上海农业学报 65 用范围小不具广谱抑菌性的弊端开发一种天然安全的外源抑菌成分应用于乳制品的抑菌具有重要的意义桑黄 (Phelinusspp.) 作为一种珍贵的传统食药用真菌, 是国际认同的食品领域中相率最高的一种食药用真菌 [6 7] 目前, 对于桑黄子实体水提物的生物活性有诸多报道, 如

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羸当龙
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1 ４８上海农业学报ＡＡＳＤＯＩ? ｊ４４４文章编号桑黄水提物抑菌作用的研究与应用王钦博杨焱齐晓彦乳业生物技术国家重点实验室光明乳业股份有限公司上海４农业部南方食用菌资源利用重点实验室４上海市农业科学院食用菌研究所国家食用菌工程技术研究中心上海摘ｍ是一种食药用真菌利用沸水可提取其子实体抑菌成分通过选取乳制品要桑黄Ｐ中常见的具有代表性的有害指示菌研究了不同浓度的桑黄水提物对革兰氏阳性菌阴性菌霉菌和酵母的抑ｍ? ｍｌ作用浓度下实现了对牛乳中有害细菌真菌有效的抑制能显制作用研究发现桑黄水提物在等抑菌剂具有广谱抑菌性著控制巴杀牛乳中菌群总数的变化同时对有益菌无显著影响相对Ｎ关键词抑菌桑黄霉菌酵母细菌７中图分类号Ｓ文献标识码ＡＳｐｐｑｍＰｍＷＡＮＧＱＹＡＮＧＹＱＩＸＳＫＬＤＢＢＤＦＣＬＳ４ＣＮＥＲＣＥＦＩＥＦＳＡｍＡＳＳ４ＣＡＰｐｍｍｍＡｍｗｗＴｐｍｐｗＴｗｍｗＴｗＰｍｑｗｍｍｍｋｍ? ｍｌＴｍｍｋｗＡｍｍｗｍｐｍｍｗＮＫｗＰｍＡＹＭｗＢｍ随着国民经济的不断提高我国乳品行业已步入了快速发展时期消费市场对乳制品的品质要求也在不断提高开发针对不同消费人群的具有特殊生理功能的高品质乳制品成为我国乳业发展的一个新年日本雪印旗下三款产品检出金黄色葡萄球菌方向而目前国内外乳品微生物污染事故频发如年美国惠氏生产的乳粉被检出阪崎杆菌超标等由于乳制品中含有丰富的营养成分包括超标蛋白质脂质乳糖维生素等在乳制品的生产流通以及储存过程容易受到微生物的污染因而抑菌问题成为开发特色高品质乳制品重要的环节之一乳制品的抑菌方式主要有内源成分抑菌和外源物质添加抑菌如目前研究最深应用最广的是乳Ｎ能有效地控制食品中的有害细菌特别是耐热的芽孢杆菌及梭菌的生长和繁酸链球菌肽Ｎ能够有效控制革兰氏阳性菌的生长繁殖但对革兰氏阴殖以达到延长不同乳制品货架期的目的Ｎ性菌酵母以及霉菌不具有抑制作用４因而与乳制品内源性抑菌物质相比外源添加抑菌成分有作收稿日期ＢＡＤ８Ｂ７新型乳制品的研发与产业化示范基金项目十二五科技支撑计划课题８４男硕士工程师从事乳制品发酵剂及活性研究Ｅｍｗｑ４ｍ作者简介王钦博

2 上海农业学报 65 用范围小不具广谱抑菌性的弊端开发一种天然安全的外源抑菌成分应用于乳制品的抑菌具有重要的意义桑黄 (Phelinusspp.) 作为一种珍贵的传统食药用真菌, 是国际认同的食品领域中相率最高的一种食药用真菌 [6 7] 目前, 对于桑黄子实体水提物的生物活性有诸多报道, 如抗氧化 [8] 抗肿瘤 [9] 抗衰老提 [10 13] 高免疫力抗纤维化抗肺炎等功效本研究通过研究桑黄子实体水提物的抑菌性, 并应用于乳制品, 考察桑黄子实体水提物对保鲜乳中菌群总数的影响, 旨在为开发一种天然安全性能佳的乳制品抑菌剂做部分基础工作 1 材料与方法 1.1 原料与仪器 PDA 培养基肉汤培养基购于国药集团, 按药品说明取固体粉末加去离子水溶解后,121 灭菌 15min 后, 待用 ;MRS 培养基 M17 培养基购于德国默克公司, 按药品说明取固体粉末溶解后,121 灭菌 15min 后, 待用 ; 指示菌 : 大肠杆菌 (Escherichiacoli) 宋内氏志贺氏菌 (ShigelaCastelani) 沙门氏菌 (Salmonela) 单增李斯特菌 (Listeriamonocytogenes) 金黄色葡萄球菌 (Staphylococusaureus) 藤黄微球菌 (Micrococusluteus) 枯草芽孢杆菌 (Bacilussubtilis) 青霉 (Penicilium candidum) 白霉 (Geotrichum candidum) 酵母菌种 (Sacharomycescerevisiae) 保加利亚乳杆菌 (Lactobacilusbulgaricus) 嗜热链球菌 (Streptococusthermophilus) 以及双歧杆菌 (Bifidobacterium), 以上菌种保存于光明乳业股份有限公司菌种库 ; 桑黄 (Phelinusbaumi.) 保存于中国微生物菌种保藏中心上海食用菌分中心 Bioscreen 全自动生长曲线分析仪, 购于芬兰 Bioscreen 公司 ; 高压蒸汽灭菌锅 HVE 50, 购于 HIRAYAMA 公司 ; 超净工作台 TH CB 402, 购于 LABCONCO 公司 1.2 桑黄水提物的制备将桑黄菌种栽培得到子实体后, 将子实体粉碎至约 1cm 3 的颗粒, 在干燥的子实体粉碎物中加入 20 倍体积的去离子水, 沸水提取 2h, 滤得残渣进行二次提取 ; 合并两次提取液并进行浓缩,4000r?min 离心 10min 去除沉淀 ; 将乙醇加入浓缩液中, 至乙醇终浓度为 90%, 室温下静置 24h 后, 将离心后沉淀部分加去离子水溶解, 再次离心去除不溶物质 ; 将上清进行透析 12h, 透析后溶液进行冷冻干燥, 即得桑黄水溶性提取物,115 灭菌 15min 后使用 1.3 革兰氏阴性菌抑制试验抑菌方法参照 ZHAO [14] 并稍作改动取桑黄水提物分别用无菌去离子水配制成 0.5mg?mL 1mg?mL 5mg?mL 20mg?mL 50mg?mL 溶液, 待用 ; 取大肠杆菌宋内氏志贺氏菌沙门氏菌分别进行菌种复苏后, 将菌体接种于液体肉汤培养基 37 下振荡培养 18h, 调节培养后菌液中菌种浓度为个?mL, 取 1mL 调节后菌液与呈液态的肉汤琼脂培养基混合均匀后倒至培养皿中 ; 待培养基凝固后, 将 20μL 不同浓度桑黄水提物溶液滴在混有有害微生物的固体培养基上, 以 20μL 无菌水作为对照组 ;37 下静置培养 48h 后测量平板抑菌圈大小 1.4 革兰氏阳性菌抑制试验抑菌方法参照 ZHAO [14] 并稍作改动取桑黄水提物分别用无菌去离子水配制成 0.5mg?mL 1mg?mL 5mg?mL 20mg?mL 50mg?mL 溶液, 待用 ; 取单增李斯特菌金黄色葡萄球菌藤黄微球菌以及枯草芽孢杆菌分别进行菌种复苏, 其余步骤参照 1.3 革兰氏阴性菌抑制试验 1.5 霉菌抑制试验参照文献 [15] 的方法, 并略做改动将灭菌后桑黄水提物与 PDA 培养基混合均匀, 使桑黄水提物终浓度为 0.1mg?mL 1mg?mL 10mg?mL, 倒入平板凝固后, 以空白 PDA 固体培养基为对照 ; 取青霉白霉菌株分别进行活化并进行固体扩大培养,7d 后分别挑取青霉白霉菌种于平板中心,30 培养 7d 后, 分别测量青霉白霉在平板中的直径 1.6 酵母生长抑制试验取啤酒酵母菌种进行复活, 挑取活化后的酿酒酵母扩大培养, 调节酵母菌体浓度为个?mL 并取 180μL 酵母发酵液与 20μL 桑黄水提物溶液均匀混合, 置于 Bioscreen10 10 孔板, 使样品终浓度分

3 66 王钦博, 等 : 桑黄水提物抑菌作用的研究与应用别为 4mg?mL 20mg?mL 40mg?mL, 以无菌水作为空白对照,30 连续震荡, 宽波长于 600nm 吸光度, 间隔 20min 读数, 连续测定 2000min 1.7 巴氏杀菌乳菌群总数的控制将灭菌后的桑黄水提物与新鲜牛乳混合均匀, 使样品在牛乳中的终浓度为 0mg?mL 0.5mg?mL 1mg?mL 5mg?mL, 均质后进行巴氏杀菌, 置于 10 下保存, 按国标 GB 食品安全国家标准方法测定牛乳中细菌总数, 连续测定 2 周 1.8 有益菌的影响抑菌方法参照 ZHAO [14] 并稍作改动取桑黄水提物分别用无菌去离子水配制成 1mg?mL 10mg?mL 50mg?mL 溶液, 待用 ; 取保加利亚乳杆菌 (MRS 培养基 ) 嗜热链球菌 (M17 培养基 ) 以及双歧杆菌 (MRS 培养基 ) 三种有益菌株复苏扩大培养, 其余步骤参照 1.3 革兰氏阴性菌抑制试验 2 结果与分析 2.1 革兰氏阴性菌的抑制结果抑菌圈大小可反映抑菌保护剂抑菌能力, 抑菌圈越大, 抑菌能力越强 ( 表 1) 当不同浓度桑黄水提物作用下, 混有有害微生物的平板出现抑菌圈, 且抑菌圈随样品作用浓度的升高, 直径也不断扩大 ; 桑黄水提物对志贺氏菌抑制作用较弱, 对于大肠杆菌的抑制较为明显, 在 1mg?mL 作用浓度下, 即对大肠杆菌的生长具有抑制作用由此可得出结论, 桑黄水提物能有效抑制革兰氏阴性菌生长, 但对不同细菌抑制程度有所不同表 1 不同浓度桑黄水提物对阴性菌的抑制 Table1 Theinhibitionofgram negativebacteriaafteraddingaqueousextracts 桑黄水提物作用组?mg ml -1 大肠杆菌抑菌直径?cm 志贺氏菌抑菌直径?cm 沙门氏菌抑菌直径?cm 空白对照 ± ± ± ± ± ± ± ± ± 革兰氏阴性菌的抑制结果不同浓度桑黄水提物作用下, 混有有害微生物金黄色葡萄球菌李斯特菌藤黄微球菌以及枯草芽孢杆菌的平板均可以观察到抑菌圈抑菌作用具有样品浓度依赖性, 随样品浓度的升高, 抑制作用加强样品在低浓度范围对藤黄微球菌作用不明显 ; 相对样品对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌抑制作用较为显著桑黄水提物作用组?mg ml -1 表 2 不同浓度桑黄水提物对阳性菌的抑制 Table2 Theinhibitionofgram positivebacteriaafteraddingaqueousextracts 李斯特菌抑菌直径?cm 金黄色葡萄球菌抑菌直径?cm 藤黄微球菌抑菌直径?cm 枯草芽孢杆菌抑菌直径?cm 空白对照 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 霉菌生长抑制情况将不同浓度桑黄水提物混入 PDA 固体培养基, 将白霉青霉菌落置于平板中心, 对霉菌生长的抑制作用与霉菌生长圈直径大小呈负相关 ( 表 3) 样品作用下, 霉菌生长圈直径相对于空白对照缩小, 且霉菌生长圈直径随着作用剂浓度增大而缩小 10mg?mL 作用浓度下, 生长圈直径分别为空白对照直径的 16 2% 40.6%, 因而样品可有效抑制霉菌的生长 2.4 酵母生长抑制情况酵母等微生物在培养液中繁殖都能产生浊度利用 Bioscreen 全自动生长曲线分析仪测定酵母生长

4 上海农业学报 67 过程中吸光值的改变, 反映其生长速度及菌体浓度等从图 1 可以看出, 在桑黄水提物的作用下, 对酵母的生长出现了抑制作用, 且随作用浓度的升高, 最大吸光值越小, 酵母生长周期最高菌体浓度越低表 3 不同浓度桑黄水提物对霉菌生长的抑制作用 Table3 Diferentconcentrationsofaqueousextractsofinhibitionforthegrowthofmold 桑黄水提物作用组?mg ml -1 白霉生长圈直径?cm 青霉生长圈直径?cm 空白对照 6.8± ± ± ± ± ± ± ± 巴杀保鲜乳中菌群生长抑制情况随着桑黄水提物浓度的提高, 保存相同时间的保鲜牛奶乳中菌群总数越低,10mg?mL 作用浓度下, 10 保存 14d 的巴杀鲜乳菌群总数最高未超过 cfu?ml 可见, 桑黄水提物能有效控制保鲜牛奶乳中菌群总数, 起到延长货架期的作用图 1 不同浓度桑黄水提物对酵母生长的抑制作用 Fig.1 Diferentconcentrationsofaqueousextractsof inhibitionforthegrowthofyeast 2.6 有益菌生长作用情况图 2 不同浓度桑黄水提物对细菌生长的抑制作用 Fig.2 Diferentconcentrationsofaqueousextractsof inhibitionforthegrowthofbacteria 选取乳制品中常见有益菌进行试验, 保加利亚乳杆菌嗜热链球菌并没有产生可见的抑菌圈, 只有在浓度较高时才在双歧杆菌平板上观察到较小的抑菌圈 ( 表 4), 所以本发明的抑菌保护剂对有益菌无显著抑制作用表 4 桑黄水提物对有益菌的作用 Table4 Theinfluenceofdiferentconcentrationaqueousextractsofprobiotics 桑黄水提物作用组?mg ml -1 保加利亚乳杆菌抑菌直径?cm 嗜热链球菌抑菌直径?cm 双歧杆菌抑菌直径?cm ± ±0.1 3 结论与讨论由于不同乳制品中成分较为复杂, 添加菌种类别奶源成分比例加工方式生产设备等均存在差异, 因此很难用统一的抑菌方法应用到乳品企业生产中目前多数乳品企业通过改变生产工艺提高原奶的品质来达到延长货架期的目的, 现有澳大利亚乳企将巴氏杀菌乳从原有 21d 保质期, 通过生产工艺改造将货架期延长至 45d 另有乳企通过添加天然安全的抑菌成分的方式, 延长保鲜乳制品的货架期, 但目前食品标准允许添加的抑菌成分较少, 且不具有广谱抑菌性应当寻求多种保鲜技术的协同作用的方式, 以达到抑制乳制品中有害微生物生长的目的本试验以食药用真菌桑黄 (Phelinusbaumi.) 子实体为研究对象, 使用沸水提取的方法, 提取子实体中具有抑菌性的物质研究分析了该水提物抑菌特性, 分别选取了乳制品中具有代表性常见的几类微生物进行抑菌试验桑黄子实体水提物对革兰氏阴性菌革兰氏阳性菌霉菌以及酵母均有不同程度的抑制作用对大肠杆菌等革兰氏阴性菌, 在 1mg?mL 作用浓度时表现出了抑菌性质, 但对志贺氏菌作用不

5 68 王钦博, 等 : 桑黄水提物抑菌作用的研究与应用明显 ; 对于金黄色葡萄球菌等阳性菌, 抑制效果较佳, 在较低浓度 0.5mg?mL 作用浓度下, 即对部分阳性菌表现抑菌活性酵母霉菌是乳制品生产运输存放方程中, 常见微生物污染源, 本研究中考察了在桑黄水提物不同作用浓度下, 有效抑制了酵母和霉菌的生长, 一定程度上延长了保鲜牛乳的货架期另外, 本研究发现, 桑黄水提物对牛乳中有益菌的影响除在 50mg?mL 高浓度作用下, 对双歧杆菌出现轻微抑制现象, 但对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌不存在显著抑制作用因此,1 10mg?mL 桑黄水提物在不抑制有益菌生长的前提下, 实现了对牛乳中有害细菌真菌有效的抑制, 能显著控制巴杀牛乳中菌群总数的变化, 相对 Nisin 等抑菌剂具有广谱抑菌性参考文献 [1] 李莎. 乳制品中乳酸菌检测不确定性及鲜奶保鲜技术研究 [D]. 长沙 : 湖南农业大学,2013. [2] 王钦博, 杭锋, 穆海菠, 等. 乳制品抑菌方法研究与进展 [J]. 上海农业学报,2015,31(4): [3]DELVESBJ.Nisinanditsusesasafoodpreservative[J].FoodTechnol,1999,44(3): [4]HITCHINSAD,GOULDGW,HURSTA.Theswelingofbacterialsporesduringgerminationandoutgrowth[J].GenMicrobiol,1963,30: [5] 吕淑霞, 白泽朴, 代义, 等. 乳酸链球菌素 (Nisin) 抑菌作用及其抑菌机理的研究 [J]. 中国酿造,2008(9): [6] 南京中医药大学. 中药大辞典 [M].2 版. 上海 : 上海科学技术出版社,2006: [7]IKEKAWAT,NAKANISHIM,UEHARAN,etal.Antitumoractionofsomebasidiomycetes,especialyPhelinuslinteus[J].Gann,1968,59: [8] 胡金霞, 杨焱, 张劲松, 等. 桑黄醇提物抗氧化和保护神经细胞损伤的研究 [J]. 上海农业学报,2009,25(2): [9] 郝瑞霞, 周帅, 杨焱, 等. 不同来源的桑黄子实体醇提物中黄酮含量及生物活性的比较 [J]. 食用菌学报, (2): [10]HUR JM,YANG CH,HAN SH,etal.AntibacterialefectofPhelinuslinteusagainstmethicilin resistantstaphylococusaureus[j]. Fitoterapia,2004(75): [11]KIMSH,SONGYS,KIMSK,etal.Anti inflammatoryandrelatedpharmacologicalactivitiesofthen BuOHsubfractionofmushroomPhelinus linteus[j].journalofethnopharmacology,2004,93: [12]SONGTY,LINHC,YANGNC,etal.AntiproliferativeandantimetastaticefectsoftheethanolicextractofPhelinusigniarius(Linnearus: Fries)Quelet[J].JournalofEthnopharmacology,2008,115: [13]KIM HM,KANGJS,KIM JY,etal.EvaluationofantidiabeticactivityofpolysaccharideisolatedfromPhelinuslinteusinnon obesediabetic mouse[j].internationalimmunopharmacology,2010,10: [14]ZHAOZ,MA Y,DAIC,etal.Imcroporinanewcationicantimicrobialpeptidefrom thevenom ofthescorpionisometrusmaculates[j]. AntimicrobAgentsChemother,2009,53: [15] 王开金, 李宁, 陈列忠, 等. 加拿大一枝黄花精油的化学成分及其抗菌活性 [J]. 植物资源与环境学报,2006,15(1): ( 责任编辑 : 张睿 )

材料方法

材料方法生物技术通报陆敏许黎明吴宏宇张继恩李国栋黄青山溶葡萄球菌酶是一种能高效裂解葡萄球菌细胞壁的肽链内切酶已有研究表明其能够有效预防和去除奶牛乳腺中葡萄球菌的感染但该酶在牛奶中的性质研究还缺少详细的研究数据现对重组溶葡萄球菌酶在牛奶中的一些性质进行研究检测了加入溶葡萄球菌酶后牛奶性状的变化和重组溶葡萄球菌酶在牛奶中的酶活的稳定性以及溶葡萄球菌酶在牛奶中的抑杀菌活性结果显示重组溶葡萄球菌酶未改变牛奶的外观性状