Ch 11. 碳水化合物分析 國立宜大學食品科學系張永鍾
碳水化合物分析 碳水化合物 (carbohydrate) 由 C H O 組成, 或稱醣類 CHO, 可以 C n (H 2 O) m 通式表示 例外 : 鼠李糖 (C 6 H 12 O 5 ) 去氧核糖 (C 5 H 10 O 4 ) 主要成分 單醣 (monosaccharides) 雙醣 (disaccharides) 寡醣 (oligosaccharides) 3~10, 腸胃道益生菌 (probiotics) 之益生元 (prebiotic) 多醣 (polysaccharides) 衍生物 : 醣醇 醣酸 醣蛋白 ( 醣類 + 蛋白質 ) 醣脂質 ( 醣類 + 脂肪 ) 花色苷 氰醣苷.
碳水化合物 構成植物體結構及組織間隙填充性質 : 纖維素 (cellulose) 及其衍生物 果膠 (pectin) ( 芭樂 水蜜桃 愛玉 ) 生物體維生 活動所需能量主來源 合成其他化合物所需基本原料 廣存於食物原料, 植物性原料中含量高 作為食品工業的主要原料和輔助材料 各種食品中的含量及存在形式不同
碳水化合物生理功能 人體能消化利用 ( 有效碳水化合物 ) 單糖 雙糖 澱粉 人體不能消化利用但促進腸道蠕動 ( 無效碳水化合物 ) 纖維素 半纖維素 果膠等 單醣 雙醣 多醣 葡萄糖 果糖 半乳糖 蔗糖 乳糖 麥芽糖 澱粉 纖維素及其衍生物 有效碳水化合物 無效碳水化合物 果膠
碳水化合物測定 總碳水化合物 (%) = 100%- 粗脂肪 (%)- 粗蛋白 (%)- 水分 (%)- 灰分 (%) 其中包含 : 總糖 ( 單 雙糖 ) 寡糖 多醣 ( 澱粉 纖維 ) 糖醇 有機酸等
碳水化合物測定 相對密度法 物理法 折光法 還原醣法 旋光法 單 低聚醣 化學法 碘量法縮合反應 PC, TLC 層析法 GC 碳水化合物 酵素法 - 半乳糖脫氫酶葡萄糖氧化酶 HPLC 多糖 澱粉 纖維素和果膠 水解後以單醣形式測定 重量法
單 雙醣的萃取與製備
理想萃取試劑 完全除去干擾物質 不吸附或沉澱待測醣, 亦不壞其理化性質 不干擾後續分析操作, 且易於移除 常用沉澱試劑 : 中性醋酸鉛 醋酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液 硫酸銅和氫氧化鈉溶液
真空旋轉濃縮機
碳水化合物定性反應 原理 碳水化合物的還原特性 遇強礦物酸 ( 硫酸 鹽酸 ) 共熱生成醣醛衍生物, 並可再與試劑反應形成顏色 ( 吸光性 ) 化合物 層析法 (TLC LC) 分離及定性
呈色反應 碳水化合物經濃硫酸 (95%) 水解為單醣, 再與硫酸作用形成醣醛 五碳醣 (pentose) 形成呋喃醛 (furfural) 六碳醣 (hexose) 形成羧甲基呋喃醛 (carboxymethyl furfural) 呈色反應可定性定量 莫里奇反應 蒽酮反應 間苯二酚反應 酚 - 硫酸法 變色酸反應 酚 - 丙酮 - 硼酸試劑反應
莫里奇反應 (Molish s reaction) 又稱紫環反應, 最常用來鑑定醣類的呈色反應 原理 醣類加濃硫酸形成呋喃醛及其衍生物, 與 α- 萘酚作用形成紅紫色化合物 醣液與濃硫酸液面間出現紫環, 故稱紫環反應 反應靈敏度高, 含蛋白質溶液亦可檢出微量之碳水化合物 硝酸鹽 (nitrate) 及亞硝酸鹽 (nitrite) 妨礙呈色 酮醣 (ketose) 呈色較醛醣 (aldose) 為快
蒽酮反應 (anthrone reaction) 醣類遇到濃硫酸時, 水解生成呋喃醛及其衍生物, 後者可與蒽酮縮合生成藍綠色化合物, 顏色會由綠色轉變為藍綠色 當糖的量在 20-200mg 範圍內時, 其呈色強度與溶液中糖的含量成正比, 故可比色定量 有機物存在時因濃硫酸而呈深褐色
間苯二酚反應 (resorcinol reaction) 鑑定酮醣的特殊反應 (Seliwanoff's test) 酸作用下, 六碳酮醣 (ketohexose) 會脫水生成羧甲基呋喃醛, 加入間苯二酚 (m-dihydroxybenzene), 於沸水浴中加熱, 如有酮醣或含酮醣的多醣存在, 形成鮮紅色 反應迅速 (20~30 秒 ), 果糖檢出濃度可達 0.001% 醛醣形成羧甲基呋喃醛之反應較慢, 須在醣濃度較高之環境或較長時間煮沸, 才有微弱的陽性反應 蔗糖經鹽酸水解生成的果糖亦會產生陽性反應
酚 - 硫酸法 ( 常用 ) 酚 - 硫酸法 (phenol-sulfuric acid method) 可測定總醣量 ( 單醣 寡醣及多醣混合 ) 呈色安定, 對五碳醣的反應較六碳醣迅速 操作流程 取乾燥樣品溶於 2 ml 水, 接著加入 1 ml 5% 酚溶液, 最後加入 5 ml 濃硫酸 熱水浴中加熱, 冷卻後於波長 490 nm 測定吸光值
變色酸反應 ( chromotropic reaction) 檢測六碳醣, 五碳醣或其他醣類無法檢出 操作流程 變色酸試劑 : 取 100 mg 1,8 二萘氧酚 -3,6- 二磺酸 (1,8-dioxynaphthalene-3,6-disulfonic acid) 溶於 1 ml 水, 接著加入濃硫酸至 50 ml 1 ml 檢液, 加入 5 ml 變色酸試劑, 檢液含羧甲基呋喃醛, 則呈紫色
酚 - 丙酮 - 硼酸試劑反應 專一性測定果糖 酚 - 丙酮 - 硼酸 (phenol-acetone-boric acid) 試劑 操作流程 有六碳醣樣品加試劑 ( 含 5% 酚 2% 丙酮 4% 硼酸 ) 後, 再加濃硫酸反應形成桃紅色 37 靜置 60 分鐘, 波長 568 nm 測吸光 Boratyński J. Colorimetric method for the determination of ketoses using phenol-acetone-boric acid reagent (PABR). Anal Biochem. 1984 Mar;137(2):528-32.
酚 - 硫酸呈色定量法概述 酚 硫酸法為一種測定高分子多醣體之定性分析, 其原理是利用醣類與硫酸先作用生成醣醛, 再與酚反應呈色, 混合后觀察其顏色變化, 再以 UV 可見光分光光度計測其吸光值作定性分析 碳水化合物經硫酸作用會水解為單糖, 而次單糖會再與硫酸作用形成醣醛, 其中五碳糖形成 furfural, 而六碳糖形成 carboxymethyl furfural 而 furfural 與 carboxymethyl furfural 會與試劑中的酚形成穩定的呈色 測定 490nm 的吸光值, 即可定量包含單糖 寡糖 多醣之總醣量 其中非五碳糖 六碳糖為單體形成的糖醇 有機酸等, 不會在此法所測得之醣類之中
還原糖反應 還原醣 : 含自由醛基或酮基的單醣和雙醣 還原醣在鹼性溶液中能將金屬離子 ( 銅 鉍 汞 銀等 ) 還原, 醣本身被氧化成酸類 可檢測醣的還原性, 並可測定還原醣含量 菲林試驗 本尼迪試驗 巴福德試驗
菲林試驗 原理 鹼性下, 醣類有烯醇化 異構化以及醣分子的分解 氧化 還原或聚合作用 生成的複雜混合物具有強烈的還原性 菲林試劑 (Fehling s solution, 硫酸銅與酒石酸鉀鈉氫氧化鈉溶液 ) 加熱生成黑色氧化銅沉澱, 若有還原醣存在, 則產生黃色或磚紅色的氧化亞銅沉澱
菲林試驗 菲林試劑之配製 A 液 : 取 69.28 g 硫酸銅 (CuSO 4.5H 2 O) 溶解於蒸餾水並定容至 1 升 B 液 : 以酒石酸鉀鈉 346 g 和氫氧化鈉 100 g 溶解後, 以蒸餾水定容至 1 升 使用前將 B 液緩慢加入等量的 A 液中混合, 若順序相反則會產生沉澱 (Cu(OH) 2 ) 而無法混合
菲林試驗 操作步驟 取試液 1 ml 加入菲林溶液 8 ml 熱水浴中加熱 10 分鐘以上 若反應生成紅色沉澱的氧化亞銅 (cuprous oxide; Cu 2 O) 則表示有還原醣的存在
菲林試驗概述 菲林試劑包含溶液 A( 硫酸銅溶液 ) 及溶液 B( 酒石酸鉀鈉與氫氧化鈉 ), 以溶液 B 加入溶液 A 中, 而成菲林試劑 其與還原糖共同加熱煮沸 10 分鐘以上, 如有還原糖存在下, 會產生氧化亞銅 (Cu 2 O) 紅磚色沉澱, 非還原糖則否, 故可定性還原糖外, 亦可作定量的後續反應 還原糖在鹼性溶液中能將 Cu 2+ 還原成 Cu +, Cu + 再與 -OH 結合成黃色 CuOH, 加熱後,CuOH 即變成紅黃色的氧化亞銅沉澱, 再滴定求出還原糖的量 反應方程式 : 2 CuO Cu 2 O + H 2 O
本尼迪試驗 原理 本尼迪試劑 (Benedict solution) 改良自菲林試劑, 其鹼性較菲林試劑弱, 靈敏度高 生化檢驗
本尼迪試驗 本尼迪試劑之配製 取硫酸銅 (CuSO 4.5H 2 O) 17.3 g 檸檬酸鈉 ( 取代酒石酸 ) 173 g 及無水碳酸鈉 ( 取代 NaOH) 100 g 溶解於蒸餾水後定容至 1 升 操作步驟 試管內置入本尼迪試劑 5 ml 並加入醣溶液 0.5 ml 火焰上加熱煮沸 2 分鐘 若形成紅色氧化亞銅沉澱表示醣溶液含還原醣
本尼迪試驗概述 由硫酸銅與檸檬酸鈉及無水碳酸鈉, 分別 17.3 g 173 g 及 100 g 溶解於蒸餾水, 定容至 1 L, 取樣品 5 ml 於試管, 並加入糖溶液 0.5 ml 於火焰上加熱煮沸 2 min, 形成紅色沉澱之氧化亞銅
巴福德試驗 (Barfoed reaction) 原理 巴福德試驗的特點是需在酸性條件下進行還原作用 酸性溶液中, 單醣和還原雙醣的還原速度具差異性 單醣約在 3 分鐘內即可還原 Cu 2+, 還原雙醣則約需 20 分鐘 巴福德試驗可用以分辨單醣和還原雙醣 注意事項 : 加熱過久, 非還原性雙醣水解亦呈陽性反應, 如蔗糖在 10 分鐘內水解可產生反應 還原雙醣濃度過高, 會迅速呈陽性反應 樣品中含少量氯化鈉也會干擾反應
巴福德試驗 巴福德試劑 (Barfoed solution) 配製 取中性結晶醋酸銅 33.3 g 溶解於約 400 ml 之蒸餾水中, 加入 3 ml 冰醋酸, 以蒸餾水定容至 500 ml( 使用前配製 ) 操作步驟 加 2~3 滴糖液至含 1 ml 巴福德試劑試管中 煮沸約 3 分鐘, 再靜置 20 分鐘以上 比較各管顏色變化及紅色沉澱出現的先後順序
巴福德試驗 巴福德試劑 (Barford solution) 配製 取中性結晶醋酸銅 33.3 g 溶解於約 400 ml 之蒸餾水中, 加入 3 ml 冰醋酸, 以蒸餾水定容至 500 ml( 使用前配製 ) 操作步驟 1 ml 巴福德試劑試管加 2~3 滴糖液 煮沸約 3 分鐘, 再靜置 20 分鐘以上 比較各管顏色變化及紅色沉澱出現的先後順序
銀鏡反應 原理 還原醣與銀鏡試劑反應生成銀而附著試管壁內側 氨銀錯鹽溶液之配製 氫氧化銨 (ammonium hydroxide;nh 4 OH) 緩慢加入硝酸銀 (silver nitrate;agno 3 ) 溶液中, 攪拌至沉澱消失停止, 此產生 [Ag(NH 3 ) 2 ] + 離子 操作步驟 試管加試液 5 ml 和氨銀錯鹽溶液 5 ml, 混合後水浴中加熱 樣品中含還原糖, 則產生銀鏡反應 試管內壁不潔, 則僅產生銀之黑色沉澱
層析法定性 層析法 (chromatography): 濾紙 薄層 (TLC) 或管柱 ( 半定量 ) 層析 原理 碳水化合物具有同極性和分子量, 藉由移動相溶液的帶動距離不同, 可於濾紙或薄層之矽膠體 (silica gel) 上產生不同的 R f 值, 進而定性醣種類 試料以純粹醣液為主, 即去除干擾物質, 如大分子的多醣類 蛋白質 脂肪 胺基酸 無機鹽類等 在確定為單 雙醣 ( 如有多醣類應水解為單 雙醣 ) 類後再進行層析試驗
醣類無色, 不吸收 UV, 噴灑硫酸使呈褐色 以毛細管少量多次沾點 展開槽以鋁箔蓋住, 不讓溶劑蒸發, 維持一定比例, 且使展開槽內部蒸氣壓飽和 TLC 板使用前需活化並烘乾
濾紙層析 以濾紙 ( 纖維,-OH, 極性 ) 做為固定相, 移動相稱為展開溶媒 ( 如正丁醇, 非極性 ) 呈色劑之配製 取苯胺 (aniline) 0.93 g 鄰苯二鉀酸 (phthalic acid) 1.66 g 溶解於水飽和的丁醇 100 ml 中, 醛醣呈紅棕色 酮醣呈色劑 : 取 1% 間苯二酚酒精溶液 10 ml 及 2N 鹽酸 90 ml 混合, 酮醣呈紅色 操作步驟 配製濃度 1% 試料醣液以及標準醣液 濾紙定出原點位置, 將試料以及標準醣分別滴於原點上 ( 直徑小於 0.5 公分為佳 ) 濾紙風乾後置入展開槽進行展開, 待展開溶媒 ( 移動相 ) 展開至既定位置後取出 濾紙經 100~105 乾燥, 噴灑呈色劑呈色 以 Rf 值來判定醣類種類 ( 圖 3-5, 各種醣類的 Rf 值如表 3-9)
碳水化合物定量反應 還原醣及總醣量測定 樣品需先前處理, 除去干擾物如 : 蛋白質 胺基酸 脂肪及脂溶性色素 酵素等 總醣量為全糖量 醣類分解為單醣後以化學法 層析法及酵素法定量單醣, 可換算出總醣量 結構性多醣類分析 先將大分子醣類分解為單 雙醣, 再依其特性分離定量 多醣 寡醣及雙醣有酸水解與酵素水解 (α- 澱粉酶 (α-amylase) 或葡萄糖解側鏈酶 (amyloglucosidase)) 酸水解較迅速, 酵素水解較正確
化學法 化學法係利用單醣還原特性, 配合沉澱及滴定原理而定量 Bertrand 法 Somogyi 變法 Munson-Walker 法
Bertrand 法 原理 還原醣 ( 單醣 ) 置硫酸銅鹼性溶液中加熱, 銅離子 (Cu 2+ ) 還原成氧化亞銅 (Cu 2 O) 而造成沉澱 酸性硫酸鐵處理沉澱 (Cu 2 O) 後, 氧化亞銅又氧化為硫酸銅, 而三價鐵鹽會與氧化亞銅量成比例地被還原為二價鐵鹽 二價之亞鐵鹽利用高錳酸鉀 (potassium permanganate; KMnO 4 ) 標準溶液進行滴定, 再從滴定值換算出被還原醣還原的銅量 查閱 Bertrand 表 ( 表 3-10) 即可得知銅量, 再由銅量求出試樣中的還原醣量
Bertrand 法 化學反應式如下 :
Bertrand 法 測定溶液的配製 : A 液 : 稱取硫酸銅 (CuSO 4.5H 2 O) 40 g 溶解於蒸餾水定容至 1 L B 液 : 稱酒石酸鉀鈉 200 g 加入氫氧化鈉 150 g 溶解於蒸餾水中定容至 1 L C 液 : 稱取硫酸鐵 (ferric sulfate;fe 2 (SO 4 ) 3 ) 50 g 溶解於蒸餾水, 加入濃硫酸 200 g, 以蒸餾水定容至 1 L D 液 : 稱取特級高錳酸鉀 5 g 溶解於蒸餾水, 再定容至 1 L( 配製後靜置 1~2 天 )
Bertrand 法 操作步驟 : 三角瓶中置入含 0.1 g 以下之還原醣樣品 20 ml, 各加入 20 ml 之 A 液及 B 液, 振盪混合 將三角瓶置於石綿網上緩慢加熱, 沸騰 3 分鐘 ( 如樣品中含有還原醣即會產生紅色氧化亞銅沉澱, 應將沉澱物維持於液面之下, 以避免與空氣接觸而造成氧化 ) 上清液倒入 Witt 過濾器之 Allihn 管內進行緩慢的抽氣過濾 ( 圖 3-6)( 傾倒上清液時亦應將氧化亞銅沉澱維持在液面以下 ) 將 50 ml 溫水緩慢倒入三角瓶內, 上清液則再次倒入過濾器內, 將此動作反覆操作 3~4 次, 直至上清液不呈鹼性為止 將過濾器內之三角瓶移出, 將含有氧化亞銅的三角瓶移入過濾器內 接著從 Allihn 管內緩慢倒入 20 ml C 液, 緩慢抽氣過濾 ( 此時不小心倒入 Allihn 管內之氧化亞銅及 Witt 過濾器內的氧化亞銅, 會因高價鐵鹽的作用而溶解 ) 以溫蒸餾水 10 ml 洗滌 Allihn 管數次, 最後以 D 液 ( 高錳酸鉀 ) 進行滴定, 滴定至顏色由綠色變化為微紅棕色止 ( 另進行空白試驗, 以蒸餾水代替樣品, 其餘作法相同 )
Bertrand 法
Bertrand 法 計算 :
Bertrand 法 由 Bertrand 法醣量和銅量之相對表查出 A mg 相當於之醣量 B mg 再由公式算出還原醣量
Bertrand 法概述
Somogyi 變法 原理 前處理和 Bertrand 法相同 紅色氧化亞銅沉澱則利用已知量且和氧化亞銅作用後會有剩餘之碘 (I 2 ) 量來做為中間介質, 再以標準之硫代硫酸鈉滴定剩餘碘量, 則可得知 I 2 消耗量 Somogyi 法醣類醣量之比對可得知還原醣量 可定量 0.015~3 mg 的醣量
Somogyi 變法 化學反應式如下 :
Somogyi 變法 測定溶液的配製 : A 液 : 取下述三種溶液混合, 蒸餾水定容至 1,000 ml 稱酒石酸鉀鈉 90 g 與磷酸鈉 (sodium phosphate;na 3 PO 4.12H 2 O) 225 g 溶於蒸餾水 600 ml 中 取硫酸銅 30 g 溶於蒸餾水 100 ml 中 碘酸鉀 3.5 g 溶於少量蒸餾水中 B 液 : 取鉻酸鉀 (potassium chromate;k 2 C 2 O 4. H 2 O) 90 g 及碘化鉀 40 g 溶於蒸餾水至 1,000 ml C 液 :2N 硫酸溶液 D 液 :0.05N 硫代硫酸鈉溶液
Somogyi 變法 操作步驟 : 於三角瓶內置入還原醣樣品液 ( 約含 5~20 mg 還原醣並已除去干擾物質 ), 接著加入 10 ml A 液, 再加入 20 ml 蒸餾水稀釋 將三角瓶加熱使樣品液沸騰,3 分鐘後停止加熱, 並以流水冷卻 待冷卻後各別加入 10 ml 的 B 液及 C 液, 輕輕搖動三角瓶使紅色氧化亞銅完全溶解後立刻以 D 液滴定之 當被滴定溶液變為綠色後, 加入數滴 1% 澱粉指示劑, 繼續滴定至終點藍色為止, 此滴定值為 a (ml); 另以蒸餾水代替樣品溶液作空白試驗, 滴定值為 b (ml)
Somogyi 變法 計算 :
Munson-Walker 法 原理 : Munson-Walker 法可用來測定牛乳中之乳糖含量, 其測定原理與菲林試驗法及 Bertrand 法相近, 差別在於以高錳酸鉀滴定至黃綠色欲接近滴定終點時, 需加入 1 滴費洛 (ferroin) 指示劑, 高錳酸鉀再滴定至終點綠色為止
Munson-Walker 法 測定溶液的配製 : 菲林試藥 A: 與前述定性分析相同 菲林試藥 B: 與前述定性分析相同 0.1573N 高錳酸鉀標準液 : 稱取高錳酸鉀 4.98 g 以蒸餾水稀釋至 1,000 ml 硫酸鐵溶液 : 稱取 Fe 2 (SO 4 ) 3.(NH 4 ) 2 SO 4.24H 2 O 135 g 或無水硫酸鐵 55 g 溶於蒸餾水並定容至 1,000 ml 費洛指示劑 : 稱取 o- 菲洛林 (o-phenanthroline) 0.7425 g 加入 0.025M 硫酸亞鐵 (ferrous sulfate;feso 4 ) 溶液 25 ml 中 4N 硫酸溶液 : 稱取濃硫酸 100 ml 以蒸餾水稀釋至 1,000 ml
Munson-Walker 法 操作步驟 : 前段步驟與 Bertrand 法相同, 以硫酸鐵溶液及 4N 硫酸溶解氧化亞銅, 再以 0.1573N 高錳酸鉀標準液滴定至接近滴定終點之黃綠色, 再加入 1 滴費洛指示劑, 最後再滴定至終點綠色為止 查閱 Hammond 表計算出乳糖量 奶粉試料配製 : 稱取奶粉 5 g, 以蒸餾水 (60, 100 ml) 溶解後再加熱至 90, 冷卻後加入蒸餾水 300 ml, 再加入 2 滴 1% 氫氧化鈉溶液, 使其呈微酸性或弱鹼性, 接著以蒸餾水定容至 500 ml, 則為樣品液
飲料中果糖測定 果糖為還原糖, 因此可利用還原糖定量法測量 Bertrand 法還原糖溶液加硫酸銅鹼性溶液加熱時,Cu 2+ 即被還原糖還原為氧化亞銅 (Cu 2 O) 而生成沉澱 此氧化亞銅以硫酸鐵的酸性溶液處理時, 氧化亞銅及氧化為硫酸銅, 而高價的鐵鹽即與氧化亞銅量成比例地被還原為低價的亞鐵鹽, 而低價鐵鹽以過錳酸鉀標準液定量, 從滴定值算出被還原糖還原的銅量, 再查 Bertrand 醣量定量表, 由銅量算出試樣中還原糖量 Somogyi 法 Cu 2+ 在鹼性溶液中被糖類還原時變為 Cu + 此氧化亞銅為碘酸鉀和碘化鉀在酸性溶液中遊離的碘所氧化, 殘存的碘用硫代硫酸標準溶液滴定, 求出被氧化亞銅所氧化的碘量, 算出醣量
飲料中蔗糖測定 用酸分解測定還原糖法用 N/10 鹽酸溶液將蔗糖分解成還原糖再用 N/10 的 NaOH 中和從此糖溶液進行還原糖定量, 從求得的定量值減去原來存在的遊離的還原糖量, 再乘以 0.95, 即得蔗糖量 使用手攜糖度計的蔗糖簡易測定法糖濃度和折射率在一定條件下成比例, 因此測定折射率, 即可求得糖濃度 使用偏光計定量法碳水化合物含有許多光學活性的物質, 利用其偏光的特性, 求得溶液中的糖含量 使用阿貝折射計的蔗糖簡易測量法
層析法 氣相層析法 高壓液相層析法
氣相層析法 原理 醣類需先分解為單 雙醣 將醣類衍生為非極性且具揮發性之衍生物 三甲基矽 (trimethyl silyl;tms) 衍生化 : 以 TMS 取代含 OH, -COOH, -SH, -NH 2 或 =NH 等官能基中之氫, 降低其極性, 成為具揮發性之衍生物, 以便於在氣相層析管柱中被帶動及分離
三甲基矽 (TMS) 衍生化 測定溶液的配製 氧化試劑 (oxidation reagent) 配製 2.5% 鹽酸羥胺 (hydroxylamine hydrochloride, NH 2 OH.HCl) 於吡啶中 不能含有水分 矽化試劑 (silylation reagent) 經乾燥且純化之 氯化三甲矽烷 (trimethyl chlorosilane, (CH 3 ) 3 SiCl) 或 N,O- 二 -( 三甲矽 ) 乙醯胺 (N,O-bis-(trimethyl-silyl)- acetamide)
三甲基矽 (TMS) 衍生化 操作步驟 精秤醣類 ( 已除去水分 ) 加入氧化試劑與矽化試劑, 於 80 作用 30 分鐘使其衍生化 反應後之樣品定容至一定體積 最後將稀釋定容之衍生化樣品注入氣相層析管柱內進行分離檢測
高壓液相層析法 原理 利用醣類極性 ( 含 -OH 量 ) 之不同, 以極性溶媒做為移動相, 因而在管柱中達到分離之目的 利用檢測器測得各波峰出現的時間和面積, 藉此判斷出醣類種類並可計算出醣量 適用於分析低分子之醣類 ( 單 雙醣 ) 優點 : 分析速度快速 試料不需經衍生化 缺點 : 需特殊管柱 折射率檢測醣類濃度太低無法檢測 目前已可藉由電化學或衍生化轉成紫外光或螢光光度檢測, 大幅提高靈敏度
高壓液相層析法 試料前處理 樣品需先除去各種干擾物質 ( 大分子 ), 如 管柱 以 50% 或 80% 酒精溶解可溶性醣類 以蛋白質沉澱劑除去蛋白質 使用氯仿或石油醚除去脂肪 於注入管柱前再以薄膜進行過濾 Silica-NH 2 (aminoalkylsilyl), 陽離子 多糖 :GFC
Carbohydrate Column Applications and Mobile Phases Column form Application Mobile Phase Max. T. ( C) aminopropyl mono-, di-, and trisaccharides 75% CH 3 CN in water 70 silica potassium lead calcium mixed cations (Ca ++, Mg ++ ) beet sugar, cane sugar, molasses, corn syrup monosaccharides, xylose/galactose/mannose high fructose corn syrup, monosaccharides, sugar alcohols, oligosaccharides mono-, di-, and trisaccharides, galactose/mannose 10mM K 2 HPO 4 90 deionized water 90 deionized water 90 10-4 N NaOH 85 hydrogen organic acids 0.1% H 2 SO 4 or H 3 PO 4 60 hydrogen organic acids 0.1% H 2 SO 4 or H 3 PO 4 90 silver oligosaccharides, glycerol/ethanol, beer, corn syrup, hydrolyzed starch deionized water 90
酵素法 原理 利用葡萄糖或果糖於生物體內之酵素代謝轉換過程形成具吸光之代謝產物特性 波長 340 nm 或 366 nm 具有最適吸光 優點為專一性高, 反應靈敏 缺點為試劑取得不易, 成本較高 蔗糖先加入 β- 果糖側鏈酶 (β-fructosidase) 分解成葡萄糖及果糖, 再分別酵素法定量 乳糖則加 β- 半乳糖側鏈酶 (β-galactosidase) 分解成葡萄糖及 β- 半乳糖 (β-galactose), 再分別測定
酵素法測定葡萄糖
酵素法測定果糖
酵素法測定半乳糖
結構性多醣類分析 結構性多醣類之組織不能被人類消化酵素分解, 為植物體特有之組織結構 粗纖維定量法 果膠定量法 膳食纖維定量法
粗纖維定量法 原理 粗纖維 (crude fiber) 不溶於稀酸 稀鹼 酒精和乙醚的植物性化合物, 包括木質素 (lignin) 纖維素 半纖維素 (hemicellulose) 等 前處理 分別以酒精 稀酸 稀鹼和乙醚溶解可溶性的醣類 蛋白質及脂肪等, 後經乾燥 灰化爐 550 灰化, 冷卻後秤重即為灰分重 ( 有機物和無機物 ); 原乾燥重扣除灰分重, 即為粗纖維重量
果膠定量法 原理 果膠先利用酸水解或果膠酶 (pectase) 分解為半乳糖醛酸 (galacturonic acid), 再以波長 295 nm 測定吸光值 半乳糖醛酸標準曲線定量果膠含量 可藉由已知 Ca 2+ 量為介質, 利用果膠和一定量鈣形成果膠 - 鈣結合之特性, 再來定量剩餘鈣, 進而間接定量
膳食纖維定量法 原理 食物中不被小腸消化或吸收, 但可被大腸細菌完全或部分分解 不可溶性膳食纖維纖維素 (cellulose) 木質素 (lignin) 與半纖維素 (hemicelluloses) 可溶性膳食纖維果膠 (pectin) 樹膠 (gums) 和黏液 (mucilages), 以及一些半纖維素 已去脂肪樣品, 粉碎後以消化酵素 ( 蛋白分解酶和醣類水解酶 ) 作用, 離心過濾剩餘殘渣即膳食纖維
總膳食纖維定量法