413, 邻苯二甲酸二辛酯 + 钠, C 24 H 38 4 a +, m/z 538, 乙酸 + 氧 + 铁 ( 喷雾管 ), Fe 3 ( 2 CCH 3 ) 6,

78 三 高效液相色谱 - 质谱 (HPLC-MS) 联用技术 LC-MS-MS 目标化合物分析 (1) Q1 Full Scan ( 一级全扫描 ) (2) Selected Ion Monitoring(SIM, 选择离子监测 ) (3) Precursor Ion Scan( 母离子扫描 ) (4) Product Ion Scan( 子离子扫描 ) (5) eutral Loss Scan( 中性丢失扫描 ) (6) Multiple Reaction Monitoring (MRM, 多反应监测 )

79 三 高效液相色谱 - 质谱 (HPLC-MS) 联用技术 LC/MS 的基本数据与信息基于 : (1)MS 质谱峰的 m/z 和强度 (2)LC 色谱峰的保留数据与面积 定性数据 : TIC 色谱峰的保留时间 (t R ); 质谱及 m/z 测定数据 ; 化合物或离子的分子量 实验式 不饱和度 ; 质谱峰的同位素丰度比 ;MS n ( CID) 结构信息 ; 氮规律 定量数据 质谱峰強度, 色谱峰的面积

80 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 LC-MS-MS 的具体应用领域 医药学 : 药物代谢 药物动力学 杂质分析 天然产物分析生物化学 : 肽 蛋白质 寡核苷酸 糖环境化学 : 农药和农残分析 有机污染物 土壤 / 食品 / 水分析临床医学 : 新生儿检查 糖化血红蛋白 ( 糖尿病 ) 血红蛋白变异 胆酸食品科学 : 香料 添加物 包装物 蛋白质 致癌物法医学 : 滥用药物 爆炸物 兴奋剂检测兽医学 : 兴奋剂 磺胺类药物 抗体合成化学 : 有机金属化合物 有机合成物有机化学 : 表面活性剂 染料

81 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 HPLC-MS 在定性分析上的应用 - 药物主成分的定性鉴别及药品打假 - 中成药非法添加化学药 违禁药物检测 - 药物中有关物质的定性 - 天然产物及天然药物研究 - 质量肽图的分析 蛋白质磷酸化修饰研究 - 蛋白质分子量的测定 ( 分子量小于 6 万, 多电荷法 ) - 临床诊断和疾病生物标志物的分析 - 食品中抗生素残留等化学残留成分分析

82 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 * Identification Points (IPs, 识别得分 ) - 欧盟 96/23/EC 及 2002/657/EC 指令 - D,Hubert F, et.al,trends in Analytical Chemistry, 2001, 20(8), 435 分析色谱柱及体系的更替使用 (1 Point) LRMS (1 Point), LRMS n (1.5 Points),HRMS (2 Points) LC-MS-MS: 1 precursor and 2 daughters (4 Points) LC-MS-MS: MS/MS Full Scan(4 Points) EU guideline: 4 Identification points

83 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 * 药典中的定性鉴别 ( 已知物的鉴别 ) 化学 红外 紫外 色谱保留时间 * 液质联用定性鉴别 ( 未知物的鉴别 ) 色谱保留时间 (1) 一级质谱分子离子 (2) 二级质谱全扫描 (4) * EU guideline: 6 Identification points

84 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 明确的色谱分析保留时间 经典的定性分析判定依据 保证良好分离的基础及方法学研究的保障 * 要求 :(1) 大于 2 倍死体积的保留时间 (2) 与对照品保留时间 2.5% 的误差 (3) 适合质谱分析的流速及分析时间

85 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 明确的一级质谱分析 明确分析目标化合物, 加强分析的专属性 从复杂的本底一级质谱中挑出目标化合物 具有特征同位素元素化合物的前期判定 * 特征 : 分子离子峰 (M+1 M-1 M+a M+ K M+H 4 双分子聚合峰 溶剂加合峰等 )

86 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 明确的二级质谱分析 经碰撞能量优化的二级质谱全扫描 提高分析灵敏度, 确认定性离子对及定量子离子 灵敏度及最低检出限的判定依据 * 指标 : 10% 母离子相对丰度, 最好形成丰度大于 10% 的碎片离子数目大于 4 个, 且丰度维持相对恒定

87 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 相对强度的容许量 相对丰度 (% 基峰 ) GC- MS/EI GC-MS/CI, GC- MS/MS n LC-MS, LC-MS-MS n > 50 % 10 % 20 % > 20 % - 50 % 15 % 25 % > 10 % - 20 % 20 % 30 % 10 % 50 % 50 %

88 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 相对强度的容许量 20 % 20 % 50 % 30 % 25 %

89 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 一级质谱及二级质谱相互关系 MS/MS

90 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 复方清开灵注射液中胆酸的鉴别 - 通过对样品进行分子离子峰的扫描发现 [M-H] - 的峰中有一个很强的 407, 根据样品处理过程以及对复方各单味药材的研究, 其应该为一有机酸的负离子峰, 并初步推断其为胆酸 ( 胆酸的分子量为 408) 如图所示 : 通过对照样品 ( 右 ) 和标准品 ( 左 ) 的二级质谱图, 发现其主要碎片峰均吻合较好 朠 roduct (407): Expt. 2, min (23 scans) from Standard of Cholic acid 4.42e3 cps 朠 roduct (407): Expt. 2, min (29 scans) from qkl/ e4 cp Intensity, cps Intensity, cps m/z, amu m/z, amu

91 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 中成药 食品 保健食品 化妆品中非法添加化学成分或有害物质残留检测 中华人民共和国食品卫生法 第九条 第十条 中华人民共和国药品管理法 第四十八条 中华人民共和国药品管理法实施条例 第五十八条 中成药中非法添加化学药 - 依据 中华人民共和国药品管理法, 第四十八条规定, 应定性为假药 - 依据 中华人民共和国药品管理法, 第五十八条规定, 申请补充检验方法和检验项目, 经 SFDA 批准后, 作为药品监督管理部门认定药品质量的依据

92 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 中成药中非法添加化学成分的特点 加入的药物廉价易得加入的化学药物具有稳定的疗效加入的剂量达到发挥药效量少量多组分加入发挥药物的协调作用, 并可减少检出可能性 加入中间体, 掩蔽剂, 达到避免检出的目的 加入天然成份物质, 为化学药物的存在伪造证据

93 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 中成药中非法添加化学药液质联用检验方法 2006 年 3 月,SFDA 通用补充检验方法及项目的批准 - 治疗肥胖症中成药 (SFDA ) - 治疗消渴症中成药 (SFDA ) - 消肿止痛类中成药 (SFDA ) - 止咳平喘类中成药 (SFDA ) - 镇静安神类中成药 (SFDA ) - 补肾壮阳类中成药 (SFDA )

94 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 降糖类 : 双胍类 CH 3 H 3 C H H2 H H 二甲双胍 Cl H CH 3 S H 格列本脲 H 磺酰脲类 α- 糖苷酶抑制剂类 H H 苯乙双胍 H H 2 H H 3 C S H CH 3 H 甲苯磺丁脲 胰岛素增敏剂 ( 噻唑烷二酮类 ) 类 非磺酰脲类促胰岛素分泌剂类 H 3 C H 格列吡嗪 S H H

95 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 降糖类 : RT: uau UV 235nm L: 2.27E6 Channel A UV Mixture1_8_06 Relative Abundance Relative Abundance uau Time (min) UV 254nm (+) ESI-MS (-) ESI-MS L: 5.55E5 Channel B UV Mixture1_8_06 L: 1.12E9 m/z= F: + c ESI Full ms [ ] MS Mixture1_8_06 L: 1.38E8 TIC F: - c ESI Full ms [ ] MS Mixture1_8_06 八种降糖药液质联用方法的建立

96 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 降糖类 : L: 1.77E6 Channel A UV BYSG&GLBQ&GLB_06 L: 4.03E8 TIC F: + c ESI Full ms [ ] MS BYSG&GLBQ&GLB_ L: 8.09E6 m/ z= F: + c ESI Full ms @35.00 [ ] MS BYSG&GLBQ&GLB_ L: 3.35E7 m/ z= F: + c ESI Full ms @27.00 [ ] MS BYSG&GLBQ&GLB_ L: 6.24E4 m/ z= F: + c ESI Full ms @27.00 [ ] MS BYSG&GLBQ&GLB_ Time (min) Time (min) Relative Abundance 苯乙双胍 m/ z H H H H 2 H Relative Abundance m/ z Relative Abundance S H H H 格列吡嗪 H 3 C m/ z Relative Abundance m/ z Relative Abundance S H H Cl 格列本脲 H CH m/ z Relative Abundance m/ z

97 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 糖皮质激素类药物 : 糖皮质激素的基本结构中均具有环戊烷骈多氢菲母核, 其中 C3 的酮基 C20 的羰基及 C4-5 的双键是保持生理功能所必需, 结构上可通过在 C1~2 引入双键, 在 C6 C9 C16 C21 引入结构修饰基团来增强其抗炎作用, 减弱水盐代谢作用 A 4 R B C CH 2 H C D H [M+1] + 准分子离子峰 : 泼尼松龙 m/z361.2 泼尼松 m/z359.3 地塞米松 m/z393.2 醋酸可的松 m/z403.2 醋酸泼尼松龙 m/z403.2 醋酸泼尼松 m/z401.3 醋酸地塞米松 m/z435.1

98 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 糖皮质激素类药物 : RT: uau Relative Abundance Time (min) RT: SM: 5G 2.54 uau Relative Abundance Time (min) HPLC-UV MS 色谱图 (a) 七种糖皮质激素对照品 ;(b) 供试品 * 以泼尼松计算, 柱上灵敏度达到 0.5ng

99 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 补肾壮阳类中成药 ( 壮阳类 ): - 磷酸二酯酶 5(PDE5) 抑制剂类及雄性激素 S H H Sildenafil (Viagra) Exact MS: H H Tadalafil Exact MS: S H H Vardenafil Exact MS: S H H Aildenafil Exact MS: H S S S Homosildenafil Exact MS: H Hydroxy-homosildenafil Exact MS: Acetildenafil(Hongdenafil) Exact MS: H Hydroxysildenafil Exact MS: 490.2

100 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 补肾壮阳类中成药 ( 壮阳类 ): RT: uau H 他达拉非 FW= S H 西地那非 FW=474.2 L: 2.22E5 Channel B UV XDF&TDL F03 L: 3.32E5 Channel B UV xdnf&tdlf Time (min) 不同流动体系分离他达拉非 西地那非 HPLC 色谱图

101 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 补肾壮阳类中成药 ( 壮阳类 ): RT: L: 4.88E5 Channel A UV XDF&TDLF_Std_ L: 8.35E m/z= F: - c ESI Full ms [ ] MS 0.36 XDF&TDLF_Std_ L: 1.20E m/z= F: - c ESI Full ms @32.00 [ ] MS XDF&TDLF_Std_ Time (min) uau RT: uau Time (min) L: 4.88E5 Channel A UV XDF&TDLF_Std_10 L: 2.80E8 m/z= F: + c ESI Full ms [ ] MS XDF&TDLF_Std_ L: 2.65E7 m/z= F: + c ESI Full ms @39.00 [ ] MS XDF&TDLF_Std_10 XDF&TDLF_Std_10 # RT: AV: 2 SB: , L: E7 F: - c ESI Full ms [ ] Relative Abundance 他达拉非 m/ z H XDF&TDLF_Std_10 # 117 RT: 2.71 AV: 1 SB: , L: 9.47E7 F: + c ESI Full ms [ ] Relative Abundance 西地那非 m/ z S H XDF&TDLF_Std_10 # 81 RT: AV: 1 SB: , L: 1.12 E7 F: - c ESI Full ms @32.00 [ ] XDF&TDLF_Std_10 # RT: AV: 2 SB: , L: 4.00E6 F: + c ESI Full ms @39.00 [ ] Relative Abundance m/ z Relative Abundance m/ z 他达拉非 西地那非的 HPLC/MS/MS 分析

102 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 西地那非类似物分析 w eilibang_01 # RT: AV: 2 L: 5.24E7 F: + c ESI Full ms @37.00 [ ] Relative Abundance S H m/z? Mass:488.2 xdnf_std10 # RT: AV: 7 L: 1.33E6 F: + c ESI Full ms @38.00 [ ] Relative Abundance S H 西地那非 Mass: m/z w eilibang_01 # RT: AV: 2 L: 6.90E7 F: - c ESI Full ms @33.00 [ ] xdnf_std10 # RT: AV: 6 L: 7.07E6 F: - c ESI Full ms @33.00 [ ] Relative Abundance Relative Abundance m/z m/z

103 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 西地那非类似物分析 RT: Relative Abundance 西地那非??? L: 3.94E5 m/z= F: + c ESI Full ms @38.00 [ ] M S Weilibang03_ RT: Relative Abundance 西地那非 S H L: 1.08E5 TIC F: + c ESI Full ms @38.00 [ ] M S xdnf_std Time (min) Time (min) 9.84 Weilibang03_ # RT: AV: 8 SB: , L: F: + c ESI Full ms @38.00 [ ] Relative Abundance m/z xdnf_std11 # RT: AV: 5 L: 1.58E4 F: + c ESI Full ms @38.00 [ ] Relative Abundance m/z

104 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 西地那非类似物分析 RT: Relative Absorbance Time (min) L: 7.58E4 Channel B UV Hunhe_12 Hunhe_12 # 122 RT: 3.31 AV: 1 L: 2.98E6 F: + c ESI Full ms @33.00 [ ] 100 Relative Abundance m/z Hunhe_12 # RT: AV: 2 L: 5.57E5 F: + c ESI Full ms @ @36.00 [ ] 100 Relative Abundance S H H Hydroxy-homosildenafil m/z Hunhe_12 # 165 RT: 4.41 AV: 1 L: 1.50E6 F: + c ESI Full ms @38.00 [ ] 100 Relative Abundance 西地那非 M+1: m/z 377.0

105 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 最小检出限的确定 ( 以西地那非为例 ) RT: SM : 5G uau Relative Abundance ng Time (min) L: 1.10E5 Channel A UV xdnf_01 L: 8.67E6 m/z= F: + c ESI Full ms @38.00 [ ] MS xdnf_01 RT: SM : 5G uau Relative Abundance ng RT: 3.03 S: Time (min) L: 6.89E3 Channel A UV XDF_03 L: 5.49E5 m/z= F: + c ESI Full ms @38.00 [ ] MS Genesis XDF_03 RT: SM : 5G uau Relative Abundance ng RT: 3.02 S: Time (min) L: 7.12E3 Channel A UV XDF_04 L: 6.05E4 m/z= F: + c ESI Full ms @38.00 [ ] M S XDF_04 xdnf_01 # RT: AV: 10 SB: , L: 5.86E5 F: + c ESI Full ms @38.00 [ ] m/z283 25% XDF_03 # RT: AV: 2 SB: , L: E5 F: + c ESI Full ms @38.00 [ ] m/z283 22% XDF_04 # RT: AV: 4 SB: , L: 6.36E3 F: + c ESI Full ms @38.00 [ ] m/z283 25% Relative Abundance m/z311 70% m/z343 46% m/z % m/ z Relative Abundance m/z311 53% m/z343 61% m/z % m/ z Relative Abundance m/z311 33% m/z343 26% m/z % m/ z

106 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 基因工程蛋白药物中抗生素残留检测 DA 序列重组载体的抗药性标记 其它类型微生物抑制剂 abxl-ms2 # RT: AV: 14 L: 1.39E7 F: + c ESI SIM ms [ ] 氨苄西林 MS H 2 H S H H + Relative Abundance FW = m/z 351.7

107 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 基因工程蛋白药物中抗生素残留检测 氨苄西林 MS/MS abxl-ms2 # RT: AV: 10 L: 2.02E6 F: + c ESI SRM ms @24.00 [ ] Relative Abundance m/z=106 H 2 m/z=191 M+H= CH C m/z H S m/z=160 H H + -H 2 Conv.= g/ml, 0.5ng(10 L), S=4

108 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 * 杂质定义 任何影响药品纯度的物质 在药品质量标准中的杂质系指在按照经国家有关药品监督管理部门依法审查批准的规定工艺和规定的原辅料生产的药品中, 由其生产工艺和原辅料带入的杂质, 或经稳定性试验确证的在贮存过程中产生的降解产物 药品质量标准中的杂质不包括 : 变更生产工艺或变更原辅料而产生的新的杂质 : 重新申报 掺入或污染的外来物质 : 假劣药品, 非法定方法予以检测

109 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 * 杂质检查分析方法 1. 分离度 : 主成分与杂质和降解产物均能分开 2. 灵敏度 :LD( 限度检查 ), LQ( 定量检查 ) 3. 方法验证 定性或确证结构 : 表观含量 0.1% 的杂质或降解产物 表观含量 0.1%, 具强烈生物作用或毒性的杂质, 以及降解产物

110 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 * 杂质定性检查分析方法 - 根据原辅料及其它环境条件推测 (1) 采用对照品, 保留时间 (DAD 不同波长响应 ) (2)MS Full Scan( 分子量 ) (3)MS/MS Full Scan or MRM (4)High Resolution MS(Q-TF,FTMS) (5) 定量 : 内标法 对照品或主成分自身法

111 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 盐酸洛美沙星光降解分析 氟喹诺酮类抗生素, 水溶液对光不稳定, 产生降解产物 A 和 B, 同时也产生少量 8- 位氯代物 ( 降解产物 C) H 3 C H F F CH C 2 H 5 洛美沙星 C17H19F233 FW hν (acl) F CH F CH F CH H 3 C H H 2 C 2 H 5 H 2 H C 2 H 5 H 3 C H Cl C 2 H 5 (A) FW (B) FW (C) FW 367.8

112 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 盐酸洛美沙星光降解分析 RT: L: 1.52E6 Channel A 5500 UV lome02_ uau A B C Time (min) lome02_ #291 RT: 6.48 AV: 1 SB: , L: 8.64E4 T: + c APCI corona SIM ms [ ] lome02_ #252 RT: 5.63 AV: 1 SB: , L: 3.64E4 T: + c APCI corona SIM ms [ ] lome02_ # RT: AV: 2 SB: , L: 3.07E5 T: + c APCI corona SIM ms [ ] Relative Abundance A M+H Relative Abundance B M+H Relative Abundance C M+H m/z m/z m/z

113 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 雷帕霉素有关物质分析 Intens. x 杂质 A 杂质 B Time [min] Intens. x Time [min]

114 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 雷帕霉素有关物质分析 Intens. x All, min (#1295-#1344) 1.00 雷帕霉素 m/z Intens. x10 4 All, min (#449-#490), Background Subtracted 杂质 A m/z

115 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 雷帕霉素有关物质分析 Intens. x 雷帕霉素 All, min (#425-#486) m/z Intens. x All, min (#1122-#1138) 杂质 A m/z

116 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 甲氨蝶呤 事件

117 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 甲氨蝶呤 事件 H 2 CH 3 H 2 HC H H 2 H CH Methotrexate Exact Mass: CH 3 H H H Cytarabine Exact Mass: H H 3 C CH 3 HC H H H CH 3 CH 3 CH 3 Vincristine Exact Mass: 824.4

118 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 甲氨蝶呤 事件 RT: L: 9.49E5 Channel B UV A070401A_01 uau Relative Abundance L: E8 TIC F: + c ESI Full ms [ ] MS A070401A_ Relative Abundance 阿糖胞苷中的长春新碱检测 4.53 L: 1.60E7 TIC F: + c ESI Full ms @30.00 [ ] MS A070401A_ Time (min)

119 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 甲氨蝶呤 事件 RT: L: 1.92E5 Channel B UV M070403A_03 uau Relative Abundance L: 2.35E8 TIC F: + c ESI Full ms [ ] MS M070403A_03 Relative Abundance 甲氨蝶呤中的长春新碱检测 Time (min) L: 9.80E6 TIC F: + c ESI Full ms @30.00 [ ] MS M070403A_03

120 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 测定人血浆中的头孢拉定和青霉素 G 头孢拉定 (FW=349.4) 青霉素 G (FW=334.4) H 2 H S +H + CH 3 H m/z m/z 289 H S H CH 3 CH 3 +H +

121 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 血浆样品前处理 - 固相萃取法 ~ Waters ASIS HLB 固相萃取色谱小柱 血浆酸化离心 活化 / 平衡 1mL 甲醇 / 1mL 水 上样 :1mL 样品 清洗 :1mL 水 萃取回收率 : 青霉素 G ~ 67% 头孢拉定 ~ 73% 洗脱 : 1mL 0.01% 醋酸水溶液 / 甲醇 (1/1)

122 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 测定人血浆中的头孢拉定和青霉素 G * HPLC UV 254nm 青霉素 G 空白血样 UV 254nm 头孢拉定 + ESI Full Mass 头孢拉定 青霉素 G 未知血样 UV 254nm

123 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 测定人血浆中的头孢拉定和青霉素 G * HPLC/MS/MS 空白血样 空白血样 对照样 对照样 未知样 未知样 青霉素 G 头孢拉定

124 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用测定人血浆中的头孢拉定和青霉素 G HPLC/MS/MS 定量分析结果 MS/MS ~ 头孢拉定,m/z 青霉素 G,m/z 线性范围 :20 ng/ml ~ 1000 ng/ml 头孢拉定相关因子 R 2 = ,LD 5ng/mL, RSD=9.5% 青霉素 G 相关因子 R 2 = ,LD 1ng/mL, RSD=7.8% 测出未知血样中含头孢拉定 1.44 g/ml(rsd=2.8%, n=5)

125 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 药物代谢动力学分析 福辛普利 福辛普利拉

126 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 药物代谢动力学分析 Plasma Concentration (ng/ml) Time (h) 志愿受试者口服 20 mg 福辛普利后活性代谢物福辛普利拉的平均血浆浓度 - 时间曲线

127 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 (1) 离子抑制原因 : 生物样品中内源性物质影响分析物离子化后果 : 使信号强度下降, 甚至消失发现 : 配制生物样品, 与溶液样品对比解决方法 : 改进样品预处理方法 ; 色谱分离 (2) 加合离子 溶剂加合离子 : 甲醇 乙腈 无机离子 : 铵离子 钠离子等 分析物聚合 : 二聚体 三聚体等解决办法 : 尝试不同的流动相组成 源内碰撞诱导解离

128 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 (3) 不同官能团质谱响应的差异 有机碱性化合物 : 正离子检测, 灵敏度最高 酸性化合物 : 负离子检测, 灵敏度较高 两性化合物 : 分子内电荷中和, 灵敏度下降 中性化合物 : 难电离, 灵敏度低改进方法 : 调节流动相 ph 和组成 (4) 生物样品预处理 液 液萃取 自动化固相萃取 串联柱切换技术 沉淀蛋白后直接分析

129 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 多肽, 蛋白质分子量的多电荷测定 std_3%0h8 #34 RT: 0.61 L: 1.26E8 F: + c ESI Full ms [ ] 3%10mlH04 #33 RT: 0.59 L: 1.42E8 F: + c ESI Full ms [ ] Relative Abundance H 14+ 人生长激素 ESI-MS Relative Abundance H 15+ 甲酰化人生长激素 ESI-MS m/z m/z std_3%0h8 #34 RT: 0.61 L: 4.74E8 F: + c ESI Full ms [ ] 3%10mlH04 #33 RT: 0.59 L: 6.83E8 F: + c ESI Full ms [ ] Relative Abundance M=22122 去卷褶 Relative Abundance M =22255 (M+131) 去卷褶 mass mass

130 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 多肽质量谱图测定 蛋白质, 多肽 酶切 混合肽段 肽段分子量 MS/MS HPLC 分离 肽谱 HPLC/MSn 质量肽谱 一级结构 翻译后修饰

131 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 多肽质量谱图测定 重组人甲状旁腺素 rh-pth(1~34) TPCK 胰蛋白酶酶切 HPLC/MS 肽谱测定 Data Dependant Scan 进行 MS/MS Bioworks 检索测定一级结构

132 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 多肽质量谱图测定 重组人甲状旁腺素 rh-pth(1~34) RT: Relative Abundance uau MS UV T T5 T2 T T L: 1.65E9 m/z= F: + c ESI Full ms [ ] MS pth_08_o2 L: 9.32E5 Channel A UV pth_08_o Time (min)

133 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 多肽质量谱图测定 重组人甲状旁腺素 rh-pth(1~34) T1~SVSEIQLMHLGK (FW=1456) T2~HLSMER (FW=886) T3~VEWLR (FW=702) T4~LQDVHF (FW=872) T5~KLQDVHF (FW=1000) BioWorks 检索 SVSEIQLMHLGKHLSMERVEWLRKKLQDVHF * FW: , Coverage: >80%, Score: 40.17, PI: 8.29

134 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 液质联用分析谱库的建立 - LC-MS 由于采用软电离技术, 样品分子的碎片信息不是很多 而且, 采用不同的源得到的图谱也是不同的, 离子化条件对质谱图的影响非常大, 所以通用的 LC -MS 标准图谱库意义不大 流动相, 碰撞气, 碰撞电压, 离子化方式, 以及不同型号仪器的影响, 建立的质谱库没有统用性 - 可以建立自己常用的化合物谱图库 - 在固定条件可在线检索进行定性鉴别

135 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 液质联用仪的操作及检定 1 目前的 HPLC/MS 供应商仪器类型 单四级杆 (SQ) 三重四级杆 (TQ) 离子阱质谱 (IT) 单飞行时间质谱 (TF) 四级杆飞行时间质谱 (Q-TF) 离子阱飞行时间质谱 (IT-TF) 静电场轨道离子阱 (rbitrap) 傅里叶离子回旋共振质谱 (FT-ICR)

136 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 2 HPLC/MS 仪器操作规程 - 药品检验仪器操作规程 中国药品生物制品检定所编 涉及 单四级杆 离子阱三重四级杆四级杆飞行时间质谱共 18 个操作规程 3 HPLC/MS 仪器检定规程 - 药品检验仪器自检 / 核查规程 中国药品生物制品检定所编

137 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 4 液相色谱 - 质谱联用仪自检 / 核查规程 ( 一 ) 项目及技术要求 (1) 质量精度 : 1.1 单四极杆 三重四极杆 离子阱质谱检测器 满足 : 0.4 amu 1.2 四极杆飞行时间质谱检测器 满足 : 5 ppm(8 小时内变化小于 2ppm) (2) 质量范围 : 在 50~2000 amu

138 四 HPLC-MS 联用技术在药物分析中的应用 4 液相色谱 - 质谱联用仪自检 / 核查规程 (3) 灵敏度 : 3.1 单四极杆质谱,100pg 利血平,S 3; 3.2 串联质谱 50pg 利血平,S 3 (4) 分辨率 : 四极杆飞行时间质谱检测器,R 10,000 (5) 整机定性及定量重复性 : 5.1 质量色谱图保留时间相对标准偏差,RSD 2% 5.2 质量色谱图峰面积相对标准偏差,RSD 5%( 仅适用于 SIM 模式的单四极杆质谱检测器和 MRM 模式的三重四极 杆质谱检测器 )