流式细胞仪的种类

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1 张新梅 流式细胞仪原理及样本制备

2 流式细胞仪的种类

3 流式细胞仪原理 样本处理

4 流式细胞仪可以检测什么? 藻类细胞 染色体 血细胞 原生动物细胞

5 流式细胞仪如何了解细胞? 分析细胞 多种荧光素标记细胞 高灵敏度快速检测

6 流式细胞仪如何得到细胞? 分选细胞 从复杂的细胞群体中得到高纯度的靶细胞, 进一步深入研究 Laser beam

7 流式细胞仪可告诉我们一个细胞的什么指标? 散射光信号 细胞的相对大小 ( 前向角散射光信号,FSC) 细胞的相对颗粒性及内部结构的复杂性 ( 侧向散射光信号,SSC) 荧光信号 相关的荧光强度

8 散射光信号的特征 FSC 和 SSC SSC 当颗粒通过聚集的激光束时, 激光向各个方向散射 与激光束方向同轴的称前向角散射光信号 (FSC ) 与激光束垂直的称为侧向角散色光信号 (SSC ) 488nm 激光激发产生散射光

9 散射光信号的特征

10 前向角散射光信号 FSC BD Technologies

11 侧向角散射光信号 SSC

12 散射光信号的特征 可将细胞初步分群

13 荧光信号的特征 当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光束时, 染料吸收光子跃迁到高能级, 返回基态时, 染料释放出能量, 大部分以光的形式释放 这种发射出的光称为荧光

14 荧光信号的特征 发射光的荧光强度与结合的位点成正比

15 直方图显示荧光信号

16 点图显示荧光信号

17 荧光信号特征 多色标记

18 Size

19

20 荧光信号特征 多色标记时荧光信号之间会相互干扰 解决办法 荧光补偿 多激光激发

21 仪器检测条件 信号放大 ( 电压调整 ) PMT 将光信号转换成电信号, 调整 PMT 的信号, 信号强度将随之改变 阈值 信号放大过程会产生不需要的脉冲信号, 通常来自于碎片 通过设定某一信号的最低强度值, 可将不需要的脉冲信号去除, 这一设定值称为阈值

22 仪器检测条件 荧光补偿 采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差 在完成双色以上荧光标记的样本时, 都需要作颜色补偿

23 流式细胞仪的特征 灵敏度高 速度快 多参数分析 ( 可同时标记多种荧光素 ) 单细胞水平上分析 可分析大量细胞 需要样本量少 出结果快 标本来源广 : 全血样本 骨髓 组织 培养细胞 穿刺物 胸水 腹水 灌洗液 脑脊液 眼泪 乳汁 血清 / 血浆 细胞裂解液

24 BD FACSCalibur 流式细胞仪 两激光配置 488nm 633nm 检测参数 四荧光参数 两个散射光参数 分析型流式细胞仪 应用 细胞分析检测

25 BD FACSAria 流式细胞仪

26 BD FACSAria 流式细胞仪 高速分析分选流式细胞仪 高速分析 高速分选 3 根激光 488nm 633nm 375nm 结合特制高性能石英杯流动室 应用 细胞分析分选 SP 细胞检测

27 FACSAria 激光配置及常用荧光染料

28 FACSAria SP 细胞检测

29 FACSAria 流式细胞仪分选系统

30 高速分选原理 分选时, 液流在驱动力的作用下断成高度均一的液滴 在喷嘴下的几毫米处, 液滴从液流断开 从颗粒被检测到液滴断开的时间由 Accudrop 技术直接计算 符合分选条件的颗粒一旦被检测到, 包含该颗粒的液滴将要从液流断开时, 液流被充电 断开后的液滴仍然带电, 带电的液滴通过被充电的偏转板 受静电吸引或排斥, 带电液滴将向左或右偏转 未带电的液滴不偏转而流入废液槽

31 高速分选原理 激光激发, 细胞被检测 液滴延迟计算 含目的细胞的液滴充电, 偏转

32

33 分选模式 Purity Yield Single Cell Initial Fine Tune

34 多样化分选 1-4 路分选 分选收集装置 微管 12 75mm 管 15mL 管 微孔板分选 : 微孔板 载玻片 FACSAria 细胞收集装置的防污染设计

35 四路分选 99% 100% 99.8% 100%

36 微孔板分选 可用 24/96/384/1500 孔板进行微孔分选

37 检测指标 阳性百分率 绝对计数 平均荧光强度

38 流式细胞仪样本准备

39 流式细胞仪结果保证 仪器质量控制 仪器保养 仪器校准 样本制备 样本处理 试剂选择 数据分析

40 样本处理 流式细胞仪分析和分选细胞时, 有些问题的出现与仪器没有关系, 而与样本制备如蛋白浓度 缓冲液 细胞条件 活性 自发荧光及试剂选择有关

41 样本制备 标本来源 : 外周血 骨髓 培养细胞 穿刺物 组织 血清 血浆 细胞裂解液 标本浓度 : 约 10 6 /ml(facscalibur), /ml(facsaria) 具体样本染色, 请参考试剂说明书 检测样本不可有聚集团块

42 样本保存 短期保存 (<1 小时 ), 所有样本放于室温 ( C ) 长期保存, 血液和骨髓样本应放于室温, 如果可能, 严格控制在 16 0 C

43 样本保存 样本保存的时间, 与样本的性质及保存条件有关 肝素钠抗凝的外周血和骨髓, 可保存 小时 EDTA 抗凝的外周血和骨髓, 可保存 小时 ( 对髓系细胞的影响 ) 单纯标记胞内抗原, 固定细胞后可长期保存 但与检测的抗原及染色方法有极大关系 所以需要新鲜样本验证

44 样本处理 鞘液与样本缓冲液 如果鞘液与样本缓冲液折射系数不同就会影响颗粒散射光的检测 所以分析或分选细胞时, 样本缓冲液要尽量与鞘液相同, 这样可以提高分辨率, 如果确实需要蛋白以保证细胞的存活, 将蛋白浓度降至允许的最低

45 样本处理 自发荧光和高背景 细胞内同工酶 :NADH 黄素 未结合抗体 培养基酚红 台盼蓝复染可降低自发荧光, 但不能同时使用发红色荧光的染料 红色激光激发染料可降低自发荧光

46 样本处理 如果待测样本中死细胞太多, 结果就难解释 因为细胞膜被破坏的细胞会非特异吸附单克隆抗体 在活性比较差的样本中找不到目的细胞, 未必可解释为阴性结果 细胞的活性可在流式细胞仪上同时检测, 或用手工的方法检测 流式方法 :PI 7AAD EMA 手工方法 : 台盼蓝染色 选择合适的荧光染料可同时检测细胞表面标志和细胞活性, 适用于待测标本中死亡细胞过多 FITC PE 7AAD 如果染色后再固定, 固定前要洗去未结合的 7-AAD 如果固定 12 小时后才检测, 推荐 EMA

47 细胞活性对结果的影响

48 细胞活性对结果的影响

49 样本处理 单细胞悬液的制备 血液样本 凝块或团块状样本 组织

50 血液样本 全血样本的制备 : 处理过程可能导致目的细胞的丢失, 强烈推荐流式细胞仪分析的样本尽可能与处理之前的样本接近

51 血液样本 溶解红细胞 : 对标本影响最小的方法 可在单抗标记之前 之后进行 如果先溶血再标记, 需要注意的是 : 抗原性不受溶血素的影响 彻底去除溶血素, 细胞充分洗涤, 抗体结合不受影响 所用的溶血素不含固定剂, 因为固定剂会改变细胞的活力, 从而影响表面标记的结果 溶血素选择标准 仅溶解成熟红细胞 对标本中其他细胞影响最低

52 血液样本 PBMC 密度梯度离心 可去除标本中的死细胞 可能造成重要细胞群体的选择性丢失

53 凝块或团块样本 样本中有凝块或团块 50um 的网过滤 细胞计数及涂片

54 组织 获得单细胞并保证得率及细胞结构和抗原的完整性 机械法 : 温和 酶消化法 : 细胞之间粘附牢固或组织干扰细胞分离 避免破坏抗原分子及细胞活力

55 细胞悬液的评价 细胞形态与制备前一致, 目的细胞未丢失 抗体标记时合适的细胞浓度 按照厂家推荐, 抗体 / 细胞比例不可改变太多 标本之间细胞系的比例不同, 仅调整细胞总数, 不一定合适 ; 如果用户自己做调整, 需要测试是否合适

56 细胞悬液的评价 形态学评价 首先要保证所取样本具有代表性 细胞处理步骤越多, 细胞丢失的危险性越大 样本进行多步处理时, 建议在每一步处理后都检查一下细胞成分

57 样本处理 细胞染色 细胞表面染色 胞内抗原染色 同时标记胞膜和胞内抗原 单色标记 多色标记

58 细胞染色 细胞表面标记 表面抗原也可能表达于细胞内 染色细胞表面标记的细胞一定是活的未标记细胞

59 细胞染色 细胞表面标记 去除亲细胞抗体 : 可采用洗涤白细胞的方法, 或在不含离子的缓冲液中 37C 孵育 1 小时, 可有效去除亲细胞抗体 Fc 受体 : 可以加外源性免疫球蛋白阻断或采用同型对照

60 细胞染色 细胞内抗原标记 对细胞打孔, 使单抗可以进入细胞内, 同时又不破坏细胞结构的完整性 一般来说, 进行胞内抗原染色时不能同时检测细胞的活性, 除非用 EMA 标记 有时, 仅仅确定标本中有没有表达某一抗原标志是不够的, 还要确认该抗原是表达在膜上还是胞浆内 检测同一标本的胞膜和胞浆抗原要分开进行

61 细胞染色 同时检测胞膜和胞内抗原 对表面标志 胞内抗原 DNA 含量可任意组合同时分析 一般而言, 染色步骤是 : 细胞表面标志 -- 固定 -- 细胞打孔 -- 胞内抗原 --DNA 含量 需要认识到的是, 用于固定和打孔试剂的多重影响, 有些条件适合某一参数而对别的参数可能非常不合适 每一步荧光染料的选择与抗体的选择一样重要 对细胞表面标记来说, 一种荧光染料一定不能被随后的打孔方法或试剂所影响 对胞内抗原检测来讲, 荧光素分子要足够小, 可以穿透打孔后的细胞

62 细胞染色 单色标记 复杂的样本, 单色标记不是首选 间接标记时, 可选择单色标记

63 细胞染色 多色标记 考虑荧光信号之间的干扰 颜色补偿, 补偿微球调整 一些联合使用的抗体会彼此阻碍与各自抗原的结合, 比如通过空间位阻 因此, 抗体组合使用前要与单色抗体标记的结果做比较

64 上样前准备 需要准备什么样的上样管? 同型对照管 补偿管 ( 多色标记时 ) 检测管

65 上样前准备 对照管 空白对照 同型对照 Fc 受体的存在 亚型相同 来源相同 荧光标记相同 与检测样本无特异结合

66 上样前准备 对照管

67 上样前准备 补偿管

68 上样前准备 补偿管 校正荧光信号之间叠加干扰造成的误差 单标记的阳性样本

69 上样前准备 补偿管 - 单标记阳性的样本存在的问题 检测样本不一定标记阳性 检测样本比较珍贵 标记后样本不能存放

70 上样前准备 Comp Beads( 补偿微球 ) 多色分析时用于调整荧光补偿 聚苯乙烯微球 阳性微球 : 根据种类不同, 与小鼠 大鼠免疫球蛋白 κ 链结合 阴性对照微球, 不与免疫球蛋白结合 荧光抗体大部分是小鼠 / 大鼠源性免疫球蛋白, 可直接与 BD Comp beads 结合 BD Comp beads 与荧光抗体混合后, 显示为清晰的阳性群和阴性群, 据此可以调节补偿

71 上样前准备 Comp Beads CD3 CD3 细胞上的抗原与荧光抗体特异结合 T 微球与免疫球蛋白 k 链结合

72 上样前准备 Comp Beads 优点 微球结合的荧光抗体与试验中检测的荧光抗体相同, 补偿更准确 对复合染料如 PE-CY5 PE-CY7 APC-CY7 等尤其有用 荧光信号 BD Comp Beads, 与抗体 100% 结合, 产生信号强 细胞信号可能弱, 补偿不准确 节省样本 Comp Beads 与荧光抗体结合后, 可稳定保持 3 周 多色补偿必需

73 样本处理 样本保存 单细胞悬液制备 细胞染色 上样管准备

74 谢谢

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