杜春玲等流式细胞磁珠微阵列法检测血清中细胞因子水平在稳定期和急性加重期哮喘中的意义 %)+9$2$9 "!3!$ '3% % ' ' '''0' 002!32$9! %!$% 3% " 3$%%$%!$!,3 $$"%! $%3 $9! #"! 3% %3%#%' 5%#%'0' 5%#%'

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属斯司公孙
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1 复旦学报医学版流式细胞磁珠微阵列法检测血清中细胞因子水平在稳定期和急性加重期哮喘中的意义杜春玲徐侃闵智慧苏孝琼董年白丰玺陈智鸿复旦大学附属中山医院呼吸科上海复旦大学附属中山医院青浦分院呼吸科上海复旦大学附属中山医院老年科实验研究中心上海摘要目的探讨流式细胞磁珠微阵列法 $$! )+ 检测血清中细胞因子水平在稳定期和急性加重期哮喘中的意义方法纳入慢性持续期哮喘例急性发作期哮喘例健康人例抽取外周血采用 +) 法检测外周血清中细胞因子水平并分析各细胞因子特征及与临床数据的相关性全自动血细胞及生化仪检测血常规反应蛋白和降钙素原结果定制含种细胞因子微球分别为 ' ' '''*0' 0 的 )+ 试剂盒与健康人相比种细胞因子在慢性持续期哮喘无明显改变急性发作期哮喘细胞因子升高分为种亚群分别为 ' 升高型 5'*0' 双高型 5 ' 升高型 5' 升高型占 5 及细胞因子正常型占 5 其中 '*0' 明显升高较健康人分别升高了倍和倍 ' 升高型 '*0' 升高型与白细胞及反应蛋白呈正相关结论 )+ 法可快速检测哮喘血清标本的多种细胞因子水平细胞因子在慢性持续期无明显升高但 '*0' ) 和.- 的综合指标有助于判断由细菌感染诱发的急性加重并快速指导抗生素的使用关键词细胞因子哮喘流式细胞磁珠微阵列法中图分类号. 文献标识码 +!! ',$$!,! $ 9! 4 %' # 8 7 0/%'% 8'6# )+#',&0/%'%# $!"# $#% $&' $! # ## $!3 '/ #"# $# % $&' $! # ## ) $ $ # "# $#% $&' $! # ## % & '* $$$9!!2 %!$%$$ $$! $% )+$ % $!$!2$9! #"$% $$$ $%!$%$$2!$% %$%!$!3+ $ $23!32 %!$! 2!#$9! )+ $$% % $!$! $ 3$%$. # $!$ $"$ " $3! 2 $ $ 国家自然科学基金!"#$% &'%%$

2 杜春玲等流式细胞磁珠微阵列法检测血清中细胞因子水平在稳定期和急性加重期哮喘中的意义 %)+9$2$9 "!3!$ '3% % ' ' '''*0' 002!32$9! %!$% 3% " 3$%%$%!$!,3 $$"%! $%3 $9! #"! 3% %3%#%' 5%#%'*0' 5%#%' 5%#%' 5 $9 5 *%!2' *0'! 2! 2!!"$ " 3$%%$%! $!,#%',#%'*0'3"!$ $ 3$% ).- )+ 3! 3 $ $$ $'$9!!$%!!%$$ 02!32$9! %!$%,3$%!"2 $9 "'*0' ).-%"2 $ $2 $% $$! $# """$ $ $ $% " "$9!$% $$! $% "" +. $ 1/ /113 哮喘是气道对无害化过敏原的过度反应 4 * 淋巴细胞分化失衡 *%*% 是大部分哮喘患者气道炎症持续存在的主要原因但临床中的哮喘又非常复杂如非过敏性哮喘晚发型哮喘哮喘伴有慢阻肺肥胖型哮喘等即哮喘的致病过程除了传统的 * 淋巴细胞比例失衡还可能有多种炎性细胞如嗜酸性细胞肥大细胞中性粒细胞等参与细胞因子是联系各种细胞间的信号分子包括免疫细胞间免疫细胞和结构细胞间因此细胞因子水平在哮喘致病机制与临床特征的相关性临床应用价值等方面备受关注尽管气道肺局部的细胞因子最为准确如气道黏膜活检支气管肺泡灌洗等但哮喘为良性疾病患者多不愿接受有创检查所以通过外周血清血浆或外周血单个核细胞来反应细胞因子水平比较常用但国际上对其利用价值尚存在争议我们采用流式细胞磁珠微阵列法 $$! )+ 检测稳定期哮喘和急性发作期哮喘外周血清中细胞因子水平试图分析细胞因子在各期哮喘中的特征并结合临床数据进行相关性分析资料和方法研究对象第一部分研究对象为年月至月期间在复旦大学附属中山医院门诊就诊的稳定期哮喘患者纳入标准需符合年全球哮喘防治创议 1$$ 2 +!$% 1 0+ 的诊断标准年龄岁轻度持续和中度持续支气管哮喘患者排除标准慢性阻塞性肺疾病社区获得性肺炎支气管扩张肺结核严重的慢性心脏肝肾病糖尿病结缔组织病妊娠等共入选轻度持续性哮喘患者例中度持续性哮喘患者例健康人例第二部分研究对象为年月至年月期间在复旦大学附属中山医院门急诊就诊的急性发作期哮喘患者纳入标准年龄岁符合年 1 0+ 关于哮喘急性发作的诊断标准包括气喘咳嗽或胸闷症状突然发生或原有症状急剧加重常有呼吸困难以呼气流量降低为特征排除标准稳定期哮喘哮喘患者由于其他疾病导致的呼吸困难如急性社区获得性肺炎肺栓塞气胸伴有严重的的慢性心脏肝肾病糖尿病结缔组织病等共纳入急性发作期哮喘例健康人例该临床研究通过复旦大学附属中山医院伦理委员会批准批准号为 + 实施时均告知患者研究目的获益和潜在风险并签署知情同意书主要试剂和仪器 )+ 人可溶性蛋白主缓冲试剂盒美国 )4 公司主要包含检测稀释液捕获微球稀释液检测稀释液血清的捕获稀释液清洗缓冲液标准微球 + 标准微球 + 标准微球标准微球 -& 标记的标准微球 -& 标记阳性对照流式检测仪器为 + 美国 )4 )!! 公司 )+

3 复旦学报医学版年月分析软件为 +-+ (! 血常规采用! 全自动血液分析仪 8& 反应蛋白和降钙素原 " $-* 采用日立全自动生化分析仪日立检测实验方法 )+ 试剂盒细胞因子标准曲线制备将细胞因子标准品 "# 置于离心管中标记个流式管分别为检测稀释液为阴性对照以上每管先加入检测稀释液从原液管开始对倍稀释即从原液管中吸到管中混匀再从管中吸加入管以此类推混合的捕获微球制备每种捕获微球取出根据要检测总样本数每种捕获微球吸取的体积为样本数混合种捕获微球 # 离心弃上清重悬于血清增强液中避光室温静置上述每管中加入混合的捕获微球室温孵育 % 再加入 -& 标记的检测抗体室温孵育 % 加入清洗缓冲液 # 离心吸去上清加入清洗缓冲液重悬留待上机检测 )+ 试剂盒血清样本中种细胞因子浓度的检测加入待测样品到流式管中如上述步骤制备种捕获微球的混合液每管加入混合的捕获微球轻轻吹打室温孵育 % 加入混合后的 -& 标记检测抗体轻轻吹打室温孵育 % 加入清洗缓冲液 # 离心弃上清加入清洗缓冲液重悬留待上机检测全血及血清生化指标检测每例患者抽取血液其中为 &4*+ 抗凝血经! 流水线通过 8& 全自动血液分析仪得到全血细胞各种数据另离心得到上清留取做 )+ 检测其余经德赛诊断试剂盒并经日立全自动生化仪检测反应蛋白经罗氏诊断试剂盒并经! 全自动生化免疫分析仪检测降钙素原统计学方法各组数据以 $ 表示对总体均数的估计采用 5 可信区间采用 - 软件进行统计学分析当方差齐性时用成组检验当组及以上连续性变量检测时先采用 ' +0 (+ 进行检验再用 07'6 检验进行两两比较并进行相关性分析为差异有统计学意义结果人口学资料本研究共纳入稳定期哮喘患者共例其中轻度持续哮喘例中持续哮喘例平均年龄为岁男女比例为健康人例平均年龄为岁男女比例为研究纳入的哮喘急性发作期患者为例平均年龄为岁男女比例为健康对照同前稳定期哮喘患者血清中细胞因子水平本研究共定制了种细胞因子检测微球分别为 ' ''''*0' 和 0 其中 ' 主要为单核细胞和巨噬细胞分泌在急性感染或组织损伤时大量释放 *0' 为细胞毒素在感染休克或肿瘤性疾病中升高本研究中稳定期哮喘患者轻度持续中度持续血清中 ' 水平分别为 "# "# $ 健康人 *0' 分别为轻度持续中度持续 "# "# $ 健康人 ' ' 主要为 *% 型淋巴细胞分泌与过敏性哮喘发病密切相关通过检测发现稳定期哮喘与健康人比较无显著差异其中 ' 血清浓度在轻中度持续性哮喘分别为 "# 和 "# $ 健康人 ' 血清浓度在轻中度持续性哮喘分别为 "# 和 "# $ 健康人 ' 和 0 是胞外菌感染时释放的细胞因子在迟发型免疫反应中可进一步趋化单核细胞和吞噬细胞到炎症部位稳定期哮喘血清中 ' 水平分别为 "# 和 "# $ 健康人 0' 水平分别为 "# 和 "# $ 健康人 ' 为抑制性细胞因子本研究中稳定期哮喘血清 ' 水平与健康人无明显差异在轻中度持续性哮喘中分别为 "# "# $ 健康人表说明检测稳定期哮喘外周血中细胞因子水平不能反应气道炎症的类型和严重程度

4 杜春玲等流式细胞磁珠微阵列法检测血清中细胞因子水平在稳定期和急性加重期哮喘中的意义表 1 稳定期哮喘患者血清中细胞因子水平 1+!!!! "# $9!,$%!$! +!$% "!!$ $ +!$% $ "!!$ $ *0' 0 哮喘急性发作期血清中细胞因子水平变化共纳入哮喘急性发作期患者例根据年 1 0+ 的诊断标准和中国支气管哮喘防治指南判断急性发作的严重程度其中轻度急性发作例中度急性发作例重度急性发作例每例患者抽取外周血血清保存于 ; 冰箱待统一检测若不对患者进行细分计算所有急性发作哮喘患者外周血中细胞因子平均水平发现仅 ' 和 *0' 明显升高分别为 "# $ 健康人和 "# $ 健康人其数据变异度也较大其余细胞因子水平与健康人无明显差异图仔细分析原始数据发现急性发作期哮喘细胞因子升高的模式不尽相同若定义急性期细胞因子的绝对值较健康人升高倍及以上为明显增高可将患者分为种细胞因子亚群分别为 ' 升高型例 5 '*0' 双高型例 5' 升高型例 5' 升高型例 5 细胞因子正常型例 5 哮喘急性发作期患者其细胞因子型与临床特征的关系对稳定期哮喘血清中细胞因子水平的筛查发现稳定期炎症聚集在气道局部全身细胞因子水平不高基本与健康人相似而哮喘急性发作期发现了种类型的细胞因子群且 ' 升高型和 '*0' 升高型细胞因子水平大幅度升高 ' 升高倍较基线水平 *0' 升高倍较基线水平而 ' 升高型和 ' 升高型轻度升高其中 ' 升高倍较基线水平 " 3$%%$%!$! 图 1 4% 法检测哮喘急性发作期和健康人血清中细胞因子水平.,1+! $9!'! 4%! ' 升高倍较基线水平图哮喘急性发作诱发因素较多如感染过敏原冷空气药物等临床上通常采用症状外周血白细胞.- 及降钙素原 -* 等来判断是否由感染诱发我们发现 ' 升高型 '*0' 升高型与白细胞升高及.- 升高相关性较好两型白细胞总数均值为两者的相关系数而.- 均值为 # 两者的相关系数细胞因子与 -* 未见明显相关性表图说明 ' 或 *0' 可反映机体急性感染的状况而 ' 升高型 ' 升高型及细胞因子正常型的外周血白细胞及.- 均无明显升高经统计分析无相关性图说明这群患者的哮喘急性发作并非感染诱发

5 复旦学报!医学版"!!"#$ 年 # 月# %&! #"! "& 2 +#Q' $ ; 6 7?3"> + 6 3#!#"!#". "#$!!"!#". "*.!!01:4$ < 图 G!<R7 法检测哮喘急性期血清中细胞因子水平并划分亚群 F #, "*2 (" 6( 1, *3) 0 "? # % 1 (6 ",7$' ( 0.3'31 ' ( *, 1!-/<R "! DG!C*-D /

6 杜春玲等流式细胞磁珠微阵列法检测血清中细胞因子水平在稳定期和急性加重期哮喘中的意义表 / 哮喘急性发作期细胞因子类型划分及其临床特征 /,%! " * " ' "# *0' "# ' "# ' "# ) &!5.- # -* #,#%',#%'*0',#%',#%' 0$9! " 3$%%$%! $! 图各细胞因子与白细胞反应蛋白及降钙素原的相关性., $ $ " 4 (( 讨论气道慢性炎症是所有类型哮喘的共同特征也是其临床症状和气道高反应性的基础已知各种炎性细胞包括 * 淋巴细胞嗜酸性细胞肥大细胞嗜碱性细胞中性粒细胞和单核细胞等均参与了哮喘复杂气道炎症的发生发展过程由炎症细胞释放的细胞因子一直备受关注细胞因子的临床研究取材主要为两大部分一部分来自哮喘患者外周血的单个核细胞 " "%! -) 另一部分来自于患者血清血浆等研究了例过敏型哮喘例其他过敏症患者和例健康人患者外周血 -) 与屋尘螨 ' 共孵育检测发现过敏性哮喘和患其他过敏症的患者其上清 ' 分泌量大增而 0 的分泌量低于其他过敏症患者且 0 的量与症状严重度成反比为比较儿童哮喘患者对常年性过敏原和季节性过敏原的反应性. 等共纳入了例尘螨过敏的哮喘例黑麦草过敏的哮喘例对两者均过敏的哮喘及例健康人外周血 -) 分别用不同的过敏原刺激发现对常年性过敏原尘螨过敏者能诱导分泌 *% 型细胞因子如 ' ' '' 等如仅对季节性过敏原如黑麦草过敏者则不能刺激 -) 分泌 *% 型细胞因子当然也有研究者发现外周血 -) 对过敏原的反应性不能鉴别哮喘的类别及疾病的状态血清血浆中细胞因子研究发现哮喘急性发作期和缓解期的 ' 水平明显增高与健康人比较布地奈德雾化吸入后血清中 0 ' 水平增高而 '' 显著降低在一项对哮喘不同时期血清中 '' 和内皮素受体 &*' 的研究中发现血清 ' 含量在哮喘急性发作期均高于慢性持续期缓解期及正常对照而 ' 和 &*' 含量在哮喘急性发作期慢性持续期均明显高于缓解期和正常对照提示以上种炎性因子均参与了哮

7 复旦学报医学版年月喘的发生和发展动态测定 '' 和 &*' 对于评价哮喘的病情及指导治疗有一定价值由于细胞因子在哮喘亚类判断病情评估和指导治疗方面尚存在争议我们选取了复旦大学附属中山医院门急诊就诊的稳定期哮喘例急性发作期哮喘例和健康对照例纳入研究虽然哮喘是以 * 淋巴细胞嗜酸性细胞肥大细胞为主的气道慢性炎症在哮喘的整个疾病过程中一旦遭遇感染还有中性粒细胞单核巨噬细胞等参与因此在细胞因子的选择上我们定制了 *% 型细胞因子 ' '*% 型细胞因子 0 *% 型细胞因子 ' 单核细胞中性粒细胞释放的细胞因子 ' *0' 抑制性细胞因子 ' 并观察各细胞因子在稳定期哮喘和哮喘急性发作期的水平变化本研究包含两组哮喘患者一组为慢性持续期患者共例其血清细胞因子水平未见升高 0 等和等检测了重度持续性哮喘血清及 -) 释放的 ' 和 ' 水平也未发现其与健康人有差异由此推测哮喘所具有的持续性气道炎主要局限于气道和肺部细胞因子几乎不释放到全身反之另一组为急性发作期哮喘其血清部分细胞因子升高其中 ' 升高型 '*0' 双高型占 5 因 ' 和 *0' 与急性感染组织损伤导致的炎症相关它可趋化中性粒细胞单核吞噬细胞到炎症局部促使急性期时相蛋白分泌在放线杆菌诱导的猪肺炎模型中血浆 '*0' 的水平在感染后 % 明显增高并持续 % 不等肺炎支原体感染的猪肺炎模型中肺泡盥洗液巨噬细胞内 ' ' 和 *0' 水平明显升高 *0' 升高与细菌清除炎细胞募集及局部肉芽肿形成关系密切且用 ' 基因敲除鼠制备的红球菌感染模型中 *0' 量的产生比野生型鼠更高说明 ' 和 *0' 在抗感染方面具有协同作用因此我们推测这两项细胞因子升高预示哮喘急性发作的诱因与细菌感染有关 * 淋巴细胞表面的 * 样受体 *. 识别病原体相关分子模式后引起细胞因子信号瀑布式传递 ' 或 *0 通常短期内呈指数样升高本研究也发现 '*0 呈高幅上升分别达正常的倍临床上通常用白细胞总数和中性粒细胞分类计数来协助判断是否合并细菌感染但白细胞的动员和向外周释放均需要一定时间而 ' 和 *0' 通常在急性感染 % 左右上升对于外周血白细胞暂无升高的急性发作者可以快速辅助鉴别相关分析显示 ' 和 *0' 均与外周血白细胞及.- 呈正相关相关系数分别为和哮喘急性发作的诱因多种多样如尘螨花粉油烟冷空气感染运动药物等临床医师从接诊到治疗决策的时间很短而可辅助判断细菌感染的指标较少因此在哮喘急性发作期是否给予抗生素治疗对医师来说是一项挑战等调查了香港例岁儿童哮喘患者的急性发作 $$ +& 其中在次 +& 中单纯 +& 为 5+& 合并感染为 5 在合并感染中 5 被证明为病毒诱发虽然研究者并没有直接给出细菌诱发的哮喘急性发作但可推知其比例也不高因此合理结合 '*0' ).- 等指标来综合判断是否合并细菌感染具有潜在的临床意义 ' 升高型和 ' 升高型占急性发作的 5' 为 *% 型细胞因子推测该型急性加重可能由过敏性因素诱发 ' 是由 *% 细胞分泌它参与胞外菌侵袭引起的迟发型免疫反应这是否与非典型病原体感染相关还需进一步研究细胞因子正常型占急性发作的 5 后种细胞因子型提示该急性加重可能并非细菌感染诱发本研究采用 )+ 法可检测组织培养上清血清血浆样本中可溶性多肽成分如细胞因子趋化因子免疫球蛋白和过敏霉素等包被了抗体的磁珠首先黏附目标多肽将多肽定位在微整列的固定位置上便于后期识别随即用标记荧光的二抗与磁珠目标多肽的二聚体结合荧光越强说明目标多肽越多 & + 也可检测可溶性多肽是检测细胞因子的传统方法但 & + 与 )+ 法比较具有较为耗时需要样本量大等缺点例如 & + 法检测一项细胞因子要标本而 )+ 法仅需一套完整的 & + 法从包被孔板到出结果需要个工作日而 )+ 法从样品分离到染色上机分析等仅需 % 从检测灵敏度看 )+ 法可检测 "# 的细胞因子而 & + 至少为 "# 价格上虽然一个 )+ 试剂盒需要多元但通过成套定制可降低成本且一个试剂盒可检测个样品单项成本并不昂贵本研究中 & + 检测个细胞因子的价格为元左右而采用 )+ 法检测的成本价仅为元另外流式细胞仪检测技术 2! $$#

8 杜春玲等流式细胞磁珠微阵列法检测血清中细胞因子水平在稳定期和急性加重期哮喘中的意义!$ + 是目前生物医学免疫学和分子医学等的通用技术它具有灵敏快捷多通道的优点通过细胞内染色可检测胞内多种蛋白的含量但 + 不适合用于可溶性介质的检测而 )+ 法正是结合了微整列和流式细胞检测技术的优势通过磁珠捕获使可溶性介质获得了通过流式仪的可能通过微整列不同的磁珠出现的位置不同从而来识别特定细胞因子它可在微小标本中同时检测多种可溶性介质达到多通量的效果因此 )+ 法用于栓测临床血清标本具有快速微量价格适中便于重复的优势且可根据不同需求灵活定制检测试剂盒细胞因子水平在慢性持续期无明显升高说明哮喘是气道和肺的局限性炎症而 ' 和 *0' 升高可辅助判断由细菌感染诱发的急性加重并快速指导抗生素的使用参考文献 1-*+ +4&&., $ '"!!!$ ''+ " $! $% " '!!$$!$%*# 1. ) +0,&** $ 2 2 $! # ' *!"!! %!2$!!$%/ # /#!$$' & 0+.4*. & ().7& +# ' $9 " $ $"!! $! $!%"$!!!$,$ / )+ && )!$ " 2 $ 2 -) $9!"!!$!! # "!!$ $"%! & &0$9!"!! 2 " "%! $ # $ $2!$%!$% "% $ "! -! 饶锦秀汪宏良胡芳等哮喘患者血清与 0 水平的测定和临床意义国际检验学杂志付海卫张松张添威黄昌河布地奈德雾化吸入对哮喘急性发作期患者细胞因子和肺功能的影响中国药业熊曙光聂晓红王慧等检测血清白细胞介素白细胞介素和内皮素在哮喘患者中的意义中国呼吸与危重监护杂志,&.)&.*, 14+&1&+00 &)&. + +!! $2 " "$! 3$% *%*% #!!$ $ %-! 7 +0 * +*+0+)&. %9 "2!"$ $!3$% " $ /, 0+4 &+. -.,+. +!! 2' '!3%" "% $!2"$ $!3$%!!$% ' # + 8 & / *% "!!!#2 2 * -& " "%!2!$% $%, ' ) ,* 7*.0&. $# $! $!!2 $' "%$ 9'$ $ 2 '# "#! 2$ 3$% + $! "", *, &,.*,+7&. ),+ ). -! " $ 2 "2 $ $9! 2 3#2$ 3$%" " $!"$!!! $#! '.' 0 7/+7,+1+ $ $ $3 $ 9' $ 9' #'$''$2$ $ &&, +7-!!"$ 2$ "$$ $## 2!$% $! % -', 何剑朱柠陈小东阿奇霉素对支气管哮喘患者肺功能及细胞因子的影响复旦学报医学版收稿日期编辑王蔚

中南大学学报医学版 + (,- ' ((,,) ' '' +/ ,''2(+,() ' 2',-5 +/ " 4! -D '!,''2 ,-1 + (' ' ( (,,) '+' '' +/ ),''2 +,(', ' 2',-+/ (1 + ('(/9'51 '*'-(,

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杜春玲 等 流式细胞磁珠微阵列法检测血清中细胞因子水平在稳定期和急性加重期哮喘中的意义 %)+9$2$9 "!3!$ '3% % ' ' '''*0' 002!32$9! %!$% 3% " 3$%%$%!$!,3 $$"%! $%3 $9! #"! 3% %3%#%' 5%#%'*0' 5%#%'

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