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1 一 方法概要 空氣中真菌濃度檢測方法 中華民國 103 年 8 月 15 日環署檢字第 號公告 自中華民國 103 年 11 月 15 日生效 NIEA E401.14C 本方法係使用衝擊式採樣器抽吸適量體積之空氣樣本, 直接衝擊於適合真菌生長的培養基上 於 25±1 培養 4~5 天後, 計數生長於培養基上之真菌菌落數, 並換算為每立方公尺空氣中的真菌濃度 二 適用範圍 三 干擾 本方法適用於空氣中真菌濃度之檢測 ( 一 ) 採樣器之幫浦及蓄電池功能異常或功率衰減, 造成採樣器操作時流量變異, 將影響採樣效率 ( 二 ) 空氣體積計算的誤差可能來自流量誤差或採樣時間測量 通常以流量控制設備減少空氣體積計算的誤差, 可使用計時器將採樣時間測量的誤差減至最小 ( 三 ) 細菌數量過多可能影響真菌之判讀與計數 ( 四 ) 風速太強可能影響採樣器的流量校正及查核 (Check) 四 設備 ( 一 ) 可攜型衝擊式採樣器 :50% 收集效率之截取粒徑 D50( 註 1) 應 2 µm( 須附證明文件 ) ( 二 ) 培養箱 : 溫度能保持 25±1 者 ( 三 ) 加熱板 : 可調溫度, 並附磁石攪拌功能者 ( 四 ) 天平 : 能精稱至 0.01 g 者 ( 五 ) 菌落計數器 : 用於計算菌落數目 ( 六 ) 乾熱滅菌器 ( 烘箱 ): 用於玻璃器皿等用具之滅菌 溫度能保持 160 達 2 小時或 170 達 1 小時以上者 ( 七 ) 高壓滅菌釜 : 能以中心溫度 121 ( 壓力約 15 lb/in 2 或 1.05 kg/cm 2 ) 滅菌 15 分鐘以上者 第 1 頁, 共 14 頁

2 ( 八 ) 培養皿 : 選用適合於採樣器之滅菌玻璃培養皿或市售無菌塑膠培養皿, 底面平滑無氣泡 刮傷或其他缺點者 塑膠培養皿, 底面平滑無氣泡 刮傷或其他缺點者 ( 九 ) 三角錐瓶 : 一般使用 250 至 2000 ml 能耐高壓滅菌之硼矽玻璃製品 ( 十 ) 冷藏箱 : 溫度能保持在 10~20 者 ( 十一 ) 水浴槽 : 溫度能保持在約 48 ± 2 者 ( 十二 ) 無菌操作檯 ( 十三 ) 流量校正器 : 校正與量測應可追溯至國家標準或國際標準 ( 十四 )ph 計 :ph 計之精確度必須達到 0.1 ph 單位 用於內含瓊脂培養基之 ph 值測定時, 應搭配表面電極 (Surface probe) ( 十五 ) 光學顯微鏡 : 能放大至 1000 倍油鏡鏡頭 五 試劑 ( 一 ) 試劑水 : 蒸餾水或去離子水, 導電度在 25 時小於 2 μmho / cm (μs / cm) ( 二 ) 培養基 : 1. 配製含氯黴素之麥芽抽出物培養基 (Malt Extract Agar with Chloramphenicol) 麥芽抽出物培養基為適合真菌生長的培養基, 添加氯黴素 (100 µg/ml), 可抑制細菌生長, 減少細菌的污染 I. 麥芽抽出物培養基 (Malt Extract Agar, 簡稱 MEA)( 市售商品化培養基 ), 每公升之培養基含下列成份 : 麥芽 (Maltose) 糊精 (Dextrin) 甘油 (Glycerol) 蛋白腖 (Peptone) 瓊脂 (Agar) II. 氯黴素 (Chloramphenicol)( 試藥級 ) g 2.75 g 2.35 g 0.78 g 15.0 g 100 mg 配製方式, 將上述芽抽出物培養基 33.6 g 溶於 1 公升試劑水中, 經 121 滅菌 15 分鐘後, 置於 48±2 的水浴槽中冷卻, 秤取 100 mg 氯黴素溶於 2 ml 95% 酒精 (Ethanol), 經無菌濾膜過濾除菌後, 全 第 2 頁, 共 14 頁

3 數加入滅菌完成溫度已降至 48±2 之上述麥芽抽出物培養基中, 混合均勻後, 依採樣器不同分裝適量之培養基至培養皿中 ( 註 2), 置於室溫下凝固,pH 值以表面電極測定應為 4.7 ± 0.2( 在 25 ), 保存於 4 ± 2, 保存期限 14 天 可根據檢測需求量, 依配方比例配製培養基 2. 添加氯黴素之二氯喃甘油培養基 (Dichloran Glycerol Agar with Chloramphenicol) 二氯喃甘油培養基為適合真菌生長的培養基, 添加氯黴素 (Chloramphenicol, 100 µg/ml), 可抑制細菌生長, 減少細菌的污染 I. 二氯喃甘油培養基 (Dichloran Glycerol Agar, 簡稱 DG18)( 市售商品化培養基 ), 每一公升之 DG18 含下列成份 : 葡萄糖 (Glucose) 蛋白腖 (Peptone) 10.0 g 5.0 g 磷酸二氫鉀 (Potassium dihydrogen phosphate)1.0 g 硫酸鎂 (Magnesium sulphate) 二氯喃 (Dichloran) 瓊脂 (Agar) II. 甘油 (Glycerol) 0.5 g g 15.0 g 220 g Ⅲ. 氯黴素 (Chloramphenicol)( 試藥級 ) 117 mg 配製方式, 將上述二氯喃甘油培養基 31.5 g 溶於 1 公升試劑水中, 加入 220 g 的甘油 (Glycerol), 經 121 滅菌 15 分鐘後, 置於 48 ± 2 的水浴槽中冷卻, 秤取 117 mg 氯黴素溶於 2 ml 95% 酒精 (Ethanol), 經無菌濾膜過濾除菌後, 全數加入滅菌完成溫度已降至 48 ± 2 之上述二氯喃甘油培養基中 ( 註 2), 混合均勻後, 依採樣器不同分裝適量之培養基至培養皿中, 置於室溫下凝固,pH 值以表面電極測定應為 5.6 ± 0.2( 在 25 ), 保存於 4 ± 2, 保存期限 14 天 可根據檢測需求量, 依配方比例配製培養基 3. 以上培養基擇一使用 ( 三 )70% 至 75% 酒精:消毒擦拭用 ( 四 ) 革蘭氏染劑 : 含有結晶紫染劑 (Crystal violet) 革蘭氏碘液媒染劑 (Gram iodine) 脫色劑 (Decolorizer) 及番紅 (Safranin) 或碳酸複紅染劑 (Carbolfuchsin) 等四種染劑 第 3 頁, 共 14 頁

4 六 採樣與保存 ( 一 ) 室內場所可能有不同的個別通風及空調系統分區, 採樣點應分佈於不同分區中 採樣位置應距離室內硬體構築或陳列設施最少. 五公尺以上及門口或電梯最少三公尺以上 ( 二 ) 採樣前先以 70% 至 75% 酒精擦拭採樣器放置培養基之部位 ( 三 ) 採樣時應將採樣器置於平台處, 不可以人員手持採樣器方式進行採樣, 以避免採樣人員本身造成的污染 採樣器應置於距離地面約 120 至 150 公分之高度 ( 四 ) 採樣時將含培養基之培養皿放置於採樣器內, 設定抽取適量之空氣體積, 以衝擊方式將生物氣膠微粒收集到培養基上, 最佳量之菌落數為 個菌落之間, 但採集時間不可超過 10 分鐘, 以免造成微生物因脫水乾燥而無法培養, 採樣結束後培養皿蓋子應先以 70% 至 75% 酒精擦拭, 再蓋回培養皿上 採樣皆需進行二重覆, 兩台採樣器之間隔為 30~40 公分, 採樣後應於 24 小時內送至實驗室培養 ( 五 ) 進行下一個採樣前, 需再以 70% 至 75% 酒精擦拭採樣器放置培養皿之部位後, 才能進行下一次的採樣 ( 六 ) 採樣後之培養皿應置於樣品容器內, 樣品容器應貼妥樣品標籤並密封且貼上封條 ( 七 ) 採樣期間攜出之培養基, 應避免於運送或搬運期間受到污染, 應有防制因跳動導致培養基受到污染的措施 ( 如以石蠟膜 (Paraffin) 透氣膠帶或塑膠套等封存培養皿 ) ( 八 ) 採樣期間攜出之培養基, 應保存於 10 ~ 20 之冷藏箱內, 使用保冷劑 (Refrigerant packs)( 如冰寶 ) 保溫, 不需要使用冰塊, 以避免培養皿累積太多的水滴或水氣, 造成培養基內的微生物彼此污染 但是實驗室內保存溫度仍應維持在 4 ± 2 採樣前若發現培養皿 ( 含蓋 ) 積留太多的水滴或水氣, 應以無菌的吸水紙或棉棒吸乾或擦乾, 以減少污染的發生 ( 九 ) 須依據 室內空氣品質檢驗測定管理辦法 相關規定執行採樣, 須執行室外採樣點之採樣 ( 十 ) 採樣前 後應執行流量查核, 所測得的流量與校正值差異不得超過 ± 5%, 採樣終了時, 記錄採樣前 後空氣流量及採集時間, 並以下式計算吸引空氣量 第 4 頁, 共 14 頁

5 七 步驟 V: 吸引空氣量 (L) Qs : 開始時之流量 (L min) Qe : 終了時之流量 (L min) t : 採集時間 (min) ( 一 ) 採樣後將培養皿置於 25±1 培養箱內, 倒置培養 4~5 天 應注意菌落計數前, 應儘可能不去擾動生長在培養基上的黴菌菌落, 以免孢子飛散形成新的菌落, 造成計數不正確 ( 二 ) 檢測人員應具備區別細菌和真菌之能力 ( 如觀察菌落形態及特徵或進行革蘭氏染色等 ), 以使真菌之計數更為正確 ( 註 3) ( 三 ) 革蘭氏染色 1. 抹片製作 : 挑取培養基上長出之菌落, 於載玻片上製成薄抹片, 風乾並過火數次固定 2. 初染 : 將已固定之抹片, 用結晶紫染劑染 1 分鐘, 水洗 5 秒鐘 3. 媒染 : 加革蘭氏碘液媒染劑染 1 分鐘, 水洗 5 秒鐘 4. 脫色 : 用酒精 丙酮或是兩者混合之脫色劑洗至不再有紫色褪出, 數秒即可, 水洗 5 秒鐘 5. 複染 : 用番紅或碳酸複紅染劑染 30 秒鐘, 水洗 5 秒鐘 6. 自然風乾 7. 以光學顯微鏡鏡檢, 區分酵母菌及細菌 ( 酵母菌成圓形或橢圓形, 大小 6 μm 以上, 細菌球菌呈圓形, 大小 3 μm 以下, 酵母菌明顯比細菌大 其餘形狀非呈圓形或橢圓形者, 皆判定為非酵母菌 ) 8. 革蘭氏染色操作步驟可依各廠牌操作說明書進行試驗 ( 四 ) 計數各培養皿中所產生的真菌菌落, 並記錄之 若因六之 ( 七 ) ( 八 ) 因素造成污染的情形發生 ( 如瀰漫生長 ), 應重新採樣分析 若麥芽抽出物培養基有發生黴菌菌落過度生長的情形, 則應選用二氯喃甘油培養基, 重新採樣分析 八 結果處理 ( 一 ) 每個採樣位置採集的二重複樣品完成菌落計數後, 先個別參照採樣器原製造廠商提供之校正表 Positive hole correction(conversion) 第 5 頁, 共 14 頁

6 table 進行換算, 換算之數值除以採樣時之吸引空氣量, 得到每立方公尺空氣中真菌的濃度, 再計算其平均值, 單位以 CFU/m 3 (Colony forming unit/per cubic meter) 表示 真菌濃度皆以整數表示 ( 小數位數四捨五入 ), 計算實例說明如範例 1 ( 二 ) 採集時間達 10 分鐘之樣品, 培養後若無菌落生長, 真菌濃度小於偵測極限 (Limits of Detection, LOD), 以 <1 x 1000 / 吸引空氣量 ( 公升 )CFU/m 3 表示 ( 計算實例說明如範例 2) ( 三 ) 計算真菌濃度室內外比值 ( 計算實例說明如範例 3), 比值計算至小數點一位 ( 四捨五入 ), 但需注意當培養皿長出菌落數與採樣器的篩孔數相同時, 即無法計算室內外比值, 應減少採樣體積重新採樣 ( 四 ) 運送空白若無菌落生長, 以 未生長 (No growth) 表示 ( 五 ) 檢測紀錄須註明採樣起始及終了時間 採樣器流速 採集時間 吸引空氣量 培養起始及終了時間 培養基名稱 培養溫度 真菌濃度室內外比值等 九 品質管制 ( 一 ) 微生物採樣人員及檢測人員應具備微生物基本訓練及知識 ( 二 ) 每個採樣位置須進行二重複 依下列計算式, 二重複差異的範圍須介於 x1( 含 ) 與 x2( 含 ) 之間 ( 註 4)( 計算範例 4), x1 是數值較小者,x2 是數值較大者,x1 及 x2 值皆為原始計數的菌落數 ( 即未經校正表換算前的菌落數 ) ( 三 ) 培養基的品質, 每次使用一新品牌或新批號的培養基時, 除了應取得該批培養基的原廠測試證明 ( 內容應包含標準菌株之測試結果 ) 之外, 實驗室內再依九 ( 二 ) 進行二重複差異分析, 確認與先前使用的培養基一致 ( 四 ) 每批次採樣時, 應進行運送空白 空白樣品經培養後不得檢出 ( 五 ) 培養基於實驗室保存 採樣運送及培養期間, 均應保持倒置 第 6 頁, 共 14 頁

7 ( 六 ) 採樣器有下列情形之一時, 則須進行流量校正, 校正時應置入充填有培養基的培養皿, 以校正器調整採樣器流量至原製造廠商建議之設計流量 1. 新機啟用時 2. 馬達修理 保養或更換零件後 3. 流量計修理 調整或更換 4. 單點查核時偏離設計流量超過 ± 5% 5. 每 3 個月的定期校正 十 精密度與準確度 略 十一 參考文獻 ( 一 )American Conference of Governmental Industrial Hygienists, Guidelines for the assessment of bioaerosols in the indoor environment. AGGIH, Cincinnati, ( 二 )American Conference of Governmental Industrial Hygienists, Bioaerosols: Assessment and Control, AGGIH, Cincinnati, ( 三 )American Conference of Governmental Industrial Hygienists, Threshold limit values for chemical substances and physical agents and biological exposure indices. ACGIH, Cincinnati, ( 四 )Hung, L. L., Miller, J. D., Dillon, H. K., Field guide for the determination of biological contaminants in environmental samples. 2nd Edition, AIHA, ( 五 )ASTM, Standard guide for using probability sampling methods in studies of indoor air quality in buildings. D , Standards on indoor air quality, ( 六 )Storey, E., Dangman, K. H., Schenck, P., DeBernardo, R. L., Yang, C. S., Bracker, A., Hodgson, M. J., Guidance for clinicians on the recognition and management of health effects related to mold exposure and moisture indoors. University of Connecticut Health Center, ( 七 )WHO, Ambient air quality monitoring and assessment. Guidelines for air quality. Geneva, WHO , ( 八 )Yang, C. S., Heinsohn, P., Sampling and analysis of indoor microorganisms. John Wiley & Sons, Inc. publication, 第 7 頁, 共 14 頁

8 ( 九 )NMAM 0800 : Bioaerosol Sampling (Indoor Air), Culturable organisms: bacteria, fungi, thermophilic actinomycetes. NIOSH Manual of Analytical Methods (NMAM), Fourth Edition, ( 十 )BS EN ISO : Cleanrooms and associated controlled environments -Biocontamination control-part 1: General principles and methods /ISO , ( 十一 ) 香港特別行政區政府室內空氣質素管理小組, 辦公室及公眾場所室內空氣質素管理指引, 中華民國 92 年 ( 十二 ) 行政院環境保護署, 建置室內空氣品質標準值暨室內空氣污染源調查及監測查驗制度 EPA-100-FA11-03-A018, 中華民國 100 年 註 1:D50 之定義為對應於 50% 收集效率時的微粒氣動直徑, 它是表示可收集微粒大小的指標 註 2: 例如選用安德森採樣器, 塑膠培養皿須填充 45 ml 培養基 ; 選用 MAS-100 系列之採樣器, 塑膠培養皿須填充 25 ml 培養基 ; 其他採樣器則依其說明書填充適量的培養基, 以免影響採樣效率 註 3: 原則上直接計數培養基上長出的菌落即為真菌菌落, 但檢測人員若懷疑某些菌落是細菌菌落者, 則繼續進行七 ( 三 ) 革蘭氏染色的步驟, 依染色結果之微生物大小及形狀, 判定該菌落是否為真菌菌落 註 4: 二重複差異的管制範圍對照表 (1) 篩孔數 300 個孔洞之採樣器二重複差異管制範圍對照表 x1 x2 x1 x2 x1 x2 x1 x2 x1 x2 x1 x 第 8 頁, 共 14 頁

9 第 9 頁, 共 14 頁

10 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * x1 是數值較小者,x2 是數值較大者 ;300 * 代表採樣器篩孔數為 300 孔洞, 產生的菌落數最高為 300 第 10 頁, 共 14 頁

11 (2) 篩孔數 400 個孔洞之採樣器二重複差異管制範圍對照表 x1 x2 x1 x2 x1 x2 x1 x2 x1 x2 x1 x 第 11 頁, 共 14 頁

12 第 12 頁, 共 14 頁

13 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * x1 是數值較小者,x2 是數值較大者 ;400 * 代表採樣器篩孔數為 400 孔洞, 產生的菌落數最高為 400 第 13 頁, 共 14 頁

14 計算範例 1 空氣中真菌濃度計算實例 A 衝擊式採樣器, 共抽吸 84.3 L 的空氣樣品,MEA 培養基長出 79 個真菌菌落 ;B 衝擊式採樣器, 共抽吸 82.5 L 的空氣樣品,MEA 培養基長出 73 個真菌菌落, 真菌濃度為 1013 CFU/m 3, 計算如下 : 區分 採樣器抽吸體積 培養皿長出真菌菌落數 校正表換計算 1 立方公平均值算後數值尺空氣中濃度 結果表示 CFU/m 3 採樣器 A ( ) 2 = 1013 採樣器 B 計算範例 2 空氣中無真菌菌落生長計算實例 A 衝擊式採樣器採集 10 分鐘, 吸引空氣量 283 L,B 衝擊式採樣器採集 10 分鐘, 吸引空氣量 280 L, 皆無真菌菌落生長以 < ( ) 2 CFU/m 3 表示, 計算結果為 < CFU/m 3, 以 < 4 CFU/m 3 表示 計算範例 3 真菌濃度室內外比值計算實例 某大樓會議室室內真菌濃度為 500 CFU/m 3, 室外真菌濃度為 1000 CFU/m 3, 室內外比值為 500/1000 = 0.5 計算範例 4 空氣中真菌二重複差異管制範圍實例說明 某採樣器篩孔數 400 個孔洞, 某採樣位置二重複之菌落數為 (62 及 99), 經查表得知二重複差異管制範圍為 62 ~ 95 之間, 結果二重複差異超出管制範圍 第 14 頁, 共 14 頁

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