44 分析化学第 4 卷 2 实验部分 2. 仪器与试剂毛细管高效液相色谱 - 电喷雾 - 线性离子阱质谱仪 ( 美国 Thermo Fisher 公司 ) ; 康达效应电喷雾离子源 ( 浙江好创生物技术有限公司 ) ; Milli-Q 超纯水系统 ( 美国 Millipore 公司 ) 磷酸化标准

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拥锄蓝
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1 第 4 卷 25 年月分析化学 ( FENXI HUAXUE) 特约来稿 Chinese Journal of Analytical Chemistry 第期 4 ~ 48 檵檵特约来稿檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵 DOI:. 895 / j. issn 有机溶剂辅助封闭式电喷雾离子源的设计及其在痕量蛋白质组样品分析中的应用,2 朱旭东周愿梁振梁玉 * 张丽华朱一心 ( 中国科学院大连化学物理研究所, 中科院分离分析化学重点实验室, 大连 62) 张玉奎 2 ( 中国科学院大学, 北京 49) ( 浙江好创生物技术有限公司, 杭州 2) 摘要将康达效应应用于电喷雾离子源, 设计了气氛可调康达效应电喷雾离子源 ( Coanda effect electrospray ionization source,ceesi) 考察了不同饱和蒸气压不同极性的有机溶剂对标准肽段在质谱上信号响应的影响结果表明, 辅助气中添加乙醇后, 标准肽段质谱信号提高约倍, 而且对于 ng BSA 酶解产物, 蛋白序列覆盖率提高约 % 在最佳条件下, 采用 nano-hplc-ceesi-ltq XL MS 系统, 实现了 6,,2 和 5 ng HeLa 细胞全提蛋白质酶解产物的定性分析, 与常用的开放式 nano-esi 相比, 肽段和蛋白质的可鉴定数目分别提高 2% ~ 6% 和 2% ~ 2% 本研究表明, 采用 CEESI 源有利于痕量蛋白质组样品的高灵敏度分析关键词康达效应 ; 电喷雾离子源 ; 蛋白质组 ; 痕量分析引言高效液相色谱 - 电喷雾离子化质谱 ( HPLC-ESI MS) 技术已被广泛应用于蛋白质组样品分析 [,2] 由于蛋白质组样品具有组成复杂蛋白含量动态范围宽物理化学性质各异等特点, 因此对分析方法的灵敏度提出了越来越高的要求提高 ESI 过程的离子化效率降低离子间相互抑制作用已成为一种有效途径 [] 众所周知, 当 HPLC 的流速降低至纳升级时, 电喷雾可产生更小的雾滴, 离子化效率得到明显改善 [4], 同时离子抑制和基质效应也会被显著抑制 [5,6] 因此, 纳喷离子源已被广泛应用于蛋白质组学样品分析 [,2] 在改善检测灵敏度的前提下, 提高 ESI 源的喷雾稳定性也至关重要目前, 最常用的开放式纳喷离子源容易受到外界环境的影响, 会出现喷雾不稳定的情况 [7] [8] 然而, 封闭式电喷雾离子源在喷针和质谱采样锥之间的空腔形成低压, 可获得稳定喷雾 ; 同时通过增加辅助气, 如空气或氮气, 可改善离子 [9 ~ 传输效率根据文献报道 2], 辅助气中添加气化的有机溶剂可以显著改变肽段电荷分布, 并提高肽 [9] 段离子化效率 Li 等在辅助气中添加醇类或羧酸类蒸汽, 可将肽段的 MS 信号增强 ~ 4 倍, 鉴定的 [2] 大肠杆菌蛋白质数目增加 4% Asperger 等发现, 辅助气中添加乙腈可提高糖肽电荷数, 使其在电子转移解离 ( Electrontransfer dissociation,etd) 中获得更高的碎裂效率此外, 有机溶剂添加的辅助气 [] 还可以降低基质干扰 de Muth 等发现, 有机溶剂添加的辅助气, 尤其是乙腈, 可以有效降低金属离子干扰上述研究表明, 气氛辅助封闭式纳喷离子源在获得稳定喷雾高效离子化的同时, 还可以提高质谱响应, 因此有望用于痕量蛋白质组样品的高灵敏度分析康达效应亦称附壁作用, 即流体 ( 水流或气流 ) 有离开本来的流动方向, 改为随着凸出物体流动的倾向结合康达效应, 本研究设计了新型 CEESI 源, 评价了不同辅助气气氛对标准肽段的质谱信号强度的影响 ; 在最佳辅助气类型和分压条件下, 实现了痕量 HeLa 细胞蛋白质组的定性分析同时与开放式 nano-esi 源进行了比较, 结果表明, 采用新型 CEESI 可将肽段和蛋白质鉴定数目分别提高 2% ~ 6% 和 2% ~ 2% 收稿 ; 接受本文系国家自然科学基金 ( Nos. 2255,2255) 资助项目 * lihuazhang@ dicp. ac. cn

2 44 分析化学第 4 卷 2 实验部分 2. 仪器与试剂毛细管高效液相色谱 - 电喷雾 - 线性离子阱质谱仪 ( 美国 Thermo Fisher 公司 ) ; 康达效应电喷雾离子源 ( 浙江好创生物技术有限公司 ) ; Milli-Q 超纯水系统 ( 美国 Millipore 公司 ) 磷酸化标准肽段 ( 序列 : STSSDQPSpYSLE, 上海强耀生物科技有限公司 ) ; 甲酸 ( FA) 二硫苏糖醇 ( Dithiothreitol,DTT) 碘代乙酰胺 ( Iodoacetamide,IAA) 牛血清白蛋白 ( BSA) 尿素 NH 4 HCO ( 美国 Sigma 公司 ) ; 乙腈 ( ACN, 德国 Merck 公司 ) ; 乙醇甲醇乙酸二甲基亚砜 ( DMSO) 异丙醇丙酮乙二醇乙二胺乙酸乙酯和环己烷等 ( 天津科密欧公司 ) ; 蛋白酶抑制剂 ( 瑞士 Roche 公司 ) ; C 8 反相填料 ( 孔径,5 μm 粒径, 天津博纳艾杰尔科技有限公司 ) ; 石英毛细管 ( 美国 Polymicro Technologies 公司 ) 实验用水为超纯水( 8. 2 MΩ cm) 2. 2 样品制备 HeLa 细胞培养及蛋白质提取在 7 5% CO 2 条件下, 用含有 % 胎牛血清的 DMEM 培养基培养 HeLa 细胞当细胞的融合度达到 9% 时, 收集并用冷的 PBS 洗涤次将 HeLa 细胞沉淀分散于裂解液 ( % 蛋白酶抑制剂的 8 mol /L 尿素溶液 ), 在冰浴中超声破碎 24 s( 超声 s, 间歇 s), 在 4,2 r /min 高速离心 min, 去除细胞碎片, 收集上清液最后用基于 BCA 法的试剂盒 ( 上海碧云天生物技术有限公司 ) 测定蛋白质浓度 BSA 及 HeLa 蛋白质样品处理蛋白质酶解 : 取 mg 蛋白质 ( HeLa 细胞提取蛋白或 BSA) 溶于 μl 8 mol /L 尿素中, 加入 8 μl mmol /L DTT,56 反应 2 h; 冷却至室温, 加入 8 μl 2 mmol /L IAA, 避光反应 4 min; 用 5 mmol /L NH 4 HCO 将溶液稀释倍后, 加入胰蛋白酶 ( 酶与底物的质量比为 25) ; 7 酶解 24 h, 加入甲酸终止反应除盐 : 使用 HPLC 的流动相 A( 98% H 2 O + 2% ACN +. % FA) 将酶解液上样至 C 8 反相色谱柱 ( mm 4. 6 mm), 冲洗 5 min 后, 用 8% 的流动相 B( 98% ACN + 2% H 2 O +. % FA) 进行洗脱收集洗脱液, 冷冻干燥后, 保存于!8 待用 2. 质谱及电喷雾离子源分析条件 2.. 考察不同溶剂辅助气对标准肽段质谱响应信号的影响负离子模式下, 使用进样针直接进样 ( μg /ml) 改变标准肽段溶剂辅助气中有机添加剂的种类及比例, 每种条件均直接采集 min, 对比不同条件下标准肽段离子峰强度 BSA 及 HeLa 蛋白酶解产物的分离和鉴定采用 nano-hplc-esi-ms /MS 分离分析酶解产物, 色谱柱 : C 8 反相色谱柱 ( 5 μm 5 cm), 末端为拉制喷针, 可直接插入封闭式电喷雾离子源, 如图所示液相色谱分离采用梯度洗脱方式,BSA 酶解产物 : ~ 5 min,2% ~ 6% B; 5 ~ 5 min,6% ~ 5% B; HeLa 细胞蛋白质酶解产物 : ~ 75 min,5% ~ 25% B; 75 ~ 9 min,25% ~ 8% B 流速均为 2 nl /min 分别考察空气和乙醇两种气氛下的质谱鉴定信号质谱扫描范围为 m /z ~ 8, 正离子模式采集, 归一化碰撞能量为 5% 质谱采集产生的原始文件通过 pxtract [4] 转换为. mgf 文件后, 使用 Mascot ( 版本, 英国 MatrixScience) 搜索引擎对 Swiss-Prot 数据库中序列进行检索参数设置为 : 母离子质量容差 2 Da; 碎片离子质量容差 Da; 蛋白水解酶 : Trypsin; 最多允许 2 个漏切位点 ; 固定修饰 : carbamidomethyl ( C) ; 可变修饰 : oxidation ( M) 和 acetyl ( protein N-term) 结果与讨论. 离子源设计结合康达效应, 设计了 CEESI 源 ( 图 ) 特殊设计的离子传输管的内表面具有康达效应功能, 气流会沿着管壁旋转向质谱方向流动, 旋转的气流将带电液滴在离子传输管的中心流向质谱仪, 降低了液滴与管壁的碰撞几率, 从而提高离子传输效率辅助气流进入低压空腔后, 绕轴线旋转, 形成以发射针为轴的三维轴对称回转体此结构可以简化

3 第期朱旭东等 : 有机溶剂辅助封闭式电喷雾离子源的设计及其在痕量蛋白质组样品分析中的应用 45 离子传输管 Capillary 发射针 Emitter 辅助气通道 Gas channel 质谱 MS 图康达效应电喷雾离子源结构图 Fig. Structure diagram of Coanda effect electrospray ionization source ( CEESI) 为二维流动进行模拟 ( 图 2) 在回转体内可形成气流稳定均匀的区域, 即流场驻点将色谱柱末端的喷针直接插入电喷雾离子源内的驻点位置, 在电场驱动下, 即可形成特别稳定泰勒锥, 进而获得稳定喷雾此外, 由于质谱内的高真空, 喷针与质谱采样锥之间的空腔处于低压, 流动的辅助气可带走泰勒锥形成的雾滴, 清洁喷针表面, 有效防止结碳, 有助于延长喷针使用寿命雾滴在密闭流场边界 Velocity boundary 驻点 Stagnation point 图 2 Fig. 2 根据理论计算的 CEESI 源腔体内速度边界的流线图 Theoretical calculation of velocity boundary layer in CEESI source 腔内不断蒸发, 当达到瑞利极限时, 即发生库仑爆炸分析物基于荷电残余模型离子蒸发模型及链弹 [5] 射模型等机理实现离子化进入腔体的辅助气, 即被有机溶剂饱和的空气, 可有效避免空气中污染物的进入, 降低干扰离子的信号在辅助气和雾滴的作用下, 分析物离子化效率显著提高, 有助于实现肽段的高灵敏度检测. 2 辅助气气氛对标准肽段质谱检测信号的影响辅助气作为 CEESI 源的重要组成部分, 可以促进喷雾稳定性改善离子传输效率, 而且辅助气中添加气化的有机溶剂可以显著改变肽段电荷分布, 提辅助气 Auxiliary gas 高肽段离子化效率 [9,] 因而首先考察了不同辅助气对肽段的质谱信号强度及电荷分布的影响 ( 图 ) 图不同辅助气气氛中肽段的质谱响应比较在负离子模式下, 酸可明显抑制负离子生成 Fig. Comparison of intensity of standard peptidein 蒸气压较低的有机试剂 ( 如 DMSO 乙二醇 ) 由于进 different kinds of auxiliary gas 入离子化室较少, 对信号强度基本无影响而饱和蒸气压较大的乙腈乙醇甲醇丙酮乙酸乙酯等极性分子可明显提高多肽离子化效率此结果与冷却 lg (Carrier gas/air) DMSO FA - -2 (M-H) - (M-2H) 2- (M-H) - Acetic acid Ammonia Ethanediamine Acetone Acetonitrile Methanol Ethanol Isopropanol Ethanediol Ethyl acetate Cyclohexane 焓理论一致 [6,7], 即高浓度的极性分子冷凝在雾滴表面的同时, 释放一定的能量 ; 此能量被雾滴表面的

4 46 分析化学第 4 卷分析物分子吸收, 最终激发分析物离子化 [5] 但在研究的辅助气气氛中, 乙醇丙酮乙酸乙酯及乙二胺等都能显著提高标准肽段的信号强度 ; 与空气为辅助气相比, 信号强度可以提高倍相比之下, 乙醇可更明显提高多价离子响应, 有利于多肽质谱鉴定, 因此, 采用乙醇作为辅助气进行后续实验. 痕量 BSA 酶解产物分析基于 nano-rplc-esi-ms /MS 系统, 对 ng BSA 酶解产物进行分离分析辅助气中添加乙醇后, 在 CEESI 空腔内, 乙醇与雾滴在离子传输管内相互作用, 肽段谱图匹配 ( PSM) 肽段数目序列覆盖率均提高约 % ( 表 ) 比较肽段的峰面积发现, 添加乙醇的辅助气提高了大部分肽段的质谱响应, 与文献 [6] 结果相似但是并未观察到标准肽段信号的改善, 这可能是因为高浓度乙醇辅助气会抑制流动相挥发表在乙醇和空气条件下 ng 牛血清白蛋白鉴定结果对比 Table Comparison of identification results of ng of tryptic digests of bovine serum albumin ( BSA) in ethanol and air 肽段谱图匹配数 Peptides spectrum matches 空气 Air 乙醇 Ethanol. 7 ± ± 7. 肽段数目 Peptides 22. ± ± 4. 5 序列覆盖率 Sequences coverage ( % ) 7. 7 ± ± 2. 9 由于高浓度乙醇气氛会抑制雾滴中有机溶剂挥 lg(ethanol/air) H 2O.%FA.%ACN.%ACN+.%FA 溶剂 Solvent (M-H) - (M-2H) 2- (M-H) -.2%ACN.2%ACN+.%FA.%ACN+.%FA.%ACN 发, 不同样品溶剂对标准肽段灵敏度有较大的影响图 4 不同溶剂中标准肽段的质谱响应比较在相同的乙醇分压下, 纯水为溶剂时信号改善效果 Fig. 4 Comparison of intensity of standard peptide in 最显著 ( 图 4) ; 溶剂中仅加入乙腈时, 随着溶剂中乙 different solvents 腈加入量增大, 信号改善效果变差, 甚至降低肽段的质谱响应 ; 加入. % FA, 获得更显著的改善效果然而, 随着有机相比例增大, 会抑制乙醇对标肽质谱响应的改善效果以上结果说明, 乙醇分压太高会抑制有机溶剂的挥发, 不利于样品离子化, 因而实际应用时, 应选择辅助气中的有机添加剂的最佳分压采用 LC-ESI-MS /MS 分析痕量 BSA 酶解产物时, 多肽的色谱峰主要分布于有机相为 % ~ 5% 的条件下, 即仅在有机相浓度较低时, 出峰的肽段信号得到改善, 进一步证实了高浓度乙醇气氛会抑制雾滴溶剂挥发当乙醇分压下降时, 抑制效果减弱, 质谱响应显著增强. 4 痕量 HeLa 细胞提取蛋白酶解产物分析在最佳分压的乙醇气氛中, 肽段和蛋白鉴定数目明显增多当 HeLa 酶解产物的上样量为 6 ng 和 ng 时, 乙醇气氛下肽段和蛋白鉴定数目较空气气氛约提高了 2% ; 当上样量为 2 ng 时, 多肽和蛋白鉴定数目分别提高 6% 和 2% ( 图 5) 此结果进一步证实乙醇气氛可以提高分析物离子化效率, 促进多肽质谱响应当进样量增大到 5 ng 时, 乙醇气氛下肽段和蛋白鉴定数目较空气气氛分别提高 28% 和 58% ; 相对 2 ng 进样量的鉴定结果提高较少因而, 气氛辅助 CEESI 源更适于痕量蛋白质组样品的分析与开放式离子源比较,CEESI 特殊设计的离子传输管的内表面具有康达效应功能, 可改善离子传输效率同时, 结合辅助气添加剂与喷雾的相互作用, 促进肽段离子化在考察的上样量范围内, 采用 CEESI 源可将鉴定的肽段和蛋白数目分别提高 58% ~ 2% 和 5% ~ 8% 采用空气作为辅助气, 当样品量较小 ( 小于 2ng) 时,CEESI 鉴定的肽段和蛋白数目较开放式 nano- ESI 分别提高 % 和 2% 但是随着样品量增加, 采用开放式 nano-esi 可以获得更多的肽段和蛋白鉴定数目这可能是因为上样量较小时, 空气气氛下的封闭式离子源具有更高的离子传输效率, 因而可以比开放源鉴定更多的肽段和蛋白数目当样品量增大时, 高效离子化产生更多的离子, 但是受离子传输管离子传输效率的限制, 进入质量分析器的肽段离子受限, 因此开放源具有更显著的优势乙醇气氛不仅改善离子传输效率促进多肽离子化, 而且可以改善喷雾稳定性以上样量 2 ng 为

5 第期朱旭东等 : 有机溶剂辅助封闭式电喷雾离子源的设计及其在痕量蛋白质组样品分析中的应用 47 例 ( 图 5C), 空气气氛封闭式离子源乙醇气氛封闭式离子源和开放式离子源三针共同鉴定到的蛋白质比例分别是 25. %,. 6% 和 9. 5%, 证实 CEESI 源比开放纳喷源具有更好的喷雾稳定性肽段数目 Peptides CEESI 鄄乙醇 (Ethanol) CEESI 鄄空气 (Air) Thermo ESI A 肽段数目 Peptides CEESI 鄄乙醇 (Ethanol) CEESI 鄄空气 (Air) Thermo ESI B (ng) (ng) C st 25 2nd rd st nd rd st 2 2 2nd rd CEESI 鄄空气 (Air) CEESI 鄄乙醇 (Ethanol) nano 鄄 ESI 4 结论图 5 不同 HeLa 细胞蛋白质酶解产物进样量鉴定数目比较 Fig. 5 Comparison of identified peptide / protein number in proteomic profiling of different amount of HeLa cell tryptic digests A: 肽段数目 ; B: 蛋白质数目 ; C: 三针共同鉴定蛋白质数目比例 ( 上样量为 2 ng) A,B. Cumulative protein and peptide identification for replicate injections of HeLa cell digests; C. Venn diagrams illustrating overlap in protein identification for tight ion source and commercial electrospray ion source with 2 ng of HeLa cell tryptic digests analyzed in triplicate. 针对开放式电喷雾离子源喷雾稳定性差离子化效率低及喷针寿命短等问题, 设计了气氛可调 CEESI 源通过考察具有不同饱和蒸气压的有机小分子作为辅助气对电喷雾效果的影响, 发现乙醇能够显著提高标准肽段信号强度在最佳的乙醇分压下, 不仅 HeLa 细胞提取蛋白质酶解产物的肽段和蛋白鉴定数目显著提高, 而且喷雾稳定性得到了改善上述结果初步说明,CEESI 源在痕量蛋白质组样品分析方面具有很大的应用潜力 References WANG Chun-Min,LIU Qiang,LI Jian,XU Bo,MI Kai,CHENG Juan. Chinese J. Anal. Chem.,24,42( 9) : 26 - 王春民, 刘强, 李建, 徐波, 米凯, 程娟. 分析化学,24,42( 9) : 26-2 WANG Gui-Ming,SHI Dong-Dong,PENG Zhang-Xiao,LU Yang-Fang,GU Xue,WANG Yan,YAN Chao. Chinese J. Anal. Chem.,25,4( 5) : 王桂明, 史栋栋, 彭章晓, 鲁阳芳, 谷雪, 王彦, 闫超. 分析化学,25,4( 5) : Luo Q,Rejtar T,Wu S L,Karger B L. J. Chromatogr. A,29,26( 8) : Wilm M,Mann M. Anal. Chem.,996,68( ) : Okudaira M,Inoue A,Shuto A,Nakanaga K,Kano K,Makide K,Saigusa D,Tomioka Y,Aoki J. J. Lipid Res.,24, 55( ) : El-Faramawy A,Siu K W M,Thomson B A. J. Am. Soc. Mass Spectrom.,25,6( ) : 72-77

6 48 分析化学第 4 卷 7 Nirmala R R,Nilgun C S,Griff H W. 58th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics,Salt Lake City,UT, 2 8 Ramanathan R N R,Comezoglu S N,Humphreys W G. Int. J. Mass Spectrom.,2,( ) : Li Z,Li L. Anal. Chem.,24,86( ) : - 5 Kharlamova A,McLuckey S A. Anal. Chem.,2,8( ) : 4-47 Kharlamova A,Prentice B M,Huang T Y,McLuckey S A. Anal. Chem.,2,82( 7) : Asperger A,Marx K,Albers C,Molin L,Pinato O. J. Proteome Res.,25,4( 6) : de Muth J C,McLuckey S A. Anal. Chem.,25,87( 2) : Wang L H,Li D Q,Fu Y. Rapid Commun. Mass Spectrom.,27,2( 8) : Konermann L,Ahadi E,Rodriguez A D,Vahidi S. Anal. Chem.,2,85( ) : Samalikova M,Grandori R. J. Am. Chem. Soc.,2,25( 44) : Iavarone A. T,Williams E R. J. Am. Chem. Soc.,2,25( 8) : Design of Organic Vapor Assisted Tight Ion Source and Its Application in Trace Analysis of Proteomic Samples ZHU Xu-Dong,2,ZHOU Yuan,LIANG Zhen,LIANG Yu,ZHANG Li-Hua *,ZHU Yi-Xin,ZHANG Yu-Kui ( Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Dalian 62,China) 2 ( University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 9,China) ( Zhejiang Haochuang Biotech Co. Ltd.,Hangzhou 2,China) Abstract A novel Coanda effect electrospray ionization source ( CEESI) was designed and applied in the analysis of the digests of bovine serum albumin ( BSA) and proteins extracted from HeLa cells. Firstly,the effects of various organic solvents on the mass spectrometry signal of a standard peptide were investigated. With ethanol vapor,the signal of standard peptide was increased by about fold,and the sequence coverage of ng of BSA was improved by about %. Finally,under the optimized conditions,6,,2 and 5 ng of HeLa cell tryptic digests were qualitatively analyzed with nano-hplc-ceesi-ltq XL MS system. In comparison with commercial nano-esi,the number of identified peptides and proteins were increased by 2% - 6% and 2% - 2%,respectively,demonstrating that the CEESI ion source is promising in the in-depth profiling of trace proteomic samples. Keywords Coanda effect; Electrospray ionization source; Proteome; Trace analysis ( Received 4 August 25; accepted 7 September 25) This work was supported by the National Natural Science Foundation of China ( Nos. 2255,2255)

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.