Microsoft PowerPoint - 5é–µç´€ [çł¸å®¹æ¨¡å¼‘]

Size: px

Start display at page:

Download "Microsoft PowerPoint - 5é–µç´€ [çł¸å®¹æ¨¡å¼‘]"

翼姗蓬
9 years ago
Views:

1 酵素

2 酵素 (enzyme) Bűchner 於 1897 年發現酵母菌的細胞液可將糖類發酵成酒精, 證實非活體發酵 (unorganized ferments) 之可行性 Dixon 與 Webb 在 1979 年的定義為 : 酵素為一種含有特殊的活性能力, 且具有催化特性之蛋白質現在一般定義為 : 一群催化生物體內化學反應 ( 如 : 分解合成再生及輸送等 ) 的蛋白質或核酸, 為了加快這些反應, 以供給生物體所需之催化劑, 這些催化劑亦稱為生物觸媒 (biological catalysts)

3 酵素之反應物稱為受質或基質 (substrate) 大多數酵素的轉化數 (turnover number) 為 100~1,000,000 個基質 /sec 化學反應式 : S + E S-E complex P + E

4 酵素的命名與分類 1978 年國際生物化學協會 (International Union of Biochemistry; IUB) 將目前的酵素歸納為六大類 : 1. 氧化還原酶 Oxidoreductase -H or +O 2, 產生 e - 轉移作用 2. 轉移酶 Transferase 將基質 function group 轉移至新受質 3. 水解酶 Hydrolase A-B + H 2 O AOH + BH 4. 解離酶 Lyase 以非水解方式移除 functional group 5. 異構酶 Isomerase 催化不對稱碳中心之光學異構物 L D 6. 聯結酶 Ligase 藉 ATP 高能磷酸鍵斷裂時所產生的能量, 使兩個分子結合 X + Y + ATP X*Y + ADP + Pi 參閱 p5-7~5-9

5 酵素的作用 (1) 具有一般催化劑的性質, 催化效率高, 可使化學反應加速進行 (2) 參與反應後, 本身結構不變, 可以重覆使用 (3) 可以改變正向或逆相之反應速率, 但不會改變化學平衡狀態 (4) 可以降低活化能, 但無法改變反應 ΔG 活化能 ΔG' S P S-E +E +E

6 酵素的特性 1. 酵素的結構為複雜的球狀蛋白質 (M.W. = 10 4 ~10 6 Da ), 由一個或數個次單位 (subunits) 組成 2. 酵素存在於生物體中, 大部分在溫和環境 (25~50 o C) 下進行反應, 少部份在極端條件下如 0 o C 以下或 100 o C 以上, 仍具活性 3. 在 37 o C 下, 酵素可以提高反應速率達到對照組的 ~10 20 倍 4. 對基質具有高度特異性 (specificity), 通常僅能催化一種或一類結構非常相似的物質依此可分為低特異性基團特異性絕對特異性立體化學特異性等 5. 高溫酸鹼紫外線重金屬與界面活性劑等會使酵素變性, 而導致活性喪失 6. 可添加穩定劑或以化學修飾法固定化方法基因工程等方法, 可以改良酵素的穩定性和應用性

7 酵素的特異性 ( 專一性 ) 低特異性 (low specificity): 對基質無專一性而僅對欲切斷的鍵結有專一性基團特異性 (group specificity): 僅對於特定基團之化學鍵作用如 :Trypsin 對 Arginine 和 Lysine 之 carboxyl group 所形成之胜肽鍵作用絕對特異性 (absolute specificity): 僅對某種基質進行某一種反應大多數酵素屬於此類立體化學特異性 : 僅對某種特殊光學或幾何異構物 (optical or geometrical isomers) 作用 Deacylase Deacylase + Acyl group L-N-acylamino acid L-amino acid (L-N- 乙醯胺基酸 ) (L- 胺基酸 ) D-N-acylamino acid (D-N- 乙醯胺基酸 ) 無反應

8 輔助因子 (cofactor) 與輔酶 (coenzymes) Prosthetic group ( 輔助基,cofactor): 金屬離子血鐵素鐵與硫聚合物, 或輔酶等輔酶 (coenzymes) 不是酶, 通常為維生素和其衍生物 ( 如 :NADH, FAD, FMN 等 ), 可作為 O 2, CO 2, e - 之攜帶者

9 * 酵素催化作用的機制酵素的催化反應是在活性中心發生, 活性中心包括受質與酵素之結合區 (binding site) 與催化基團 (catalytic groups), 通常位於酵素表面, 此構造通常由蛋白質內部兩個區域 (domains) 之界面所形成活性中心通常與受質形狀電荷和極性互補, 結合的力量包括 : 氫鍵 (H), 離子鍵 (I), 疏水性交互作用 ( hydrophobic interaction) 和凡得瓦力 (V) 等非共價鍵

10 酵素動力學 (Enzyme Kinetics) 酵素動力學為研究酵素對某一反應進行的快慢, 以及反應物變產物的過程與機制, 與反應速率反應級數有關 (1) 反應速率 : 是指單位時間內反應物減少的量, 或是產物增加的量為 V vs. [S] 圖中之斜率 (2) 反應級數 : 反應級數 (order) 與反應物的種類有關例 Zero order kinetics: 反應速率與反應濃度無關 v = k First order kinetics: A P v = k [A] Second order kinetics: A+B P v = k [A][B]

11 參閱課本 P.5-15

12 穩定狀態的酵素動力學 (Steady-state enzyme kinetics) 麥氏方程式 (Michaelis-Menten Equation) 酵素 (E) 與基質 (S) 作用產生產物 (P), 以 ES complex 為中間產物 k1 E + S ES E + P k2 其中 k1, k2, k3, k4 為各反應之反應速率常數 ; 則 k 1 [E][S]+ k 4 [E][P] = k 2 [ES]+ k 3 [ES] =(k 2 + k 3 )[ES] k3 k4

13 M-M Equation ( 續上 ) 反應初期時 : [P] = 0; 則 k 1 [E][S] = (k 2 + k 3 )[ES] 移項得 [E]/ [ES] = (k 2 + k 3 )/ k 1 [S], 令 Km = (k 2 + k 3 )/ k 1 ; 則 [E]/ [ES]= Km/ [S] Km 稱為 Michaelis-Menten 常數 ( 單位 mole/l 或 M) i. 若 [E 0 ] 為酵素總量, [E] 為自由態酵素, [ES] 為酵素 - 基質複合體 ; 則 [E 0 ] = [E] + [ES] ii. 將 [E] = [E 0 ]-[ES] 代入方程式 [E]/ [ES]= Km/ [S] 中, 移項得 : [ES] = [E 0 ] [S] / {[S] + (k 2 + k 3 )/ k 1 } iii. 又 P 生成速率 (v) 與 [ES] 成正比, v = k 3 [ES]. iv. 將 [ES]= v/ k 3 代入方程式 [ES] = [E 0 ] [S] / {[S] + (k 2 + k 3 )/ k 1 } 中, 可得 V = k 3 [E 0 ] [S] / {[S] + Km} v. 當基質濃度極高時, 反應最大速率 Vmax = k 3 [E 0 ] 代入 V = k 3 [E 0 ] [S] /{[S] + Km} 中可得 : V = Vmax[S] / {[S] + Km} 參閱 p.5-13~5-15

14 斜率 : Km/V max 縱軸截距 : 1/V max 橫軸截距 : -1/K m 參閱圗 5-3

15 * 酵素活性的抑制作用 (1) 競爭型抑制作用 (Competitive Inhibition) 競爭型抑制劑與基質 (S) 構造相近, 能和以基質競爭酵素的活化部位基質濃度增至極大時, 仍可以達到 V max K EI E + I EI E +P 其中 I 為抑制劑, K IE 為抑制劑 - 酵素解離常數當 [I] 增加時, Km 變大, Vmax 不變 1/v Lineweaver-Burk 圖 [I] 3 [I]2 [I] 1 E S I 濃度 : [I] 3 >[I] 2 >[I] 1 0 1/[s]

16 (2) 非競爭型抑制作用 (Noncompetitive Inhibition) 非競爭型抑制劑與基質 (S) 構造不同, 故和基質沒有競爭反應此抑制劑結合 E 和 S 結合部位以外之部位, 而對酵素產生抑制作用 K ESI ES +I ESI EI +P 當 [I] 增加時, Vmax 變小, Km 不變 Lineweaver-Burk 圖 I 1/v [I] 3 [I] 2 [I] 1 E S 濃度 : [I] 3 >[I] 2 >[I] 1 0 1/[s]

17 (3) 反競爭型抑制 (Uncompetitive Inhibition) 反競爭型抑制劑僅能與 ES complex 結合, 使產物無法生成 K ESI ES + I ESI EI +P 其中 I 為抑制劑 K IES 為抑制劑 - 酵素 - 基質解離常數當 [S] 增加時, Km 和 Vmax 減少 1/v Lineweaver-Burk 圖 [I] 3 [I] 2 I E [I] 1 E S 參閱課本 p.5-17~5-19 P 0 濃度 : [I] 3 >[I] 2 >[I] 1 1/[s]

18 * 不同類型之酵素抑制作用之特徵抑制作用類型抑制結合對象 V max Km 不同抑制劑濃度所得之 1/v 對 1/[S] 圖形競爭型 E 不變變大在縱軸相交於一點 (Competitive) 非競爭型 E 和 ES 變小不變在橫軸相交於一點 (Noncompetitive) 反競爭型 ES 變小變小互相平行 (Uncompetitive)

19 影響酵素反應速率的因子 ( 續後 ) 1. 溫度 (temperature) 酵素最適作用溫度 : 30~40 o C 高溫 (45 o C) 以上時變性而破壞 (denaturation) 低溫時失去活性 (deactivation) 2. ph 最適 ph 值 : 4.0~ 穩定化因子 (stabilizer) 電解質與離子強度陰離子較陽離子無專一性 K + Mg 2+ Co 2+ Mn 2+ Zn 2+ Fe 2+ 等金屬離子對酵素之活性具有活化或熱穩定之作用與金屬之種類濃度及酵素種類, 均有相關性重金屬離子 ( 如 : Hg +2, Pb +2, Ag + ) 抑制酵素活性

20 ( 續後 ) 4. 酵素的活性中心 (Active center of enzyme) 酵素的活性中心對於催化作用扮演重要角色其與基質結合後先形成非共價鍵結中間產物, 再分解斷裂成最終產物常見的胺基酸殘基有絲胺酸半胱胺酸離胺酸或組胺酸等 5. 其他因子水活性與水分含量水活性 0.8~0.99 之間酵素反應達到最高抑制作用 : 水分含量低於 13% 以下剪斷力和壓力剪斷力 (Shearing force): 當 Shear value >10 4 /sec 時, 開始不活化 ; 當 >10 7 時,50% 的酵素因變性而失去活性高壓下可使酵素失去活性

21 放射線酵素種類 : 觸媒 catalase 的抗力 >> 羧基胜肽酶 carboxypeptidase 水份 :20~30% 破壞最多 ; 乾燥可降低破壞溫度 : 愈高愈易受傷害氧 : 愈高愈易受傷害界面蛋白質存在於介面時, 由於表面張力作用的結果, 常使部分蛋白質二三四級結構被拆開, 使蛋白質之次單位 (subunits) 分散於介面上, 酵素失去活性

22 酵素的分離與純化胞外酵素 : 利用高速離心分離胞內酵素 : 細胞破碎真空濃縮膜過濾提高濃度或交聯葡萄聚糖凝膠 (Sephadex) 聚丙烯醯胺凝膠 (Polyacrylamide gel) 與親合性層析法 (Affinity chromatograpgy) 等管柱層析法, 進行溶析 (elution) 分離

23 *1. 凝乳酶 (Rennet) 食品加工上常用的酵素食品工業使用量最多, 用於牛乳凝乳乾酪之生產原來自小牛胃部現多利用基因工程, 由酵母菌 Kluyveromyces lactis 生產酪蛋白 (casein) 為乳蛋白之主要成分, 主含 s 等類型凝乳酶的作用為將 - 酪蛋白水解形成副 - 酪蛋白 (para- -casein), 並釋出含糖部分之親水性胜肽 (glycomacropeptide), 因副 - 酪蛋白具有疏水性, 與鈣結合成副 - 酪蛋白鈣, 使酪蛋白膠粒形成凝聚而產生凝乳 ( 見圖 5-9)

24 *2. 果膠酶 (Pectinase) 果膠質是一種異質多醣類 (heteropolysaccharides), 是高等陸生植物之中膠層及初級細胞壁之主要構成物質聚合程度及酯化程度的改變, 會改變追熟採收後處理及加工過程蔬果之質地, 例如 : 葡萄綠豆芽敏豆莢等蔬果經中溫 (50~70 ) 預熱後再高溫烹煮時, 其組織硬度比直接烹煮者高, 這是因為中溫預煮提高了果膠酯酶的活性, 使得果膠分子上的甲酯基水解成自由 COOH 基, 而由內在的鈣離子形成架橋結構所致在天然植物中, 其活性以莖部頂端最低, 而往底端方向遞增, 根部最高食品加工所需的果膠酵素大多數以黴菌來生產, 主要適用於果汁萃取及澄清化果膠酶可分為 : (1) 果膠脂酶 ;(2) 聚半乳糖醛酸酶 ;(3) 果膠裂解酶

25 *3. 細胞自溶酶 (Cathepsins): 是一群存在於動物細胞溶酶體 (lysosome) 內的蛋白質水解酵素, 在低 ph 值下具高活性, 最適 ph 值為 2.5~4.5 與其它蛋白酶, 如胰蛋白酶凝乳蛋白酶等胞外酵素之不同處, 在於其存在於胞內已知有超過五種組織蛋白酶被發現, 且命名為細胞自溶酶 A B C D E 與肉品的熟成有關動物於死後之組織中 ph 值下降時, 由肌肉細胞之溶酶體中釋放出這些蛋白酶滲入組織而使肌原纖維斷裂

26 *4. 多酚氧化酶 (Polyphenol oxidase, PPO) 此酵素之基質為二酚化合物 (diphenols) 在完整蔬果細胞中酚類化合物與酚酶是隔開存在, 因此不發生褐變反應, 若以刀切水果或蔬菜, 如蘋果香蕉馬鈴薯等, 被切表面細胞破裂, 酚酶與酚類化合物接觸, 並暴露於空氣中, 則經由酚酶之作用, 酚類化合物會轉變成鄰苯二酮 (ortho-quinone), 在迅速聚合成褐色素或黑色素 (melanin), 而造成酵素性褐變酚酶以銅離子為輔基 (prosthetic group), 當氧與銅離子存在時, 如果植物組織受傷, 褐變反應即開始

27 5. 過氧化酶 (Peroxidase) 與蔬果殺青 (blanching) 之關係 : 過氧化酶廣泛存在於植物組織中, 且耐熱性極強, 以熱處理時, 如果過氧化酶活性消失, 則其它酵素必大部分已被破壞 ; 又因其測定法靈敏度極高, 且呈色反應容易進行, 因此長久以來被做為植物性食品殺青是否適宜的指標 6. 超氧岐化酶 (Superoxide dismutase, SOD) : 此酵素之名稱暗示它可催化超氧化物之歧化反應 : O 2 - +HO 2 3 O 2 +H 2 O 2 雖其產生之氧以基態存在, 但同時也產生具潛在破壞性之過氧化氫此酵素以取得專利在食品中當抗氧化劑使用, 但必須同時使用觸酶以破壞所產生之過氧化氫, 才會更有效此酵素少量存在於大部分組織中, 由於來源不同,SOD 之活性部位可能包含有 Fe Mn Cu Zn 等

28 7. 麩胱甘肽過氧化酶 (Glutathione peroxidase) 此酵素可藉由還原態之麩胱甘肽 (GSH) 來還原過氧化物 : 2GSH+ROOH ROH+H 2 O+GSSG 雖然在生物體中可破壞過氧化物, 但在食品中是否可當作抗氧化劑, 則尚不明確 8. 胰蛋白酶抑制因子 ( 劑 ) (Trypsin inhibitor): 豆科植物種子及葉子含有能在體內抑制酵素活性的蛋白質, 而減低攝入蛋白質的消化率及營養價值胰蛋白抑制劑及胰凝乳蛋白酶抑制劑廣泛的存在於所有豆科植物, 如 : 黃豆等, 它們可造成胰液分泌過多, 抑制消化道中酵素的活性, 使動物無法完全吸收養分, 造成某些動物生長遲緩排泄物中若檢出有抑制劑與胰蛋白酶的複合物, 則可能有嚴重的含硫胺基酸流失

29 固定化酵素 (Immobilized enzymes) 以物理或化學方法限制酵素的移動, 酵素於作用完畢後, 可與產物分離後再度利用方法有 : 吸附法包埋法共價鍵法與交聯鍵結法優點 : 酵素再利用, 大幅降低成本增加連續式操作工程的多變性可使多種不同酵素反應槽串連成連續式反應系統提高酵素 ( 三級結構 ) 或細胞之穩定性缺點 : 不一定適用於每一種基質有毒性化學物質殘留連續式操作時, 可能受微生物污染而污染食品酵素固定化後之性質可能與原來酵素不同, 進而影響操作

30 酵素固定化的方法 ( 參閱圖 5-21) 方法原理優點缺點吸附法物理 ( 凡得瓦爾力 ): 玻璃活性炭矽膠離子 ( 靜電引力 ): DEAE- 纖維素離子交換樹脂包埋法酵素固定於高分子聚合物膠體 ( 如 : 聚丙烯醯胺澱粉纖維三醋酸酯 ) 中共價鍵結法交聯鍵結法酵素與載體藉由試劑將兩者共價結合利用 : 醯化烷基化異氰酸或重氮鹽等連結酵素官能基 ( 胺基羧基酚基及羥基等 ) 戊二醛之雙醛官能基聯結酵素分子與分子間形成聚合分子不會破壞酵素活性酵素活性破壞小結合力強穩定度高酵素不易脫落酵素吸附於不溶性載體, 穩定度高吸附力弱, 容易造成酵素脫落使活性喪失 ( 吸附力 : 離子鍵 > 凡得瓦爾力 ) 酵素易脫落可能會造成部分酵素活性的破壞損失可能會造成部分酵素活性的破壞損失

31 酵素穩定性的改良 (1) 添加酵素穩定劑保護劑 : 蛋白質中性鹽類醣類或多醇類輔助因子 ( 重金屬界面酵素抑制劑會降低穩定性 ) 還原劑 (2) 化學修飾與酵素固定法化學修試劑單一官能基修飾 : 改變酵素表面電荷雙官能基修飾 : 分子內交互鍵結水溶性聚合物聯結酵素固定法 : 多點吸附法 ( 見圖 5-23) (3) 新菌種之開發與基因工程篩選與菌種突變選擇並轉殖優良的酵素基因, 使其於微生物或細胞體內表現與生產定位突變 (site-directed mutagenesis)

蔬菜有機栽培

蔬菜有機栽培 1 2 (1) (2) (3) (4) (ph ) ph 5.5~7.0 (ph 6.0 ) (ph 7.5 ) 8.0 a. ( ) b. ( ) c. 3 (