10期

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殊缪
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1 中国农学通报 213,29(1):196-2 Chinese Agricultural Science Bulletin 灵芝大田栽培土壤真菌的初步鉴定陈友 1, 徐宏家 2 1, 陈永敢 ( 1 琼州学院, 海南三亚 57222; 2 海南新海源有机农业开发有限公司, 海口 57125) 摘要 : 通过对灵芝大田栽培土壤采用涂布平板法, 提取分离土壤中的真菌进行培养检测及鉴定结果表明, 土壤中共有木霉青霉曲霉毛霉链孢霉根霉毛壳霉狄氏裸囊菌 8 种真菌根据真菌的生长速度, 灵芝生长不同时期出现的真菌种类和菌落数量, 提出针对灵芝栽培土壤真菌的防治建议试验既获得有益的真菌资源, 又为高产高质高效的灵芝栽培提供有效帮助关键词 : 灵芝 ; 栽培 ; 土壤真菌 ; 鉴定中图分类号 :S5 文献标志码 :A 论文编号 : Ganoderma lucidum Field Cultivation of Soil Fungi Identification Chen You 1, Xu Hongjia 2, Chen Yonggan 1 ( 1 Qiongzhou University, Sanya Hainan 57222; 2 Hainan New Source of Organic Agriculture Development Limited Company, Haikou 57125) Abstract: This article through to the Ganoderma lucidum field cultivation soil with coated plate method, extraction and separation of soil fungi were cultured in detection and identification. The results showed that soil of Trichoderma, Penicillium, Aspergillus, Mucor, Neurospora, Rhizopus, Chaetomium and Gymnoascus subumbrinus in eight species of fungi. According to the fungal growth speed, Ganoderma lucidum in different growth period appeared the species and the colony number, put forward suggestions of prevention of soil fungi cultivation of Ganoderma lucidum. This experiment was to obtain beneficial fungi resources, high yield, high quality and efficient cultivation of Ganoderma lucidum, provide effective help. Key words: Ganoderma lucidum; cultivation; soil fungus; appraisal 引言灵芝 (Ganoderma lucidum) 属担子菌纲多孔菌目多孔菌科灵芝属, 自古以来就是吉祥富贵美好长寿的象征, 素有仙草瑞草之称, 古今药理与临床研 [1] 究均证明, 灵芝确有防病治病延年益寿的功效随着人们生活的提高, 现代科学技术的推进, 科研人员对灵芝栽培技术药理药效和临床等方面的开发和研究日新月异, 人们对灵芝的需求量日益增多要得到优质高产的灵芝, 除了掌握好的栽培技术, 选择好的菌种外, 对栽培土壤真菌种类及数量变化的认识是非常重要, 只有完全了解才能更好地做好防治工作对于土壤真菌有比较系统的研究学者主要有 Gilman Barron 和 Domsch, Gams & Anderson 等 Gilman [2] 在 A Manual of Soil Fungi 中列出了 756 个种, 包括子囊菌藻状菌和半知菌 ( 不包括土壤中的植物病原菌以及陆地的大型真菌 ) Barron [3] 所著土壤中的丝孢菌属一书中, 包含丝孢真菌 214 属 436 种 Dom sch Gams & Anderson [4] 汇集了土壤真菌 159 个属, 计 41 种, 包括子囊菌接合菌藻状菌担子菌和半知菌, 其中的少数属已划归于管毛生物界 (Straminopila) 据 [5] Domsch 等估计土壤中的真菌不少于 12 种, 按 Haw ksworth [6] 的观点, 真菌中仅有 17% 可以培养成活, 这样估计土壤中存在的真菌数量最少为 7 种因传统的研究土壤真菌多样性的方法是将其从土壤中基金项目 : 农业部热带种质资源保护项目香蕉种质资源调查与收集 (12RZZY-47); 三亚市院校专项资金项目海南野生灵芝的驯化研究 (YD941)第一作者简介 : 陈友, 男,1975 年出生, 江西萍乡人, 讲师, 硕士研究生, 主要从事热带作物分子生物学的研究与教学通信地址 :57222 海南省三亚市育才路 1 号琼州学院, @qq.com收稿日期 : , 修回日期 :

2 陈友等 : 灵芝大田栽培土壤真菌的初步鉴定 197 分离, 实验室培养和鉴定, 受分离和检测技术的限制, 只有那些对人工培养条件适合的真菌才能分离出来, 故迄今为止仅有少数土壤真菌被报道从事不同土壤的真菌研究的人员很多, 例如 :192 年,Koning 和 Oudemans 用麦芽汁或麦芽加琼脂作为培养基, 将土壤中的植物部分打碎后, 制成悬浮液进行培养, 得到 4 [7] [8] 多个菌株 ;1999 年,Bodding 等采用热带老成土和温 [9] 带有机土提取真菌, 国内的杨红等对长白山北坡森林土壤真菌分类研究但专门对灵芝栽培土壤真菌进行研究的文献报到很少而真菌在灵芝的栽培过程中, 对灵芝的品质和产量影响都比较大 [1-12], 所以, 笔者以海南省五指山琼州学院灵芝栽培基地的土壤为研究对象, 对灵芝大田栽培土壤真菌进行分离培养及初步鉴定, 希望能对灵芝生产中的真菌预防有所帮助 1 材料与方法 1.1 试验时间地点研究田间试验于 212 年 3 月在海南省琼州学院五指山校区的南校区灵芝实验基地进行, 室内试验在海南省琼州学院生物科学与技术学院灵芝研究所内进行 1.2 试验材料利用棋盘取样法, 在取样地区取 5 个土样点并作标记, 分别于灵芝入田 12 h 灵芝入田 7 天灵芝入田 27 天灵芝入田 47 天取样采集深度约 5~1 cm 处的土壤样品, 装入无菌聚乙烯袋中, 编号, 将土样带回实验室中, 放置到 4 冰箱中备用 1.3 试验方法土壤真菌的分离 ( 稀释涂布平板法 ) [13] (1) 倒平板按马丁氏培养基配方精确配制培养基, 分装加塞包扎灭菌, 无菌检查链霉素受热容易分解, 将培养基溶化后待温度降至 45 左右时才能加入可先将链霉素配成 1% 的溶液, 在 1 ml 培养基中加 1% 链霉素液.3 ml, 使每毫升培养基中含链霉素 3 μg [13] 倒 48 个培养皿, 凝固后成平板, 倒置备用 (2) 制备土壤稀释液每土样各取.5 g 配制个浓度的土壤溶液 [14] (3) 涂布培养每种浓度及土样各制作 4 个平板, 标签注明土样浓度板数然后用无菌吸头分别由相应的土壤稀释液中各吸取.2 ml 涂布 [15] 将培养基平板倒置于 25 温室培养房中培养, 每天观察记录菌落生长情况 (4) 挑菌落将培养出的菌落在生长连接之前记录每个平板中的菌落种类和数量, 并将菌落进行形态学分类, 部分保存在 4 冰箱中 [16] 培养将种类分类后的菌落, 单个分别挑取少许细胞接种到 PDA 培养基上各 3 个平板进行纯化培养 25 温室培养房中培养 3~5 天, 平板底部十字划线法记录菌落生长速度 [17] 鉴定挑取纯化后培养 3~5 天的菌落, 在显微镜下观察形态特征并测量孢子大小, 参照土壤微生物研 [18] 究法真菌鉴定手册 [19] [2] 和真菌分类学进行鉴定, 鉴定到属 2 结果与分析 2.1 木霉的菌落形态及鉴定木霉在灵芝栽培的各个时期普遍发生木霉菌落扩展迅速培养 2 天, 菌落直径为 3.5~5. cm; 培养 3 天, 菌落直径为 7.3~8. cm; 培养 4 天, 菌落直径为 8.1~ 9. cm 一般比灵芝的生长速度快木霉菌菌落开始时为白色, 圆形, 向四周扩展, 后从菌落中央产生绿色孢子, 中央变成绿色菌落周围有白色菌丝的生长带最后整个菌落全部变成绿色, 如图 1 图 1 木霉菌落形态 2.2 青霉的菌落形态及鉴定青霉菌丝体白色, 气生菌丝少, 呈绒状 ( 如图 2) 青霉菌的分生孢子呈黄色黄绿色或绿色等 2~3 天图 2 青霉菌落形态

3 198 中国农学通报后从菌落中心开始产生绿色或黄绿色的分生孢子, 菌落中心为绿色, 外圈为白色菌落扩展有局限性培养基下面有的产生色素, 有的不产生 2.3 链孢霉的菌落形态及鉴定链孢霉菌丝体无色白色或灰色, 有分枝和隔膜, 可产生分生孢子在 PDA 培养基上链袍霉菌落初为白色, 生长迅速,24 h 长满平板菌丝体很快向外蔓延, 皿底与皿盖之间产生大量菌落成团的分生孢子, 桔红色粉状链孢霉白色菌丝体在培养基表面分布呈现不均匀的状态 ( 如图 3) 图 5 毛壳霉菌落形态呈黑色疏松的颗粒状黄曲霉菌落初略带黄色, 后渐变为黄绿色灰绿曲霉菌落初为白色, 后为灰绿色, 分生孢子椭圆形至球形, 淡绿色在培养基上, 曲霉菌落初为白色, 后变为黑色黄绿色淡绿色 ( 如图 6) 图 3 链孢霉菌落形态 2.4 毛霉的菌落形态及鉴定毛霉菌丝初期白色透明, 后期为淡黄色毛霉菌丝体生长极为迅速,2~3 天即可长满培养基毛霉菌丝体淡白色稀疏, 很快产生孢子囊呈现为肉眼可见的散生小黑点 ( 如图 4) 图 6 曲霉菌落形态 2.7 根霉的菌落形态及鉴定根霉菌丝白色透明, 无分隔, 根霉菌落初为白色, 气生菌丝发达, 产生呈现黑色小颗粒状的孢子囊, 菌丝呈灰色 ( 如图 7) 培养料发生根霉, 菌丝迅速生长根霉菌丝生长分泌毒素, 争夺营养, 一定程度上影响菌种菌丝生长图 4 毛霉菌落形态 2.5 毛壳霉的菌落形态及鉴定毛壳菌发生在培养基上, 菌落初期白色, 后为褐色, 可见针头大小的颗粒 ( 如图 5) 2.6 曲霉的菌落形态及鉴定曲霉菌丝无色或白色 PDA 培养基上黑曲霉菌落初为白色菌丝体绒状, 扩展较慢, 后为黑色分生孢子梗直立, 不分枝分生孢子球形炭黑色, 肉眼看图 7 根霉菌落形态

4 陈友等 : 灵芝大田栽培土壤真菌的初步鉴定狄氏裸囊菌的菌落形态及鉴定狄氏裸囊菌菌丝白色粗壮, 浓密有分隔分枝 ( 如图 8) 分生孢子串生或单生子囊果由一团疏松交错的菌丝所组成, 初期奶油色, 老熟后为红褐色, 形状不规则, 表面脑状皱纹, 似核桃仁, 直径 1~3 cm, 散生图 8 狄氏裸囊菌菌落形态 2.9 不同取样时间土壤真菌菌落数量变化及菌落在培养基中的生长速度由表 1 可以看出, 灵芝大田栽培土壤真菌共有 8 属, 分别是木霉属青霉属链孢霉属毛霉属毛壳菌属曲霉属根霉属狄氏裸囊菌属菌落数量变化以 1-3 浓度计算, 其中青霉属在所分布的菌属中菌落数量最多, 平均值为 153 个 ; 然后依次是链孢霉属 (86 个 ), 木霉属 (81 个 ), 曲霉属 (78 个 ), 毛霉属 (46 个 ), 毛壳菌属 (41 个 ), 狄氏裸囊菌属 (16 个 ), 根霉属 (6 个 )链孢霉属的生长速度最快, 平均值达到 6.6 cm/d, 然后依次是曲霉属 (3.99 cm/d) 青霉属 (2.64 cm/d) 木霉属 (2.26 cm/d) 毛霉属 (1.96 cm/d) 毛壳菌属 (1.66 cm/d) 毛壳菌属是后期出现的, 根霉属和狄氏裸囊菌属在 27 天的样品中已经检测不到了 3 讨论针对灵芝生长不同时期的真菌不同, 要采取不同的防治措施并且根据不同菌属生长速度传播方式和危害等生活特性, 可以采取不同的手段进行针对性防治如木霉和青霉的发病机理和生活习性基本一致, 即为培养料中木霉菌孢子含量高, 容易大量发生 ; 空气中木霉菌孢子密度大, 容易发生 ; 培养室高温高湿条件, 容易造成木霉菌大量发生当温度在 35~4 条表 1 菌落数量变化和生长速度真菌类别灵芝入田 12 h 灵芝入田 7 d 灵芝入田 27 d 灵芝入田 47 d 木霉属青霉属链孢霉属毛霉属毛壳菌属曲霉属根霉属狄氏裸囊菌属件下, 菌丝体死亡, 而绿霉菌乘机大量发生, 这是导致灭菌失败的主要原因培养料酸碱度偏低, 有利于绿 [1] 霉菌发生因此, 在防治真菌性病害的时候, 可以同时防治这 2 种真菌病害毛霉与曲霉的发病机理和生活习性基本一致, 即 [12] 为在土壤粪便及植物残枝体上广泛生长毛霉孢子通过空气和工具传播, 生料栽培主要通过培养料传播可以通过切断其传播路径的方式同时控制毛霉与曲霉的危害狄氏裸囊菌和根霉主要发生在灵芝栽培的前期, 因此, 只要在前期做好预防工作, 彻底清除, 便可在整个灵芝栽培过程中避免出现狄氏裸囊菌和根霉这 2 种病害参考文献 [1] Wagner. Current techniques for the Cultivation of Ganoderma for the production Biomas, Ganoderic Acid and polysaccharides[j]. Submerged Cultivation of Ganoderma lucidnm Food Techol Biotechnol, 23.41(4): [2] Gilman J C. A Manual of Soil Fungi (2nd Edn) [M]. Iow a State University Press Inc,1957. [3] Barron G L. The genera of hyphomycetes from soil[m].the Williams & Wilk ins Co, Baltimore,1968.

5 2 中国农学通报 [4] Domsch K H, Gams W, Anderson T H. Compendium of Soil Fungi [M]. London & New York,198. [5] Domsch K H, Gams W, Anderson T H. Compendium of Soil Fungi [M]. IHW-Verlag Eching,1993. [6] Hawksworth D L. The fungal dimension of biodiversity: magnitude significance and conservation[j].soil Biology and Biochemistry, 1977,9: [7] Chesters C G C. Concerning fungi inhabiting soil[j].transactions of the British Mycological Society, 195,32: [8] Bodding C L, Bassett E E, Jacobsen I, et al. Comparison of technique for the extraction and quantificat ion of extra radical mycelium of arbuscular mycorrhizal fungi in soil[j].soil Biology and Biochemistry,1999,31: [9] 杨红, 刘志恒, 吕国忠, 等, 长白山北坡森林土壤真菌分类鉴定与名录 [J]. 江苏农业科学,29(3): [1] 汪义平. 灵芝病虫害种类调查 [J]. 安徽农学通报,29,15(1). [11] 叶向花, 杨勇岐. 灵芝栽培新技术 [J]. 现代农业科技,27,16:46. [12] 白丽荣, 芦站根, 周文杰. 灵芝的国内栽培技术及其药理研究概况 [J]. 邯郸学院学报,27,17(3): [13] 梁晨, 吕国忠. 土壤真菌分离和技术方法的探讨 [J]. 沈阳农业大学学报,2,31(5) [14] Waller N. 土壤微生物研究法 [M]. 北京 : 科学出版社,1975:4-41, 54-59,9-91, [15] 姚魁应, 黄昌勇. 土壤微生物生态学及其实验技术 [M]. 北京 : 科学出版社, [16] 于慧瑛, 吕国忠, 孙晓东, 等. 病健人参根际土壤真菌种类及数量的研究 [J]. 安徽农业科学,27,35(26): ,8291. [17] 吴兴亮. 中国海南岛灵芝资源及其分布特征 [J]. 菌物系统,1998: [18] 中国科学院南京土壤研究所微生物实验室. 土壤微生物研究法 [M]. 北京. 科学出版社,1985:44-51, [19] 魏景超. 真菌鉴定手册 [M]. 上海 : 上海科技出版社,1979:62-66, 7-72, , [2] 邵力平, 沈瑞祥. 真菌分类学 [M]. 北京 : 中国林业出版社,1984: 4-57.

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