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樊橘尹
7 years ago
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1 新型食品防腐剂溶菌酶酶解物的抗菌活性研究朱伶俐, 孙俊, 朱明捷, 杨严俊 ( 江南大学食品学院, 江苏无锡 ) 摘要 : 溶菌酶作为天然防腐剂具有很强的抑菌能力, 但在非酸性条件下热稳定性极差, 且分子量大而具有免疫原性, 使溶菌酶的应用受到限制本实验采用胃蛋白酶酶解溶菌酶, 并进行抑菌试验结果表明 : 酶解得到的多肽混合物 (PLz), 相对分子量均在 6000 以下 ; 未经热处理时,PLz 对金黄色葡萄球菌的抑制能力略低于溶菌酶, 而高于乳酸链球菌素 ; 在不同 ph 值下经热处理后,PLz 比溶菌酶具有更强的热稳定性, 对金黄色葡萄球菌的抑制作用强于溶菌酶和乳酸链球菌素 PLz 对几种常见的食品腐败菌都具有抑菌作用, 有望成为一种新型食品防腐剂关键词 : 溶菌酶 ; 溶菌酶酶解物 ; 相对分子量 ; 热稳定性 ; 抗菌活性中图分类号 :TS201.3 The antibacterial activity of a novel food preservative hydrolysates derived from lysozyme ZHU Lingli, SUN Jun, ZHU Mingjie, YANG Yangjun (School of Food Science and Technology, Jiangnan University, JiangSu WuXi ) Abstract: Lysozyme, as a natural preservative, has strong antimicrobial activit. However, lysozyme shows poor thermal stability in the acid conditions, besides that, lysozyme, with the high molecular weight possesses immunogenicity. As a result, application of lysozyme is limited. In this paper, lysozyme was hydrolyzed by pepsin.the bacteriostatic activity of hydrolysates, lysozyme and nisin were texted and compared. The results indicated that:the Molecular weight of peptides released from lysozyme(plz) were below 6000; Without heat treatment, the anti-bacteria ability of PLz on staphylococcus aureus was less weak than lysozyme, but much stronger than nisin;under heat treatment in different ph level, PLz Had stronger thermal stability.plz was more antibacterial than lysozyme and nisin. Moreover, PLz showed great inhibition effect on some other food spoilage microbes. Consequently, PLz is promising to be as a new kind of nature food preservative. Keywords: Lysozyme; hydrolysates; Relative molecular weight; Thermal stability; Antimicrobial activity ** 0 引言食品防腐剂按来源分, 有化学防腐剂和天然防腐剂两大类 [1] 化学防腐剂主要包括苯甲酸山梨酸硝酸盐等化学防腐剂存在致癌性致畸性和易引起食物中毒等, 使其应用受到局限所以, 天然防腐剂的开发利用受到食品行业的青睐天然防腐剂, 通常是从动物植物和微生物的代谢产物中提取, 如乳酸链球菌素乳酸链球菌素是一种多肽类物质, 可广泛应用于肉制品乳制品罐头饮料酿造工业等 [2] 鸡蛋溶菌酶也是一种天然防腐剂, 已于 2011 年 1 月被列入中国食品防腐剂行列, 但允许添加的食品只有奶酪和发酵酒由于鸡蛋溶菌酶相对分子量 14300, 作为一种蛋白具有免疫原性, 可以引起过敏 [3] ; 溶菌酶不能耐受高温高压, 且在非酸性条件下的耐热性大大降低 [4], 这两点严重限制了溶菌酶的应用国外研究者通过蛋白酶酶解溶菌酶得到抗菌肽, 这些抗菌肽虽然丧失了酶活, 但其抗菌作者简介 : 朱伶俐,(1986-), 女, 硕士, 食品生物技术通信联系人 : 杨严俊,(1965-), 男, 教授, 食品生物技术. yangyj2005@hotmail.com - 1 -

2 45 活性并不亚于溶菌酶 [5] 有文献报道 [6], 溶菌酶酶解物能强烈抑制芽孢的萌发, 但其热稳定性及对不同菌种的抑菌能力未见报道而在实际生产中, 许多食品需进行加热灭菌, 因此, 有必要研究溶菌酶酶解物的耐热性, 为其在食品工业中的应用提供理论依据本文以胃蛋白酶酶解溶菌酶得到多肽混合物 (PLz), 考察了 PLz 的分子量分布对金黄色葡萄球菌的抑菌能力和热稳定性此外, 还考察了 PLz 对常见食品腐败菌的抑菌能力 1 材料仪器与方法材料与仪器蛋清溶菌酶, 大连绿雪蛋品发展有限公司 ; 胃蛋白酶, 国药集团化学试剂有限公司 ; 营养肉汤营养琼脂 MRS 培养基, 国药集团化学试剂有限公司 ; 溶壁微球菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌大肠杆菌李斯特菌嗜热脂肪链球菌大肠杆菌, 江南大学食品生物技术组 AKTA 层析仪, 瑞典 GE Healthcare 公司 ; 数控超级恒温槽, 宁波天恒仪器厂 ; 冷冻离心机, 上海力申科学仪器有限公司 ;SPX 型智能生化培养箱, 南京盈鑫实验仪器有限公司 ; 手提式不锈钢蒸汽消毒器, 上海三申医疗器械有限公司 ; UV-1100 紫外可见分光光度计, 上海美谱达仪器有限公司 1.2 实验方法 PLz 的制备首先, 将质量浓度为 5mg/mL 的溶菌酶溶液加入到酶解反应容器中设定酶解反应温度 37, 达到酶解温度后, 保温 5min 左右, 用 1.0 mol/hcl 调 ph2.0, 加入酶, 使最终加酶量 [E]/[S] 为 2%( 酶与底物质量比 ) 反应过程中不断搅拌, 并维持 ph 恒定不变在最适温度条件下酶解 4h, 反应达到终点, 停止搅拌, 并将 ph 升到 7.0, 此时胃蛋白酶已失活最后, 进行冷冻离心,10000rpm,20min, 之后取上清液, 冻干备用 PLz 的相对分子量分布 70 凝胶层析法判断乳铁蛋白抗菌肽的相对分子质量分布凝胶柱 :Superdex Peptide 10/300 GL; 检测波长 :215 nm; 洗脱液 :50mM ph7.2 磷酸盐缓冲液 ; 流量 0.5mL/min 对比抑肽酶 ( 相对分子量 6521) 维生素 B 12 ( 想对分子量 1355) 胞嘧啶核苷( 相对分子量 246) 这三个标样的保留体积, 考察 PLz 的相对分子量分布溶菌酶及 PLz 的酶活性测定参考文献 [7], 以溶壁微球菌作为底物, 采用分光光度法测定酶活力抑菌圈的测定参考文献 [8], 将溶菌酶 PLz 乳酸链球菌素, 分别用 50mM ph3.0 ph4.0 ph5.0 ph6.0 ph7.0 ph8.0 的磷酸盐缓冲液配制浓度 250μg/mL 分别以相应缓冲液作空白对照在超净台下进行操作 : 将准备好的菌液 ( 采用金黄色葡萄球菌, 浓度为 ~ cfu/ml) 移取 500μL 至培养皿中, 然后将冷却至 40~45 的固体培养基倒入其中, 待其凝固将牛津杯放置在培养基平面, 加满样品液,37 培养 24h 测定培养皿内各抑菌圈直径大小, 每个样品重复三次, 抑菌圈直径大小求平均值抑菌圈直径越大, 说明该样品的抗菌效果越强, - 2 -

3 热稳定性越好 PLz 在不同 ph 值下的热稳定性将样品分别用 50mM ph3.0 ph4.0 ph5.0 ph6.0 ph7.0 ph8.0 的磷酸盐缓冲液配制浓度 1mg/mL,90 水浴 30min, 冷却后按方法测抑菌圈直径分别以相应缓冲液作空白对照将样品分别用 50mM ph3.0 ph4.0 ph5.0 ph6.0 ph7.0 ph8.0 的磷酸盐缓冲液配制浓度 5mg/mL,115 高温高压处理 20min, 冷却后按方法测抑菌圈直径分别以相应缓冲液作空白对照 PLz 对几种常见食品腐败菌的抗菌活性测定 [9] 本次实验将采用二倍稀释法进行操作, 对多个浓度梯度的样品进行试验, 得出最低抑菌浓度具体步骤为 ( 以金黄色葡萄球菌为例 ): 在无菌条件下用二倍稀释法配制浓度为 20μg/mL 10μg/mL 5μg/mL 2.5μg/mL 1.25μg/mL 0.625μg/mL 的 PLz 浓度梯度分别吸取 200μL 不同浓度的样品液, 加入 200μL 浓度为 ~ (OD 为 0.6~0.8)cfu/mL 的金黄色葡萄球菌, 混合均匀放置于 37 恒温培养箱中静置 2h 用灭过菌的生理盐水将各个混合液稀释 1000 倍分别吸取 100μL 各稀释液加入培养皿中,37 培养 24h 2 结果与讨论 2.1 PLz 的相对分子量分布 100 由于溶菌酶对胰蛋白酶木瓜蛋白酶菠萝蛋白酶等几种常见的用于酶解蛋白制备抗菌肽的蛋白酶具有很强的耐受性 ; 碱性蛋白酶和酸性蛋白酶酶解的重复性差, 水解度太大, 片段短, 而抗菌肽需要一定结构才具有较强的活性因此, 本实验选用胃蛋白酶酶解溶菌酶, 酶解物的凝胶层析结果见图 1 mau ml 105 图 1 PLz 的凝胶层析图 Fig.1 Gel chromatography figure of PLz 表 1 PLz 的各峰参数 Tab.1 parameters of each peak 保留时间 /ml 峰高 /mau 峰面积 / (mau ml) 峰面积所占比例 % % % % - 3 -

4 抑肽酶 ( 分子量 6521) 维生素 B 12 ( 分子量 1355) 胞嘧啶核苷( 分子量 246) 的保留体积分别为 11.5mL 16.2mL 19.7mL( 图未给出 ) 对比这三个标样的保留体积, 可以看出 PLz 中的相对分子质量范围在 200~6000 左右根据表 1, 相对分子量在 1000~6000 的组分的峰面积占总面积的 90.42% 根据文献报道 [10], 抗菌肽一般由 10~50 个氨基酸组成, 相对分子量多为 1000~6000, 本实验与前人研究保持一致性过敏是指由免疫机制诱导的高敏反应, 大多数蛋白质能与 IgE 和 IgG 抗体发生反应而引起过敏溶菌酶能与 IgE 抗体强烈的结合在一起, 是蛋清中主要过敏源之一 [3] 抗原相对分子量一般都在 10 4 以上, 而在 4000 以下者一般无免疫原性 [11] 溶菌酶经酶解后, 降解为分子量小于 6000 的多肽, 从而减弱了其免疫原性 2.2 PLz 的抑菌能力和在不同 ph 下的热稳定性未经热处理的样品的抑菌活性 120 为了确定 PLz 的抑菌作用是否受 ph 条件的影响, 有必要测定不同 ph 下的抑菌活性将未经过热处理的样品, 分别用不同 ph 的缓冲液溶解, 浓度为 0.25mg/mL, 进行抑菌圈实验溶菌酶乳酸链球菌素 PLz 对金黄色葡萄球菌的抑菌情况如图 2 所示 : 图 2 未经热处理的样品的抑菌能力 Fig.2 The antibacterial ability of samples without heat treatment 通过图 2 可以看出, 未经热处理时, 溶菌酶和乳酸链球菌素发挥抑菌作用的最适 ph 值在 6 左右, 而 PLz 受 ph 条件的影响较小溶菌酶和 PLz 的抑菌活性均高于乳酸链球菌素经测定,PLz 的酶活为 1332U/mg, 只有溶菌酶的 7.4%, 但仍具有很强的抑菌活性, 抑菌能力稍逊于溶菌酶可见,PLz 的抑菌能力并不完全依赖于酶活, 而是其中的抗菌肽在发挥主要抑菌作用 min 热处理后的样品的抑菌活性 135 许多食品添加防腐剂的同时还需热处理灭菌, 因此必须选择耐热性较强的防腐剂, 以避免因防腐剂失活而不能达到延长货架期的目的 ph 条件会影响抗菌肽的热稳定性, 有必要研究样品在不同 ph 条件下经过热处理后的抑菌能力, 可为 PLz 在不同 ph 值的食品中的应用提供理论依据样品分别用不同 ph 的缓冲液溶解, 浓度为 1mg/mL, 经 90 30min 热处理后进行抑菌圈实验溶菌酶乳酸链球菌素 PLz 对金黄色葡萄球菌的抑菌情况如图 3 和图 4 所示 : - 4 -

5 140 图 min 热处理后的样品的抑菌圈 Fig.3 The inhibition zone of samples after heating at 95 for 30 min 注 :(1) 左起 ph 条件分别为 :ph4 ph5 ph7; (2)a: 溶菌酶,b:PLz,c: 乳酸链球菌素,d: 缓冲液图 min 热处理后的样品的抑菌能力 Fig.4 Effect of heating at 95 for 30 min of samples on their antimicrobial activity 通过图 4 可看出, 经过 90 30min 热处理后,PLz 在酸性条件下热稳定极较好, 随着 ph 的升高, 抑菌活性略有降低而溶菌酶受 ph 的影响较大, 特别是在 ph 超过 7 后, 其抑菌活性急剧下降乳酸链球菌素的抑菌活性随着 ph 的升高呈现略微的降低趋势在各个 ph 条件下,PLz 的抑菌活性均高于溶菌酶和乳酸链球菌素 min 热处理后的样品的抑菌活性 155 有些食品如非酸性食品, 需进行高压杀菌因此, 有必要研究 PLz 在不同 ph 条件下经高温高压处理后的抑菌能力样品分别用不同 ph 的缓冲液溶解, 浓度为 5mg/mL, 经 min 热处理后进行抑菌圈实验溶菌酶乳酸链球菌素 PLz 对金黄色葡萄球菌的抑菌情况如图 5 和图 6 所示 : 160 图 min 热处理后的样品的抑菌圈 Fig.5 The inhibition zone of samples after autoclaving at 115 for 20 min 注 :(1) 左起 ph 条件分别为 :ph3 ph5 ph7; (2)a: 溶菌酶,b:PLz,c: 乳酸链球菌素,d: 缓冲液 - 5 -

6 图 min 热处理后的样品的抑菌能力 Fig.6 Effect of autoclaving at 115 for 20 min of samples on their antimicrobial activity 从图 6 可看出, 经过 min 热处理,PLz 在酸性条件下仍保持很好的抑菌活性, 其活性随着 ph 的升高而降低溶菌酶的热稳定性受 ph 影响非常大, 在 ph 超过 7 时完全失活, 而 PLz 和乳酸链球菌素仍保持一定抑菌活性乳酸链球菌素的抑菌活性在各个 ph 条件下,PLz 的抑菌活性均高于溶菌酶和乳酸链球菌素对于需 115 高温灭菌的非酸性食品, 可以选择 PLz 和乳酸链球菌素做防腐剂, 但不能选择溶菌酶未经热处理时,PLz 对金黄色葡萄球菌的抑制能力略低于溶菌酶 ; 而经热处理后,PLz 对金黄色葡萄球菌的抑制能力高于溶菌酶导致这种差异的可能原因是 :PLz 中含有耐热性较强的抗菌肽由于抗菌肽在多肽混合物中的含量较低, 因此, 未经热处理时,PLz 的抑菌活性低于溶菌酶抗菌肽分子量小, 大多数只具有二级结构, 这就决定了抗菌肽较强的耐高温能力, 并且在较大的离子强度和较低或较高的 ph 值下仍可保持抑菌活性 [10] 因此, 经过热处理后,PLz 的抑菌能力强于溶菌酶乳酸链球菌素也是肽类物质, 它耐高温的能力也强于溶菌酶 2.3 PLz 对几种食品腐败菌的抑制作用要使 PLz 在食品中得到应用, 只研究其对金黄色葡萄球菌的抑制活性并不能说明其价值, 因此, 研究 PLz 的抗菌谱具有重要意义 PLz 对几种常见食品腐败菌的抑菌作用如表 2 所示 : 185 菌种表 2 PLz 对不同菌种的抑菌情况 Tab.2 The antimicrobial activity of PLz against various strains of bacteria 样品浓度 (μg/ml) 空白大肠杆菌沙门氏菌嗜热脂肪链球菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌单核增生李斯特菌乳酸菌注 :-: 无菌生长 ;+-: 少量的菌落 ;+: 菌落面积超过培养皿 1/3 面积, 不超过培养皿 1/2 面积 ;++: 菌落面积超过培养皿 1/2 面积 - 6 -

7 表 2 的实验结果说明了 PLz 对于革兰氏阴性菌 ( 大肠杆菌和沙门氏菌 ) 基本没有抑菌作用 ; 而对革兰氏阳性菌有不同程度的抑抑菌作用单增李氏菌在 4 的环境中仍可生长繁殖, 是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一, 本实验结果表明, 添加 PLz 可以有效地抑制李斯特菌的生长乳酸菌并不都是益生菌, 其中某些乳酸菌也是果汁及饮料中最常见的腐败菌 [12] PLz 对乳酸菌具有抑制能力, 可用于饮料的防腐当 PLz 浓度达 300μg/mL 时能抑制枯草芽孢杆菌的芽孢萌发 ( 数据未给出 ) 前人研究表明 [5] : 溶菌酶酶解物对枯草芽孢杆菌具有很强的抑制作用, 并且在 100μg/mL 的浓度下就 [5] 能完全抑制枯草芽孢杆菌的芽孢萌发导致这差异的可能原因是 : 与文献相比, 本实验得到的活性抗菌肽在酶解物中的含量较低 3 结论本文用胃蛋白酶酶解溶菌酶, 降低其免疫原性重点考察了酶解物在不同 ph 下的热稳定性及对几种常见食品腐败菌的抑菌能力结论如下 : 未经热处理时,PLz 具有较好的抑菌活性, 抑菌能力稍逊于溶菌酶, 而高于乳酸链球菌素 ; 经过 90 30min 热处理后,PLz 溶菌酶和乳酸链球菌素的抑菌活性都随着 ph 的升高而降低, 在各个 ph 条件下,PLz 的抑菌活性均高于溶菌酶和乳酸链球菌素 ; 经过 min 热处理后, 溶菌酶受 ph 影响较大, 在 ph 超过 7 时就完全失去了抗菌活性, 而 PLz 和乳酸链球菌素仍保持一定抑菌活性, PLz 的抑菌能力高于溶菌酶和乳酸链球菌素 ;PLz 的抗菌谱实验表明,PLz 对革兰氏阴性菌作用较弱, 对阳性菌具有较强抑制作用本文通过对溶菌酶酶解物的抑菌活性研究, 为扩展溶菌酶在食品中的应用提供理论基础 [ 参考文献 ] (References) [1] 张红艳, 林凯, 阎春娟. 国内外天然食品防腐剂的研究进展 [J]. 粮食加工,2004,(3): [2] 李科德, 韩木兰, 柏建玲. 乳酸链球菌素的研究和应用 [J]. 微生物学通报,2002,29(4): [3] 佟平, 高金燕, 陈红兵. 鸡蛋清中主要过敏原的研究进展 [J]. 食品科学,2007,28(8): [4] Laurents D V and Baldwin R L.Characterization of the unfolding pathway of hen egg white lysozyme[j]. Biochemisty,1997,36: [5] Yoshinori Mine, Fupeng Ma, and Sophie Lauriau.Antimicrobial.Peptides Released by Enzymatic Hydrolysis of Hen Egg White Lysozyme[J]. J. Agric. Food Chem. 2004, 52: [6] Adham M. Abdou b, S. Higashiguchia and A.M. Aboueleinin, et al.antimicrobial peptides derived from hen egg lysozyme with inhibitory effect against Bacillus species[j]. Journal of Food Control,2007,18: [7] 李德海, 迟玉杰. 溶菌酶活力的简易测定 [J]. 中国乳品工业,2002,30(5): [8] 庞莉, 陆建安, 王淼等. 阿魏酸化学修饰溶菌酶及扩展抗菌谱的研究 [J]. 食品工业科技 2009,30(11): [9] 蔡宏亚, 何宁先, 王泽平等. 连续稀释法研究红腺忍冬体外抑菌作用 [J]. 中华实用中西医杂志,2007,20 (5): [10] 刘德辉, 徐蕙, 黄毓茂. 抗菌肽的生物活性及在畜牧生产中的应用前景 [J]. 广东兽牧兽医科技.2009,43 (3):3-5. [11] 北京大学生命科学导论编写组. 生命科学导论 [M]. 北京 : 高等教育出版社,2000. [12] 关怀. 制果汁及果汁饮料中腐败菌的非加热法 [J]. 国外医学卫生学分册.2002,29(3):

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材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌