郑见宝, 等援泽澡砸晕粤干扰悦阅载圆基因表达对裸鼠结直肠癌肝转移瘤的影响 远源苑 ( 杂宰源愿园鄄晕悦, 匀栽圆怨鄄晕悦 )( 杂宰源愿园 :[ 员缘援园圆依圆援园园 ] 早增泽 [ 员愿援园园依圆援源愿 ] 早,[ 员愿援园猿依圆援园缘 ] 早, 云越猿援苑远员, 孕约园援园缘 ; 匀栽圆怨 :[

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1 远源远 中国肿瘤生物治疗杂志摇澡贼贼责 : 辕辕憎憎憎援遭蚤燥贼澡藻则援燥则早悦澡蚤灶允悦葬灶糟藻则月蚤燥贼澡藻则, 韵糟贼援圆园员远, 灾燥造援圆猿, 晕燥援缘 阅韵陨 : 员园援猿愿苑圆辕躁援蚤泽泽灶援员园园苑鄄猿愿缘载援圆园员远援园缘援园员园 基础研究 泽澡砸晕粤干扰悦阅载圆基因表达对裸鼠结直肠癌肝转移瘤的影响 葬葬葬葬葬葬遭葬郑见宝, 李孝彬, 孙学军, 王孝珑, 王炜, 魏光兵, 陈南征, 王恺 ( 西安交通大学医学院第一附属医院葬援普通外科 ; 遭援胸外一科, 陕西西安苑员园园远员 ) [ 摘摇要 ] 摇目的 : 建立人结直肠癌裸鼠肝转移瘤模型, 探讨干扰尾型同源盒基因圆 ( 糟葬怎凿葬造鄄则藻造葬贼藻凿澡燥皂藻燥遭燥曾圆, 悦阅载圆 ) 基因表达对结直肠癌肝转移瘤的影响 方法 : 通过慢病毒载体将悦阅载圆鄄泽澡砸晕粤体外转染人结直肠癌细胞杂宰源愿园 匀栽圆怨, 筛选建立稳定干扰悦阅载圆基因表达细胞株和阴性病毒细胞株 ; 将稳定干扰悦阅载圆基因表达的结直肠癌细胞 ( 杂宰源愿园鄄运阅 匀栽圆怨鄄运阅 ) 空白对照细胞 ( 杂宰源愿园鄄悦韵晕 匀栽圆怨鄄悦韵晕 ) 和阴性对照细胞 ( 杂宰源愿园鄄晕悦 匀栽圆怨鄄晕悦 ) 接种到裸鼠脾下极包膜内, 建立裸鼠结直肠癌肝转移瘤模型, 每天称量裸鼠体质量并观察其摄食 活动及精神情况 ; 缘园凿后处死裸鼠, 分别从大体水平以及镜下观察肝转移瘤情况 结果 : 成功构建裸鼠结直肠癌肝转移模型, 匀鄄耘染色确认为结直肠癌肝转移 各细胞干扰组 ( 杂宰源愿园鄄运阅 匀栽圆怨鄄运阅 ) 裸鼠体质量明显低于相应空白对照组和阴性对照组 [ 杂宰源愿园鄄运阅 :( 员缘援园圆依圆援园园 ) 增泽 ( 员愿援园园依圆援源愿 ) ( 员愿援园猿依圆援园缘 ) 早 ; 云越猿援苑远员, 孕约园援园缘 ; 匀栽圆怨鄄运阅 :( 员缘援猿怨依圆援员远 ) 增泽 ( 员苑援怨远依圆援源愿 ) ( 员愿援猿园依员援愿苑 ) 早 ; 云越猿援苑圆员, 孕约园援园缘 ] 杂宰源愿园鄄运阅组肝转移瘤数目明显多于杂宰源愿园鄄悦韵晕组和杂宰源愿园鄄晕悦组 [( 缘苑援愿猿依圆圆援缘远 ) 增泽 ( 圆怨援缘园依员远援怨园 ) ( 圆愿援圆园依员缘援源园 ) 个 ; 云越源援员怨苑, 孕约园援园缘 ]; 匀栽圆怨鄄运阅组肝转移瘤数目明显多于匀栽圆怨鄄悦韵晕组和匀栽圆怨鄄晕悦组 [( 缘远援愿猿依圆怨援员远 ) 增泽 ( 圆远援源园依员圆援苑远 ) ( 圆员郾园园依员员援缘园 ) 个 ; 云越源援源远苑, 孕约园援园缘 )] 结论: 脾注射法裸鼠肝转移模型可作为体内研究基因功能的理想模型 ; 干扰悦阅载圆基因表达可促进结直肠癌杂宰源愿园和匀栽圆怨细胞在体内的转移 [ 关键词 ] 摇干扰尾型同源盒基因圆 ; 短发夹砸晕粤 ; 结直肠癌 ; 动物模型 [ 中图分类号 ] 摇砸苑猿缘援猿摇摇摇摇 [ 文献标识码 ] 摇粤摇摇摇摇 [ 文章编号 ] 摇员园园苑鄄猿愿缘载 ( 圆园员远 ) 园缘鄄园远源远鄄园远 耘枣枣藻糟贼燥枣泽澡砸晕粤蚤灶贼藻则枣藻则蚤灶早藻曾责则藻泽泽蚤燥灶燥枣悦阅载圆早藻灶藻燥灶澡藻责葬贼蚤糟皂藻贼葬泽贼葬泽蚤泽燥枣糟燥造燥则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则蚤灶灶怎凿藻皂蚤糟藻 葬葬葬葬葬葬遭在匀耘晕郧允蚤葬灶遭葬燥, 蕴陨载蚤葬燥遭蚤灶, 杂哉晕载怎藻躁怎灶, 宰粤晕郧载蚤葬燥造燥灶早, 宰粤晕郧宰藻蚤, 宰耘陨郧怎葬灶早遭蚤灶早, 悦匀耘晕晕葬灶扎澡藻灶早, 宰粤晕郧葬运葬蚤 ( 葬援阅藻责葬则贼皂藻灶贼燥枣郧藻灶藻则葬造杂怎则早藻则赠 ; 遭援贼澡藻云蚤则泽贼阅藻责葬则贼皂藻灶贼燥枣栽澡燥则葬糟蚤糟杂怎则早藻则赠, 贼澡藻云蚤则泽贼粤枣枣蚤造蚤葬贼藻凿匀燥泽责蚤贼葬造燥枣载蚤 葬灶允蚤葬燥贼燥灶早哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠, 载蚤 葬灶苑员园园远员, 杂澡葬灶灶曾蚤, 悦澡蚤灶葬 ) [ 粤遭泽贼则葬糟贼 ] 摇韵遭躁藻糟贼蚤增藻 : 栽燥藻泽贼葬遭造蚤泽澡葬造蚤增藻则皂藻贼葬泽贼葬泽蚤泽皂燥凿藻造燥枣澡怎皂葬灶糟燥造燥则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则蚤灶灶怎凿藻皂蚤糟藻, 葬灶凿贼燥蚤灶增藻泽贼蚤早葬贼藻贼澡藻藻枣枣藻糟贼燥枣蚤灶贼藻则枣藻则蚤灶早悦阅载圆早藻灶藻燥灶贼澡藻皂藻贼葬泽贼葬泽蚤泽燥枣糟燥造燥则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则蚤灶增蚤增燥援酝藻贼澡燥凿泽 : 蕴藻灶贼蚤增蚤则葬造增藻糟贼燥则责葬则贼蚤糟造藻泽憎藻则藻怎泽藻凿贼燥蚤灶枣藻糟贼澡怎皂葬灶糟燥造燥则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则匀栽圆怨葬灶凿杂宰源愿园糟藻造造泽 ; 悦阅载圆早藻灶藻蚤灶贼藻则枣藻则蚤灶早糟藻造造造蚤灶藻泽 ( 杂宰源愿园鄄运阅 匀栽圆怨鄄运阅 ) 葬灶凿灶藻早葬贼蚤增藻泽澡砸晕粤憎藻则藻泽糟则藻藻灶藻凿葬灶凿藻泽贼葬遭造蚤泽澡藻凿 ; 糟藻造造造蚤灶藻泽憎蚤贼澡悦阅载圆早藻灶藻蚤灶贼藻则枣藻则蚤灶早 ( 杂宰源愿园鄄运阅, 匀栽圆怨鄄运阅 ), 糟藻造造造蚤灶藻泽憎蚤贼澡灶藻早葬贼蚤增藻泽澡砸晕粤 ( 杂宰源愿园鄄晕悦, 匀栽圆怨鄄晕悦 ) 葬灶凿遭造葬灶噪糟燥灶贼则燥造糟藻造造泽 ( 杂宰源愿园鄄悦韵晕, 匀栽圆怨鄄悦韵晕 ) 憎藻则藻蚤灶躁藻糟贼藻凿蚤灶贼燥贼澡藻泽责造藻藻灶燥枣灶怎凿藻皂蚤糟藻, 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠 ; 贼澡藻蚤灶早藻泽贼蚤燥灶, 皂燥增藻皂藻灶贼葬灶凿皂藻灶贼葬造泽贼葬贼怎泽燥枣贼澡藻皂蚤糟藻憎藻则藻燥遭泽藻则增藻凿藻增藻则赠凿葬赠葬灶凿贼澡藻憎藻蚤早澡贼燥枣灶怎凿藻皂蚤糟藻憎藻则藻皂藻葬泽怎则藻凿藻增藻则赠凿葬赠泽援栽澡藻灶怎凿藻皂蚤糟藻憎藻则藻泽葬糟则蚤枣蚤糟藻凿燥灶阅缘园贼燥燥遭泽藻则增藻贼澡藻造蚤增藻则皂藻贼葬泽鄄贼葬泽蚤泽遭赠增蚤泽怎葬造葬灶凿皂蚤糟则燥泽糟燥责蚤糟燥遭泽藻则增葬贼蚤燥灶援砸藻泽怎造贼泽 : 栽澡藻造蚤增藻则皂藻贼葬泽贼葬泽蚤泽皂燥凿藻造燥枣澡怎皂葬灶糟燥造燥则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则蚤灶灶怎凿藻皂蚤糟藻憎葬泽泽怎糟糟藻泽泽枣怎造造赠糟燥灶泽贼则怎糟贼藻凿葬灶凿糟燥灶枣蚤则皂藻凿遭赠匀鄄耘泽贼葬蚤灶蚤灶早援栽澡藻憎藻蚤早澡贼燥枣则葬贼泽蚤灶噪灶燥糟噪凿燥憎灶早则燥怎责 ( 杂宰源愿园鄄运阅, 匀栽圆怨鄄运阅 ) 憎葬泽泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼造赠造燥憎藻则贼澡葬灶贼澡葬贼燥枣贼澡藻遭造葬灶噪糟燥灶贼则燥造早则燥怎责 ( 杂宰源愿园鄄悦韵晕, 匀栽圆怨鄄悦韵晕 ) 葬灶凿灶藻早葬贼蚤增藻糟燥灶贼则燥造早则燥怎责 [ 基金项目 ] 摇国家自然科学基金资助项目 ( 晕燥援愿员员园员愿苑源, 晕燥援愿员员苑圆猿远圆 ); 陕西省科学技术研究发展计划项目 ( 晕燥援圆园员远杂云鄄园员缘, 晕燥援圆园员远杂云鄄员缘苑, 晕燥援圆园员缘杂云园猿苑 ); 陕西省科技统筹创新工程计划项目 ( 晕燥援圆园员猿运栽悦匝园猿鄄园愿 ) 孕则燥躁藻糟贼泽怎责责燥则贼藻凿遭赠贼澡藻晕葬贼蚤燥灶葬造晕葬贼怎则葬造杂糟蚤藻灶糟藻云燥怎灶凿葬贼蚤燥灶燥枣悦澡蚤灶葬 ( 晕燥援愿员员园员愿苑源, 晕燥援愿员员苑圆猿远圆 ), 贼澡藻杂糟蚤藻灶糟藻葬灶凿栽藻糟澡灶燥造燥早赠孕则燥躁藻糟贼燥枣杂澡葬葬灶曾蚤孕则燥增蚤灶糟藻 ( 晕燥援圆园员远杂云鄄园员缘, 晕燥援圆园员远杂云鄄员缘苑, 晕燥援圆园员缘杂云园猿苑 ), 葬灶凿贼澡藻悦燥鄄燥则凿蚤灶葬贼蚤增藻葬灶凿陨灶灶燥增葬贼蚤增藻孕造葬灶孕则燥躁藻糟贼泽燥枣贼澡藻杂糟蚤藻灶糟藻葬灶凿栽藻糟澡灶燥造燥早赠蚤灶杂澡葬葬灶曾蚤孕则燥增蚤灶糟藻 ( 晕燥援圆园员猿运栽悦匝园猿鄄园愿 ) [ 作者简介 ] 摇郑见宝 ( 员怨愿员原 ), 男, 陕西渭南人, 博士, 主要从事消化系统肿瘤的基础与临床研究 耘鄄皂葬蚤造 : 遭燥遭援扎澡藻灶早岳泽贼怎援曾躁贼怎援藻凿怎援糟灶 [ 通信作者 ] 摇孙学军 ( 杂哉晕载怎藻躁怎灶, 糟燥则则藻泽责燥灶凿蚤灶早葬怎贼澡燥则 ), 耘鄄皂葬蚤造 : 泽怎灶曾赠岳皂葬蚤造援曾躁贼怎援藻凿怎援糟灶

2 郑见宝, 等援泽澡砸晕粤干扰悦阅载圆基因表达对裸鼠结直肠癌肝转移瘤的影响 远源苑 ( 杂宰源愿园鄄晕悦, 匀栽圆怨鄄晕悦 )( 杂宰源愿园 :[ 员缘援园圆依圆援园园 ] 早增泽 [ 员愿援园园依圆援源愿 ] 早,[ 员愿援园猿依圆援园缘 ] 早, 云越猿援苑远员, 孕约园援园缘 ; 匀栽圆怨 :[ 员缘援猿怨依圆援员远 ] 早增泽 [ 员苑援怨远依圆援源愿 ] 早,[ 员愿援猿园依员援愿苑 ] 早, 云越猿援苑圆员, 孕约园援园缘 ) 援栽澡藻灶怎皂遭藻则燥枣造蚤增藻则皂藻贼葬鄄泽贼葬贼蚤糟贼怎皂燥则泽蚤灶杂宰源愿园鄄运阅早则燥怎责憎葬泽泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼造赠皂燥则藻贼澡葬灶贼澡葬贼燥枣贼澡藻杂宰源愿园鄄悦韵晕早则燥怎责葬灶凿杂宰源愿园鄄晕悦早则燥怎责 ([ 缘苑郾愿猿依圆圆援缘远 ] 增泽 [ 圆怨援缘园依员远援怨园 ],[ 圆愿援圆园依员缘援源园 ], 云越源援员怨苑, 孕约园援园缘 ) 援栽澡藻灶怎皂遭藻则燥枣造蚤增藻则皂藻贼葬泽贼葬贼蚤糟贼怎皂燥则泽蚤灶匀栽圆怨鄄运阅早则燥怎责憎葬泽泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼造赠皂燥则藻贼澡葬灶贼澡葬贼燥枣贼澡藻匀栽圆怨鄄悦韵晕早则燥怎责葬灶凿匀栽圆怨鄄晕悦早则燥怎责 ([ 缘远援愿猿依圆怨郾员远 ] 增泽 [ 圆远郾源园依员圆援苑远 ],[ 圆员援园园依员员援缘园 ], 云越源援源远苑, 孕约园援园缘 ) 援悦燥灶糟造怎泽蚤燥灶 : 栽澡藻造蚤增藻则皂藻贼葬泽贼葬泽蚤泽皂燥凿藻造蚤灶灶怎凿藻皂蚤糟藻藻泽贼葬遭造蚤泽澡藻凿遭赠贼澡藻泽责造藻藻灶蚤灶躁藻糟贼蚤燥灶憎葬泽葬灶蚤凿藻葬造皂燥凿藻造贼燥泽贼怎凿赠贼澡藻早藻灶早枣怎灶糟贼蚤燥灶蚤灶增蚤增燥 ; 贼澡藻悦阅载圆早藻灶藻蚤灶贼藻则鄄枣藻则蚤灶早糟燥怎造凿责则燥皂燥贼藻贼澡藻皂藻贼葬泽贼葬泽蚤泽燥枣悦砸悦杂宰源愿园糟藻造造泽葬灶凿匀栽圆怨糟藻造造泽蚤灶灶怎凿藻皂蚤糟藻援 [ 运藻赠憎燥则凿泽 ] 摇糟葬怎凿葬造鄄则藻造葬贼藻凿澡燥皂藻燥遭燥曾圆 ( 悦阅载圆 ) 早藻灶藻 ; 泽澡砸晕粤 ; 糟燥造燥则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则 ; 葬灶蚤皂葬造皂燥凿藻造 [ 悦澡蚤灶允悦葬灶糟藻则月蚤燥贼澡藻则, 圆园员远, 圆猿 ( 缘 ): 远源远鄄远缘园援阅韵陨 : 员园援猿愿苑圆辕躁援蚤泽泽灶援员园园苑鄄猿愿缘载援圆园员远援园缘援园员园 ] 摇摇 摇摇结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一, 全世界每年 [ 员约有员源园万结直肠癌新发病例, 死亡约苑园万例 ] [ 圆 ] 据国家癌症中心数据资料显示, 圆园员缘年我国结直肠癌新发病例数已超过猿愿万, 死亡病例员怨万以上 转移和复发是结直肠癌患者最常见的死因, 约源园豫 的结直肠癌患者死于肿瘤的转移, 而肝是最主要的 [ 猿转移部位 ] ; 员缘豫耀耀耀耀耀圆缘豫的患者在结直肠癌确诊时即有肝转移, 并有约圆园豫的患者在结直肠癌手术后出现肝转移, 如不采取治疗, 患者中位生存时间仅为 [ 源缘耀耀耀耀耀员园个月 ] 尾型同源盒基因圆 ( 糟葬怎凿葬造鄄则藻造葬贼藻凿澡燥皂藻燥遭燥曾圆, 悦阅载圆 ) 属于同源盒基因 ( 澡燥皂藻燥遭燥曾 [ 缘早藻灶藻泽 ) 家族中的一员 ], 在胚胎期肠上皮细胞的增 [ 远鄄苑殖和分化过程中发挥着关键作用 ], 并与细胞的凋 [ 愿鄄怨亡 黏附 侵袭和迁移有关 ] 悦阅载圆表达下调可能参与了结直肠癌的发生发展 浸润和转移等过程, 悦阅载圆可作为结直肠癌高危因素和预后不良的评估 [ 员园鄄员员指标之一 ] 本研究拟通过将构建好的稳定干扰悦阅载圆基因表达的结直肠癌细胞株注射到裸鼠脾下极包膜内, 构建裸鼠结直肠癌细胞肝转移模型, 初步探讨悦阅载圆对结直肠癌转移的影响 员摇 员援员摇 材料与方法 细胞株 病毒 实验动物及主要试剂 人结直肠癌细胞株杂宰源愿园和匀栽圆怨为本课题组保存, 培养于含员园豫胎牛血清的砸孕酝陨员远源园培养基中, 置于猿苑益 缘豫悦韵圆培养箱中培养, 取对数生长期细胞进行实验 慢病毒载体郧灾圆源愿鄄悦阅载圆 ( 悦阅载圆鄄泽澡砸晕粤 ) 阴性病毒载体 ( 晕栽鄄泽澡砸晕粤 ) 均由上海吉凯基因技术有限公司合成并鉴定 猿怨只源周龄 体质量为员猿耀耀耀耀耀员缘早的雌性月粤蕴月辕糟裸鼠为北京维通利华实验动物有限责任公司培育 [ 动物合格证号 : 杂悦载运 ( 京 ) 圆园员圆鄄园园园员 ], 在西安交通大学动物实验中心杂孕云条件下适应性饲养一周后用于本实验研究 实验用胎牛血清为美国耘曾悦藻造造公司产品, 砸孕酝陨鄄员远源园培养基购买自美国匀赠悦造燥灶藻公司 悦阅载圆兔抗人一抗 ( 阅员员阅员园 ) 为美国悦杂栽公司产品 员援圆摇 干扰悦阅载圆表达结直肠癌细胞株的建立 圆源孔培养板中接种处于对数生长期的杂宰源愿园 源匀栽圆怨细胞 ( 缘伊员园辕孔 ), 置于猿苑益 缘豫悦韵圆培养箱中培养, 待细胞密度达苑园豫耀耀耀耀耀愿园豫时按转染复数 ( 酝韵陨 ) 越员园进行转染, 分为猿组 : 只加转染试剂组 ( 遭造葬灶噪糟燥灶贼则燥造早则燥怎责, 悦韵晕 ) 转染郧灾圆源愿鄄悦阅载圆组 ( 悦阅载圆泽澡砸晕粤, 噪灶燥糟噪凿燥憎灶早则燥怎责, 运阅 ) 转染阴性对照组 ( 晕栽泽澡砸晕粤, 灶藻早葬贼蚤增藻糟燥灶贼则燥造早则燥怎责, 晕悦 ) 员圆澡 后用含员园豫胎牛血清的新鲜培养基替换含有病毒的培养基继续培养, 苑圆澡后用嘌呤霉素筛选稳定转染慢病毒载体的细胞株 源愿澡后即可置于荧光显微镜下观察各转染组细胞郧云孕的表达情况 提取各组细胞蛋白, 月悦粤法蛋白定量 取源园 μ 早蛋白行 员园豫杂阅杂鄄孕粤郧耘, 转移至孕灾阅云膜, 缘豫脱脂牛奶 猿苑益封闭员澡, 悦阅载圆抗体 ( 员颐员园园园 ) 于源益孵育过夜, 二抗常温孵育员澡, 凝胶成像系统曝光, 以 β 鄄葬糟鄄贼蚤灶为内参照 员援猿摇 结直肠癌细胞单细胞悬液的制备 依据文献 [ 员圆 ] 的方法, 取各组对数生长期的结直肠癌细胞株, 用含耘阅栽粤的园援圆缘豫胰蛋白酶液猿苑益消化圆皂蚤灶 ; 用含血清培养基终止消化, 员愿园伊早离心缘皂蚤灶 ; 弃上清, 用无血清培养液洗涤细胞猿次 ; 用 孕月杂溶液定容制成单细胞悬液, 锥虫蓝染色 计数活苑细胞, 制成终密度为员园辕皂造的单细胞悬液 员援源摇 裸鼠结直肠癌肝转移模型的建立 匀栽圆怨组, 每组苑只, 分别建立匀栽圆怨鄄悦韵晕 匀栽圆怨鄄晕悦 匀栽圆怨鄄运阅裸鼠肝转移模型 杂宰源愿园组, 每组远只, 分别建立杂宰源愿园鄄悦韵晕 杂宰源愿园鄄晕悦 杂宰源愿园鄄运阅裸鼠肝转移模型 裸鼠麻醉后, 左侧腋后线肋缘下纵行切口开腹, 将结直肠癌细胞悬液缓慢注入脾脏下极包膜下, 注射过程至少持续猿皂蚤灶, 后将脾复位, 逐层缝合切口, 一周后拆线 每天称质

3 远源愿 中国肿瘤生物治疗杂志, 圆园员远年员园月, 圆猿 ( 缘 ) 量并观察裸鼠摄食 活动 员援缘摇裸鼠结直肠癌肝转移瘤结节的观察按照文献 [ 员猿 ] 的方法, 将自然衰竭死亡裸鼠以及术后第缘园天处死裸鼠的肝 脾 肺 肾等取出 首先计数肝表面肉眼可见的转移结节, 后用源豫甲醛溶液固定肝 脾 肺 肾等, 常规石蜡包埋 其中肝切取远个肝冠状切面, 每个切面相距园援圆糟皂, 切片厚度源 μ 皂 匀鄄耘染色后光镜下观察 计数, 以肝最大冠状切面为中心进行观察, 若同一结节出现在不同切面上则计数为员个结节 将肉眼计数和显微镜计数之和作为最终的肝转移结节数目 员援远摇统计学处理采用杂孕杂杂员愿援园统计软件, 组间比较用粤晕韵灾粤方差分析, 率的比较采用云蚤泽澡藻则确切概率法 以孕 约园援园缘或孕约园援园员表示差异有统计学意义 圆摇结摇果圆援员摇慢病毒载体转染后结直肠癌细胞中悦阅载圆表达下调慢病毒载体转染人杂宰源愿园 匀栽圆怨细胞, 圆周后郧云孕, 怨缘豫以上的细胞中均表达绿色荧光蛋白 ( 图员 ) 宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼贼蚤灶早检测结果 ( 图圆 ) 显示, 干扰组 ( 杂宰源愿园和匀栽圆怨细胞 ) 悦阅载圆表达明显低于空白对照组和阴性对照组 [( 园援圆苑依园援园猿 ) 增泽 ( 园援怨怨依园郾员远 ) ( 园援怨源依园援员缘 ), 云越圆怨援苑远, 孕约园援园员 ;( 园援圆苑依园援园苑 ) 增泽 ( 员援员远依园援圆园 ) ( 员援园怨依园援员猿 ), 云越猿缘郾远苑, 孕约园援园员 ], 干扰效率苑园豫以上 图员摇慢病毒转染杂宰源愿园和匀栽圆怨细胞 ( 荧光素染色法, 伊圆园园 ) 云蚤早援员摇酝蚤糟则燥泽糟燥责蚤糟枣蚤灶凿蚤灶早泽燥枣杂宰源愿园葬灶凿匀栽圆怨糟藻造造泽贼则葬灶泽枣藻糟贼藻凿遭赠造藻灶贼蚤增蚤则怎泽 ( 云造怎燥则藻泽糟藻蚤灶增蚤贼葬造泽贼葬蚤灶蚤灶早, 伊圆园园 ) 粤, 月葬灶凿耘, 云 : 晕藻早葬贼蚤增藻糟燥灶贼则燥造早则燥怎责 ; 悦, 阅葬灶凿郧, 匀 : 运灶燥糟噪凿燥憎灶早则燥怎责 ; 粤, 悦葬灶凿耘, 郧 : 韵遭泽藻则增藻凿怎灶凿藻则糟燥皂皂燥灶皂蚤糟则燥泽糟燥责藻 ; 月, 阅葬灶凿云, 匀 : 韵遭泽藻则增藻凿怎灶凿藻则枣造怎燥则藻泽糟藻灶糟藻皂蚤糟则燥泽糟燥责藻 图圆摇 云蚤早援圆摇 宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼贼蚤灶早分析悦阅载圆表达水平 宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼贼蚤灶早葬灶葬造赠泽蚤泽燥枣悦阅载圆责则燥贼藻蚤灶藻曾责则藻泽泽蚤燥灶造藻增藻造泽 粤 : 杂宰源愿园 ; 月 : 匀栽圆怨 ; 员 : 月造葬灶噪糟燥灶贼则燥造早则燥怎责 ; 圆 : 运灶燥糟噪凿燥憎灶早则燥怎责 ; 猿 : 晕藻早葬贼蚤增藻糟燥灶贼则燥造早则燥怎责 ; 孕约园援园缘增泽遭造葬灶噪糟燥灶贼则燥造早则燥怎责葬灶凿灶藻早葬贼蚤增藻糟燥灶贼则燥造早则燥怎责 圆援圆摇 结直肠癌肝转移模型各组裸鼠的生长情况 接种癌细胞后员耀耀耀耀耀圆园凿, 各组裸鼠体质量均快速增长 从第猿园天起, 杂宰源愿园和匀栽圆怨干扰组开始裸 鼠出现消瘦 活动受限 倦怠乏力等, 部分出现精神萎靡 行动迟缓 弓背 明显消瘦等衰竭症状 杂宰源愿园鄄运阅组在源园 源源凿时各有员只裸鼠死亡, 匀栽圆怨鄄运阅组猿愿 源园 源愿凿时各有员只裸鼠死亡 杂宰源愿园和匀栽圆怨空白对照组和阴性对照组虽有部分裸鼠出现消瘦 倦怠等症状, 但未出现裸鼠死亡, 从猿远凿开始才出现体质量缓慢下降 杂宰源愿园和匀栽圆怨干扰组裸鼠体质量下降明显快于空白对照组和阴性对照组 ( 孕约园援园缘, 图猿 ) 圆援猿摇干扰悦阅载圆基因促进裸鼠结直肠癌肝转移接种结直肠癌细胞后第缘园天处死裸鼠, 各组裸鼠心 肺 肾等均未见肉眼转移结节 肝转移方面, 杂宰源愿园和匀栽圆怨总体肝转移率超过苑园豫, 杂宰源愿园鄄运阅组有远辕远只 杂宰源愿园鄄悦韵晕组源辕远 杂宰源愿园鄄晕悦组缘辕远肝转移 ; 匀栽圆怨鄄运阅组远辕苑 匀栽圆怨鄄悦韵晕组缘辕苑 匀栽圆怨鄄晕悦组源辕苑肝

4 郑见宝, 等援泽澡砸晕粤干扰悦阅载圆基因表达对裸鼠结直肠癌肝转移瘤的影响 远源怨 转移, 各组间差异无统计学意义 ( 孕约园援园缘 ) 匀栽圆怨鄄运阅组和杂宰源愿园鄄运阅组肝表面发现广泛转移, 肝表面不平 粗糙 布满灰白色转移结节, 大的转移灶约猿皂皂, 多数为针头大小转移灶, 或融合成片 ; 而相应空白对照组和阴性对照组转移结节数目较干扰组明显减少, 个别肝仅见散在单个转移结节甚至整个肝肉眼未见转移结 节 杂宰源愿园鄄运阅组肝转移瘤数目明显多于杂宰源愿园鄄悦韵晕组和杂宰源愿园鄄晕悦组 [( 缘苑援愿猿依圆圆援缘远 ) 个增泽 ( 圆怨援缘园依员远郾怨园 ) 个 ( 圆愿援圆园依员缘援源园 ) 个 ; 云越源援员怨苑, 均孕约园郾园缘 ]; 匀栽圆怨鄄运阅组转移瘤数目明显多于匀栽圆怨鄄悦韵晕组和匀栽圆怨鄄晕悦组 [( 缘远援愿猿依圆怨援员远 ) 增泽 ( 圆远援源园依员圆郾苑远 ) ( 圆员郾园园依员员援缘园 ) 个 ; 云越源援源远苑, 均孕约园援园缘 ] 云蚤早援猿摇 图猿摇结直肠癌肝转移动物模型各组裸鼠生长情况栽澡藻早则燥憎贼澡泽贼葬贼藻燥枣灶怎凿藻皂蚤糟藻蚤灶藻葬糟澡造蚤增藻则皂藻贼葬泽贼葬泽蚤泽皂燥凿藻造早则燥怎责 孕约园援园缘增泽遭造葬灶噪糟燥灶贼则燥造早则燥怎责葬灶凿灶藻早葬贼蚤增藻糟燥灶贼则燥造早则燥怎责 圆援源摇结直肠癌肝转移瘤的组织学变化光镜下观察结果 ( 图源 ) 显示, 裸鼠结直肠癌肝转移的肝内有大量肿瘤细胞生长, 多呈不规则岛状分布在血管周围, 肿瘤细胞周围可见正常肝组织萎缩 肝细胞变性坏死和肥大代偿增生的肝细胞等 干扰组可见转移灶密集分布, 并相互连接成片状, 周围肝组织小叶结构紊乱 图源摇杂宰源愿园和匀栽圆怨细胞各不同处理组结直肠癌肝转移瘤组织学变化 ( 匀鄄耘染色, 伊圆园园 ) 云蚤早援源摇匀蚤泽贼燥造燥早蚤糟葬造糟澡葬灶早藻泽燥枣造蚤增藻则皂藻贼葬泽贼葬泽蚤泽燥枣糟燥造燥灶糟葬灶糟藻则蚤灶凿蚤枣枣藻则藻灶贼贼则藻葬贼皂藻灶贼早则燥怎责泽 ( 匀鄄耘泽贼葬蚤灶蚤灶早, 伊圆园园 ) 猿摇讨摇论上皮来源的肿瘤形成转移瘤需要一系列的过程 : 原发肿瘤侵犯邻近组织, 形成循环肿瘤细胞 ( 糟蚤则鄄糟怎造葬贼蚤灶早贼怎皂燥则糟藻造造泽, 悦栽悦 ) 进入血管或淋巴管道, 悦栽悦 能在脉管系统内生存, 也能游走出脉管系统并生长定居在次级转移灶 在整个转移级联过程中, 上皮源性肿瘤细胞只有随时随地的发生表型改变, 少部分细胞才能连续克服障碍从而发生明显的转移 在这些表型变化中, 上皮细胞间质细胞化 ( 藻责蚤贼澡藻造蚤葬造贼燥皂藻泽藻灶糟澡赠皂葬造贼则葬灶泽蚤贼蚤燥灶, 耘酝栽 ) 能减少上皮细胞特性, 增加间质细胞特性, 在转移级联特定阶段发挥重要 [ 员源鄄员缘作用 ] [ 员远 ] 研究发现, 过表达在藻遭员蛋白 杂灶葬蚤造 蛋白和杂造怎早蛋白可明显抑制悦阅载圆的表达, 对 悦阅载圆进行干扰后发现蕴陨鄄糟葬凿澡藻则蚤灶蛋白和酝怎糟圆蛋白的表达明显降低, 而酝酝孕圆蛋白和酝酝孕苑蛋白表 [ 员苑 ] 达升高 在澡葬灶早等研究发现, 悦阅载圆过表达可显著增加耘鄄糟葬凿澡藻则蚤灶的表达并且减少了灾蚤皂藻灶贼蚤灶的表达, 这都提示悦阅载圆可能促进结直肠癌细胞发生 耘酝栽 [ 猿, 员愿结直肠癌最常见的转移部位是肝 ] 但肝转移瘤形成的机制仍不清楚, 有报道称发生肝硬化的肝可抑制肿瘤生长, 肝硬化时许多细胞因子如栽郧云鄄 α 栽晕云鄄 β 陨蕴鄄员和孕阅郧云等表达增加, 而肝细胞生长因子 ( 澡藻责葬贼燥糟赠贼藻早则燥憎贼澡枣葬糟贼燥则, 匀郧云 ) 和耘郧云等细胞因子减少, 导致肝微环境发生变化, 不利于癌细胞生 [ 员怨存 ] [ 员怨鄄圆园 ] 国内研究表明, 肝门静脉压 匀郧云和 耘郧云表达水平与肝转移瘤密切相关 目前常用的结直肠癌肝转移模型建模方法有原位种植法 肝门静脉注射法和脾种植法等 经脾注射制造肝转移模型法实验技术相对简单, 具有稳定

5 远缘园 中国肿瘤生物治疗杂志, 圆园员远年员园月, 圆猿 ( 缘 ) 重复性高 转移率高和较少发生其他器官转移等诸 [ 圆员鄄圆圆多优点 ] 本研究利用经脾注射法成功构建人结直肠癌裸鼠肝转移动物模型, 总体肝转移率超过苑园豫, 裸鼠内其他脏器均未发现转移灶 本研究结直肠癌肝转移动物模型中, 杂宰源愿园和匀栽圆怨各不同处理组在肝转移率上差别没有统计学意义, 这可能与样本量少有关 然而, 各细胞干扰组裸鼠体质量明显低于相应空白对照组和阴性对照组 ( 孕约园援园缘 ) 悦阅载圆表达缺失的匀栽圆怨和杂宰源愿园干扰组裸鼠肝表面均发生广泛转移 干扰组肝转移结节数明显多于空白对照组和阴性对照组 ( 孕约园援园缘 ) 表明干扰悦阅载圆基因能促进结直肠癌肝转移的发生, 提示悦阅载圆在抑制结直肠癌转移过程中发挥重要作用, 但悦阅载圆抑制结直肠癌转移的具体机制仍需进一步探讨 [ 参考文献 ] [ 员 ] 摇粤砸晕韵蕴阅酝, 杂陨耘砸砸粤酝杂, 蕴粤灾耘砸杂粤晕晕耘酝, 藻贼葬造援郧造燥遭葬造责葬贼贼藻则灶泽葬灶凿贼则藻灶凿泽蚤灶糟燥造燥则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则蚤灶糟蚤凿藻灶糟藻葬灶凿皂燥则贼葬造蚤贼赠 [ 允 ] 援郧怎贼, 圆园员远 : 耘责怎遭葬澡藻葬凿燥枣责则蚤灶贼援阅韵陨 : 员园援员员猿远辕早怎贼躁灶造鄄圆园员缘鄄猿员园怨员圆援 [ 圆 ] 摇悦匀耘晕宰, 在匀耘晕郧砸, 月粤粤阅耘孕阅, 藻贼葬造援悦葬灶糟藻则泽贼葬贼蚤泽贼蚤糟泽蚤灶悦澡蚤灶葬, 圆园员缘 [ 允 ] 援悦粤悦葬灶糟藻则允悦造蚤灶, 圆园员远, 远远 ( 圆 ): 员员缘鄄员猿圆援阅韵陨 : 员园援猿猿圆圆辕糟葬葬糟援圆员猿猿愿援 [ 猿 ] 摇砸再悦匀粤匀韵哉孕郧, 运粤晕郧允, 郧哉蕴匀粤栽陨孕, 藻贼葬造援粤噪贼圆燥增藻则藻曾鄄责则藻泽泽蚤燥灶责造葬赠泽葬糟则蚤贼蚤糟葬造则燥造藻蚤灶贼澡藻藻泽贼葬遭造蚤泽澡皂藻灶贼燥枣糟燥造燥则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则皂藻贼葬泽贼葬泽蚤泽 [ 允 ] 援孕则燥糟晕葬贼造粤糟葬凿杂糟蚤哉杂粤, 圆园园愿, 员园缘 ( 缘员 ): 圆园猿员缘鄄圆园猿圆园援阅韵陨 : 员园援员园苑猿辕责灶葬泽援园愿员园苑员缘员园缘援 [ 源 ] 摇粤砸砸哉酝, 粤蕴阅砸陨郧匀耘栽栽陨蕴, 悦粤杂栽韵蕴阅陨砸, 藻贼葬造援粤灶葬造赠泽蚤泽燥枣责则燥早灶燥泽贼蚤糟枣葬糟贼燥则泽蚤灶枣造怎藻灶糟蚤灶早造燥灶早鄄贼藻则皂泽怎则增蚤增葬造葬枣贼藻则澡藻责葬贼蚤糟则藻鄄泽藻糟贼蚤燥灶枣燥则皂藻贼葬泽贼葬贼蚤糟糟燥造燥则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则 [ 允 ] 援宰燥则造凿允杂怎则早, 圆园园愿, 猿圆 ( 员 ): 怨猿鄄员园猿援阅韵陨 : 员园援员园园苑辕泽园园圆远愿鄄园园苑鄄怨圆愿缘鄄赠援 [ 缘 ] 摇酝蕴韵阅在陨运酝, 云允韵杂耘粤, 郧耘匀砸陨晕郧宰允援陨泽燥造葬贼蚤燥灶燥枣糟葬怎凿葬造, 葬阅则燥泽燥责澡蚤造葬澡燥皂藻燥遭燥曾鄄糟燥灶贼葬蚤灶蚤灶早早藻灶藻憎蚤贼澡皂葬贼藻则灶葬造藻曾责则藻泽泽蚤燥灶, 憎澡燥泽藻贼则葬灶泽糟则蚤责贼泽枣燥则皂葬糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶早则葬凿蚤藻灶贼葬贼贼澡藻责则藻鄄遭造葬泽贼燥鄄凿藻则皂泽贼葬早藻 [ 允 ] 援耘酝月韵允, 员怨愿缘, 源 ( 员员 ): 圆怨远员鄄圆怨远怨援 [ 远 ] 摇月耘悦运云, 悦匀粤宰耘晕郧杂粤运杂韵孕匀粤运运, 蕴哉悦运耘栽栽允, 藻贼葬造援粤泽贼怎凿赠燥枣则藻早蚤燥灶葬造早怎贼藻灶凿燥凿藻则皂责燥贼藻灶糟赠遭赠葬灶葬造赠泽蚤泽燥枣悦凿曾圆灶怎造造皂怎贼葬灶贼糟澡蚤皂葬藻则蚤糟皂蚤糟藻 [ 允 ] 援阅藻增月蚤燥造, 圆园园猿, 圆缘缘 ( 圆 ): 猿怨怨鄄源园远援阅韵陨 : 员园援员园员远辕杂园园员圆鄄员远园远 ( 园圆 ) 园园园怨远鄄怨援 [ 苑 ] 摇月韵再阅酝, 匀粤晕杂耘晕酝, 允耘晕杂耘晕栽郧, 藻贼葬造援郧藻灶燥皂藻鄄憎蚤凿藻葬灶葬造赠鄄泽蚤泽燥枣悦阅载圆遭蚤灶凿蚤灶早蚤灶蚤灶贼藻泽贼蚤灶葬造藻责蚤贼澡藻造蚤葬造糟藻造造泽 ( 悦葬糟燥鄄圆 )[ 允 ] 援允月蚤燥造悦澡藻皂, 圆园员园, 圆愿缘 ( 猿猿 ): 圆缘员员缘鄄圆缘员圆缘援阅韵陨 : 员园援员园苑源辕躁遭糟援酝员园怨援园愿怨缘员远援 [ 愿 ] 摇杂粤粤阅砸杂, 郧匀韵砸粤月在, 运匀粤蕴陨云粤酝粤, 藻贼葬造援悦阅载圆葬泽葬皂葬则噪藻则枣燥则蚤灶贼藻泽贼蚤灶葬造凿蚤枣枣藻则藻灶贼蚤葬贼蚤燥灶 : 蚤贼泽怎贼蚤造蚤贼赠葬灶凿造蚤皂蚤贼葬贼蚤燥灶泽 [ 允 ] 援宰燥则造凿允郧葬泽贼则燥蚤灶贼藻泽贼杂怎则早, 圆园员员, 猿 ( 员员 ): 员缘怨鄄员远远援阅韵陨 : 员园援源圆源园辕憎躁早泽援增猿援蚤员员援员缘怨援 [ 怨 ] 摇杂陨酝酝陨晕陨杂, 月陨粤蕴耘悦运粤酝, 匀哉悦匀酝, 藻贼葬造援栽则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶燥枣蚤灶贼藻泽贼蚤灶葬造泽贼藻皂糟藻造造泽蚤灶贼燥早葬泽贼则蚤糟泽贼藻皂糟藻造造泽燥灶造燥泽泽燥枣贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶枣葬糟贼燥则悦凿曾圆 [ 允辕韵蕴 ] 援晕葬贼悦燥皂皂怎灶, 圆园员源, 缘 : 缘苑圆愿 [ 圆园员远鄄园苑鄄员愿 ] 援 澡贼贼责 : 辕辕憎憎憎援灶糟遭蚤援灶造皂援灶蚤澡援早燥增辕责皂糟辕葬则贼蚤糟造藻泽辕孕酝悦源圆愿源远远圆辕援阅韵陨 : 员园援员园猿愿辕灶糟燥皂皂泽远苑圆愿援 [ 员园 ] 月粤耘允酝, 蕴耘耘栽匀, 悦匀韵晕再, 藻贼葬造援蕴燥泽泽燥枣悦阅载圆藻曾责则藻泽泽蚤燥灶蚤泽葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿憎蚤贼澡责燥燥则责则燥早灶燥泽蚤泽蚤灶糟燥造燥则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则责葬贼蚤藻灶贼泽 [ 允 ] 援宰燥则造凿允郧葬泽贼则燥藻灶贼藻则燥造, 圆园员缘, 圆员 ( 缘 ): 员源缘苑鄄员源远苑援阅韵陨 : 员园援猿苑源愿辕憎躁早援增圆员援蚤缘援员源缘苑援 [ 员员 ] 在匀耘晕郧允, 杂哉晕载, 宰粤晕郧宰, 藻贼葬造援匀赠责燥曾蚤葬鄄蚤灶凿怎糟蚤遭造藻枣葬糟贼燥则鄄员 α 皂燥凿怎造葬贼藻泽贼澡藻凿燥憎灶鄄则藻早怎造葬贼蚤燥灶燥枣贼澡藻澡燥皂藻燥凿燥皂葬蚤灶责则燥贼藻蚤灶悦阅载圆蚤灶糟燥造燥则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则 [ 允 ] 援韵灶糟燥造砸藻责, 圆园员园, 圆源 ( 员 ): 怨苑鄄员园源援阅韵陨 : 员园援猿愿怨圆辕燥则赃园园园园园愿猿猿援 [ 员圆 ] 酝韵砸陨运粤宰粤运, 宰粤蕴运耘砸杂酝, 允耘杂杂哉孕允酝, 藻贼葬造援陨灶增蚤增燥泽藻鄄造藻糟贼蚤燥灶燥枣澡蚤早澡造赠皂藻贼葬泽贼葬贼蚤糟糟藻造造泽枣则燥皂泽怎则早蚤糟葬造泽责藻糟蚤皂藻灶泽燥枣凿蚤枣枣藻则鄄藻灶贼责则蚤皂葬则赠澡怎皂葬灶糟燥造燥灶糟葬则糟蚤灶燥皂葬泽蚤皂责造葬灶贼藻凿蚤灶贼燥灶怎凿藻皂蚤糟藻 [ 允 ] 援悦葬灶糟藻则砸藻泽, 员怨愿愿, 源愿 ( 苑 ): 员怨源猿鄄员怨源愿援 [ 员猿 ] 肖志明, 沈守荣, 连平, 等援裸鼠脾脏移植瘤模型在晕郧载远抗结直肠癌转移作用研究中的应用 [ 允 ] 援中南大学学报 ( 医学版 ), 圆园园苑, 猿圆 ( 缘 ): 苑缘猿鄄苑缘苑援阅韵陨 : 员园援猿猿圆员辕躁援蚤泽泽灶 : 员远苑圆鄄苑猿源苑援圆园园苑援园缘援园园远援 [ 员源 ] 月韵晕晕韵酝耘栽粤, 月砸再杂杂耘粤, 栽粤悦匀杂陨阅陨杂粤, 藻贼葬造援耘责蚤贼澡藻造蚤葬造鄄贼燥鄄皂藻泽藻灶糟澡赠皂葬造贼则葬灶泽蚤贼蚤燥灶泽葬灶凿糟蚤则糟怎造葬贼蚤灶早贼怎皂燥则糟藻造造泽 [ 允 ] 援允酝葬皂鄄皂葬则赠郧造葬灶凿月蚤燥造晕藻燥责造葬泽蚤葬, 圆园员园, 员缘 ( 圆 ): 圆远员鄄圆苑猿援阅韵陨 : 员园援员园园苑辕泽员园怨员员鄄园员园鄄怨员苑源鄄园援 [ 员缘 ] 陨宰粤栽杂哉运陨酝, 酝陨酝韵砸陨运, 再韵运韵月韵砸陨栽, 藻贼葬造援耘责蚤贼澡藻造蚤葬造鄄皂藻泽鄄藻灶糟澡赠皂葬造贼则葬灶泽蚤贼蚤燥灶蚤灶糟葬灶糟藻则凿藻增藻造燥责皂藻灶贼葬灶凿蚤贼泽糟造蚤灶蚤糟葬造泽蚤早灶蚤枣蚤鄄糟葬灶糟藻 [ 允 ] 援悦葬灶糟藻则杂糟蚤, 圆园员园, 员园员 ( 圆 ): 圆怨猿鄄圆怨怨援阅韵陨 : 员园援员员员员辕躁援员猿源怨鄄苑园园远援圆园园怨援园员源员怨援曾援 [ 员远 ] 郧砸韵杂杂陨, 阅哉蕴哉悦陨, 月耘晕粤酝耘哉砸栽, 藻贼葬造援栽澡藻蚤灶贼藻泽贼蚤灶藻鄄泽责藻糟蚤枣蚤糟澡燥皂藻燥遭燥曾早藻灶藻悦凿曾圆凿藻糟则藻葬泽藻泽皂燥遭蚤造蚤贼赠葬灶凿葬灶贼葬早燥灶蚤扎藻泽凿蚤泽泽藻皂蚤灶葬鄄贼蚤燥灶燥枣糟燥造燥灶糟葬灶糟藻则糟藻造造泽 [ 允 ] 援韵灶糟燥早藻灶藻, 圆园园愿, 圆苑 ( 员 ): 员园苑鄄员员缘援阅韵陨 : 员园援员园猿愿辕泽躁援燥灶糟援员圆员园远园员援 [ 员苑 ] 在匀粤晕郧允云, 匝哉蕴杂, 匝陨粤晕载云, 藻贼葬造援晕怎糟造藻葬则贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶枣葬糟鄄贼燥则悦阅载圆蚤灶澡蚤遭蚤贼泽早葬泽贼则蚤糟糟葬灶糟藻则糟藻造造早则燥憎贼澡葬灶凿则藻增藻则泽藻泽藻责蚤贼澡藻造蚤葬造鄄贼燥皂藻泽藻灶糟澡赠皂葬造贼则葬灶泽蚤贼蚤燥灶蚤灶增蚤贼则燥葬灶凿蚤灶增蚤增燥 [ 允 ] 援酝燥造酝藻凿砸藻责, 圆园员缘, 员圆 ( 源 ): 缘圆猿员鄄缘圆猿愿援阅韵陨 : 员园援猿愿怨圆辕皂皂则援圆园员缘援源员员源援 [ 员愿 ] 匀哉杂, 在韵哉在, 蕴陨匀, 藻贼葬造援栽澡藻责则藻燥责藻则葬贼蚤增藻责藻则蚤责澡藻则葬造遭造燥燥凿皂燥灶燥糟赠贼藻糟燥怎灶贼蚤泽葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿憎蚤贼澡造蚤增藻则皂藻贼葬泽贼葬泽蚤泽葬灶凿燥增藻则葬造造泽怎则鄄增蚤增葬造蚤灶糟燥造燥则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则责葬贼蚤藻灶贼泽 [ 允辕韵蕴 ] 援孕蕴燥杂韵灶藻, 圆园员远, 员员 ( 远 ): 藻园员缘苑源愿远 [ 圆园员远鄄园苑鄄员愿 ] 援澡贼贼责 : 辕辕躁燥怎则灶葬造泽援责造燥泽援燥则早辕责造燥泽燥灶藻辕葬则贼蚤糟造藻? 蚤凿越员园援员猿苑员辕躁燥怎则灶葬造援责燥灶藻援园员缘苑源愿远援阅韵陨 : 员园援员猿苑员辕躁燥怎则灶葬造援责燥灶藻援园员缘苑源愿远援 [ 员怨 ] 蒋春晖, 周全博, 孙隆慈, 等援结直肠癌肝转移机制的研究 [ 允 ] 援外科理论与实践, 圆园员缘, 圆园 ( 猿 ): 圆猿圆鄄圆猿缘援阅韵陨 : 员园援员远员猿怨辕躁援员园园苑鄄怨远员园援圆园员缘援园猿援园员猿援 [ 圆园 ] 匀粤砸哉晕晕, 晕陨运云粤砸允粤酝酝, 酝哉砸粤蕴陨阅匀粤砸粤晕灾, 藻贼葬造援蕴蚤增藻则则藻早藻灶藻则葬贼蚤燥灶泽贼蚤皂怎造葬贼藻泽贼怎皂燥则皂藻贼葬泽贼葬泽藻泽 [ 允 ] 援允杂怎则早砸藻泽, 圆园园苑, 员猿愿 ( 圆 ): 圆愿源鄄圆怨园援阅韵陨 : 员园援员园员远辕躁援躁泽泽援圆园园远援园远援园圆源援 [ 圆员 ] 李晖, 王道荣, 李清国, 等援结直肠癌肝转移动物模型研究进展 [ 允 ] 援中国现代普通外科进展, 圆园员猿, 员远 ( 员员 ): 愿苑缘鄄愿苑怨援阅韵陨 : 员园援猿怨远怨辕躁援蚤泽泽灶援员园园怨鄄怨怨园缘援圆园员猿援员员援园员员援 [ 圆圆 ] 运韵在蕴韵宰杂运陨允酝, 云陨阅蕴耘砸陨允, 悦粤酝孕月耘蕴蕴阅, 藻贼葬造援酝藻贼葬泽贼葬贼蚤糟遭藻澡葬增蚤燥则燥枣澡怎皂葬灶贼怎皂燥则糟藻造造造蚤灶藻泽早则燥憎灶蚤灶贼澡藻灶怎凿藻皂燥怎泽藻 [ 允 ] 援悦葬灶糟藻则砸藻泽, 员怨愿源, 源源 ( 愿 ): 猿缘圆圆鄄猿缘圆怨援 [ 收稿日期 ] 摇圆园员远原园源原员园 [ 修回日期 ] 摇圆园员远原园愿原员愿 [ 本文编辑 ] 摇党瑞山