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1 台灣昆蟲特刊第十六號 Formosan Entomol. Spec. Pub. No. 16 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會專刊 Proceeding of Symposium on Trans-Century Plant Protection and Quarantine Technologies 行政院農業委員會動植物防疫檢疫局 國立臺灣大學昆蟲學系 國立臺灣大學植物醫學研究中心 國立自然科學博物館 主辦 台灣昆蟲學會 中華植物保護學會 中華民國植物病理學會 協辦 黃榮南 蕭旭峰 吳文哲 主編 2015 年 12 月 31 日

2 序 於全球化的競爭下, 我國農作物之栽培趨於精緻化, 並以生產高品質產品為導向, 為保持農林漁牧產品之優質與安全, 需嚴格執行進出口產品之檢疫與防疫工作, 方能提升產銷價值, 因此正確診斷有害生物更顯其重要性 自行政院農業委員會於 1998 年成立動植物防疫檢疫局以來, 以專責機構職掌我國農業有害生物的所有行政業務, 包括有害生物的診斷鑑定 動植物防檢疫 國內外有害生物偵察 監測 風險評估與整合管理等政策的研擬與執行 值此同時, 我國植物保護體系也正邁向新紀元 : 先進的 植物醫學 觀念導入我國, 隨後相關學制的出現, 除結合過去傳統 植物保護學 及 植物病蟲害學 的優點外, 並增加健檢預防及後續健康照護之概念 過去 15 年來我國已建立諸多有害生物診斷鑑定的標準作業流程, 藉以提供新進的專家參考 但有了標準的鑑定作業程序, 其後我們更應當正視過去 現在與未來所有有害生物鑑定資訊的整合 本 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會 的舉辦目的, 主要就我國當前診斷鑑定的技術與政策等各類實務, 在未來應該如何整合與調整, 使國內各單位在農業有害生物診斷與鑑定業務, 可達到互相支援與資料統合的目標 此外, 新一代的 植物醫學 人才培育在現今更為重要, 希望透過此次研討會來深入討論傳統的植物保護與未來的植物醫學相關制度的建構與發展 有鑑於防疫檢疫為植物醫學體系中重要的一環, 植物醫學體系同時也是防疫檢疫相關人員重要之培育平台, 透過本研討會集合了國內各方領域中經驗豐富的專家, 深入探討植物有害生物防檢疫技術最新發展 植醫相關制度的建構與未來發展, 不僅就技術與政策兩大層面切入, 同時將相關專業人員於病蟲害診斷 防檢疫第一線之實務經驗, 透過本專刊詳實記錄下來, 相信本刊將是未來發展植物有害生物診斷鑑定新科技及訂定植物醫師政策與法規的重要參考資料 台灣昆蟲學會理事長楊恩誠謹誌 2015 年 12 月 26 日

3 目 錄 蟲害診斷鑑定 - 案例介紹 1 林大淵于逸知白桂芳病害診斷鑑定技術 17 楊秀珠害蟲分子鑑定技術之開發 - 焦磷酸定序鑑定平台 37 黃旌集謝佳宏王弘毅吳文哲昆蟲刺探電位圖譜 (EPG): 刺吸式害蟲取食行為鑑定新技術 49 Elaine A. Backus 林柏安張宗仁石憲宗寡核苷酸微陣列鑑定檢疫害蟲 73 路光暉陳嬿后臺灣重要檢疫害蟲偵察調查 87 陳健忠蕭旭峰石憲宗吳文哲有害生物資料庫介紹 101 蕭旭峰植物醫師在技術研發與推廣上扮演的角色 - 以高雄區農業改良場為例 117 黃昌陳以錚曾敏南周浩平中興大學植物醫學體系的建構與未來展望 137 詹富智從柑橘黃龍病談植醫的重要性與未來展望 141 洪挺軒

4 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會議程 2015 年 6 月 26 日 ( 五 ) 國立自然科學博物館國際會議廳 ( 紅 ) 時間講題講者 08:45~09:15 註冊及報到 開幕 來賓致詞及團體照 ( 楊恩誠主任 ) 09:15~09:45 來賓致辭 09:45~09:50 團體照 茶敍 有害生物診斷鑑定技術 ( 張雅君主任 ) 10:10~10:40 蟲害診斷鑑定技術 - 案例介紹白桂芳課長 10:40~11:10 病害診斷鑑定技術楊秀珠研究員診斷鑑定技術之開發與展望 ( 蕭文鳯教授 ) 害蟲分子鑑定技術之開發 - 焦磷酸定序鑑定 11:10~11:40 平台 11:40~12:10 昆蟲刺探電位圖譜 (EPG): 刺吸式害蟲取食行為鑑定新技術午餐及防治資材展示交流 黃旌集博士 石憲宗副研究員 外來害蟲偵察與資料庫之現況與發展 ( 方尚仁組長 ) 13:30~14:00 寡核苷酸微陣列鑑定檢疫害蟲 路光暉主任 14:00~14:30 臺灣重要檢疫害蟲偵察調查 陳健忠研究員 14:30~15:00 有害生物資料庫介紹 蕭旭峰教授 茶敍及防治資材展示交流植物醫學的回顧與展望 ( 張念台教授 ) 15:30~16:00 植物醫師在技術研發與推廣上扮演的角色 - 以高雄區農業改良場為例 黃 昌場長 16:00~16:30 中興大學植物醫學體系的建構與未來展望 詹富智主任 16:30~17:00 從柑橘黃龍病談植醫的重要性與未來展望 洪挺軒主任 休息 植物醫學座談與討論吳文哲教授及各講者 主持人

5 研究報告 2015 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會 P Symposium on Trans-Century Plant Protection and Quarantine Technologies P1-16 蟲害診斷鑑定 - 案例介紹 * 林大淵 于逸知 白桂芳 行政院農業委員會臺中區農業改良場 515 彰化縣大村鄉田洋村松槐路 370 號 摘 要 蟲害診斷攸關田間防治決策與成效, 因此快速 正確判斷案件樣品與田間狀況, 才是診斷鑑定最重要的環節 本文中依照害蟲造成的傷害特徵作為案例比較之依據, 並以急診檢傷的概念逕將作物受蟲害類型分為兩類, 即表觀傷害與延宕傷害 表觀傷害包括缺刻 傷疤 潛食痕 蛀食孔等主要徵狀 延宕傷害包括萎凋 變色 畸形 異物汙染等主要徵狀 由於尋求診斷鑑定的原因可能不單純, 診斷人員必須綜合判斷各項資訊以避免發生診斷錯誤 進行診斷時應有系統的檢視樣本上的蟲體及蟲害徵狀, 並詳細詢問田間發生狀況 防治過程 發生歷程等資訊, 才能正確診斷並提供防治建議 關鍵詞 : 蟲害 診斷 前言蟲害診斷為植物保護人員最基本的工作, 攸關後續防治與否及其成效, 因此正確診斷至關重要 第一線人員接獲田間案例時不僅要快速檢定樣品, 還要依送檢對象 田間狀況描述 現場勘查等資訊進行判斷 ; 部分案例中由於送檢人員可能是農友 農藥販賣業者及一般民眾, 對蟲害及徵狀的認知差異甚大 ; 或其目的為判斷藥害 汙染等非蟲害範圍, 可能隱匿部分資訊以期獲得對自身有利之診斷結果, 故診斷人員必須依專業與經驗快速判斷蟲 害與否, 再詢問田間狀況等資訊, 避免發生診斷錯誤甚或衍生後續問題 雖然昆蟲口器形式決定其危害類型, 但危害不同部位與時期, 各作物的生理反應與表觀徵狀相當複雜, 常與作物生理異常 物理傷害 化學傷害 病害 環境因素等徵狀混淆, 作物中不同時期的蟲害混雜或是防治後蟲相變化也可能誤導蟲害診斷的方向, 因此有系統的判斷受害徵狀, 才能快速釐清樣品是否為蟲害問題 蟲害可造成作物受害部位產生缺刻 傷疤 潛食 蛀食等表觀可辨的徵狀, 也可能造成作物萎凋 變色 ( 白化或黃化等 ) 畸形 異 * 論文聯繫人 Corresponding [email protected] 蟲害診斷鑑定 1

6 物汙染等較易與其他因素混淆的徵狀 ; 因此接獲案件進行診斷時, 可先探詢田間發生狀況 防治過程 發生歷程等資訊, 過濾非生物因子的可能性, 再進行樣本蟲體檢查 蟲體為診斷重要依據, 農友也多依此諮詢防治措施, 不過送樣前若已施行防治 轉送 重新採樣等過程, 診斷過程中可依樣本狀態再徵詢其他資訊, 避免蟲相變化造成診斷誤差 此外, 田間送樣中較為困擾的狀況是僅有受害樣本但未發現蟲體, 而診斷人員必須依樣品受害徵狀判斷是否為蟲害, 以及是由何類害蟲造成 因此本文將列舉害蟲為害的形式輔以案例說明, 並參照近似徵狀的非蟲害案例作比對 文中大部分案例均有發現蟲體或確定原因造成的傷害, 但若以案例中作物之傷害對照或反推其成因時, 則應詳查並比對各種可能因素, 避免先入為主的判斷而驟下結論 蟲害檢傷分類第一線植保人員對已有發現蟲體及其危害之案例多有經驗, 原因不明或模糊之案例才是挑戰所在 因此本文中不以害蟲分類作為案例比較之依據, 而是以醫學中急診檢傷的概念逕將作物受蟲害類型分為兩類, 即 表觀傷害 與 延宕傷害, 依照傷害特徵作為案例比較依據 大多數鱗翅目與鞘翅目害蟲造成之傷害多屬表觀傷害, 害蟲造成的痕跡通常較獨特或清楚易辨識, 以缺刻 傷疤 潛食痕 蛀食孔等為主要徵狀 ; 部分蟎類 蚜蟲 薊馬等害物則因口器極小, 植株受害時不會立即產生可見徵狀, 植株通常在一段時間後方顯現萎凋 變色 ( 白化或黃化等 ) 畸形 異物汙染等徵狀 指植物體上出現物理性的傷害與缺損, 此種危害係由咀嚼式口器之昆蟲啃食植物體造成, 主要為害類群為鱗翅目 ( 幼蟲 ) 鞘翅目 直翅目與膜翅目昆蟲, 植物的根 莖 葉 花 果實都有可能遭害蟲啃食 啃食 ( 部分危害則是因為蟲體活動時造成的物理性傷害 ) 根部之常見害蟲有鞘翅目的黃條葉蚤 金龜子科的幼蟲 ( 蠐螬, 俗稱雞母蟲 ), 直翅目的蟋蟀 螻蛄等 地上部被害蟲啃食的情況較地下部更常見, 尤其較為幼嫩的莖 葉 葉部遭啃食的情況較為多變, 多數害蟲皆可由葉緣開始啃食, 形成不規則狀缺刻, 切葉蜂則會造成規則且圓滑的缺刻 ; 部份害蟲於葉表中央直接啃食, 造成中央不規則穿孔 ( 鞘翅目 鱗翅目害蟲 ), 或僅留一層透明之表皮組織 ( 部分鱗翅目幼蟲 黃條葉蚤等 ) 花器亦常受害蟲啃食, 以鱗翅目與鞘翅目害蟲較為常見, 部份害蟲如番茄夜蛾會由花苞外部啃食, 直至蛀入花苞內危害 果實營養豐富, 會吸引各式害蟲前來取食, 包括鱗翅目幼蟲 金龜子 胡蜂等昆蟲皆會啃食果實, 造成缺刻傷口, 甚至導致果實感染病菌而腐爛 當瓜螟等鱗翅目幼蟲為害瓜果時, 會在果表上形成條狀之淺凹槽 ; 許多啃食危害的昆蟲則會在週遭留下糞便, 藉由糞便外觀 數量和新鮮程度, 亦可協助判斷害蟲之類群 數量 大小與危害時間 非蟲害之近似徵狀 : 鳥害 鼠害 耕作造成機械傷害 辨別方式 : 上述情況所造成的缺刻, 植物體上不會有蟲體, 或是蟲蛻 蟲糞等害蟲活動痕跡 ( 圖一 ) 一 表觀傷害 ( 一 ) 缺刻 : 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

7 黃條葉蚤幼蟲啃食蘿蔔地下部 胡蘿蔔遭夜蛾類幼蟲危害 紋白蝶啃食高麗菜葉片 形成缺刻 斜紋夜蛾幼蟲啃食葡萄葉表 瓜螟於苦瓜上啃食危害 鱗翅目幼蟲啃食洋香瓜表皮 形成凹痕 大菜螟危害葉片後 留下大量糞便 葡萄園中的鳥害症狀 野鼠為害甜豌豆果莢 (圖一) 蟲害診斷鑑定 3

8 ( 二 ) 不規則傷疤 : 當小型害蟲危害植物體時, 其口器無法造成明顯的物理性傷口, 僅破壞植物體表層, 而這些小傷口癒合後, 會留下不規則之傷疤 其中以纓翅目薊馬的危害最容易出現這類不規則傷疤 薊馬以刺吸式口器取食時, 會破壞植物細胞, 癒合後產生近似島狀的疤痕 由於薊馬大多取食植物幼嫩之部份, 這些疤痕在危害初期並不明顯, 而是植物繼續發育後才表現出來 ( 特別是於幼果上危害時 ), 造成防治上的困難 柑橘銹蜱亦會於柑橘類果實上留下類似傷疤, 然而銹蜱所造成傷疤是因為果實表皮油胞被破壞, 芳香油類氧化後導致果皮變黑, 嚴重時整顆果實變成黑色, 俗稱 黑柑 火燒柑 非蟲害之近似徵狀 : 風疤 藥害 病害 辨別方式 : 不規則傷疤通常由小型害蟲造成, 其活動力較弱, 故通常可在受害植株上尋獲蟲體 此外, 風疤 乃植物因風力作用互相摩擦而產生的傷痕, 故僅出現在植物體相互接觸點, 且傷痕具方向性 ; 藥害所產生的傷疤則通常出現某種 規律 的現象, 如點狀 ( 藥滴造成 ) 水痕狀 有時僅出現於果實最低點 ( 藥液逕流聚集 ) 或僅出現於某側 ( 僅噴灑到藥劑面產生 ) 等 ( 圖二 ) ( 三 ) 潛食痕 : 潛食, 顧名思義即害蟲於植物體中潛行取食所造成的危害, 以鱗翅目與雙翅目昆蟲為主要害蟲, 其中又以潛葉性害蟲最為人所熟知 此類幼蟲於葉片中潛行取食葉肉組織, 僅留下表皮, 並造成葉片白色條狀且彎曲的食痕, 影響植物光合作用, 嚴重時造成植株枯萎 臺灣作物上最常見的潛葉害蟲非斑潛蠅莫屬, 且因食性龐雜 世代短, 故防治不易 另外, 在柑橘類作物上則有柑橘潛葉蛾會造成潛葉狀為害 非蟲害之近似徵狀 : 無 ( 圖三 ) ( 四 ) 蛀食孔 : 一般通稱的 蛀食, 係指害蟲以咀嚼式口器於植物莖幹或果實內蛀孔鑽食時所造成的危害, 此種危害常造成農民嚴重的損失 蛀食莖幹之害蟲, 以鞘翅目及鱗翅目害蟲為大宗 天牛可為鞘翅目蛀莖害蟲的代表, 多種天牛幼蟲於活體植株之主幹或分枝內蛀食, 並於枝幹表面開一 排糞孔, 將糞便由此孔向外排出, 有時伴隨流膠現象 ; 植株遭天牛寄生後, 輕則影響生長, 重則樹勢衰弱, 甚至引發雜菌感染, 導致植株死亡 此外, 小蠹蟲 吉丁蟲等鞘翅目昆蟲, 亦偶有發現蛀莖危害 鱗翅目的木蠹蛾與蝙蝠蛾之幼蟲亦以蛀食莖幹為生, 以木蠹蛾為例, 雌成蟲產卵於腋芽或嫩枝, 孵化之幼蟲鑽入枝條內蛀食危害, 糞便由排糞口排出 ; 受害枝條水分傳輸受阻, 造成上方植體枯萎, 易受外力影響折斷 由排糞口排出的蟲糞, 可大致分辨害蟲的類群, 若蟲糞鬆散或略呈不規則條型, 成木屑狀, 可能為天牛蛀食 ; 若蟲糞成褐色顆粒狀, 則為鱗翅目木蠹蛾等危害 果實亦常發生蛀食危害 蛀果害蟲以雙翅目與鱗翅目為大宗, 最為國人熟知且頭痛的蛀果害蟲非東方果實蠅莫屬 成熟雌蠅以產卵管於果實上扎孔產卵, 有時可於果表形成明顯外傷 ; 孵化之幼蟲於果實內鑽食, 造成果實變質 畸形 腐爛 提早落果 瓜實蠅則是另一種重要的實蠅類害蟲, 食性和東方果實蠅不同, 專危害葫蘆科瓜果類, 受害瓜果亦會產生畸形 變質 腐爛掉落等症狀 國內鱗翅目蛀果害蟲除了少數夜蛾類蛀入果實危害之外, 多為小型蛾類, 如荔枝細蛾 捲葉蛾類與螟蛾類 此類鱗翅目害蟲通常非專以果實為食, 而是蛀食植株幼嫩部, 並隨季節轉換為害部位 以荔枝細蛾為例, 一年三個世代中, 前二世代 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

9 薊馬於葉脈週遭形成傷疤 薊馬於葡萄幼果上危害 形成不規則傷 疤 火燒柑 銹蜱造成的果皮傷疤 黑星病於果表形成均勻的黑斑 網狀袋套在番石榴表皮留下化學性傷害 葡萄園施用除草劑造成果實下方受害 (圖二) 多以嫩芽 葉脈 花穗為蛀食對象 造成組織 害部留下糞便痕跡 可藉此與實蠅類危害區 褐化乾枯 第三世代則蛀食果實為主 由蒂頭 分 鑽入果實內危害 鱗翅目蛀果害蟲通常會於被 豆科經濟作物的果莢亦有鱗翅目幼蟲蛀 蟲害診斷鑑定 5

10 斑潛蠅危害菊花葉片所形成之彎曲食痕 柑橘潛葉蛾之危害狀 (圖三) 食危害 較常見的有豆莢螟 波紋小灰蝶等 黃化甚至萎凋 蟲害阻斷維管束傳輸的狀況大 其幼蟲蛀入果莢中取食豆仁 糞便堆積於果莢 致可分為兩類 一是直接切斷幼嫩植物體地基 內或隨孔洞排出莢外 雜糧作物則有玉米螟蛀 部 造成地上部萎凋 如球菜夜蛾 蕪菁夜蛾 食危害玉米 幼蟲自卵塊孵出後可取食玉米植 (俗稱切根蟲) 等夜蛾科幼蟲 另外則是害蟲於 株各部位 亦會蛀入花穗及果穗中危害 受害 植物體內蛀食 破壞植物水分運輸 而造成全 果穗變形 腐爛 並可看到蟲糞及蟲繭等痕跡 株或部分植物體萎凋 如蛀心蟲 芒果螟蛾 亦有部分害蟲會蛀食植株根部 天牛於莖 葡萄捲葉蛾等 小型害蟲如蚜蟲 薊馬 粉蝨 部向下蛀食時 可能蛀入根中危害 甘藷蟻象 或蟎類大量為害 吸食寄主汁液時 亦可能造 是專門蛀食根部之害蟲 幼蟲於地下塊根中蛀 成部分或全株的萎凋 食危害 造成蛀孔 並容易引起雜菌感染 導 致塊根腐敗發臭 非蟲害之近似徵狀 病害造成的軟腐症 狀 耕作傷害 辨別方式 遭蛀食之受害部剖開後通常可 非蟲害之近似徵狀 生理障礙 藥害 病 害 耕作傷害 辨別方式 萎凋是其他蟲害現象所造成的 後續結果 通常可發現如啃食缺刻 蛀食等物 理性傷口 並伴隨蟲體 蟲糞等跡象 其他非 看見蟲體 若害蟲已離開則可看見蟲蛻 蟲糞 蟲害則無此特徵 (圖五) 的痕跡 並有活動用之孔道 病害與耕作傷害 (二) 變色 (白化或黃化等) 則無此特徵 (圖四) 當害蟲以口器刺吸植體時 會造成植物細 胞受損 引起白化 黃化等變色現象 蚜蟲聚 二 延宕傷害 集於幼葉危害時 可能導致幼葉黃化 萎縮 (一) 萎凋 薊馬類在蔥 韭上危害時 會留下白色且略為 某些蟲害可造成植物部分或全株萎凋 萎 連續之點狀食痕 嚴重時食痕互相連接 成近 凋的三大因素分別為根部受損 維管束運送受 似條狀之白化現象 葉蟎類危害葉片時 初期 阻及汁液遭大量吸食 危害根部造成萎凋的蟲 亦會產生白色點狀細斑 隨族群數量上升 白 害 以根蟎最為常見 根蟎聚集於植物根部取 斑日漸增多 嚴重時產生大面積或全葉白化 食 繁殖 當族群密度高時會造成植物根部嚴 最後甚至使葉片褐化枯萎 造成植株死亡 節 重受損 影響水分吸收造成地上部生長不良 蟎科中的番茄癭蟎危害番茄植株時 初期會造 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

11 小蠹蟲危害葡萄 天牛於葡萄莖幹蛀食, 將糞便於排糞口排出 木蠹蛾蛀食葡萄細枝 豆莢螟於敏豆果莢內危害 玉米螟危害茄子莖幹 甘藷螟蛾於甘藷莖中蛀食, 並於其內結蛹 夜蛾幼蟲蛀食番茄幼果 ( 圖四 ) 缺乏管理之果樹成為孳生果實蠅之溫床 蟲害診斷鑑定 7

12 番石榴遭果實蠅產卵的痕跡 果實蠅於番石榴內蛀食 南瓜遭瓜實蠅蛀食危害 甘薯蟻象蛀食甘薯之地下塊根 (續圖四) 成輕微黃化 由於蟎體極其微小 容易誤判為 合 生長受阻 生理活性改變等因素 造成植 病害 直至後期嚴重時 葉片 葉柄 莖幹皆 體形狀改變 形成 畸形 植體因蟲害而畸 出現褐色銹斑 造成植株枯萎 盲椿危害葉片 形的成因龐多複雜 在此以田間常見及特殊的 時 其刺吸取食處會呈現水浸角狀斑點 隨時 作物案例進行討論 間漸漸變成白或褐色 嚴重時造成葉片皺縮 枯萎 非蟲害之近似徵狀 病害 藥害 生理障 礙 日燒 蟲害造成的葉體畸形在診斷案件中相當 常見 多是小型刺吸式口器害蟲造成 薊馬類 喜愛取食嫩葉 造成細胞受損 植體發育受阻 而造成葉片捲曲 嚴重時甚至造成皺縮或革質 辨別方式 病害造成之病斑通常有孢子囊 化 細蟎於瓜類等葉片為害時 亦會造成葉片 堆 菌泥等病害特徵 藥害通常於田間分布具 邊緣捲曲 (尤其是幼葉) 並伴隨黃化現象 細 均一性 藥斑危害也容易僅出現於單一側或植 蟎由於體型小 無法以肉眼辨識 易造成誤 體下緣 生理障礙於田間分布具均一性 無蟲 判 但其於瓜類葉片為害時有一特殊特徵 即 體 蟲蛻 蜜露等痕跡 日燒產生位置通常僅 受害葉背會呈現微微亮白色反光 可做為田間 侷限於一側 為曝曬陽光最烈之處 用藥紀錄 快速診斷之參考 有兩種害物可在於荔枝上造 與田間視察為正確判定之重要參考依據 (圖 成葉片畸形 荔枝銹蟎於嫩葉上銼吸時 會分 六) 泌物質 刺激植物組織產生絨毛 猶如毛氈 (三) 畸形 受害葉片增厚 捲曲腫脹 嚴重時影響樹勢 植物遭害蟲取食後 可能因為損傷 癒 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會 荔枝癭蚋則是成蟲於葉片產卵 幼蟲孵化後鑽

13 韭菜遭根蟎為害後 植株萎凋 根蟎為害韭菜地基部 檬果螟蛾造成檬果新稍萎凋 檬果螟蛾危害症狀 番茄刺皮癭蟎造成番茄葉片萎凋 番茄青枯病造成的萎凋 萎凋病造成的菊花萎凋 絲瓜受除草劑影響而萎凋 (圖五) 蟲害診斷鑑定 9

14 葡萄葉片上不同程度之葉蟎危害 葉蟎造成花胡瓜葉片白色點狀斑紋 葉蟎於蕹菜上造成的白斑 蔥薊馬於蔥葉上造成連續點狀白斑 盲椿吸食造成竹葉上之白斑 薊馬洋桔梗遭薊馬危害而白化 (圖六) 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會 缺鋅造成的黃化現象

15 缺鎂造成的倒 V 字型黃化現象 除草劑施用不當 造成葉片黃化 除草劑造成豌豆葉表點狀白斑 病毒感染造成香瓜葉片黃化 (續圖六) 入葉片並刺激葉片組織增生 形成突起的瘤狀 於蟲害零散 不規則的發生狀況 了解作物的 蟲癭 羽化後蟲癭漸枯乾變褐 影響植株光合 病毒發生狀況 提供完整用藥紀錄 以及必要 作用 時至田間調查害蟲發生情形 將有助於辨認作 果實受蟲害影響時也很容易產生畸形 瓜 果實蠅類產卵時 會於果實表面造成機械 物畸形的確切原因 (圖七) (四) 異物汙染 傷口 使果實發育受阻 引發不等速發育 行 害蟲的排泄物或分泌物可能影響植物正 成果實凹陷 彎曲等現象 秋葵果實發育快 常生長 造成間接性危害 當小型害蟲吸食植 速 受到刺吸式口器傷害時 會形成癒傷組 物汁液時 會將多餘糖分 水分排出體外 當 織 造成瘤狀突起 使果實變形 荔枝銹蟎危 害蟲密度高時 這些排泄物大量產生 噴灑在 害荔枝果實時 幼果將停止生長 畸形 終至 植體上 猶如一層黏稠糖液 若引發雜菌滋 乾縮 成果則會產生褐色絨毛 影響品質 生 則會發黑成煤煙狀 即俗稱的 煤煙病 非蟲害之近似徵狀 病害 藥害 生理障 礙 耕作傷害後的癒傷畸形 煤煙病 並不會直接危害植物體 但覆蓋葉 片時將影響光合作用 且會汙染花器 果實 辨別方式 病毒病會造成植株皺縮 葉片 降低商品價值 幾乎小型刺吸式昆蟲皆可引發 捲曲 但通常僅以頂芽嫩稍較明顯 且多伴隨 煤煙病 包括蚜蟲 粉蝨 介殼蟲 葉蟬 腹 嵌紋 黃化徵狀 藥害 生理障礙發生時具均 鉤薊馬等 半翅目中的介殼蟲類 會分泌蠟質 一性 常全園或田間特定區塊均勻發生 有別 或膠狀物覆蓋蟲體 不但造成施藥防治困難 蟲害診斷鑑定 11

16 薊馬危害致葡萄葉片革質化, 生長受阻 蚜蟲吸食致羅漢松嫩葉捲曲 細蟎造成花胡瓜葉片捲曲 黃化 細蟎危害香瓜時, 於葉背產生亮白反光 荔枝癭蚋於葉片形成蟲癭 荔枝銹蟎於荔枝葉片上形成之絨毛物 葉蟬危害造成秋葵果實畸形 ( 圖七 ) 苦瓜遭瓜實蠅產卵後, 產生的畸形果 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

17 施肥不當造成葉片黃化捲曲 除草劑造成葡萄葉片變形 病毒造成番茄嫩葉皺縮 黃化 除草劑造成菊花新稍皺縮 生長受阻 (續圖七) 亦汙染植體 位產生畸形 此案例若非現場勘察與驗證 及 非蟲害之近似徵狀 葉肥施用不當 後續累積相同診斷案件 僅就 可能沾有蜜露 辨別方式 葉肥施用不當時亦會引發雜菌 之秋葵畸形果實 樣本診斷 很難斷定果實畸 滋生 但其發生情形具有均一性 亦無法尋獲 蟲體 蟲蛻等害蟲活動痕跡 (圖八) 形的成因 以蟲害診斷而言 接受案件後通常需快速 判斷相關徵狀 並對案件的成因出現多種可能 結 論 的選項 因此經驗的累積對診斷有相當大的影 響 試驗改良場所中經常有大量案件需要不同 上述案例比較中 部分蟲害徵狀的界定有 領域的人互相參與討論及解決 除了病蟲害的 時判定不易 害蟲為害時的齡期 作物生長時 案例外 植物生理及肥培管理的類似案件診斷 期及生長速度 鄰近植物發生的蟲害等各項因 經驗也有助於釐清案件的真正成因 蟲害診斷 素都足以干擾田間診斷的正確性 有些蟲害也 的工作內容其實與急診室檢傷分類無異 多數 可能產生兩種以上的徵狀 以秋葵果實受葉蟬 案件不需要鑑定至種的位階 只需要確認害蟲 為害的案例而言 鄰近桃樹的秋葵同受葉蟬的 的類群及其危害 根據相關資料作出防治或管 為害 桃樹上有大量葉蟬族群致葉片大量白化 理建議即完成案件 但唯有詳細探究診斷案件 落葉 秋葵植株上有蜜露及少量煤煙病 但僅 的成因 將植體 害蟲 田間狀況或特殊因素 有少量葉蟬停駐 秋葵果實生長快速致刺吸部 詳細記錄 甚至記錄其他領域人員的專業判 蟲害診斷鑑定 13

18 粉介於柑橘上造成的煤煙病 粉介殼蟲於木瓜葉片上為害 膠蟲包覆於荔枝枝條上 金露華上為害的一種介殼蟲 葉肥施用不當 造成果表生成雜菌 (圖八) 斷 才能對樣本做出 診斷 此外 蟲害診 鱗翅目害蟲觀察 臺中區農業改良場研究 斷的經驗與案例需要不斷傳承與驗證 若能有 彙報 24: 系統的整理出相關案件 對第一線的植保人員 將有莫大助益 陳淑珮 王清玲 翁振宇 2008 作物蟲害診 斷服務及鑑定 農業試驗所技術服務 74: 引用文獻 O Day M, Becker A, Keaster A, Kabrick L, Steffey K Corn insect pests: a 張德前 陳慶忠 1989 三種危害豆類蔬菜之 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會 diagnostic guide. M166

19 missouri.edu/p/m166 Kreeuish RM Plant protection 4 - how to diagnose plant problems. h/pp4.pdf Green JI, Maloy O, Capizzi J Kentucky master gardener manual chapter 7: diagnosing plant problems. ID Master Gardener Publication.htm 蟲害診斷鑑定 15

20 Diagnosis of Insect Injuries to Crops, a case Analysis Da-Yuan Lin, Yi-Chih Yu, and Kuei-Fang Pai * Taichung District Agricultural Research and Extension Station, Council of Agriculture, Executive Yuan, Changhua County 515, Taiwan ABSTRACT Diagnosis of insect injury critically concerns pest control decision and efficacy in field. Fast and correct diagnosis of sample and field condition is the most important aspect. In this article, insect injuries were divided subjectively into two categories, which were apparent injuries and delayed injuries. Apparent injuries include main symptoms such as notches, scars, mining tunnels and emergence holes. Delayed injuries have some obscure symptoms like wilt, discoloration, malformation and surface contaminants. Specialists must analyze any information comprehensively to avoid misdiagnosis for reasons of seeking diagnosis maybe complex. With systematically examination of insect samples or injury symptoms and detail information about pest condition, occurrence and control treatments, we could offer pest control recommendations based on correct diagnosis. Key words: insect injuries, diagnostic 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會 * Corresponding [email protected]

21 研究報告 2015 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會 P Symposium on Trans-Century Plant Protection and Quarantine Technologies P17-35 病害診斷鑑定技術 * 楊秀珠 行政院農業委員會農業藥物毒物試驗所 413 臺中市霧峰區舊正里光明路 11 號 摘 要 植物病害可分為感染性病害與生理症, 感染性病害可依形態及病原菌生態分類, 主要有病毒 類病毒 細菌 真菌 線蟲等, 可由外部病徵診斷病害種類及病原菌分類, 無法由外部病徵診斷者, 亦可藉助生化方式鑑定 生理症包括急性傷害與生理障礙, 急性傷害多為環境快速變化與一次性全面之管理失當所造成 ; 生理障礙則為長期之營養失調所引起 由於外部病徵表現會受環境 栽培條件 氣候條件與時間等因素影響, 進行診斷時除須詳細觀察外部病徵外, 同時須了解植物所在地之詳細資料與栽培歷史, 方可正確診斷, 而達成對症管理之目標 關鍵詞 : 診斷 植物病害 病原菌 環境因子 栽培技術 生理障礙 前言所謂健康植物應具備下列條件 : 一 外表正常 : 健康植物的特徵包括 1. 植株挺立或硬實, 組織表面緊繃呈保水狀 ;2. 植物器官如根 莖 葉 花 果實 種子等形狀或顏色均勻, 無不規則破損或變色, 是以健康葉片應為顏色規則 均勻, 無斑點 不規則突起 破損 皺縮或其他明顯不同之外觀變化 ; 健康莖須為直立 飽滿 組織均勻, 葉腋及分枝處無異物附著 健康根則具有白色 具多數根毛, 無異味之特徵 ; 二 生理作用正常 : 植物之生長速率適中, 與其他同種植物之生長速率相同, 無 太快或太慢現象 ; 三 未受傳染性害物為害 然而物化因子如環境 氣候與肥培等及感染性因子包括病原菌 蟲害 雜草及其他有害生物等影響, 植株出現異常現象, 若未加以排除, 往往引發作物不健康, 甚至造成農業之嚴重損失, 其中病害之損失佔其大部份, 因此, 如何在作物病害發生時, 迅速診斷 鑑定, 並提出解決策略, 當可維持農作之經濟效益 良好之生長環境為栽培健康植物所必備之條件, 其中包括土壤顆粒大小適宜 土壤酸鹼度平衡 根系生長之空間足夠 養分平衡 水分充足 溫度適宜 光照充足以及通風良好, 若植物生長於適宜之環境, 則植物與環境 * 論文聯繫人 Corresponding [email protected] 病害診斷鑑定技術 17

22 表一感染性病害與生理性病害之主要差異 特徵 傳染性病害 生理性病害 病株分佈 不均勻, 由一點或數點開始發生 均勻分佈, 大面積同時或特殊部位發生 症狀特點 有病徵狀, 有些具病兆 有病徵, 無病兆 侵染特性 具傳染性, 由發生點開始向其周圍快速或緩慢的擴散 無傳染性, 不會擴散 病源 可檢測到病原菌 與理化因素相關, 無病原菌 恢復性 罹病組織或病徵不可復原 受害組織或症狀可復原 維持互動關係, 當環境改變時, 植物可內部調適而維持正常生長, 但若環境之改變為持續性或劇變, 則植物無法調適而引起生長及功能之不正常, 稱為病害 而為害作物之主要生物因子為蟲害與病害, 蟲害可於被害植株上發現蟲體 蟲孔 ( 食痕 ) 蟲癭及蟲糞, 藉由表徵區分極為容易, 故一般病害診斷乃針對生物性因子即感染性因子進行診斷, 然引起作物異常之因素尚包括非生物因子, 亦即環境因子 氣候及突發性因子等因素對作物所造成之影響, 因此作物病害診斷仍須考慮非生物因子所造成之影響, 而非生物性因子引發之植物異常, 往往加劇生物性因子之為害程度, 在作物管理作業上不可輕忽 病害診斷之基本原則一 觀察異常植物之症狀病害診斷須由觀察作物所表現之不正常現象, 亦即症狀 ; 觀察症狀可用肉眼觀察或借助放大鏡 顯微鏡等, 且同時須觀察鄰近植物是否出現相同之症狀表徵, 進展過程及嚴重度 出現部位保存詳細記錄有助於診斷 至於時間因素亦不可忽略, 症狀最初出現之時間及已持續發生之期間為重要之考量因素, 若無法確知最初發生時間, 可嘗試藉由症狀進展過程推算最初發生時間 二 鑑定 比對症狀植物因受外在因素影響, 而產生外表上之變化, 可視為症狀, 若因病原菌與植物接觸後, 促使植物組織產生肉眼可辨識之變化, 一般稱為病徵 (symptom), 而在病徵上可見到病原菌則稱為病兆 (sign) 異常植株所表現之表徵為診斷 鑑定之重要依據, 而表徵往往受病原 環境與栽培技術影響, 因此診斷 鑑定時須由栽培環境 栽培管理方式 作物生長情形及發生時期著手 因此於栽培期間應保存詳細且完整之環境及栽培操作過程之記錄, 以備不時之需 植物病害因致病因子不同可區分為感染性病害與生理障礙, 二者之病株分布 症狀特點 侵染特性 病原與恢復性均有明顯之差異, 詳如表一之描述 簡而言之, 感染性病害多由一點或數點開始發生, 初期病株均呈零星分布, 且由發生點開始向其周圍快速或緩慢的擴散, 栽培環境改變時, 所表現之徵狀可能會有消減現象, 但無法完全回復, 一旦環境變惡劣或病原菌之病原性增強時, 病徵亦加劇 而生理症則為同一時間在植株的相同器官和部位, 出現相同的症狀, 發生後不會蔓延 三 確認病原感染性病害之診斷通常須依據柯氏法則 (Koch s postulates) 進行, 共可分為四步驟 : (1) 病原菌與病害之發生有絕對之相關性, 亦即於病徵發生部位必定可發現致病之病原菌 (2) 病原菌可以分離 培養 純化或可以 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

23 生長於感病寄主上 : 大部份之真菌及細菌引起之病害均符合此一原則, 但少部份絕對寄生菌, 如露菌病及白粉病等, 則無法進行分離培養, 故僅能培養於感病寄主植物上 ; 病毒感染者, 僅能將病毒由寄主植物經純化, 以特殊方法保存 ; 至於線蟲引起者, 與絕對寄生真菌之特性相同 (3) 分離 純化所得之純化菌種必須可接種在原寄主植物上, 並且產生完全相同之病徵 (4) 由接種所得之病徵發生部位, 必定可再度將病原菌分離 培養, 且其特徵與 (2) 項所得之純化菌種相同 因此診斷絕對寄生性真菌及線蟲引起之病害時, 可將病原菌之菌體直接由寄主組織上取出, 去除雜質後稍經處理而得單一菌體, 而後再進行接種試驗 ; 至於病毒及菌質引起之病害, 則往往須應用嫁接 昆蟲 傷口 汁液與磨擦等方法接種於指示植物 (Indicator Plant), 待表現特殊病徵後, 再以此病徵作為病害鑑定之參考 利用傳統診斷無法診斷之害物, 包括病毒 類病毒及菌質體等, 可利用生物科技發展相關技術, 製備單元抗體或核酸探針, 作為偵測診斷的工具, 正確診斷進而對症治療 目前已完成多種植物病毒, 包括竹嵌紋病毒 香蕉萎縮病毒 柑桔萎縮病毒 葡萄捲葉病毒 木瓜輪點病毒 齒舌蘭輪斑病毒等, 以及引起甘薯簇葉病 落花生簇葉病和水稻黃萎病等之菌質體之單元抗體, 並已實際應用於 ELISA ( 酵素聯結免疫抗體法 ) 偵測技術上, 作為植物病害之偵測 診斷, 以為管理之基礎 例如竹嵌紋病毒之單元抗體已用於偵測臺灣竹類病毒的感染情形 ; 香蕉萎縮病毒單元抗體用於檢定組織培養苗以生產無病毒健康蕉苗 ; 柑桔萎縮病毒單元抗體用於田間病毒系統之調查及交互保護用弱毒系統之追蹤 ; 齒舌蘭輪斑病毒單元抗體用於蘭花上病毒之偵測與無病毒苗之篩選 在核酸探針之研製方面, 亦已完成黑穗 病菌 腐霉病菌之菌種鑑別及昆蟲病毒多角體偵測用核酸探針 同時由於核酸探針之偵測靈敏度高於 ELISA 法, 所以再進一步開發上述病毒與菌質體之核酸探針 核酸探針的應用, 如腐霉病菌之專一性核酸探針可偵測水耕蔬菜栽培養液中之特定腐霉病菌 ; 而利用核酸探針偵測罹患竹嵌紋病之竹株, 其靈敏度較 ELISA 法高出 500 倍 生理症障礙為由環境不適植物生長所引起之異常現象, 診斷時考量之栽培環境因素須包括溫度 濕度 通風 肥料及土壤之物理及化學性質等, 均可能為病害之致因 ; 栽培管理方式則須考慮種植 施肥 除草 給水及施藥各方面等因素, 若能保存詳細之資料, 可協助判斷是否曾進行不正確或不適當之處理而導致為害 依據上述原則將表徵詳細描述, 推測可能之為害因子, 並按可能性依序排列, 列出一詳細之清單, 再依據環境之變化, 推測環境變化造成為害發生之可能性, 以此資料與已記載之為害因子進行詳細之比對, 以尋找正確之為害因子 ; 若無法於國內之記載獲得證實, 則須參考國外資料, 或交由專家試驗研究 四 擬定管理策略擬定管理策略時須詳列可行之對策, 且不考慮防治費用, 同時必須抱定決心, 當擬定之管理策略無法施行時, 則將作物予以廢耕 所擬定之改善措施, 須實際可行 改善作物之不正常狀況, 進而促使作物正常生長 因此, 擬定管理策略時須考量 :1. 依據生產計畫與害物整合管理 (IPM) 原則, 擬定改善措施 ;2. 評估所須使用之資源 工具 設備和機械等, 同時估計所有資源之供應性 可用性與替代性, 並分析所需的成本 效益與執行人員 ;3. 確認作業人員之健康與安全, 並進行作業過程中之 病害診斷鑑定技術 19

24 圖一 植物病害診斷作業流程 風險評估和管理 4. 在可行的範圍內 改善作 五 評估管理成效 物之生長條件 以及 5. 因應所造成損失之管 管理策略擬定後 除須積極執行外 並須 控 市場需求 以及對農業永續經營之影響 於執行後評估管理成效 以為改進之參考 管 評估特定植物種類生長條件之改善措施 理成效評估宜包括 1. 持續監測植株之生長狀 實際可行之防治策略必須符合三要素 1. 況與不正常狀況之發生與進展 2. 保存完整 簡單易行且合乎經濟原則 2. 施行防治策略之 詳實紀錄 3. 持續監測並評估預期效益之符合 最有效時機極易掌握 3. 實際施行防治策略所 性 4. 依管理成效修改管理策略 及 5. 製作 須耗費之人力及時間 須不超出栽培管理所能 並保存完整 詳實之管理報告 容許之最高限 但若經過詳細評估後發現所提 出之防治策略不合乎經濟效益 或該防治策略 病害診斷之作業流程 無法徹底防除病害時 則剷除所有植株 重新 種植 當可將病原徹底清除 否則安於現狀不 植物病害診斷之主要目的在於了解植物 作任何處理 病害經一段時間之擴展而達到穩 之不健康狀況 判定影響之因子 同時提出改 定平衡後 自然不再擴展 如此可避免造成無 善措施 促使作物健康而生產高品質之優質農 謂的浪費 產品 診斷流程詳如圖一 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

25 表二影響植物病害發生之環境條件 環境氣候 温度 光照 濕度 風向等 不正常氣候 氣候狀況 持續時間 通風 良好 可或不良等 栽培地理環境 平地 坡地或高山地區 ( 海拔高度 : 公尺 ) 栽培環境 露天 設施 栽培設施 隧道棚 簡易棚架 簡易黑網 網室或溫室 栽培方式 穴盤 盆栽 袋耕 槽穴 本田及水耕等方式 質地 : 砂質土壤 砂壤土 壤土 粘質土壤等 土壤條件 有機質肥料 : 不施用 施用 ; 施用時, 每季施用量 ( 公斤 / 公頃 ) ph 值 : 鹽基 : 排水 : 佳 可或差 通氣性 : 佳 可或差 一 田間實際發生狀況觀察 檢視主要為外表異常現象觀察, 包括辨認異常與健康作物之外表形態與生理特徵與檢查不同組織之受害狀況 檢視植株受害出現之症狀時, 除觀察異常現象持續之時間外, 仍須觀察葉片大小 顏色是否正常 樹冠生長與大小是否正常 植株正常生長勢, 包括植株高度 枝條生長速度 葉片數等 二 發生史調查發生史調查除了解病害之嚴重度 進展狀況 持續時間及受害植株之分佈與擴展狀況等, 同時須了解鄰近植物之生長狀況, 須觀察之項目包括 : 鄰近之作物種類 相同作物是否發生相同症狀 不同作物是否正常生長 ; 同一田區之不同作物是否發生相同症狀, 若同一田區之不同作物均出現相相同症狀, 則有可能是因環境失調引發生理障礙, 或寄主範圍廣之病蟲害發生, 而小型昆蟲分泌之蜜露引發煤病亦不可忽視 此外, 並須觀察並詳細了解作物之栽培過程與生長狀況, 以為診斷之參考 三 發生環境調查發生環境調查首先須檢測環境因子 氣候 條件, 同時比較受害與健康作物間, 栽培管理方法之差異性 所須檢測之環境因子詳如表二 四 彙整 分析, 歸納異常現象之類別觀察並與現有資訊 歷史記錄 自身的經驗和技術準則進行比較 : 每一作物均有不同的環境須求 ( 如光照 水分 ) 栽培管理須求與營養須求, 也可能發生不同的病害與蟲害, 而部份症狀僅發生於特定品種 ; 而不同的原因亦可能產生類似而難以區分的症狀 因此, 診斷前須先了解該作物之常見的病蟲害與生理症狀 土壤酸鹼度對營養成分吸收之影響等, 若診斷前能掌握完整之相關資料, 以作為診斷之依據, 則較易獲得正確之診斷結果 五 病害發生確認除充分觀察出現的症狀與此一症狀在植株與田間之分布狀況外, 同時須監測此一症狀最初出現的時間點 明顯症狀於何時出現及症狀進展過程與時間之相關性, 亦即由初期症狀出現至發生嚴重發生而不再擴展之進展過程與症狀全程進展所須之時間, 並持續監測症狀持續於田間發生時間之長短, 再綜合所收集之 病害診斷鑑定技術 21

26 表三 感染性病害之主要病徵與診斷 病害類別 真菌性病害 細菌性病害 菌質病害 病毒病害 線蟲病害 寄生性植物 症狀診斷 病 徵 葉斑 葉枯 枝枯 變色 壞死 腐爛 萎 凋 畸形 斑點 黃化 潰瘍 腫瘤 病 兆 病斑上可見病原菌菌體 (病 兆) 葉斑 葉枯 枝枯 軟腐 潰瘍 腫瘤 變 色 壞死 萎凋 畸形 斑點 黃化 葉緣 焦枯 局限導管 植株矮縮 叢生 小葉 黃化 花變葉 系統性 變色 嵌紋 壞疽 畸形捲葉 植 株矮縮 簇生 生長勢衰退 媒介物傳播 菌泥 菌塊 變色 壞死 腐爛 萎凋 畸形 矮化 黃 化 腫瘤 直接觀察病原 根瘤 胞囊 病斑上無病原菌菌體 病斑上無病原菌菌體 輔助診斷 顯微鏡觀察 保濕培養 病原菌分離培養 病組織菌泥觀察病原 菌分離培養 電子顯微鏡觀察 鑑別寄主測定 電子顯微鏡觀察 生物技術鑑定 線蟲分離鑑定 資訊 判斷影響植株健康 並列出可能之原 引起之病害 病徵出現於新生部位而後隨植株 因 並逐一驗證並去除不可能之因子 藉以確 生長而擴展至呈全株系統性病徵 黃綠嵌紋壞 認為害因子 疽斑 畸型或捲縮 生長勢較弱 此病徵會因 環境改變而減輕 但不會消失 細菌引起之病 診斷要領 害 多於罹病部位出現乳濁狀菌泥 切片置於 水中會污濁水 切面位置多濕高溫 (適溫時) 作物在田間出現不正常現象之因素有 會出現乳白或乳黃菌泥 切片用顯微鏡觀察時 二 分別為生物性因子與非生物性因子 而生 由被害處流出細菌 被害株處黃化或簇葉狀 物性因子主要之病原包括真菌 細菌 菌質 或葉緣焦枯 線蟲病 可行內寄生及外寄生 病毒 線蟲及其他寄生性植物 非生物性因素 罹病部位呈瘤腫或腐爛狀 罹病植株之根系減 引起之作物不正常包括 因環境劇變所引起之 少 斷根 根腐 殘根 根腫大 根增生及根 傷害 藥害 鹽害 (肥傷) 空氣污染 水污染 捲曲 真菌病害 罹病部位出現菌體 可感染 等 而因肥料所引起之生理障礙常被誤為病 新梢 葉片 花器 莖基部及根部 感染莖基 害 診斷時不可不慎 不同病原引起之症狀與 部及根部 可藉土壤及灌溉水等傳播 感染地 輔助診斷方法詳述於後 上部 藉風 雨水 霧水及昆蟲等傳播 寄生 藻類具葉綠素或其他色素 可行光合作用製造 一 感染性病害 (Infectious disease) 感染性病害發生時 病徵呈零星分布而後 擴展至全園 且病徵不會於短期間同時出現 養分 與寄主植物行寄生或共生關係 顯花植 物具或不具葉綠素 可明顯區分其根 莖 並 藉由吸器侵入寄主植物吸取養分 但若由因無性繁殖苗全面帶菌時 則可能於短 真菌引起之病害種類極多 病徵極具特 期間內全面發病 分別依不同病原引起之病害 徵 並易於病徵上觀察到病原菌 較易由罹病 所呈現之主要病徵作一簡要說明 (表三) 病毒 植株體表診斷 鑑定 至於細菌 病毒等病原 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

27 表四土壤傳播性真菌病害 1a. 病害發生於幼苗期 2a. 種子發芽後, 胚軸萌前即受害 3a. 胚軸之生長點受害, 罹病部呈褐色水浸狀斑, 病斑有時與健康部位有明顯界限立枯絲核菌 3b. 胚軸上水浸狀斑之組織凹陷, 通常組織會迅速瓦解, 呈軟腐狀倒伏腐霉病菌 2b. 種子發芽後, 胚軸突出土表面後受害 4a. 幼苗接觸土壤表面之莖基部受害 5a. 幼苗之莖基部呈水浸狀 變細, 組織軟化 瓦解, 病徵急速蔓延, 造成大面積軟腐腐霉病菌狀, 後期病班顏色轉黑 5b. 幼苗莖基部呈水浸狀後, 組織軟化面積較小, 顏色不轉黑立枯絲核菌 5c. 莖基部病徵, 初呈圓形或橢圓形凹陷, 嚴重時病斑向四週擴展, 使莖部外圍皮層細立枯絲核菌胞瓦解, 只剩下中柱支撐植物體 4b. 幼苗之主根或支根受害 6a. 幼苗根部由根尖部位受害 7a. 受害之根部褐化但不瓦解軟腐鐮胞菌 7b. 受害之根部褐化且迅速擴及全部根莖並瓦解呈軟腐狀腐霉病菌 6b. 幼苗根部不一定由根尖受害立枯絲核菌 4c. 幼苗莖葉枯萎 腐敗且土壤表面可見漏斗形子囊盤之構造菌核病菌 4d. 幼苗出土後, 莖葉有潰瘍及焦枯病徵立枯絲核菌 1b. 病害發生於成株期 8a. 植株地上部萎凋, 莖部之維管束褐化 9a. 維管束褐化, 用力擠壓可流出乳白色混濁汁液細菌性病害 9b. 維管束褐化, 無乳白色汁液流出, 且初發病時呈半側萎凋狀鐮胞菌 8b. 植株地上部萎凋, 莖部之維管束無褐化現象 10a. 植株莖基部受害 12a. 受害莖基部呈腐敗狀 14a. 莖部中空呈乾腐狀, 偶而可見白色絹狀菌絲及褐色圓形菌核白絹病菌 14b. 莖部呈軟腐狀, 表面或內部有黑色如鼠糞狀菌核菌核病 14c. 莖基部軟腐顏色變黑腐霉病菌 12b. 受害莖基部呈現潰瘍 壞疽斑, 病斑呈紅褐色與健康部區隔明顯立枯絲核菌 10b. 植株根部受害 13a. 根部由根尖處開始褐化 15a. 根部褐化, 但不立即瓦解, 後期根之皮層易剝落, 只留下中柱鐮胞菌 15b. 根部褐化後皮層組織瓦解, 但表皮不易與中柱分離腐霉病菌 13b. 根部出現壞疽斑立枯絲核菌 13c. 根部變褐色, 伴隨有白色絹狀菌絲出現白絹病菌 10c. 可感染新梢 葉片 花器 莖基部及根部疫病 腐霉病菌 8c. 受害植株之少許葉片或枝條呈現失水狀枯萎 11a. 葉片或枝條枯萎後, 無軟腐現象產生, 後期則全株死亡鐮胞菌 11b. 葉片或枝條枯萎後, 有軟腐現象, 濕度高時病斑處會產生白色菌絲及黑色如鼠糞狀之菌核病菌菌核 11c. 葉片或枝條枯萎後, 病斑處會產生紅色菌絲層赤衣病 11d. 葉片或枝條枯萎後, 病斑處會覆蓋明顯之菌絲層, 有如膏藥狀 膏藥病 8d. 植株根部 地際部份受害, 組織褐變, 後期植株萎凋 死亡 12a. 無明顯菌體, 濕度高時, 受害根出現白色幅射狀菌絲白紋羽病 12b. 無明顯菌體, 剝視受害組織, 呈網紋狀 褐根病 病害診斷鑑定技術 23

28 表五真菌引起之地上部病害 1a. 為害枝條 2a. 為害木本植物 3a. 由自然開口侵入及傷口侵入, 造成枝條褐化 凹陷之病斑, 嚴重時植株乾枯 萎凋死枝枯病亡 3b. 新梢感染, 病斑初期呈水浸狀, 以後乾枯, 罹病組織上覆蓋灰色黴狀物灰黴病 2b. 為害草本植物 4a. 初期病斑呈水浸狀並逐漸擴大, 後期萎凋, 若由地際部份侵入, 可造成植株死亡灰黴病 4b. 被害部呈瘤狀或類似狀, 內含大量黑色粉狀物黑穗病 4c. 可為害莖 葉等地上部組織, 造成黑褐色水浸狀病斑, 嚴重時整株萎凋 死亡 晚疫病 1b. 為害花器 5a. 高溫時發病嚴重 6a. 病斑部呈水浸狀腐爛, 濕度高時罹病部覆蓋白色菌絲, 頂端著生黑色球形顆粒 Choanephora sp. 6b. 花辦上出現黃褐色至褐色病斑, 濕度高時出現黑色粉末狀顆粒, 病斑部常見呈同心輪 Alternaria sp. 紋狀 5b. 低溫時發病嚴重 7a. 初期呈水浸狀病斑, 嚴重時花朵腐爛, 濕度高時病斑部覆蓋灰色粉末狀物灰黴病 1c. 為害葉片 8a. 低溫度發病嚴重 9a. 濕度高時發病嚴重 10a. 幼嫩葉片較易罹病, 病斑部覆蓋灰色黴狀物, 可藉風及雨水傳播灰黴病 10b. 病斑呈角斑病斑部覆蓋白色至黃褐色黴狀物, 嚴重時葉片變型, 並會造成落葉露菌病 10c. 被害部呈不整大型輪紋斑, 上著生白色胞子束, 天冷多濕時才會發生 Cristulariella 10d. 被害部呈橄欖色至黑色斑, 上著生黴狀物, 天氣較涼時易發生黑星病 9b. 濕度低時發病嚴重 11a. 病斑突出寄主表面 12a. 病斑部組織上表皮凹陷 下表皮突出, 病斑部呈黃色腫瘤狀餅病 12b. 病斑呈白色, 後期轉為黃褐色, 濕度高時釋放小生子, 為新的感染源白銹病 12c. 病斑呈黃褐色至紅褐色, 大小不超過 1 厘米, 後期病斑破裂, 釋出銹色夏銹病胞子 11b. 病健部份界線不明, 白色粉末狀物覆蓋於病斑部, 嚴重時葉片扭曲變形白粉病 8b. 高溫時發病嚴重 13a. 病斑為紅色至紅褐色 圓形至紡錘形, 後期病斑部可產生黑色粉末狀物, 為新的感赤斑病染源 13b. 病斑為黑色, 圓形, 病健部份組織界線分明, 偶而可見黃色暈環, 嚴重時會造成落黑斑病葉 13c. 被害部呈白色小斑突起白銹病 13d. 被害部呈水浸狀褐色或黑色, 邊緣組織產生白色黴狀物, 多發生於雨季疫病 舞病 8c. 週年發生 14a. 病斑為圓形至不規則形, 亦可見由傷口及自然開口侵入, 後期病斑可見黑色顆粒, 炭疽病濕度高時可溢出粉紅色至桔紅色之分生胞子堆 14b. 病斑呈圓形至不規則形, 後期病斑部覆蓋黑色粉末狀物, 乃病原菌之分生胞子, 因葉斑病受光照影響, 病斑明顯呈同心輪紋狀 (Alternaria sp.) 14c. 被害部呈煤煙狀, 佈於被害面, 多發生於葉表面組織, 剝之可脫落煤病 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

29 則須藉助儀器或生化技術方可順利完成 由真菌引起之土壤傳播性病害之病原菌存活於土壤中, 藉土壤及灌溉水等傳播, 可感染莖基部及根部, 常見之發生部位與病徵如表四所述 真菌引起之地上部病害可感染枝條 莖部 葉片及花器, 並產生不同病徵, 依其發生部位與病徵分別描述於表五 二 生理症若環境劇變所導致之徵狀於短時間內迅速出現, 低溫 環境劇變 藥劑使用不當 施肥不當以及栽培管理上之失誤均可導致植物不正常, 則稱為傷害 (injury) 或稱急性病害 (acute disease), 此類不正常因發生突然, 且立即造成傷害, 因此一旦產生徵狀後無法治療, 僅能藉此獲得經驗而防患未然, 故稱為傷害 (injury), 經由長時間之環境改變而造成之不正常, 又可稱為生理障礙 (disorders) 植物長期生長於不適合之環境而造成形態或生理之不正常現象均通稱為生理障礙, 而不適合之環境因子可能為養分不平衡 雜草競爭以及土壤之 ph 值等, 此類現象於不適合之環境因子消除後, 逐漸恢復正常 至於土壤水分 土壤通氣性 土壤堅實度 光照 溫度等環境因子亦間接造成生理障礙 生理症之診斷要點可描述如下 :1. 突然大面積同時發生, 發病時間短, 多為空氣污染 氣候因素如凍害 焚風 日燒 酸雨所致 ;2. 為害狀只限於某一品種發生, 出現生長不良或有系統性的一致症狀, 多為遺傳性障礙所致 ;3. 全面性出現明顯的枯斑 灼傷, 且多集中在某一部位, 無既往病史, 多為使用農藥或化學肥不當所引起之藥害與肥傷 ;4. 局部性 特定部位或特殊氣候環境發生, 出現組織褪色 焦枯現象, 多為強光照射之日燒 ;5. 明顯的元素失 衡症狀, 多見於老葉 頂部新葉或果實特定部位 為有效及快速診斷生理症, 表六簡單描述一般較常見之急性傷害, 表七則針對生理障礙區分不同之症狀 三 植物之疑難雜症大部份的植物病害均可依前述技術進行診斷, 但受環境因子及栽培技術影響, 症狀及病徵的表現往往出現非典型症狀或病徵, 造成診斷上之困難, 常見之疑難雜症說明如後 ( 一 ) 同症現象 (homosymptom): 不同屬 種的病原物或不同病因引起相同的 ( 或相似的 ) 症狀 ( 二 ) 異症現象 (heterosymptom): 同一種病原物在同一植物上出現不同症狀 ( 三 ) 隱症現象 (masking): 在一定條件下症狀暫時消失, 一旦具備發病條件時症狀又重新出現 ( 四 ) 潛伏感染 (latent infection): 由於植物的生育期抗性或環境條件不適合, 病原菌侵入寄主後長期存活而植物不表現症狀, 一旦寄主抗性減弱或條件適合, 病原菌迅速增殖擴展, 導致植物發病和表現症狀 炭疽病為最典型之潛伏感染病害 ( 五 ) 複合感染 (compound symptom): 當同一植株受兩種或兩種以上的病原菌感染, 產生兩種完全不同的症狀, 如腫瘤和壞死, 或感染後共同發生的症狀, 不同於兩種病原菌單獨感染 明顯可見的案例為甜椒栽培過程中因缺鈣引發果實於臍部出現褐色 乾枯病狀時, 受傷織易為炭疽病侵入造成果實腐敗, 以致喪失商品價值, 嚴重損失其經濟效益, 而高溫季節之果實日燒亦可導致炭疽病發生 以豆科蔬菜與甜椒為例, 主要之病害詳列於圖二至圖三十八, 供為田間診斷之參考 病害診斷鑑定技術 25

30 表六急性傷害之原因與常見症狀 2.1. 急性病害 ( 傷害 ) 環境劇變造成之生理性傷害 機械傷害葉尖褐化或由葉尖開始出現塊斑 ; 全株中間部份枝條葉片黃化, 葉片捲曲褐化光度 溫度及相對濕度劇變 : 落葉栽培管理不當落葉落芽葉片黃化葉片萎凋 新葉變小 枝條軟弱土壤物化條件不適土壤表層有結晶體 堅硬根生長不良 生長延遲嫩葉退綠造成葉片呈黃綠狀葉尖捲曲褐化, 落葉 萎凋或大量落葉 根系發育不良 植株衰弱 根部腐爛常因底層有硬土層造成生長延遲葉尖捲曲褐化, 出現斑點或斑塊, 全株黃化 落葉 萎凋或大量落葉 水分失調葉片黃化, 葉片出現黃色 褐色斑點 葉片黃化 頂端葉片褐化 植株萎凋頂端葉片褐化 葉片乾縮老葉黃化, 葉間捲曲褐化, 葉尖褐化或由葉尖開始出現黃色 褐色斑點, 葉片減少, 嚴重者落葉 ; 生長不良 生長延遲 植株褪色, 嚴重莖部腐爛 植株萎凋 葉片上產生黃色或白色斑點光照影響生長不良 生育期延遲 葉片減少 植株褪色 枝條徒長 葉片變長且有褪色現象 老葉黃化 花苞小且著色不良葉尖褐化或由葉尖開始出現塊斑, 老葉葉間捲曲褐化 新葉變小緊縮 全株黃化, 嚴重者植株萎凋向陽部份組織初期呈水浸狀灼傷, 後期褐化 萎凋黃色 褐色斑點溫度失調生長不良 葉片減少及植株褪色生長不良, 全株黃化, 生育期延遲 葉片黃化落葉, 老葉變小捲曲, 新葉變小且緊縮落芽葉片腫大 葉脈突起 水浸狀病斑並轉為紅 褐色 移植突然改變栽植環境通風不良密植肥料中之鹽分累積土壤呈強酸性土壤酸鹼值不平衡土壤鹽基 (EC) 過高土壤條件環境劇變 : 溫度 濕度 空氣等因素造成土壤通氣不良土壤排水不良土壤過份乾燥乾旱水分不足濕度太低水分過多冷水噴濺光照不足光照太強日燒強光照下過多水分留於葉片上高溫低溫寒害芽形成時期溫度劇變低溫時植株吸收土壤中之溫水 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

31 表六急性傷害之原因與常見症狀 ( 續 ) 空氣污染 : 葉尖褐化或由葉尖開始出現塊斑 葉片黃化並有微小斑點, 其後造成褐色乾枯 a. 植物組織褪色如被漂白 二氧化硫 b. 葉片邊緣或尖端深褐色向內部進展, 亦可由土中吸收為害 氟 c. 顆粒狀沈澱物 泥粉 燃燒物灰渣 灰塵 藥害 : 葉尖褐化或由葉尖開始出現塊斑 葉片出現黃色 褐色斑點 葉片捲曲 葉片乾縮 葉部畸型, 嚴重時落葉 a. 葉片畸型或植株生長不正常除草劑 (a) 接觸部位畸型 接觸性除草劑 (b) 症狀出現於全株, 尤以新生長出之部分最明顯 生長調節型殺草劑 b. 殺菌劑 殺蟲劑或混合藥劑 (a) 發生時間整齊, 一般在噴藥後數天之內全面或噴藥量多處發生, 嚴重者數小時後即發生 (b) 果實一般有面向性, 即向南面比向北面嚴重 c. 萎凋或大量落葉化學物質中毒 表七常見之植物生理障礙 1. 營養缺乏 1.1. 於植物體內不易移動之元素 由嫩葉頂端變形並延伸至葉基部, 以後莖頂端部份枯死 a. 頂端部份新葉變成釣子狀, 葉緣波浪狀紅黃色, 並由頂端及四周開始乾枯, 最後莖頂缺鈣端部亦乾枯 b. 頂端部份新芽基部變淡綠色, 新芽枯死 彎曲後頂端部份枯萎 部份枝條節間縮短, 缺硼表皮龜裂呈橫裂紋 維管束曲摺或橫斷裂 受粉不良 花苞畸型 果實畸型 1.2. 莖頂端部份不會枯死 新葉黃白化, 產生壞死斑後枯萎缺氯 頂端部份新葉枯萎 捲曲, 變褐色, 不易抽稍 枝條軟化 葉片尖端凋萎, 葉片彎曲呈杯缺銅狀 新葉黃化 白化或出現褐斑, 但葉片不會枯萎 a. 葉肉組織或纖維質部份出現淡綠或灰白條紋, 後褐色小斑點, 葉脈仍維持綠色缺錳 b. 一般不出現枯死斑點 (a) 新葉葉肉組織變黃並延伸至葉脈 全葉淡黃色缺硫 (b) 新葉黃白化, 葉脈初期仍維持綠色, 後期全葉黃白化缺鐵 2.1. 於植物體內易移動之元素, 缺乏症狀由成熟老葉開始出現 下位葉變黃並出現黃斑, 以後轉為褐色斑點, 葉脈仍維持綠色, 但葉片不乾枯 a. 下位出現黃斑, 以後葉片呈酒杯狀向上捲曲缺鉬 b. 下位葉脈間葉肉組織出現黃斑, 葉緣仍保持綠色, 並向上延伸, 以後斑點轉為紅色斑缺鎂點, 嚴重時黃化部位壞疽, 落葉 c. 葉片變黃或出現褐斑, 最後組織壞死, 葉片呈褐色斑點 (a) 葉片初期呈暗綠色, 以後葉尖及葉緣先黃化或褐化後枯死, 莖部纖細, 老葉出現缺鉀白色或黃色斑點, 斑點後期壞疽 (b) 葉片增厚, 葉脈間出現木紋狀之細微黃斑, 以後褐變, 葉片明顯變小, 葉片黃化, 缺鋅壞疽, 根生長不良 病害診斷鑑定技術 27

32 表七 常見之植物生理障礙(續) 由下位開始乾透而逐漸枯萎 莖部纖細並呈紫紅色 a.由下位葉向上依次變淡綠色 由內向葉緣逐漸黃化後轉為淡褐色乾透 葉片枯萎 脫 落 b.植物呈深綠色 莖部呈紫紅色 下位葉變黃或乾透 呈綠褐色或黑色 後期出現紅色 斑點或紫色斑點 並壞疽 2.營養過多 肥料過多會造成肥傷 又稱 鹽害 2.1.植株生長受阻 並出現異常現象 葉色濃綠 莖葉軟弱 少花 徒長 抗病 抗寒 抗旱性降低 葉緣焦枯 土壤易變酸 成熟葉開始葉尖 葉緣黃化後 全葉黃化 並落葉 生長被抑制 葉尖有水浸狀小點 葉緣色澤較淡隨後褐斑壞疽 易生毒害 異常性落葉 根部伸長受阻 葉肉組織色澤較淡呈條紋狀 2.2.抑制其他元素吸收 導致其他元素缺乏症 分生組織旺盛使植株矮小 早熟易減產 葉片肥厚 易引起鋅 銅及鐵缺乏症狀 下部葉 出現紅斑 葉尖焦枯易造成鈣及鎂缺乏症狀 土壤易成中性或鹼性 引起微量元素不足 (鐵,錳,鋅) 葉肉顏色變淡 葉尖紅色斑點或條 紋斑出現 葉尖萎凋 葉片組織色澤葉尖處淡色 葉基部色澤正常 鉀肥吸收降低及硼 錳缺乏 易引起錳 磷缺乏 結 論 正確診斷對症管理為病害整合管理之作 缺氮 缺磷 氮過多 硫過多 硼過多 鋅過多 錳過多 銅過多 磷過多 鉀過多 鈣過多 鎂過多 鐵過多 技術 引用文獻 業原則 因此 正確診斷為病害管理之出發 點 如何使用精準的技術進行診斷 可達事半 功倍之效 然而在田區之觀察不確實或病徵判 草坪病害診斷手冊 亞洲高爾夫球場業主協會 (AGCOA) 19 頁 斷技術不足均可能影響診斷結果 隨科技進步 王艺凯 李宝聚 陈红漫 石延霞 阚国仕 與通訊軟體之開發 應用通訊軟體傳送病害病 刘洋 2008 植物病害免疫学诊断技术 徵圖像 請專家協助診斷已成為即時診斷模 生物技术通报 2008 年第 4 期 式 然當送樣之標本不具代表性時易造成誤 李昱輝 2009 作物病蟲害診斷 行政院農業 判 進而影響之後之管理作業流程 且此一流 委員會農業藥物毒物試驗所編印 52 頁 程可能在各專業領域中傳送過程而喪失其即 曾國欽 徐世典 2003 重要植物細菌性病害 時性 應用專家之專業技術 配合軟體開發 之診斷鑑定 植物重要防檢疫病害診斷鑑 建立網路診斷系統 以手機或平板於田間自行 定技術研習會專刊 (二) 進行比對 可迅速完成病害診斷 即時規劃管 謝式坢鈺 2003 植物空氣污染病害診斷鑑定 理策略 以收管理成效 此外 上傳圖片 利 技術 植物重要防檢疫病害診斷鑑定技術 用圖像比對完成病害診斷亦為須加強開發之 研習會專刊 (二) 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

33 圖二 甜椒病毒病造成生長抑制 圖三 病毒病害造成豆科葉片有嵌紋和皺縮 圖四 甜椒青枯病植株呈綠色萎凋 圖五 甜椒細菌性軟腐病造成果實水浸狀軟化 圖六 甜椒細菌性斑點病造成葉片不規則和色斑 圖七 豆科腐霉菌造成豆莢上白色棉絮狀菌絲 圖八 腐霉菌造成甜椒莖基部隘縮 圖九 疫病造成甜椒莖基部變黑褐色 病害診斷鑑定技術 29

34 30 圖十 疫病造成豆科植物莖基部變黑褐色 圖十一 立枯病為害甜椒根部造成腐敗 圖十二 立枯病造成豆科植物莖基部隘縮 圖十三 萎凋病造成辣椒下位葉黃化植株萎凋 圖十四 萎凋病造成豆科蔬菜下位葉黃化植株萎凋 圖十五 菌核病使甜椒椒地際莖部產生白色菌核 圖十六 菌核病組織產生褐色膠狀菇形子囊盤於豆 科蔬菜植體上 圖十七 白絹病使豆科植物地際莖部產生白色菌絲 2015 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

35 圖十八 銹病於豆科蔬菜葉片下表皮之鐵銹色凸起病斑 圖十九 白粉病於豌豆葉上表皮出現白色粉狀斑 圖二十 白粉病為害甜椒葉片下表皮出現白色粉狀斑點 圖二十一 煤黴病造成葉表面紅褐色不規則斑點 圖二十二 角斑病於豆科蔬菜葉片上形成角斑 圖二十三 灰黴病於甜椒罹病莖部佈滿分生孢子 圖二十四 灰黴病為害豌豆果莢組織軟化佈滿分生孢子 圖二十五 蚜蟲分泌蜜露誘發甜椒煤病 病害診斷鑑定技術 31

36 圖二十六 炭疽病為害甜椒果實 病斑後期轉成黑褐色 圖二十七 炭疽病為害豆科果實 病斑呈凹陷 黑褐色 圖二十八 根瘤線蟲為害甜椒造成根部腫瘤狀 圖二十九 根瘤線蟲為害豆科造成根部腫瘤狀 圖三十 甜椒日燒-果肉失水變薄 半透明 圖三十一 高溫障礙-甜椒葉片向上捲曲 圖三十二 甜椒缺鋅-葉片細小 葉片白化 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會 圖三十三 甜椒缺鎂-葉尖開始出逐漸向葉脈兩側葉 肉組織黃化

37 圖三十四 甜椒缺鈣-果實前端受害部凹陷 圖三十五 甜椒營養失調造成裂果-果實表面呈細紋 狀龜裂 圖三十五 甜椒氮肥過剩葉片組織軟而肥大 葉色濃 綠並有下彎現象 圖三十六 甜椒鹽基過高-葉片缺乏活力 嚴重時中午 時葉片呈萎凋現象 圖三十七 三十八 栽培後期施肥經高溫或下雨 豆科蔬菜下位葉上表皮有不規則褐色斑點 下表皮組織正常 Anonymous Diagnostic protocols 蔡東纂 2003 植物寄生性線蟲之鑑定與病害 for regulated pests. Normes OEPP 診斷 植物重要防檢疫病害診斷鑑定技術 EPPO Standards. PM 7/20. OEPP/ 研習會專刊 (二) EPPO, Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 楊秀珠 2012 作物健康管理與診斷 農藥管 理人員資格訓練講義 (二) 10-1~ , Anonymous Diagnostics. Normes 病害診斷鑑定技術 33

38 OEPP EPPO Standards. PM 7/45. OEPP/EPPO, Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 35, Anonymous Crop and Agroecosystem Health Management. Annual Report 2006 Project PE-1. Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT). 19 pages. Anonymous Basic requirements for quality management in plant pest diagnosis laboratories. OEPP/EPPO, Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 37, Danielsen S, Fernández M Public Plant Health Services for All. plant Clinics Plant Healthcare and Diagnostic Network Global Plant Clinic. 84 pages 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

39 The Diagnostic Techniques of Plant Diseases Hsiu-Chu Yang * Taiwan Agricultural Chemicals and Toxic Substances Research Institute, Council of Agricultural, Executive Yuan, Taichung 413, Taiwan ABSTRACT Plant diseases can be classified as infectious diseases and physiological disorders. Infectious diseases can be classified according to morphological, pathogenic and ecological criteria, including viruses, viroids, bacteria, fungi, nematodes, etc. that can be diagnosed by external symptoms. Some infectious diseases can not be diagnosed by external symptoms, can also be identified by biochemical methods. Physiological disorders include acute injuries and disorders. The acute injury caused by rapid change of the environment and one-time mismanagement. The physiological disorders are caused by long-term malnutrition. The external symptoms will be affected by the environment, cultivation conditions, such as weather conditions and time factors. It is very important for diagnosis to do the detailed observation of the external symptoms, and also must understand the details and cultural history of the plant location, before a correct diagnosis. Key words: diagnosis, plant disease, pathogen, environmental factors, cultural techniques, physiological disorders * Corresponding [email protected] 病害診斷鑑定技術 35

40 研究報告 2015 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會 P Symposium on Trans-Century Plant Protection and Quarantine Technologies P37-47 害蟲分子鑑定技術之開發 焦磷酸定序鑑定平台 黃旌集 1,2 謝佳宏 3 王弘毅 4 吳文哲 1,5* 1 國立臺灣大學生物資源暨農學院昆蟲學系 106 臺北市羅斯福路四段 113 巷 27 號 2 台北市立大學地球環境暨生物資源系 3 中國文化大學森林暨自然保育學系 111 臺北市陽明山華岡路 55 號 4 國立臺灣大學臨床醫學研究所 100 臺北市中山南路 7 號 5 國立臺灣大學植物醫學研究中心 106 臺北市羅斯福路四段 1 號 摘 100 臺北市愛國西路 1 號 要 生物技術可協助鑑定有害生物 尤其在有害生物難以區分時 可不經由分類專家 協助 即可快速鑑定出種類 鑑定技術的開發 可分為蛋白質與核酸二大類 單株抗 體具有準確與速度的優勢 核酸則是受限於 DNA 萃取與 PCR 反應費時較多 近來 因發展同時鑑定多種物種的平台需要 如核酸探針生物晶片技術也廣為發展應用 本 研究則以焦磷酸定序技術為核心 建立一個可以在 5 小時內鑑定有害昆蟲的平台 目 前所收集的 26 目 157 科 280 種及其中的 10 目 51 科 112 種害蟲皆可以設計的通用引 子增幅 DNA 再以焦磷酸定序引子進行快速定序 所得序列依建構的資料庫比對鑑 定 此平台還具有學習與擴充能力 足可因應未來需要鑑定的防檢疫害蟲種類 關鍵詞 分子鑑定 焦磷酸定序 鑑定平台 前 言 疫人員 更需在短時間內取得鑑定結果 政府 過去發展很多工具協助 如鑑定手冊及圖鑑等 分類學中所謂鑑定 (identification) 是將 (吳和柯 2007 吳和石 2010 翁等 2013) 一生物個體歸屬到分類系統中之某一單元 或 然而 昆蟲不同的發育時期的形態不一 鑑定 歸屬到未記述的分類單元上 通常是根據檢索 種類上常會遇到困難 比如幼蟲期或卵期因體 (key) 中 的 特 徵 來 判 別 (Mayr and 型微小或特徵較少 不如成蟲易於鑑定 因此 Ashlock, 1991; 周 1998) 但是對於非研究 需要其他方法輔助 如分子鑑定方式 (Huang 該類群的分類專家或是未受過專業訓練人 et al., 2009) 表 員 鑑定物種常有困難 特別是第一線的防檢 *論文聯繫人 Corresponding [email protected] 生物技術可用來協助分類學研究 1984 害蟲分子鑑定技術之開發 37

41 表一 1984 年及 2000 年 Annual Review of Entomology 上昆蟲分子系統分類學方法之差異 Table 1. Differences in methods of insect molecular systematics listed in Annual Review of Entomology in 1984 and 2000 Molecule Berlocher, 1984 Caterino et al., 2000 Protein Protein sequence Allozymes Gel electrophoresis Nucleotide Nucleotide sequence Restriction endonuclease map DNA hybridization DNA sequence mtdna Nuclear DNA Noncoding markers Gene arrangements RFLP RAPD SSCP 表二常用於鑑定的生物技術 Table 2. Techniques commonly used for identification 細胞學 Cytology 蛋白質 Protein 核酸 Nucleic acid 核型 Karyotype 染色體條紋 Chromosome banding 電泳 Electrophoresis 同功酶電泳 (Isoenzyme electrophoresis) PAGE (SDS-PAGE) 抗體 Antibody 多價抗體 (polyclonal Ab) 單株抗體 ( 專一性抗體 ) (monoclonal Ab) 膠金抗體診斷套件 (colloidal gold-labeling kit) 酵素免疫分析法 (ELISA) 聚合酶連鎖反應 (PCR) 限制酶片段長度多型性 (RFLP) 隨機擴增片段多型性 (RAPD) 單鏈構造多型性 (SSCP) 重複序列數目變異 (Variable number tandem repeats):strs; Microsatellite 核酸探針生物晶片 (Biochip) 恆溫式圈環形核酸增幅法 (LAMP) 定序 Sequencing 焦磷酸定序 (Pyrosequencing) 年與 2000 年的 Annual Review of Entomology 整理了應用於鑑定昆蟲分子系統分類學技術 ( 表一 ), 隨著時代進步與技術發展及與便利性, 更多形式的分子鑑定技術被開發出來 ( 表二 ) 核型分析技術已較少使用, 現今主流是使用蛋白質與核酸鑑定技術 單株抗體法是目前最快速的方法, 以鑑定入侵紅火蟻 (Solenopsis invicta) 為例, 可像驗孕棒一樣方便 ( 吳,2005) 但是從眾多的抗體中挑選合 適的抗體並不簡單, 故發展最多的是以核酸進行聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) 為基礎的相關技術 與單株抗體法相比, 受限於 DNA 萃取與 PCR 反應的時間, 完成鑑定所花費時間遠比單株抗體長 Notomi et al. (2000) 發展出不需升降溫的核酸增幅方法 - 恆溫式圈環形核酸增幅法 (loop-mediated isothermal amplification, LAMP), 經改進後可於 15 分鐘內得到可檢測 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

42 出的核酸增幅 (Nagamine et al., 2002), 加快了核酸鑑定的速度 ; 該方法也隨即應用於昆蟲鑑定,Itakura et al. (2006) 即利用此方法鑑定白蟻 臺灣也已應用此方法發展地中海果實蠅與煙草粉蝨等重要防檢疫害蟲的鑑定技術 (Huang et al., 2009; Hsieh et al., 2012) LAMP 方法通常只能鑑定少數幾種, 甚至於只進行單一種類的鑑定, 因此, 生物晶片被應用於開發可同時偵測鑑定多種有害生物,Chen et al. (2014) 與 Naeole and Haymer (2003) 即以生物晶片法鑑定數種果實蠅 然而, 前述根據核酸所開發的技術, 設計時如未將所有親緣關係相近的種類加入分析, 亦可能導致誤判, 實際使用將遭遇問題 大部分生物體皆具有的 DNA, 利用其序列為基礎發展具有學習與擴充能力的鑑定平台具有實用性與發展性 定序技術日新月異, 如焦磷酸定序技術 (pyrosequencing) (Ronaghi et al., 1996, 1998) 的特點為 DNA 解序時不需進行電泳 DNA 片段不用螢光標記 且可進行多檢體序列同時分析 ( 謝等, 2010) 焦磷酸定序技術是利用一系列的酵素反應組合進行定序 ( 圖一 ), 首先 DNA 聚合酶 (DNA polymerase) 在複製 DNA 時與去氧核苷酸 (dntp) 結合而產生焦磷酸根離子 (PPi), 隨後再以三磷酸腺苷 - 硫酸化酶 (ATPsulfurylase) 將產生的 PPi 與腺苷醯硫酸 (adenosine phosphosulfate, APS) 轉換成三磷酸腺苷 (adenosine triphosphate, ATP), 而 ATP 會提供能量使冷光酶 (luciferase) 產生冷光, 最終所有反應物經三磷酸腺苷雙磷酸酶 (apyrase) 作用而完成一次解序, 隨後可再加入其他的去氧核苷酸進行下一輪的解序步驟 藉由依序加入 4 種不同的去氧核苷酸, 偵測反應時冷光激發與否及強度, 即可得出相對應的 DNA 序列 目前焦磷酸定序使用酵素價 位降低且新的機器與試劑可解讀更長的序列, 約可在 1.5 小時完成解序, 雖然所得序列長度仍有限 ( 可達 300 個鹼基 ), 但已經足夠用來鑑定物種 ; 美國 CDC 曾用來偵測禽流感與新流感 (Pourmand et al., 2006), 及致病病原與癌症篩檢 (Innings et al., 2005; Wong et al., 2010), 也應用於基因體 genome 解序 (Heng and Stanton, 2010) 本文以此技術開發快速鑑定平台, 進行防檢疫重要性害蟲鑑定 材料與方法一 測試樣本國內重要作物害蟲 甲乙類及有害生物清單之特定害蟲, 以及國內危害或新入侵種微小昆蟲等重要性害蟲, 累計收集種類共 10 目 51 科 112 種 採集昆蟲樣本共 26 目 157 科 280 種, 應用於測試引子廣用性 收集到的樣本也進行種內 種間 屬間與科間的序列差異比較, 分別以薊馬及果實蠅樣本進行種內與種間比較 粉介殼蟲進行屬間比較及毛翅目石蠶蛾進行科間比較 二 DNA 快速萃取方法根據 BuccalAMPTM DNA Extraction Kit (Epicentre, Madison, WI, USA), 取適量昆蟲組織, 加入 50 μl Quick Extraction Solution, 以 65 水浴 6 分鐘後, 再以 95 水浴 2 分鐘, 總共 8 分鐘即可完成害蟲 DNA 之萃取, 並將其置於 -20 冷凍櫃中保存 三 昆蟲焦磷酸定序引子設計根據 Simon et al. (1994) 之引子組 : LR-J-12887: 5`-CCGGTTTGAACTCAGAT CATGT-3` LR-N-13398: 5`-CGCCTGTTTA 害蟲分子鑑定技術之開發 39

43 圖一 焦磷酸定序可以分為 2 個部分 首先是增幅 DNA 時利用帶有生物素 (biotin) 的引子複製 DNA 其次是解序反應 整體而言 若加入的特定去氧核苷酸序列正確 可使 DNA 聚合酶反應 即有光可偵測 若加入的去氧核苷酸不對 則沒有反應 故藉由加入的去氧核苷酸種類與光讀值就可以解出序列 (黃等 2011) Fig. 1. The process of pyrosequencing can be divided into two parts; DNA amplification using biotin labeled primers, and sequencing reaction. In general, DNA polymerase incorporates nucleotide which complementary matches template DNA, resulting light emission. If the nucleotide fails to match template DNA, no light emission will be observed. DNA sequence can be recovered by recording the order of nucleotide release and light emission. (Huang et al., 2011) ACAAAAACAT-3` 進行粒線體 16S DNA 增 上 GenBank 所下載之害蟲粒線體 16S 序列比 幅 以 ABI Veriti (Applied Biosystems, Foster 對 樣本資訊與序列整合後建立害蟲序列資料 City, CA, USA) 聚合連鎖反應器進行 PCR 反 庫 並建構害蟲序列比對搜尋系統 所收集的 應 並以引子 LR-J 與 LR-N 直 序列以 PSQ Assay Design 軟體設計焦磷酸定 接解序 如有需要以 pgem -T Easy Vector 序專用之 PCR 增幅通用引子 及焦磷酸定序 Systems (Promega, Madison, WI, USA) 套 用之引子 組進行 cloning 再以此質體上的引子解序並 且保存該質體 將可為以後實試驗的對照組 PCR 增幅產物利用 Sanger 法解序與 NCBI 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會 四 害蟲焦磷酸定序 上述樣品與所設計的焦磷酸引子進行定

44 圖二 荔枝椿象 (Tessaratoma papillosa) 為樣本 PCR 產物進行焦磷酸定序 GTAC 依序加入共 40 次循環 正向引子 PYRSEQF (A) 及反向引子 PYRSEQR (B) 定序結果 所獲得序列與 Sanger 定序出之序列進行比較 (C) Fig. 2. Using Tessaratoma papillosa as a template, the nucleotides were added according the order of G, A, T, C for 40 cycles. The result of pyrosequencing by forward, PYRSEQF (A), and reverse, PYRSEQR (B), primers and their comparisons with sequence derived from Sanger sequencing (C) are shown. 序及鑑定測試 PCR 反應後 (反應條件為 (1) 引子組進行 PCR 及定序後所獲得序列進行分 預熱 (prewarming) 94 2 分鐘 (2) 變性 析與排序 設計出焦磷酸定序所需的正反向增 (denaturing) 秒 (3) 黏合 (annealing) 幅引子與定序引子 SEQPYRF 及 SEQPYRR 秒 (4) 延伸 (extension) (中華民國專利證書 發明第 I 號) 焦 秒 (5) 重複步驟 (2) 至 (4) 共 40 個循環 磷酸定序測試 根據結果設定 GTAC 依序加入 (6) 最終延長 (final extension) 分 40 次循環所獲得結果為最佳 並以此設定進 鐘) 應用磷酸定序專用引子 以 PyroMark 行往後焦磷酸雙向定序 以荔枝椿象 Q24 system 系統 (Qiagen, Germany) 進行 (Tessaratoma papillosa) 為樣本進行雙向定 焦磷酸定序 序測試 PCR 產物依序加入 GTAC 共 40 次循 環 正向引子 SEQPYRF (圖二 A) 及反向引 結 果 子 SEQPYRR (圖二 B) 定序結果與 Sanger 定序出之序列進行比較 (圖二 C) 正向引子定 一 焦磷酸定序引子組設計與測試 害蟲樣本經 LR-J 與 LR-N 序出的序列準確度約大於 60 bp 反向引子定 序出的序列準確度大於 70 bp 分析使用的粒 害蟲分子鑑定技術之開發 41

45 圖三 粒線體 16S 序列以鄰接法重建昆蟲綱 26 目親緣關係 (A) 以蔥薊馬 (Thrips tabaci) 進行種內親緣關係之重建 (B) 以粉介殼蟲科 (Pseudococcidae) 進行屬間親緣關係之重建 (C) 以毛翅目 (Trichoptera) 昆蟲進行科間親緣 關係之重建 (D) Fig. 3. Phylogenetic relationships among 26 orders of insects (A), within Thrips tabaci (B), between different genera of Pseudococcidae (C), and between different families of Trichoptera (D) constructed by neighbor-joining method based on mitochondrial 16S sequences. 線體 16S 片段約 120 bp 因此焦磷酸定序正 用性測試 包括蛛形綱 倍足綱與軟甲綱的樣 反向引子所定出的序列具有重疊性 可拼接出 本 此三綱物種序列差異介於 28.7~45.2% 之 全長序列約 120 bp (圖二 C) 間 顯示不同綱之間序列差異明顯 非昆蟲的 物種亦可利用此通用引子增幅出粒線體 16S 二 粒線體 16S 通用增幅引子廣用性測試 序列並區分種類 昆蟲樣本 除了原尾目 螳虫脩目 蛩蠊目 撚翅目與缺翅目未有樣本外 其餘 26 目昆蟲 三 昆蟲樣本種內 種間 屬間與科間序列差 樣本被用於增幅引子組廣用性測試 結果此 26 異比較 目昆蟲的粒線體 16S 序列皆可被增幅出 顯示 粒線體 16S 片段引子除了廣用性外 亦以 此增幅引子組在昆蟲綱具廣用性 上述樣本定 不同分類群來測試應用於各分類階元 序所獲得序列經排序後 以鄰接法重建親緣關 (taxonomic category) 包含種 屬 科等分類 係樹 (圖三 A) 26 目的昆蟲可被清楚區分 單元 (taxon) 的鑑別 物種的鑑定方面 來自 26 目昆蟲間序列差異介於 10.1~38.4% 目間 不同國家的蔥薊馬 (Thrips tabaci) 樣本 序 序列具明顯差異 非昆蟲樣本亦被用來進行廣 列上並無差異 但蔥薊馬與同屬的南黃薊馬 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

46 圖四 害蟲序列比對搜尋介面 輸入昆蟲樣本粒線體 16S 序列 根據比對出的序列相似度高低為依據來鑑定物種 Fig. 4. The platform for sequence comparison. Based on a input sequence, the platform will list candidate species according to sequence similarity. (T. palmi) 種間序列差異達 4.3% 顯示粒線 蟲 亦有序列搜尋介面 輸入未知昆蟲樣本粒 體 16S 片段應用於種間具鑑別力 (圖三 B) 線體 16S 序列 系統會根據比對出的序列相似 科級分類群方面 比較粉介殼蟲科 度 由高到低排列 可藉由此資訊來鑑定物種 (Pseudococcidae) 不同屬昆蟲的序列差異 結 (圖四) 果 顯 示 粉 介 殼 蟲 科 11 屬 間 樣 本 差 異 介 於 3.5~20.2% 本片段對於同科不同屬的樣本也 討 論 具鑑別力 (圖三 C) 毛翅目昆蟲不同科之間的 序列差異 結果顯示 13 科間樣本序列差異介 早在 2003 年 Hebert et al. 即提出了生物 於 5.4~28.6% 本片段可應用於同目不同科的 條碼 (DNA barcode) 的想法 希望以粒線體 鑑定 (圖三 D) COI 基因 (cytochrome oxidase I) 區分物 種 昆蟲方面也依此建立生物條碼資料庫 四 害蟲粒線體 16S 序列資料庫與比對搜尋系 統之建立 (Gwiazdowski et al., 2015) 但是 只使用 COI 基因來鑑定物種會遭遇問題 如 COI 基 害蟲粒線體 16S 序列資料庫之建立 將種 因有分化的現象 (von Beeren et al., 2015) 類 學名 採集地 時間 寄主與序列等資訊 或是異質體 (heteroplasmy) 現象 Kang et 建檔 害蟲種類目前累積共 10 目 51 科 112 al. (2015) 即建議收集多組 COI 基因序列於 種害蟲 本平台研發過程中 所測試過的昆蟲 資料庫中來避免問題 本研究則是利用 COI 種類也一併定序及列入序列資料庫 目前資料 以外的基因序列來達到鑑定物種的功能 以現 庫內包括害蟲總共有 26 目 157 科 280 種昆 有昆蟲樣本的粒線體 16S 序列經排序後 所設 害蟲分子鑑定技術之開發 43

47 圖五 利用焦磷酸定序發展快速鑑定平台 此系統為一可學習與擴充的系統 而使用上 只要資料庫有記載的物種 可 於 5 小時內比對出其種類 Fig. 5. Rapid identification platform by pyrosequencing technique. This is an expandable system. In practice, if the species has been recorded, it can be identified by this platform within 5 hours. 計出的通用增幅引子組 可增幅粒線體 16S 序 的物種 即可判定 然而 目前只用一組引子 列約 120 bp 且可成功應用於焦磷酸定序 以 不排除未來會有無法區分的物種 所以仍需多 收集到的 26 目昆蟲進行測試 結果顯示 26 目 開發幾組通用性引子 昆蟲樣本皆可被增幅出此段粒線體 16S 片 雖然本研究是利用焦磷酸定序建立害蟲 段 證實此增幅引子組在昆蟲綱具高度通用 快速鑑定平台 但是實際上核心是利用通用性 性 另外 利用所收集到的蛛形綱 倍足綱與 引子增幅 DNA 並與序列資料庫比對 所以未 軟甲綱物種進行測試 皆可被成功增幅出此片 來如果有更新更快的定序技術 只要還是利用 段 更加證實此增幅引子組的廣用性 至少適 PCR 技術增幅 DNA 本研究的成果一樣可以 用於昆蟲與其近緣的節肢動物門的物種 繼續延用下去 焦磷酸定序技術為基礎建立的害蟲快速 鑑定平台 是一個可以學習與擴充的系統 (圖 誌 謝 五) 只要目前已在資料庫的序列 或是在 GenBank 上可以比對的序列 (排除上傳錯誤 本研究承動植物防疫檢疫局經費補助 的資訊者) 皆可於 5 小時內確定其物種 未 (100 農科 檢-B1(2) 101 農科 比對出的物種 經分類專家鑑定後 再將物種 檢-B1(1)與 102 農科 檢 B1(3)) 及基 資料與序列新增於資料庫中 未來如果有相同 隆分局同仁 提供進口檢疫害蟲樣本 柯俊 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

48 成 徐歷鵬 王錫杰 黃莉欣 陳健忠 陳文華 楊永裕 許如君 黃守宏 董景生 蔡馨儀 黃秀雯 邱名鐘 廖治榮 蔡明諭 林彥伯 郭世杰 曾書萍等提供測試樣本, 謹此誌謝 特別感謝國立臺灣大學生科院系統生物與生物資訊學研究中心林志康先生 ( 現於準訊生醫股份有限公司 ), 協助害蟲序列資料庫及比對系統之建構 引用文獻吳文哲 石憲宗 ( 主編 ) 2010 農業重要防疫檢疫昆蟲幼期形態 ( 總論 ) 行政院農業委員會動植物防疫檢疫局 國立臺灣大學昆蟲學系, 台北市 211 頁 吳文哲 柯俊成 ( 主編 ) 2007 動植物疫病害蟲診斷鑑定作業流程 - 植物害蟲 ( 全套二冊 ) 農委會動植物防疫檢疫局 國立臺灣大學, 台北市 頁 吳孟玲 2005 入侵紅火蟻之鑑定 植物重要防疫檢疫害蟲診斷鑑定研習會 ( 五 ): 周樑鎰 1998 分類與鑑定 種苗檢查人員技術訓練班 ( 昆蟲鑑定 ) 講義 :1-9 翁振宇 陳淑佩 吳文哲 ( 編著 ) 2013 臺灣進口植物農產品檢出介殼蟲圖鑑 行政院農業委員會農業試驗所出版, 臺中市 181 頁 黃旌集 吳文哲 王弘毅 謝佳宏 2011 應用焦磷酸定序技術快速鑑定防檢疫害蟲 動植物防疫檢疫季刊 29:55-58 謝佳宏 黃旌集 王弘毅 吳文哲 2010 焦磷酸定序 (Pyrosequencing) 技術進行檢疫害蟲快速鑑定初探 2010 中華植物保護學會九十九年年會會員手冊 :22 Berlocher SH Insect molecular systematics. Annu Rev Entomol 29: Caterino MS, Cho S, Sperling FAH The current state of insect molecular systematics: A thriving tower of babel. Annu Rev Entomol 45: Chen YH, Liu LY, Tsai WH, Haymer DS, Lu KH Using DNA chips for identification of tephritid pest species. Pest Manag Sci 70: Gwiazdowski RA, Foottit RG. Maw HEL, Hebert PDN The Hemiptera (Insecta) of Canada: Constructing a reference library of DNA barcodes. PLoS ONE 10(4): e doi: /journal.pone Hebert PDN, Cywinska A, Ball SL, dewaard JR Biological identifications through DNA barcodes. Proc R Soc Lond B 270: Heng NC, Stanton JA Oral bacterial genome sequencing using the highthroughput Roche Genome Sequencer FLX System. Methods Mol Biol 666: Hsieh CH, Wang HY, Chen YF, Ko CC Loop-mediated isothermal amplification for rapid identification of biotypes B and Q of the globally invasive pest, Bemisia tabaci, and studying population dynamics. Pest Manag Sci 68: Huang CG, Hsu JC, Haymer SD, Lin GC, Wu WJ Rapid identification of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) by 害蟲分子鑑定技術之開發 45

49 loop-mediated isothermal amplification. J Econ Entomol 102: Innings A, Krabbe M, Ullberg M, Herrmann B Identification of 43 Streptococcus species by pyrosequencing analysis of the rnpb gene. J Clin Microbiol 43: Itakura S, Kankawa T, Tanaka H, Enoki A Identification of two subterranean termite species (Isoptera: Rhinotermitidae) using the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method. Sociobiology 47: Kang AR, Kim MJ, Park IA, Kim KY, Kim I Extent and divergence of heteroplasmy of the DNA barcoding region in Anapodisma miramae (Orthoptera: Acrididae). Mitochondr DNA 2: [Epub ahead of print]. doi: / Mayr M, Ashlock PD Principles of systematic zoology, 2nd Ed. New York: McGraw-Hill. 475 pp. Naeole CKM, Haymer D Use of oligonucleotide arrays for molecular taxonomic studies of closely related species in the oriental fruit fly (Bactrocera dorsalis) complex. Mol Ecol Notes 3: Nagamine K, Hase T, Notomi T Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cellul Probes 16: Notomi T, Okayama H, Masubuchim H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res 28: e63. Pourmand N, Diamond L, Garten R, Erickson JP, Kumm J, Donis RO, Davis RW Rapid and highly informative diagnostic assay for H5N1 influenza viruses. PLoS ONE 1: e95. Ronaghi M, Uhlen M, Nyren P A sequencing method based on real-time pyrophosphate. Science 281: Ronaghi M, Karamohamed S, Pettersson B, Uhlen M, Nyren P Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release. Anal Biochem 242: Simon C, Frati F, Beckenbach A, Crespi B, Liu H, Flook P Evolution, weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers. Ann Entomol Soc Am 87: von Beeren C, Stoeckle MY, Xia J, Burke G, Kronauer DJ Interbreeding among deeply divergent mitochondrial lineages in the American cockroach (Periplaneta americana). Sci Rep 5: doi: /srep08297 Wong CM, Anderton DL, Smith-Schneider S, Wing MA, Greven MC, Arcaro KF Quantitative analysis of promoter methylation in exfoliated epithelial cells isolated from breast milk of healthy women. Epigenetics 5: 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

50 Development of Molecular Tool for Rapid Identifications of Insect Pests - the Pyrosequencing Identification Platform Chin-Gi Huang 1,2, Chia-Hung Hsieh 3, Hurng-Yi Wang 4, and Wen-Jer Wu 1,5* Department of Entomology, National Taiwan University, Taipei 106, Taiwan Department of Earth and Life Science, University of Taipei, Taipei 100, Taiwan Department of Forestry and Nature Conservation, Chinese Culture University, Taipei 111, Taiwan Graduate Institute of Clinical Medicine, National Taiwan University, Taipei 106, Taiwan Research Center for Plant Medicine, National Taiwan University, Taipei 106, Taiwan ABSTRACT The use of molecular biology technologies enables us to rapidly identify pest species which are otherwise difficult to be recognized by a non-specialist. Both proteins and DNA/RNA can be used for species identification. Monoclonal antibody is able to target species with high specificity in a short period of time. Identification by DNA sequences requires nucleic acid extraction and PCR amplification which usually take several hours to couple days. Recently, because of the needs to identify multiple species at the same time, the array-based platform, which hybridizes DNA samples to pre-coded nucleic acid probes on the array, is widely developed. This study applied the pyrosequencing technique to establish a platform which can rapidly identify important quarantine insect pests within 5 hrs. The partial mitochondrial 16S sequences from a total of 280 species, including 157 families from 26 insect orders, which contain 112 pest species from 51 families of 10 orders, were successfully amplified. These sequences were used to construct a mitochondrial 16S sequence database. With the potential feasibility and utility of this technique, combined with the expandable database, this rapid detection tool for important pests can be established. Key words: molecular identification, pyrosequencing, identification platform * Corresponding [email protected] 害蟲分子鑑定技術之開發 47

51 研究報告 2015 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會 P Symposium on Trans-Century Plant Protection and Quarantine Technologies P49-72 昆蟲刺探電位圖譜 (EPG) 刺吸式害蟲取食行為鑑定新技術 Elaine A. Backus1 林柏安 2 張宗仁 3,4 石憲宗 2* 1 USDA Agricultural Research Service, San Joaquin Valley Agricultural Sciences Center, 9611 So. Riverbend Ave, Parlier, CA U.S.A. 2 行政院農業委員會農業試驗所應用動物組 413 臺中市霧峰區中正路 189 號 3 Department of Plant Pathology, University of Georgia, Griffin Campus, Georgia, U.S.A. 4 國立中興大學植物病理學系 402 臺中市南區國光路 250 號 本文之英文原始報告 已投稿至台灣農業研究期刊 (Journal of Taiwan Agricultural Research) 本文將其內容翻譯為中文 建議引 用此報告的來源為 Backus, E. A., P. A. Lin, C. J. Chang, and H. T. Shih Electropenetrography: A new diagnostic technology for study of feeding behavior of piercing-sucking insects. J. Taiwan Agric. Res. 65 (accepted: December 16, 2015) 摘 要 由於無法直接觀察半翅目昆蟲特化口針在植物組織的刺探與穿刺過程 致使研究 此類昆蟲的取食行為 對植物損害以及傳播植物病原的相關研究 存在極大挑戰 及 至 50 年前所發明昆蟲刺探電位圖譜 (electrical penetration graph, EPG) 監測儀 才克服這些研究上的障礙 如今 EPG 主要以三個方向發展半翅目害蟲整合管理 (IPM) 新策略 包括 (1) 對特定半翅目昆蟲之取食行為與造成植物傷害機制未明時 EPG 是可有效解決的工具 (2) 解決上述問題之後 EPG 可被應用於分析殺蟲劑或 拒食劑對害蟲行為所造成的影響 並進一步評估其他化合物對於特定取食行為造成危 害與傳病的原因 (3) EPG 能被應用於不同植物品系抗蟲程度的評估 包括基因改造 表現生物殺蟲成分的作物 本回顧報告主要目的包括 (1) EPG 的原理以及歷史 特 別針對第三代 AC-DC 儀器進行介紹 (2) 以蚜蟲為模式系統 作為瞭解那些波形可 自 EPG 獲得 (3) EPG 可應用在臺灣農業的那些需求 特別是對於那些具有經濟重 要性的蚜蟲 本文係首次提出三型 EPG 在蚜蟲研究概況的回顧研究報告 關鍵詞 昆蟲刺探電位圖譜 半翅目 取食行為 前 言 類昆蟲的取食行為 及其對植物所造成的損害 與傳播植物病原之相關研究 存有極大挑戰 由於無法直接觀察半翅目昆蟲其特化口 早期由於技術上的限制 學者們藉由觀察昆蟲 針在植物組織的刺探與穿刺過程 致使研究此 遺留在植物組織的唾液鞘 (Leopold et al., *論文聯繫人 Corresponding [email protected] 昆蟲刺探電位圖譜 (EPG) 49

52 2003) 分析昆蟲分泌之液體 (Dugravot et al., 2008) 記錄植物病原經過媒介昆蟲的特定取食行為後之傳播情形 (Purcell et al., 1979; Almeida and Purcell, 2006) 等, 瞭解半翅目昆蟲之取食行為 直到 EPG 發明之後, 半翅目昆蟲的取食行為研究才開始蓬勃發展 如今 EPG 主要以三個方向發展半翅目害蟲整合管理 (IPM) 新策略, 蟲媒病原媒介昆蟲即為其中一個重點 首先, 對特定半翅目昆蟲之取食行為與造成植物傷害機制未明時, EPG 是可有效解決的工具 ; 對該半翅目昆蟲之取食行為有相當研究基礎後,EPG 則能被應用於分析殺蟲劑或拒食劑對害蟲行為造成的影響, 並進一步評估其他化合物對於特定取食行為造成危害與傳病的原因 ;EPG 能被應用於不同植物品系抗蟲程度的評估, 其中包括基因改造表現生物殺蟲成分的作物 EPG 記錄經過快速的電腦分析之後能夠得到量化的行為資料, 研究者因此能夠進行精準的評估, 例如, 量化比較抗蟲或無抗蟲作物品系之媒介昆蟲取食行為差異, 以此推測傳病的可能性, 並協助搜尋新的植物抗性機制 本回顧報告主要目的包括 (1) EPG 的原理以及歷史, 特別針對第三代 AC-DC EPG 儀器進行介紹,(2) 以蚜蟲作為研究模式, 瞭解那些取食波形可自 EPG 獲得,(3) EPG 可應用在臺灣農業的那些需求, 特別是對於那些具經濟重要性的蚜蟲 本文首度回顧三代 EPG 在蚜蟲的研究概況, 同時我們也參考中文的 EPG 相關研究, 未來也將陸續回顧與臺灣農業有關的葉蟬 飛蝨 木蝨 粉蝨等重要害蟲之 EPG 研究 本文部分內容來自第一作者刊印中的報告 (Backus, in press), 欲了解更多資訊則可參閱該篇報告 昆蟲刺探電位圖譜儀之原理與發展史一 基礎原理如 Fig. 1a 中所示, 以具有導電性的黏著劑將細金絲 ( 直徑約 10~60 μm, 依昆蟲體型決定金絲直徑 ) 黏在昆蟲背部 ( 稱為昆蟲電極 ), 並與電流放大器 (Head stage amplifier) 相連, 該放大器則與 EPG 監測儀本身相連, 形成一個潛在的電流迴路, 同時 EPG 監測儀另於植物端提供來源電流 (Vs 是指通到植物土壤的電壓,Fig. 1) 當昆蟲口針刺探植物組織, 電流隨口針 食道及唾液腔的液體通過蟲體傳回儀器本身, 經過放大 (amplification) 及電子數位化 (digitalization) 後於電腦呈現 當輸入穩定電源經過植物昆蟲界面 (plant-insect interface), 會受到變動的生物電位 (biopotential 或 biological voltage) 與變動的電阻 (electrical resistance) 影響, 而使原本的固定電壓, 成為一種持續變動的模式, 經由連續記錄一段時間內電壓的變動, 最終成為 EPG 儀器中呈現的波形 二 發展史及儀器設計 EPG 發展於 1950 年代末期至 1960 年代初期, 並隨著電子工業快速發展, 第一代 EPG 監測儀又稱為 交流電監測儀 (AC monitor) 或是 AC 系統, 是由 McLean and Kinsey (1964) 基於無線電科技原理發明, 所使用的技術相對較傳統, 例如 1950 年代盛行的玻璃管電子放大器 (glass-tube amplifiers), 為 1960 年代固態晶體管 (solid-state transistor) 的前身, 是以交流電為輸入電源, 其電訊放大器 (amplifier) 之敏感度較低, 使用 10 6 Ohms 的低值輸入電阻 (Ri, input impedance) (McLean and Weigt, 1968) 此低值輸入電阻的交流電監測儀所記錄的訊號, 主要是電流通 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

53 Fig. 1. Diagrammatic representation of the primary (1 o ) circuit of an EPG monitor. a. Realistic model of the plant and insect. b. Electronic block diagram of primary circuit, including variable biopotentials (emf) and variable resistance (Ra). Modified from an original drawing by G. P. Walker. 2 o = secondary circuit (i.e., signal processing circuitry); head ampl. = head stage amplifier; emf = electromotive force (biopotential); Ra = insect (e.g., aphid) resistance; Ri = input impedance of the head amplifier; Vs = source voltage. (Derived from an original drawing by G. Walker, in Walker 2000.) Reprinted with permission of the American Phytopathological Society.) 過昆蟲口針中液體的電阻 ( 即變動電阻 (Ra, variable resistor) (Fig. 1b) (Walker, 2000) 因此第一代 EPG 監測儀適合記錄口針穿刺的始末 唾液分泌 唾液鞘形成 ( 即目前所稱之昆蟲口針穿刺的路徑階段 ) 口針移動 ( 例如口針的伸長或收縮 ) 及口針與維管束組織的接觸 ( 例如穿刺韌皮部或木質部 ) (Backus et al., 2005) 其實第一代 EPG 監測儀已具備偵測生 物電位的功能, 但受限當時之輸出模式是採用緩速的帶狀圖記錄器 (strip chart recorder) 及某些第一代 EPG 監測儀所使用的濾波器 (bandpass filter), 使得生物電位訊息波形無法有效呈現 (Backus et al., 2000; Tjallingii, 2000) 至 1970 年代末期, 電子科學因固態晶體管技術 ( 過去稱為運算放大器, operational 昆蟲刺探電位圖譜 (EPG) 51

54 amplifiers, 或是簡稱 op amp) 的進步而有所革新, 較先進的技術能以合理價格被納入 EPG 的發展中, 並造就第二代 EPG 監測儀的發展 第二代 EPG 監測儀又稱為 直流電監測儀 (DC monitor) 或是 DC 系統, 是由 Schaefers (1966) 發明, 後經荷蘭科學家 Tjallingii (1978) 改良 改良部分包括運算放大器的使用 輸入電源更改為直流電電源 利用法拉第籠 (Faraday cages) 控制環境干擾訊號 使用 FM 帶狀紀錄器 (FM tape recorder) 或是高反應帶狀圖記錄器 (rapidresponse strip chart recorders) 以及藉由提高輸入電阻值 ( 如 10 9 Ohms 或 Ohms) 提高儀器電訊放大器的敏感度 (Tjallingii, 1978, 1985b) 除此,Tjallingii 也建立了目前此領域對波形電位組成起源 (electrical origin) 的理論基礎, 目前認為在植物昆蟲界面造成特定波形 ( 連續電位的變動 ) 的因子有二, 包括 emf 成分 ( 即生物電位, 其英文同義詞則包括 electromotive force, biological voltage 或 biopotential) 與 R 成分 ( 即變動電阻, Ra) (Walker, 2000) 以 emf 成分而言, 目前所知機制有兩種, 第一種為植物細胞膜電位的差異 (membrane potential), 一般來說膜內電位低於膜外電位, 當口針穿刺植物細胞, 會造成波形突降至較低電位 因此, 可用電位的相對正負值, 作為口針位置的判斷依據, 例如電位相對為負時, 口針位於活體細胞內部 ; 電位偏正時, 口針則位於活體細胞的外部 ; 第二種引發生物電位的機制為液流電位 (streaming potential), 液流電位產生的原理為含有電解質的液體, 流經薄壁毛細管 (thin capillary tube) 產生電極分離而造成微小的電位差異, 而刺吸式昆蟲的口針就如同微小的管柱, 其中液體為流動的電解質液 (Walker, 2000) 液流電位會產生固定且規律的波形, 其產生方式可能因規律的肌肉收縮及吸食植物汁液所造成 (Walker, 2000), 例如控制液體進入前食道的圍食腔擴張肌 (cibarial dilator muscles) (Dugravot et al., 2008) 第二代 EPG 監測儀因增加電訊放大器的敏感度, 因此可偵測出 R 成分 ( 第一代 EPG 監測儀只能偵測的部分 ) 與 emf 成分, 並以波形方式呈現 而釐清每種波形的電位訊號源, 對於後續各波形生物意義研究有相當程度的貢獻 Tjallingii 的另一個重大貢獻是提出電阻 / 生物電位相對變化理論 (theory of R/emf responsive curve) (Tjallingii, 1978, 1985b) 他以圖表方式呈現每個波形之 R/emf 比率與輸入電阻質 ( 從 10 6 到 Ω) 的關係 (Backus and Bennett, 2009; Backus, in press) 基於 Tjallingii 的理論, 電位來源只包含 R 成分與 emf 成分, 兩者間的比率呈相互變動, 當某一成分比率較小時, 另一成分的比率較高 (Fig. 2) 在較低的輸入電阻值時表現的波形, 有較高比率的 emf 成分, 也就是該波形的電位來源會著重於 emf 成分 ; 反之, 在較高輸入電阻時, 波形則會表現較高比率的 R 成分 (Backus et al., 2000; Walker, 2000; Backus and Bennett, 2009) 以上所指的 表現 代表監測儀偵測的波形結果, 而非該行為產生電壓波動的實際 R 成分與 emf 成分比率, 雖然電壓波動本身兩成分的比率理論上是固定的, 但藉由調整輸入電阻值,EPG 監測儀能夠改變兩個成分由儀器記錄之波形所表現的比率 Tjallingii 更發現電阻 / 生物電位相對變化理論所提出之曲線, 其位置會隨著被記錄昆蟲體型大小而改變 (Fig. 2; 比較蚜蟲 小型葉蟬與大葉蟬亞科 (Cicadellinae) 的差異 ) 一般來說當昆蟲體型越大, 口針中具有較寬的食物道及唾液道 ( 具有較強的導電能力 ), 則該曲線會向圖表左方移動 (Fig. 2) 因 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

55 Fig. 2. Theoretical R/emf responsiveness curves for selected example insects. See text for summary, and (Backus and Bennett, 2009) for more detailed explanation of theory. (Reprinted with permission of the American Phytopathological Society.) 此, 較低的 Ri 值能在大型的昆蟲 ( 例如大葉蟬亞科成員 ) 取食行為中記錄較完整的 emf 成分 特定的昆蟲在 R:emf 為 1:1 的 Ri 值之下, 由於可以平均記錄到來自兩個電位成分的所有訊息, 不會偏重其中一個成分, 因此最能夠記錄該行為之所有波形細節 基於該理論 Tjallingii 在第二代 EPG 監測儀中選擇了對於蚜蟲最適當的輸入電阻值 10 9 Ohms 電阻/ 生物電位相對變化理論也解釋了為何第一代 EPG 監測儀無法記錄蚜蟲取食行為波形中的 emf 成分 (Backus and Bennett, 2009), 但卻能在較大型的昆蟲 ( 如大葉蟬亞科 ) 記錄到部分 emf 成分 (Backus et al., 2005) 在 1990 年代中期之後, 幾乎所有使用 EPG 的科學家都放棄傳統的帶狀圖紀錄器, 轉而使用電腦化的類比 - 數位 (analogto-digital) 轉換方式記錄儀器訊號, 此舉有效的增加第一代及第二代 EPG 監測儀在波形細 節保留程度 (Reese et al., 1994) 同時兩代 EPG 監測儀也逐漸分化, 第一代 (AC 系統 ) EPG 監測儀主要被用於較大型的昆蟲, 例如葉蟬 飛蝨等頸吻群昆蟲 (auchenorrhynchans), 第二代 (DC 系統 ) EPG 監測儀則被用於小型的昆蟲, 例如蚜蟲 粉蝨以及薊馬或是其他腹吻群昆蟲 (sternorrynchans) (Backus, 1994) 這種分化現象直到第一代 EPG 監測儀停產之後 ( 西元 2000 年左右 ) 才結束, 自此之後大部分 EPG 研究都以第二代 EPG 監測儀為主 過去的分化現象能用電阻 / 生物電位相對變化理論來解釋, 由於小型昆蟲 ( 如腹吻群昆蟲 ) 所產生的訊號, 在輸入電阻較高 (10 9 Ohms) 的時候, 可記錄較完整的電位組成 ; 而大型昆蟲 ( 如頸吻群昆蟲 ) 所產生的訊號, 則需在較低的輸入電阻 (10 6 Ohms) 才能記錄較完整的電位組成 另外, 雖然缺乏有力的證據指出可能與 昆蟲刺探電位圖譜 (EPG) 53

56 昆蟲承受不同電源的能力有關, 但根據過去經驗發現葉蟬在低輸入電阻時, 對交流電電源似乎有較高的忍受力, 而蚜蟲則對直流電有較高的忍受力 (Backus unpub. data) 其實, 昆蟲對電流的忍受程度在 EPG 研究至關重要, 因為有許多 R 成分為主的波形, 需在較高電流 ( 幾百毫伏特 ) 及較低輸入電阻 (10 6 Ohms) 的條件下, 才能被 EPG 監測儀完整記錄 記錄時, 若使用較高電壓, 昆蟲一定得具有耐受較大量電流的能力, 不同昆蟲似乎在較高電壓與低輸入電阻的條件下, 對不同電源 (AC 或 DC) 有不同的耐受程度, 此情形很可能與昆蟲取食植物的特性, 例如活體細胞內或是活體細胞外有關, 此部分將在後續章節討論 基於以上限制因素, 為了增加 EPG 監測儀選擇昆蟲的彈性,Backus 與 Bennett 研發第三代 EPG 監測儀 ( 稱為 AC-DC 監測儀或 AC-DC 雙系統 ) (Backus and Bennett, 2009) 第三代 EPG 監測儀提供 6 種輸入電阻予研究人員選擇, 包括 10 6, 10 7, 10 8, 10 9, 與 Ohms, 具有可切換的直流電或交流電之供應電源, 同時結合其他當代電子技術, 例如儀表運算放大器 (instrumentationquality op amps) 以及標準化生產的印刷電路板 (printed circuit board) 這些現代的電子技術, 可免除諸多老式儀器引發之電壓雜訊 (Backus et al., 2000; Backus and Bennett, 2009) 雖然被命名為 AC-DC, 但是第三代 EPG 監測儀與第一代的 AC 系統並不同 第三代的 EPG 監測儀完整的保留了第二代儀器的功能, 包括偵測 emf 成分的功能, 然而在第三代的改良之下, 即便使用交流電 (AC) 為供應電源, 也可記錄到 emf 成分, 因此也可應用在那些對直流電較敏感的昆蟲種類 舉例來說第三代儀器中之交流電訊號處理系統, 已經不使用高通 / 帶通濾波器 (highpass/bandpass filters) 耦合電容器 (coupling capacitor) 對數放大器 (log amplifier) 以及其他目前已知會消除 emf 成分訊號的裝置 (Backus et al., 2000; Tjallingii, 2000; Backus and Bennett, 2009) 雖然於交流電訊號處理系統中, 仍存在整流 (rectification) 的步驟, 但儀器中設置的電壓補償裝置 (offset function) 卻能調整電壓值, 避免負極走向的電壓訊號經過整流之後, 出現疊相失真 (fold-over) 的情況, 這個特性使得交流電記錄之訊號, 可被正確呈現 此外第三代 EPG 監測儀為目前唯一可調整輸入電阻值的機型, 擁有非常精確及細緻的調控面板, 相較於前兩代 EPG 監測儀, 能夠很精確的調整測試條件, 例如輸入電壓值以及訊號放大值, 使實驗可具高成度的再現性 (Backus and Bennett, 2009) 基於以上革新, 第三代 EPG 監測儀排除了前兩代所有的缺點, 並兼具兩者的優點 研究者因此能夠針對不同的昆蟲將記錄條件調整至最佳化, 並利用不同輸入電阻值建立該昆蟲的 波形資料庫 (waveform library), 也能更精確的分辨波形中 R/emf 成分的比率 (Backus et al., 2013; Pearson et al., 2014) 以蚜蟲為例, 使用 AC-DC EPG 監測儀時, 在不同輸入電源 ( 直流電或交流電 ) 的研究結果, 並不會產生相異的波形 但如同電阻 / 生物電位相對變化理論所預測, 調整輸入電阻值, 可改變波形 (Backus and Bennett, 2009), 此情況符合第三代儀器的設計目的 第三代 EPG 監測儀判別 R/emf 成分的方式, 也與第二代相似, 利用調整輸入電壓強度, 並觀察波形強度變化以及改變輸入電阻值來觀察 三 EPG 波形之生物意義及研究原理 EPG 波形之生物意義, 通常可藉由若干 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

57 方法進行定義, 包括 (1) 透過切片技術 顯微鏡觀察或口針切截技術, 研究昆蟲口針在植物組織的位置,(2) 藉由透明人工食料, 直接觀察蚜蟲取食行為,(3) 分析各個波形的電子訊號特徵 (Walker, 2000) 波形的電子訊號特徵隱含口針位置的訊息, 根據不同的輸入電阻值可分為兩類, 第一類為反映口針的深度 ; 第二類為反映口針與細胞的相對位置 在低輸入電阻值 ( 依據測試昆蟲種類差異, 約在 10 6 ~10 7 Ω) 時, 可藉由波形整體上升或下降判別口針在植物組織的深度 進一步而言, 在低輸入電阻值條件下, 波形整體為正值走向, 整個波形整體位置 ( 可稱為其電壓值 ) 隨著口針深度呈現變動 ( 詳見圖示可參考 Backus, in press), 當口針抽回時波形整體電壓值上升, 當口針深入時, 波形整體電壓下降 (Jiang and Walker, 2001; Backus et al., 2005) 由此可知植物組織中的口針深度, 其訊號之電位組成, 具有很高的 R 成分 ; 在較高輸入電阻值 (10 9 ~10 13 Ω) 時, 波形一般含正值走向及負值走向, 高輸入電阻值條件下波形電壓值受口針周圍電壓值影響很大, 此電壓值的改變, 代表口針在植物活體細胞內部或外部的不同電壓值, 也就是所謂的生物電位, 在電位組成中稱為 emf 成分 負值走向的波形 ( 在 DC 系統文獻中稱為胞內波形 (intracellular) 層次 ) (Walker, 2000) 代表著植物組織中共質體區域 (symplastic place) ( 也就是活體細胞內部, 膜電位受完整細胞膜維持與外界分離, 尚未受口針穿刺 ) 正值走向的波形 ( 或胞外波形 (extracellular)) 代表植物組織中非原質體區域 ( 也就是細胞間隙 細胞壁中 成熟木質部細胞或被口針影響的活體細胞 ) (Backus et al., 2009; Miranda et al., 2009; Pearson et al., 2014) 有趣的是在輸入電阻值為 10 8 Ω 時, 不同昆蟲或是各別穿刺行 為 ( 往往與金絲連接蟲體品質有關 ) 之波形走向, 有可能是正值走向, 也有可能同時具有正或負值的走向 另一種具有指標性的波形為 X 波 (Backus et al., 2009) 過去 EPG 相關研究發現具有分泌唾液鞘能力的昆蟲, 可產生 X 波, 這是一種非常複雜 清晰可見與規律重複的波形, 具有種間的特異性 (McLean and Kinsey, 1967; Backus and Bennett, 2009) X 波代表昆蟲口針與目標細胞接觸, 換句話說,X 波代表在昆蟲偏好的目標細胞中, 昆蟲取食行為由路徑階段 (pathway phase) 轉換到持續取食階段 (sustained ingestion phase) 的過程 因此 在所有分泌唾液鞘進行取食的昆蟲中, X 波可作為昆蟲是否接受寄主植物取食部位的判斷依據, 包含下列連續行為 :(1) 昆蟲口針嘗試穿刺韌皮部篩管或木質部導管 ( 依照昆蟲種類不同 ) 細胞與接受度,(2) 於該細胞製造一個穩固的取食點,(3) 開始因應植物細胞的抗性因子或取食障礙因素 (Backus et al., 2009) 以上這些具有種的專一性 X 波形, 往昔研究已被記錄的種類, 包括取食韌皮部的蚜蟲與角頂葉蟬亞科 (Deltocephalinae) 昆蟲及取食木質部的大葉蟬亞科昆蟲 四 EPG 在蚜蟲取食行為及 IPM 研究的應用自從昆蟲刺探電位圖譜 (EPG) 發明以來, 蚜蟲一直就是研究半翅目昆蟲取食行為的模式生物, 此與其擁有較大體型及行動緩慢有關, 迄今只要是研究蚜蟲的取食行為, 多與 EPG 研究有關 蚜蟲的取食行為可細分為若干連續行為, 當蚜蟲接觸植物後, 蚜蟲藉由觸角上的化學感覺器偵測植物表面氣味 (Powell and Hardie, 2002) 蚜蟲開始刺探植物組織初期, 會持續刺穿植物細胞 (Tjallingii, 1985a), 此時蚜蟲會取食少量的植物汁液, 接 昆蟲刺探電位圖譜 (EPG) 55

58 著植物的汁液會與蚜蟲前圍食腔 (precibarium or antecibarium) 的化學感覺毛 (chemosensilla) 接觸, 促使蚜蟲決定是否離開植物或持續對植物的維管束組織進行刺探 (Powell et al., 2006) 本文回顧的蚜蟲取食行為研究資料, 係來自既有的三型 EPG ( 指 AC EPG, DC EPG, AC-DC EPG) 已知蚜蟲的取食波形主要包括路徑階段 (pathway phase) 韌皮部階段 (phloem phase) 及木質部階段 (xylem phase) 同時, 在路徑階段與韌皮部階段間, 尚有一個過渡階段, 稱之為 X wave 路徑階段包含了波形 A, B, C, F 以及 pd (potential drop) (Fig. 3a-d) (Tjallingii, 1978); 韌皮部階段包含波形 E1 以及 E2 (Fig. 3e-h); 木質部階段則包含波形 G (Fig. 3j) (Tjallingii, 1987) 雖然 EPG 的波形可直接由研究人員以目視分類, 卻難以明確定義 即便是依據波形相對強度 波形頻率與電壓值予以輔助定義波形特徵, 仍缺乏絕對客觀的定義 (Tjallingii, 1978) 迄今所有與蚜蟲有關的 EPG 研究, 皆顯示所有蚜蟲具有相似的取食波形, 不同行為具有不同的波形, 此說明其他害蟲也可將蚜蟲作為 EPG 研究的參考模式, 並將結果作為研擬害蟲管理策略的參考 五 蚜蟲的 EPG 取食波形及其生物學意義 ( 一 ) 路徑階段 : 波形 A, B 及 C 為了成功找到韌皮部, 並持續進行取食, 蚜蟲以 唾液鞘取食策略 (the salivary sheath strategy of feeding) ( 例如可同時分泌凝膠型唾液 (sheath saliva) 及水溶型唾液 (watery saliva)), 此種取食策略之口針穿刺行為, 大多發生在細胞外, 並同時分泌兩種唾液 (Moreno et al., 2011), 偶爾也有細胞內穿刺行為的產生 (Fig. 3a) (Pollard, 1973), 一般 來說穿刺行為開始的時間多發生在蚜蟲接觸植物 1 分鐘左右 (Powell et al., 2006), 口針的穿刺行為會造成 EPG 記錄的電位產生正值電壓突增 在穿刺行為發生之後, 波形 A B 與 C (Fig. 3a, b) 會緊接著發生 (Tjallingii, 1978), 這些波形基本上以固定的順序產生, 並組成所謂蚜蟲口針穿刺的 路徑階段 (Tjallingii and Hogen Esch, 1993) 在早期 EPG 文獻中, 都是使用緩速的帶狀圖紀錄器 (strip chart recorder), 波形 A B 與 C 因被壓縮在一起, 而被看成單一波形, 當時稱為 Salivation 波, 因此無法得知在 AC EPG ( 第一代 EPG) 與較低值電阻的 EPC 監測儀, 是否能夠區辨此 3 種波形 (McLean and Kinsey, 1967) 雖然這 3 種波形成因及其行為細節尚未明確, 但其對於穩定韌皮部取食的建立非常重要 有關蚜蟲口針在植物組織內部之穿刺路徑及位置的詳細研究, 可參考 Tjallingii and Hogen Esch (1993) 的研究報告 ( 二 ) 路徑階段 : 波形 pd 在路徑階段中, 特別是波形 C ( 占大部分路徑階段 ), 蚜蟲會沿著口針路徑周圍的細胞, 進行多次的細胞內穿刺行為, 並以 5~15 秒的波形 pd 呈現 (Fig. 3b, d) 第 1 個波形 pd, 最快可在刺探行為開始的 10 秒左右發生, 一般多在刺探行為發生後的 1 分鐘出現 (Fig. 3b) 許多研究證據顯示這些電壓突降的短暫波形, 與穿刺植物細胞膜有關 例如藉由比較取食植物組織 人工食料或是人工植物細胞懸浮液等實驗,Tjallingii (1985a) 成功的將 pd 波與在活體植物細胞的取食行為進行關聯 除此, 一般 pd 波的電壓較 C 波低約 100~180 Mv 左右, 此電壓差異正好符合植物細胞膜內外電位差約 -100~-200 mv 以及 E 波形 ( 當口針位於韌皮部篩管細胞內 ) 之電位 ( 詳見後續章節 ) (Tjallingii, 1982) 基於以上發現, 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

59 昆蟲刺探電位圖譜 (EPG) 57

60 Fig. 3. Summaries of typical EPG waveforms (using an AC-DC monitor at Ri 109 Ohms) from stylet probing of the pea aphid, Acyrthosiphon pisum. a. Drawing of a hypothetical salivary sheath/stylet pathway to xylem and phloem cells with labeled [labelled] portions of the sheath to represent typical locations of the waveforms (letters) recorded during each stage of probing. The sheath is hollow because the stylets were removed during E2, to identify the final sheath branch into a phloem sieve element cell. Filled, abandoned, branches represent stylet derailment during probing (waveform F; not pictured below) and xylem ingestion (waveform G, not pictured below). All scale bars represent 2 sec of recording, unless otherwise stated. b. Start of a stylet probe (voltage increase after flat baseline/non-probing; baseline denoted by an arrow). Note that waveform A is quite brief, and that the first intracellular puncture (pd) occurred within the first 30 sec. The two pd s are also noticeably below the baseline level (therefore, negative-going). c. Waveform C, much later in pathway; note that its amplitude (Y axis) is shorter than that of either A or B. Amplification of parts b and c is4x. d. Short section of waveform C with embedded pd (with pd sub-phases), at twice the amplification (8x) of part c. e. Compressed view of 5.5 X waves at the end of pathway in the same probe, prior to E1 then E2. Boxed area of waveform with * is enlarged in the inset box, showing details of sub-phase II of the R-pd. Lettered boxes on waveforms are expanded in the next sections. f. Start of E1, with positive-going peaks, showing the evolution of its appearance over time. Amplification of sections f h is 8x (double that of section e). g. Tallest peaks of E1 in transition to E2, during which the E1 and E2 peaks overlap and merge. h. E2 alone, much later in the probe. An appearance similar to classical E2 (using the DC monitor), with negative-going peaks, occurs at the beginning of this excerpt near the letter h; other variations in appearance are typical of pea aphid recordings with the AC-DC monitor, probably due to greater sensitivity and rapid response time of modern amplifier electronics. pd 波被證明是路徑階段過程 口針從細胞之 時間極為短暫 (約 5~15 秒) 的次階段行為 間 刺穿植物細胞及進入細胞內部所造成的 或是在植物組織的停留位置 因此蚜蟲傳播非 電壓下降 (Tjallingii, 1985a) 除了以上的證 持續性病毒 (non-persistent viruses) 之特 據外 以組織切片與電子顯微鏡觀察 發現蚜 性被轉而用於解釋次階段 II-1 II-2 與 II-3 所 蟲口針鞘所經過的植物組織周圍細胞 有許多 發生的行為 (Martin et al., 1997) 效法早期 被穿刺的情形 此更進一步證實 pd 波與細胞 使 用 AC EPG 監 測 儀 學 者 Scheller and 穿刺行為有關 (Tjallingii and Hogen Esch, Shukle (1986) 的概念 Martin et al. (1997) 1993) 以兩種 蚜蟲-病毒 組合 分別為 Aphis pd 波可被細分為 3 個次階段 I II 與 III gossypii Glover 與 其 傳 播 之 Cucumber (Fig. 3d) 次階段 I 為 pd 波電壓的突降區域 mosaic virus (CMV) 以及 Myzus persicae 次階段 II 為 pd 波電壓持續位於低電位的區 Sulzer 與其傳播之 Potato virus Y (PVY) 在 域 次階段 III 則為 pd 波電的突升區域 並 第一部分研究中 以 EPG 記錄不帶毒的蚜蟲 回到原始的電壓值 (細胞外的電壓值) 次階段 被置於帶毒植株上的獲毒過程 並於第一個 pd I 以及 III 分別代表口針刺入細胞以及最終抽 波之次階段 II-1 II-2 或 II-3 的後期 人工中 出口針的過程 (Tjallingii, 1985a) 次階段 II 止獲毒行為 該蚜蟲隨之被使用於接種試驗 為相對較複雜的區域 其中又可再細分為次階 在第二部分的實驗中 以 EPG 記錄帶毒的蚜 段 II-1 II-2 與 II-3 (Fig. 3d) (Powell et 蟲被置於健康植株上傳毒 並於第一個 pd 波 al., 1995) 以 傳 統 方 法 ( 例 如 口 針 切 截 之次階段 II-1 II-2 與 II-3 的後期 人工中止 (stylectomy) 等) 很難觀察蚜蟲口針在發生 傳毒行為 結果顯示次階段 II-3 與非持續病毒 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

61 傳播有最大關聯, 很可能代表於植物細胞內取食 ; 次階段 II-1 與傳毒最為相關, 很可能代表於植物細胞內分泌唾液 以上研究結果顯示次階段 II-1 II-2 與 II-3 分別代表了植物細胞內唾液分泌 未知行為以及植物細胞內取食 (Martin et al., 1997) Harris and Harris (2001) 隨後提出了假說, 認為 II-2 代表取食的汁液由前圍食腔吐回植物的行為 這個假說尚未在蚜蟲中以實驗證明, 但在最近已在其他半翅目昆蟲的吐食行為被證實 (Backus et al., 2015) 波形 pd 在高輸入電阻值時能夠完整顯現所有次階段, 例如第二代 EPG 監測儀 (DC EPG 系統之輸入電阻值為 10 9 Ohms) 或是第三代 EPG 監測儀 (AC-DC EPG 系統之輸入電阻值則為 10 8 Ohms 或以上 ) 至於使用第一代 EPG 監測儀 (AC EPG 系統之輸入電阻值為 10 6 Ohms), 雖然無法辨別次階段 II-1 II-2 與 II-3, 但次階段 II-2 卻可被偵測 (Reese et al., 2000), 次階段 I 與 III 則不能被呈現 在 AC-DC EPG 監測儀可使用不同的 Ri 值來記錄 pd 波,pd 波的深度以及其中次階段的細節, 會隨著輸入電阻值的升高 (10 6 至 Ohms) 而漸趨增加 (Backus and Bennett, 2009) 這個結果證實了次階段 II 是以 emf 為主成分的波形 ( 三 ) 路徑階段 : 波形 F 波形 F 是路徑階段較不常見的波形, 在蚜蟲取食人工食料的過程從未出現此波形, 只在取食植物組織時才會產生 F 波的長度變異很大, 從幾分鐘到幾小時, 且不會於 E 波之前發生 所有在 Tjallingii (1987) 報告中測試過的蚜蟲都能夠產生這個波形, 但波形發生的頻率隨寄主植物種類而異 根據組織切片的觀察, 當 F 波產生時, 蚜蟲口針位於細胞間隙, 周圍的細胞通常有較厚的細胞壁及不明顯的 中膠層 (middle lamellae) 以放射性同位素 (radioisotope) 標定取食測試結果, 顯示發生 F 波的植物汁液取食量, 高出路徑階段 A B 與 C 波總和的 10 倍以上 基於有限資訊,F 波被推測是蚜蟲試著將口針於狹窄空間中移動過程, 口針與特定細胞壁交互作用的結果 (Tjallingii, 1987), 此波形目前被稱為 口針錯位波形 (derailed stylet mechanics) AC EPG 研究者將波形 F 定義為 非韌皮部取食行為 (non-phloem ingestion), 此乃因使用較低輸入電阻值而無法與波形 G ( 詳見下述 ) 進行區別 ( 四 ) 波形 X 最早鑑定出 X 波形的 EPG, 是使用較低電阻的 AC EPG 監測儀 雖然詳細的行為並不清楚, 但以豌豆蚜 (Acyrthosiphon pisum (Harris)) 為材料的研究, 此波形存在於韌皮部階段之前, 且發生率為 100% (McLean and Kinsey 1964, 1967) Scheller and Shukle (1986) 研究麥長管蚜 (Sitobion avenae (F.)) 取食行為報告, 利用病毒作為標示因子, 精確的將波形 X 與大麥黃矮病毒 (Barley yellow dwarf virus (BYDV)) 的傳播作關聯 BYDV 被 S. avenae 以持續循環型 (persistentcirculative) 的模式傳播, 並侷限感染於韌皮部之中 病毒顆粒經由韌皮部汁液被蚜蟲取食獲得, 經過一段時間於蚜蟲體內循環之後, 由唾液傳播回植物中 (Sylvester, 1980) 帶毒之蚜蟲被置於健康植株上, 以 EPG 監測儀記錄 90 分鐘 結果顯示 X 波為傳毒必要的波形, 因此代表口針與韌皮部篩管細胞的接觸以及唾液分泌 單一的 X 波就能造成植物 65% 的感染率, 且與 X 波產生時間的長短無關 獲毒以及傳毒的機率, 則隨 X 波發生的數量而上升 (Scheller and Shukle, 1986) X 波與 pd 波的關聯性, 隨著 Reese et al. 昆蟲刺探電位圖譜 (EPG) 59

62 (2000) 發現 X 波前段為延長的 pd 波之後, 逐漸明朗,X 波的後面部分則為一個較長 精細的梳狀 C 波 由於這種較長的波形組成, 讓 X 波在早期擁有緩速帶狀圖紀錄器的 AC EPG 監測儀也能被記錄及觀察 R-pd 波的發現則讓 X 波被瞭解的更為透徹,R-pd 波於 A. pisum, Brevicoryne brassicae (L.), Drepanosiphum platanoidis (Schrank) 以及 Periphyllus acericola (Walker) 等蚜蟲的取食行為研究過程被記錄 (Tjallingii and Gabryś, 1999; Backus and Bennett, 2009), 此特殊的 pd 波為一般 pd 波的延長, 具有較長的次階段 II 以及較低的強度 (Fig. 3e) R-pd 波必定存在於 X 波之中 (Fig. 3e), 因此永遠在 E1 之前出現, 相較於幼葉及莖部, 在成熟葉或是老葉 (B. brassicae 較不偏好取食的組織 ) 有較高的發生機率 基於電子顯微鏡的觀察結果, Tjallingii and Gabrys (1999) 認為 R-pd 波 ( 同時為 X 波 ) 是口針重複穿刺單一篩管細胞所造成之波形 蚜蟲的 X 波代表了路徑階段以及韌皮部階段取食行為的轉換過程, 雖然 X 波的功能尚未被證實, 但該行為很可能類似於其他半翅目昆蟲產生之 X 波, 與寄主細胞辨識及接受有很大的關係 (Backus et al., 2009) ( 五 ) 韌皮部階段 : 波形 E1 與 E2 Kimmins and Tjallingii (1985) 以 DC EPG 監測儀研究獲知韌皮部的穿刺, 與波形 D+E (pd) 有關, 此名稱在 Tjallingii (1990) 的報告中更名為波形 E1 與 E2 一般來說 E1 波發生於最後一個 X 波之後,E1 波發生一段時間後, 而植物又是蚜蟲所偏好者,E2 波將伴隨發生, 亦即 E1 與 E2 是規律且重複發生的組合波形 (Fig. 3e-h) 相對於 A B 和 C 波,E1 與 E2 波的強度較低,E1 與 E2 兩者之間的主要差異為波形模式與電位變化源 (electrical origins) E1 波是以 emf 為主的波 形,E2 波則是以 R 為主的波形, 亦即 E2 波強度隨著供應電壓強度而變化, 而 E1 波受供應電壓變化的影響則較小 (Tjallingii, 1990) 在發生順序上,E2 波永遠發生在 E1 波之後, 雖然 E1 與 E2 波的出現有很強的關連性, 但不代表一旦 E1 波產生之後, 就會有 E2 波產生 (Prado and Tjallingii, 1994) 由於 AC EPG 監測儀的 Ri 值較低, 所以儀器本身無法區分 E1 與 E2 波, 經由組織切片的觀察結果, 將兩者混合波形稱為 韌皮部取食波形 (phloem ingestion), 不過以 韌皮部階段 (phloem phase) 稱之更為適當 E1 與 E2 波在生物學上的意義已被透徹瞭解 使用同位素標定植物汁液以及研究唾液腺肌肉電生理圖譜 (electromyograms (EMG) of salivary pump muscle) 的結果, 分別發現取食植物汁液與唾液分泌有關 (Tjallingii, 1978) 在早期的 DC 系統研究報告所指的波形 D ( 等同於現今所稱的波形 E1 與 E2) 的時間長短, 與昆蟲體內獲得的放射性物質呈正相關, 且該波形的波動頻率, 與電生理圖譜所記錄的蚜蟲唾液腺肌肉收縮頻率相同 利用口針切截技術以及電子顯微鏡的觀察, 研究蚜蟲口針於植物組織的位置, 例如蚜蟲的口針在產生 E1 與 E2 波 7 分 30 秒之後被截斷, 大部分的口針切口會因為韌皮部膨壓關係泌出汁液 電子顯微鏡的觀察也發現在 E1 與 E2 波發生期間, 口針位置大多在篩管細胞之中 (Kimmins and Tjallingii, 1985), 此外在篩管細胞中並無唾液鞘存在 (Tjallingii and Hogen Esch, 1993) Prado and Tjallingii (1994) 的研究中, 藉由重複以及延伸 Scheller and Shukle (1986) 過去的實驗, 證明 E1 與 E2 波之行為, 代表在韌皮部篩管分泌唾液 (E1), 同時以水溶性唾液進行取食 (E2) 再者, 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

63 Prado and Tjallingii (1994) 以稻麥蚜 (Rhopalosiphum padi (L.)) 傳播大麥黃矮病毒 (BYDV), 研究取食行為對傳病效率的影響, 但不同於 Scheller and Shukle (1986) 的研究, 蚜蟲傳毒或是獲毒的行為分別被中止 ( 自植物上移開取食中的蚜蟲 ) 於特定波形 結果與 Scheller and Shukle (1986) 的發現有點類似, 當 E2 波持續 10 分鐘或以上時會有 58% 獲毒機率, 此波形也與獲毒最為相關, E1 波則與病毒傳播最為相關 (Prado and Tjallingii, 1994) 結合兩篇報告的結果可以得知反覆的篩管細胞穿刺 ( 如 X 波中的 R-pd 波 ) 以及持續性分泌的水溶性唾液 ( 如 E1 波 ) 皆代表了在上述 X 波章節中提到, 辨識與接受寄主前蚜蟲複雜的行為模式 Tjallingii (1994) 發現 Aphis fabae Scopoli 自穿刺開始至抵達韌皮部的時間約 45 分鐘, 但達到穩定的韌皮部取食, 則需耗時 3 ~4 小時, 這些重複穿刺篩管細胞 ( 如 R-pd 波 ) 及持續的分泌唾液 ( 如 E1 波 ), 顯示在刺吸韌皮部細胞之前存在複雜的行為 E1 波也被發現與寄主植物的接受程度有很大的關係, 當蚜蟲的寄主植物存在某些程度的抗性, E1 波的時間往往較長, 亦即擁有較長的唾液分泌時間, 有時還會伴隨較短的 E2 波, 或未伴隨 E2 波的發生 (Nielson and Don, 1974; Niassy et al., 1987; Ryan et al., 1987; Dixon et al., 1990), 以上顯示蚜蟲分泌唾液的潛在機制, 或許與抑制寄主韌皮部汁液抗蟲因子有關 ( 六 ) 木質部階段波形 G 偶爾會在蚜蟲取食人工食料或是植物組織中產生, 根據組織切片觀察結果發現該波發生時, 蚜蟲口針位於木質部, 據此推測 G 波與木質部取食有關 此外藉由飢餓或是乾燥環境處理, 蚜蟲都能有效的促發 G 波的產生 (Spiller et al., 1990) Tjallingii (1987) 指出 G 波與 E2 波之間的差異, 包括 (1) 波形更加類似正弦曲線 ;(2) 波形強度較大 ;(3) 電壓值較高 (G 波具有細胞外電壓值 );(4) 波形較為不規則 蚜蟲就如同多數的韌皮部取食者一樣, 多數 EPG 研究報告未顯示蚜蟲可取食木質部汁液 ( 沒有產生 G 波的紀錄 ), 但 Powell and Hardie (2002) 指出 Aphis fabae 在接觸植物之後,60% 的有翅型個體會取食木質部汁液, 但無翅型個體卻未取食木質部汁液, 據此推論在蚜蟲的擴散行為中, 取食木質部汁液的個體具有演化上的優勢 六 以 EPG 研究蚜蟲在害蟲整合管理的應用 EPG 除了可鑑定害蟲的取食特性, 也被運用在其他具有實務價值的研究, 其中以寄主抗性評估的應用研究最多 蚜蟲在感性與抗性寄主品系, 或是在寄主與非寄主植物上的 EPG 取食行為特徵, 可大幅縮短研究人員有效評估寄主抗性的研究時程 (Nielson and Don, 1974; Lohar and Kawada, 1987; Peters et al., 1988; Montllor and Tjallingii, 1989; Annan et al., 2000; Wang et al., 2004), 也有助於判斷不同抗性因子在植物組織的存在或表現位置 (van Helden and Tjallingii, 1993; Caillaud et al., 1995; Kaloshian et al., 2000; Zehnder, 2001; Sandanayaka et al., 2003; Le Roux et al., 2008; Lightle et al., 2012; Koch et al., 2015); 在農業上, 尚可評估殺蟲劑與拒食劑對蚜蟲取食行為的影響 (Holbrook, 1977; Reuter et al., 1993; Harrewijn and Kayser, 1997; Abraham and Epperlein, 1999; Kang et al., 2012) 蚜蟲同時也是許多蟲媒植物病毒的媒介昆蟲, 造成全球性的重大經濟損失, 過去也有很多運用 EPG 研究蚜蟲的傳毒行為, 例如透過 EPG 定 昆蟲刺探電位圖譜 (EPG) 61

64 義蚜蟲取食行為與獲得病毒或接種病毒之間的相互關係 (Hodges and McLean, 1969; Holbrook, 1978; Powell, 1991; Prado and Tjallingii, 1994; Martin et al., 1997), 也可以進行帶毒或不帶毒蚜蟲的取食行為差異研究, 或是研究蚜蟲在感病或健康植株上的取食行為差異比較 (Ullman et al., 1988; Blua and Perring, 1992; Quiroz et al., 1992; Boquel et al., 2011; Hu et al., 2013) EPG 研究也可應用在生態學或演化學 蚜蟲與植物之間交互作用的結果, 可藉由 EPG 快速與客觀的作出推論, 此部分可參見本文已闡述的內容 藉由比較 EPG 的行為差異, 可將之應用在蚜蟲的種間或種內交互作用的研究 (Chongrattanameteekul et al., 1991; Formusoh et al., 1992; Prado and Tjallingii, 1997; Morris and Foster, 2008; Brunissen et al., 2009); 同時, 利用行為差異除可檢測遺傳變異性, 也可檢視蚜蟲寄主專一性 寄主多樣化 同域種化 (sympatric speciation) 以及異域種化 (allopatric speciation) 的相關假說 (Caillaud, 1999; Powell and Hardie, 2000; Funk and Bernays, 2001; Tosh et al., 2001, 2003; Halarewicz and Gabryś, 2012; Kordan et al., 2012) 七 EPG 於臺灣蚜蟲應用之研究展望儘管國際上有關 EPG 的研究發展已超過 50 年, 但直到 2014 年臺灣才由農業試驗所應用動物組開始引入 AC-DC EPG 機器, 從事葉蟬等刺吸式害蟲取食行為與抗蟲育種之相關研究 蚜蟲為臺灣農業重要害蟲, 如同其他蟲媒病原的媒介昆蟲一樣, 蚜蟲可傳播許多作物病害, 造成嚴重的經濟損失 (Lee, 1986; Bau et al., 2004; Deng, 2011) 在臺灣目前田間由蚜蟲傳播的重要植物病毒, 包括胡瓜嵌紋病毒 (Cucumber mosaic virus) 木瓜輪點病毒西瓜系統 (Papaya ringspot virus W strain) 木瓜輪點病毒 (Papaya ringspot virus) 馬鈴薯 Y 病毒 (Potato virus Y) 蕪菁嵌紋病毒 (Turnip mosaic virus) 矮南瓜黃化嵌紋病毒 (Zucchini yellow mosaic virus) 與香蕉萎縮病毒 (Banana bunchy-top virus) 等 (Deng, 2011; Tsai and Chen, 2011) 多年來專家學者費心尋找防治病害及蚜蟲的有效方法, 其中抗蟲或抗病特性的作物品系 (Niassy et al., 1987; Li et al., 2007; Smith and Boyko, 2007), 較能有效降低田間病毒感染情形, 而植物針對這兩者的抗性有時候是同時有效的 (Chen et al., 1996), 因此抗性作物品系的選育, 普遍被認為可有效控制植物病毒病害, 並能減少農業用藥 改善作物品質以及產量 在抗病毒的作物選育上,EPG 可提供一個快速篩選的技術, 由於各種蚜蟲所產生的波形相當一致, 更有利於不同作物不同蚜蟲的篩選 在臺灣田間主要的蚜蟲傳播病毒病害大多屬於非持續型傳播 ( 陳,2006), 傳播的行為能快速的在蚜蟲與植物接觸後發生, 因此 EPG 研究主要可針對抑制蚜蟲穿刺行為前期 ( 例如口針穿刺路徑階段 ) 的植物表面抗性因子, 進行作物品系篩選 除了抗性作物選育之外, 農藥對於蚜蟲行為的影響也能藉由 EPG 來偵測, 並藉此瞭解各種農藥在蚜蟲防治以及防止病毒傳播的潛力以及效果 雖然在臺灣有許多主要病媒蚜蟲已被人研究, 但蚜蟲的病毒傳播行為從未使用 EPG 做精準的分析 EPG 技術不僅可為臺灣從事刺吸式口器害蟲的基礎生物 取食行為鑑定及生態學, 提供一個新技術, 也可應用在農業上的抗蟲育種與抗藥性檢測, 更能應用在氣候變遷下, 二氧化碳及臭氧濃度提高對此類害蟲取食行為及 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

65 生物學的影響研究 八 引入 EPG 從事臺灣農業害蟲的規劃及後續研究展望本文通訊作者多年來與藥試所蘇秋竹博士合作研究臺灣葡萄皮爾斯病媒介昆蟲之傳病效率與取食行為, 當時認為若能引入 EPG 至臺灣, 將可大幅縮短傳病驗證與寄主植物確認的研究時程, 可節省龐大的研究人力與時間 為此, 本文通訊作者與農委會動植物防檢疫局植防組陳保良科長及蔡偉皇技正 ( 現轉任農委會科技處 ), 自 2010 年始盤點我國農作物蟲媒植物病原原核生物的研究缺口, 並由防檢局與農試所在 2011 年辦理 農作物害蟲及其媒介病害整合防治技術研討會, 以盤點臺灣在此領域的既有研究成果及缺口, 其中需由國外引入之關鍵研究技術, 則列為研提農委會國際合作領域動植物防檢疫推動小組的課題 因此, 自 2012~2015 年期間, 由農委會各試驗場所派遣專家至國外學習新技術, 或邀請國際學者來台辦理專業訓練班, 期望藉由強化此領域的研究基礎, 進而可開發解決產業的應用研究 其中, 引入昆蟲刺探電位圖譜監測儀 (EPG) 及辦理訓練班, 即為國際合作的重點 有鑑於此, 農業試驗所在 2014 年由通訊作者, 至美國農部加州帕里爾市經瓦金谷農業研究中心 (San Joaquin Valley Agricultural Sciences Center, Parlier, CA, USDA /ARS), 在 AC-DC EPG ( 即第 3 代昆蟲刺探電位圖譜監測儀 ) 發明者 Dr. Elaine A. Backus 的指導下, 學習 AC-DC EPG 之操作與分析技術, 盼能將此技術與儀器引入臺灣, 應用在媒介昆蟲防治的相關研究, 同時也可協助作物育種專家縮短抗蟲育種時程 ; 同年農試所應用動物組也完成 AC-DC EPG 監測儀的購置 並於 2015 年 2 月 25 日至 3 月 19 日, 透過自辦計 畫編列經費邀請 Dr. Elaine A. Backus 至農試所辦理 2015 年昆蟲刺探電位圖譜儀之操作與分析技術專題討論會, 藉此將此技術推廣至農委會各試驗場所與相關大學 同年, 藥試所黃莉欣博士透過國際合作計畫, 於 104 年 4 月 日邀請美國加州大學河濱分校 Professor Gregroy P. Walker 至藥試所, 針對 DC EPG, 辦理 昆蟲刺探電位測量系統 (Electric Penetration Graph, EPG) 研習會, 這兩個訓練班是臺灣首次密集辦理兩類型 EPG 監測儀專業訓練的開始 本文係由 Dr. E. A. Backus 與通訊作者, 為感謝國立臺灣大學昆蟲學系吳文哲教授長期以來, 支持昆蟲界研究學者所研提的國際合作計畫 本文作者群藉由吳教授榮退前, 共同撰寫華人首篇完整回顧三代 EPG 監測儀原理及其在蚜蟲的研究回顧報告, 盼提供臺灣與中國學者未來在 EPG 的應用研究, 可更為深入, 為提升兩岸農業產值各自奉獻心力及橫向合作 誌謝本文感謝臺灣大學吳文哲教授 屏東科技大學張念台教授 動植物防疫檢疫局陳保良科長 農委會陳昌岑技正及蔡偉皇技正等先進, 長期以來大力支持國際合作領域的病蟲害各個子項計畫 除此, 通訊作者也感謝農試所應用動物組高靜華組長與張淑貞助理研究員, 支持部分經費購置 AC-DC EPG 最後, 本文通訊作者感謝應用動物組同仁過去幾年, 協同辦理國內外研討會, 對於盤點國內研究缺口與引入國外新技術, 有重大貢獻 ; 另感謝藥試所黃莉欣博士與臺灣大學昆蟲學系蔡志偉博士, 邀請國外專家來台辦理 EPG 相關訓練班與演講, 嘉惠農業研究學者 昆蟲刺探電位圖譜 (EPG) 63

66 引用文獻陳慶忠 2006 防疫檢疫重要植物病毒之媒介昆蟲與傳毒原理 植物重要防疫檢疫害蟲診斷鑑定研習會專刊 6:21-72 Abraham K, Epperlein K Influence of imidacloprid after seed-treatment of maize on the sucking behavior of the bird-cherry aphid (Rhopalosiphum padi L.) and on the transmission of BYDV using electrical penetration graph technique in laboratory investigations. Gesunde Pflanzen 51: Almeida RPP, Purcell AH Patterns of Xylella fastidiosa colonization on the precibarium of sharpshooter vectors relative to transmission to plants. Ann Entomol Soc Am 99: Annan IB, Ward M, Tingey WM, Schaefers GA, Tjallngil WF, Backus EA, Saxena KN Stylet penetration activities by Aphis craccivora (Homoptera: Aphididae) on plants and excised plant parts of resistant and susceptible cultivars of cowpea (Leguminosae). Ann Entomol Soc Am 93: Backus EA History, development, and applications of the AC electronic monitoring system for insect feeding. pp In:Ellsbury MM, Backus EA, Ullman DE (eds). History, Development, and Application of AC Electronic Insect Feeding Monitors. Entomological Society of America, Lanham, MD. Backus EA. in press. Sharpshooter feeding behavior in relation to transmission of Xylella fastidiosa: A model for foregutborne transmission mechanisms. pp. In:BrownJK (ed). Vector-Mediated Transmission of Plant Pathogens. American Phytopathological Society. Backus EA, Bennett WH The AC-DC correlation monitor: New EPG design with flexible input resistors to detect both R and emf components for any piercing-sucking hemipteran. J Insect Physiol 55: Backus EA, Devaney MJ, Bennett WH Comparison of signal processing circuits among seven AC electronic monitoring systems for their effects on the emf and R components of aphid (Homoptera: Aphididae) waveforms. pp In:Walker GP, Backus EA (eds). Principles and Applications of Electronic Monitoring and Other Techniques in the Study of Homopteran Feeding Behavior. Entomological Society of America, Lanham, MD. Backus EA, Habibi J, Yan F, Ellersieck M Stylet penetration by adult Homalodisca coagulata on grape: Electrical penetration graph waveform characterization, tissue correlation, and possible implications for transmission of Xylella fastidiosa. Ann Entomol Soc Am 98: Backus EA, Holmes WJ, Schreiber F, Reardon BJ, Walker GP Sharpshooter X wave: Correlation of an electrical penetration graph waveform 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

67 with xylem penetration supports a hypothesized mechanism for Xylella fastidiosa inoculation. Ann Entomol Soc Am 102: Backus EA, Rangasamy M, Stamm M, McAuslane HJ, Cherry R Waveform library for chinch bugs (Hemiptera: Heteroptera: Blissidae): characterization of electrical penetration graph waveforms at multiple input impedances. Ann Entomol Soc Am 106: Backus EA, Shugart HJ, Rogers EE, Morgan JK, Shatters R Direct evidence of egestion and salivation of Xylella fastidiosa suggests sharpshooters can be flying syringes. Phytopathology 105: Bau HJ, Cheng YH, Yu TA, Yang JS, Liou PC, Hsiao CH, Lin CY, Yeh SD Field evaluation of transgenic papaya lines carrying the coat protein gene of papaya ringspot virus in Taiwan. Plant Dis 88: Blua MJ, Perring TM Effects of zucchini yellow mosaic virus on colonization and feeding behavior of Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae) alatae. Environ Entomo 21: Boquel S, Giordanengo P, Ameline A Divergent effects of PVY-infected potato plant on aphids. European J Plant Pathol129: Boquel S, Delayen C, Couty A, Giordanengo P, Ameline A Modulation of aphid vector activity by potato virus y on in vitro potato plants. Plant Dis 96: Brunissen L, Cherqui A, Pelletier Y, Vincent C, Giordanengo P Host-plant mediated interactions between two aphid species. Entomol Exp Appl 132: Caillaud CM Behavioural correlates of genetic divergence due to host specialization in the pea aphid, Acrythosiphon pisum. Entomol Exp Appl 91: Caillaud CM, Pierre JS, Chaubet B, Di Pietro JP Analysis of wheat resistance to the cereal aphid Sitobion avenae using electrical penetration graphs and flow charts combined with correspondence analysis. Entomol Exp Appl 75: Chen JQ, Delobel B, Rahbé Y, Sauvion N Biological and chemical characteristics of a genetic resistance of melon to the melon aphid. Entomol Exp Appl 80: Chongrattanameteekul W, Foster JE, Shukle RH, Araya JE Feeding behavior of Rhopalosiphum padi (L.) and Sitobion avenae (F.) (Hom., Aphididae) on wheat as affected by conspecific and interspecific interactions. J Appl Entomol 111: Deng TC Evolutionary change of trends in prevalence of cucurbitsinfecting viruses in Taiwan, In: Shih HT, Chang CJ (eds). Proceedings of the Symposium on 昆蟲刺探電位圖譜 (EPG) 65

68 Integrated Management Technology of Insect Vectors and Insect-Borne Diseases. Special Publication of TARI No pp Dixon AGO, Bramel-Cox PJ, Reese JC Feeding behavior of biotype E greenbug (Homoptera: Aphididae) and its relationship to resistance in sorghum. J Econ Entomol 83: Dugravot S, Backus EA, Reardon BJ, Miller TA Correlations of cibarial muscle activities of Homalodisca spp. sharpshooters (Hemiptera: Cicadellidae) with EPG ingestion waveform and excretion. J Insect Physiol 54: Formusoh ES, Wilde GE, Reese JC Reproduction and feeding behavior of greenbug biotype E (Homoptera: Aphididae) on wheat previously fed upon by aphids. J Econ Entomol 85: Funk DJ, Bernays EA Geographic variation in host specificity reveals host range evolution in Uroleucon ambrosiae aphids. Ecology 82: Halarewicz A, Gabryś B Did the evolutionary transition of aphids from angiosperm to non-spermatophyte vascular plants have any effect on probing behaviour? Bull Insectol 65: Harrewijn P, Kayser H Pymetrozine, a fast-acting and selective inhibitor of aphid feeding. In-situ studies with electronic monitoring of feeding behaviour. Pestic Sci 49: Harris KF, Harris LJ Ingestionegestion theory of cuticula-borne virus transmission. pp In: Harris KF, Smith OP, Duffus JE (eds). Virus- Insect-Plant Interactions. Academic Press, New York. Hodges LR, McLean DL Correlation of transmission of bean yellow mosaic virus with salivation activity of Acyrthosiphon pisum (Homoptera: Aphididae). Ann Entomol Soci Am 62: Holbrook FR Aldicarb and thiofanox: effect on the feeding activity of green peach aphids. J Econ Entomol 70: Holbrook FR Transmission of potato leaf roll virus by the green peach aphid. Ann Entomol Soc Am 71: (832). Hu Z, Zhao H, Thieme T Modification of non-vector aphid feeding behavior on virusinfected host plant. J Insect Sci 13: 28. Jiang YX, Walker GP Pathway phase waveform characteristics correlated with length and rate of stylet advancement and partial stylet withdrawal in AC electrical penetration graphs of adult whiteflies. EntomolExp Appl 101: Kaloshian I, Kinsey MG, Williamson VM, Ullman DE Mi-mediated resistance against the potato aphid 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

69 Macrosiphum euphorbiae (Hemiptera: Aphididae) limits sieve element ingestion. Environ Entomol29: Kang MA, Seo MJ, Hwang IC, Jang C, Park HJ, Yu YM, Youn YN Insecticidal activity and feeding behavior of the green peach aphid, Myzus persicae, after treatment with nano types of pyrifluquinazon. J Asia- Pacif Entomol15: Kimmins FM, Tjallingii WF Ultrastructure of sieve element penetration by aphid stylets during electrical recording. Entomol Exp Appl 39: Koch KG, Palmer N, Stamm M, Bradshaw JD, Blankenship E, Baird LM, Sarath G, Heng-Moss TM Characterization of greenbug feeding behavior and aphid (Hemiptera: Aphididae) host preference in relation to resistant and susceptible tetraploid switchgrass populations. Bioenergy Res 8: Kordan B, Dancewicz K, Wróblewska A, Gabryś B Intraspecific variation in alkaloid profile of four lupine species with implications for the pea aphid probing behaviour. Phytochem Lett 5: Le Roux V, Dugravot S, Campan E, Dubois F, Vincent C, Giordanengo P Wild Solanum resistance to aphids: Antixenosis or antibiosis? J Econ Entomol 101: Lee H Seasonal occurrence of the important insect pests on cabbage in southern Taiwan. J Agric Res China 35: Leopold RA, Freeman TP, Buckner JS, Nelson DR Mouthpart morphology and stylet penetration of host plants by the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata, (Homoptera: Cicadellidae). Arthropod Struct Dev 32: Li Y, Hill C, Carlson S, Diers B, Hartman G Soybean aphid resistance genes in the soybean cultivars Dowling and Jackson map to linkage group M. Mol Breed 19: Lightle DM, Dossett M, Backus EA, Lee JC Location of the mechanism of resistance to Amphorophora agathonica (Hemiptera: Aphididae) in red raspberry. J Econ Entomol 105: Lohar MK, Kawada K Probing behaviour of the aphid, Schizaphis graminum (Rondani), Rhopalosiphum maidis (Fitch) and Longiunguis sacchari (Zehntner) on resistant and susceptible sorghum plants. Ber Ohara Inst Iandw Biol Okayama Univ 19: Martin B, Collar JL, Tjallingii WF, Fereres A Intracellular ingestion and salivation by aphids may cause the acquisition and inoculation of nonpersistently transmitted plant viruses. J Gen Virol 78: 昆蟲刺探電位圖譜 (EPG) 67

70 McLean DL, Kinsey MG A technique for electronically recording aphid feeding and salivation. Nature 202: McLean DL, Kinsey MG Probing behavior of the pea aphid, Acyrthosiphon pisum. I. Definitive correlation of electronically recorded waveforms with aphid probing activities. Ann Entomol Soc Am 60: McLean DL, Weigt WA, Jr An electronic measuring system to record aphid salivation and ingestion. Ann Entomol Soc Am 61: Miranda MP, Fereres A, Appezzato- Da-Gloria B, Lopes JRS Characterization of electrical penetration graphs of Bucephalogonia xanthophis, a vector of Xylella fastidiosa in citrus. Entomol Exp Appl 130: Montllor CB, Tjallingii WF Stylet penetration by two aphid species on susceptible and resistant lettuce. Entomol Exp Appl 52: Moreno A, Garzo E, Fernandez-Mata G, Kassem M, Aranda MA, Fereres A Aphids secrete watery saliva into plant tissues from the onset of stylet penetration. Entomol Exp Appl 139: Morris G, Foster WA Duelling aphids: Electrical penetration graphs reveal the value of fighting for a feeding site. J Exp Biol 211: Niassy A, Ryan JD, Peters DC Variations in feeding behavior, fecundity, and damage of biotypes B and E of Schizaphis graminum (Homoptera: Aphididae) on three wheat genotypes. Environ Entomol 16: Nielson MW, Don H Probing behavior of biotypes of the spotted alfalfa aphid on resistant and susceptible alfalfa clones. Entomol Exp Appl 17: Pearson CC, Backus EA, Shugart HJ, Munyaneza JE Characterization and correlation of EPG waveforms of Bactericera cockerelli (Hemiptera: Triozidae): Variability in waveform appearance in relation to applied signal. Ann Entomol Soc Am 107: Peters DC, Kerns D, Puterka GJ, McNew R Feeding behavior, development, and damage by biotypes B, C, and E of Schizaphis graminum (Homoptera: Aphididae) on Wintermalt and Post barley. Environ Entomol 17: Pollard DG Plant penetration by feeding aphids (Hemiptera, Aphidoidea): a review. Bull Entomol Res 62: Powell G Cell membrane punctures during epidermal penetrations by aphids: consequences for the transmission of two potyviruses. Ann Appl Biol 119: 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

71 Powell G, Hardie J Host-selection behaviour by genetically identical aphids with different plant preferences. Physiol Entomol 25: Powell G, Hardie J Xylem ingestion by winged aphids. Entomol Exp Appl 104: Powell G, Pirone T, Hardie J Aphid stylet activities during potyvirus acquisition from plants and an in vitro system that correlate with subsequent transmission. Eur J Plant Pathol 101: Powell G, Tosh CR, Hardie J Host plant selection by aphids: Behavioral, evolutionary, and applied perspectives. Annu Rev Entomol 51: Prado E, Tjallingii WF Aphid activities during sieve element punctures. Entomol Exp Appl 72: Prado E, Tjallingii WF Effects of previous plant infestation on sieve element acceptance by two aphids. Entomol Exp Appl 82: Purcell AH, Finlay AH, McLean DL Pierce s disease bacterium: mechanism of transmission by leafhopper vectors. Science 206: Quiroz C, Lister RM, Shukle RH, Araya JE, Foster JE Selection of symptom variants from the NY-MAV strain of barley yellow dwarf virus and their effects on the feeding behavior of the vector Sitobion avenae (Homoptera: Aphididae). Environ Entomol 21: Reese J, Tjallingii WF, Van Helden M, Prado E Waveform comparisons among AC and DC electronic monitoring systems for aphid (Homoptera: Aphididae) feeding behavior. pp In: Walker GP, Backus EA (eds). Principles and Applications of Electronic Monitoring and Other Techniques in the Study of Homopteran Feeding Behavior. Entomological Society of America, Lanham, MD. Reese JC, Margolies DC, Backus EA, Noyes S, Bramel-Cox P, Dixon AGO Characterization of aphid host plant resistance and feeding behavior through use of a computerized insect feeding monitor. pp In: Ellsbury MM, Backus EA, Ullman DE. (eds). History, Development, and Application of AC Electronic Insect Feeding Monitors. Entomological Society of America, Lanham, MD. Reuter LL, Toscano NC, Perring TM Modification of feeding behavior of Myzus persicae (Homoptera, Aphididae) by selected compounds. Environ Entomol 22: Ryan JD, Dorschner KW, Girma M, Johnson RC, Eikenbary RD Feeding behavior, fecundity, and honeydew production of two biotypes of greenbug (Homoptera: Aphididae) on resistant and susceptible wheat. Environ Entomol 16: 昆蟲刺探電位圖譜 (EPG) 69

72 Sandanayaka WRM, Bus VGM, Connolly P, Newcomb R Characteristics associated with woolly apple aphid Eriosoma lanigerum, resistance of three apple rootstocks. Entomol Exp Appl 109: Schaefers GA The use of direct current for electronically recording aphid feeding and salivation. Ann Entomol Soc Am 59: Scheller HV, Shukle RH Feeding behavior and transmission of barley yellow dwarf virus by Sitobion avenae on oats. Entomol Exp Appl 40: Smith CM, Boyko EV The molecular bases of plant resistance and defense responses to aphid feeding: current status. Entomol Exp Appl 122: Spiller N, Koenders L, Tjallingii W Xylem ingestion by aphids a strategy for maintaining water balance. Entomol Exp Appl 55: Sylvester E Circulative and propagative virus transmission by aphids. Annu Rev Entomol 25: Tjallingii WF Electronic recording of penetration behaviour by aphids. Entomol Exp Appl 24: Tjallingii WF Electrical recording of aphid penetration. pp In: Visser JH,MinksAK (eds). Proceedings of the 5th International Symposium on Insect-Plant Relationships. Centre for Agricultural Publication and Documentation, Wageningen. Tjallingii WF. 1985a. Membrane potentials as an indication for plant cell penetration by aphid stylets. Entomol Exp Appl 38: Tjallingii WF. 1985b. Electrical nature of recorded signals during stylet penetration by aphids. Entomol Exp Appl 38: Tjallingii WF Stylet penetration activities by aphids: new correlations with electrical penetration graphs. pp In: Labeyrie V, Fabres G, Lachaise D (eds). Proceedings of the 6th International Symposium on Insect-Plant Relationships. Dr. W. Junk Publishers, Dordrecht. Tjallingii WF Continuous recording of stylet penetration activities by aphids. pp In: Campbell RK., Eikenbary RD (eds). Aphid-plant genotype interactions. Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam. Tjallingii WF Sieve element acceptance by aphids. Eur J Entomol 91: Tjallingii WF Comparison of AC and DC systems for electronic monitoring of stylet penetration activities by homopterans. pp In: Walker GP, Backus EA (eds). Principles and Applications of Electronic Monitoring and Other Techniques in the Study of Homopteran Feeding Behavior. Entomological Society of America. Tjallingii WF, Hogen Esch T Fine 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

73 structure of aphid stylet routes in plant tissues in correlation with EPG signals. Physiol Entomol 18: Tjallingii WF, Gabryś B Anomalous stylet punctures of phloem sieve elements by aphids. Entomol Exp Appl 91: Tosh CR, Walters KFA, Douglas AE On the mechanistic basis of plant affiliation in the black bean aphid (Aphis fabae) species complex. Entomol Exp Appl 99: Tosh CR, Powell G, Hardie J Decision making by generalist and specialist aphids with the same genotype. J Insect Physiol49: Tsai CW, Chen WT Control strategies of important aphids that transmit viral diseases of crops. Proceedings of the Symposium on Integrated Management Technology of Insect Vectors and Insect-Borne Diseases. pp Ullman DE, Qualset CO, McLean DL Feeding responses of Rhopalosiphum padi (Homoptera: Aphidae) to barley yellow dwarf virus resistant and susceptible barley varieties. Environ Entomol 17: van Helden M, Tjallingii WF Tissue localisation of lettuce resistance to the aphid Nasonovia ribisnigri using electrical penetration graphs. Entomol Exp Appl 68: Walker GP A beginner s guide to electronic monitoring of homopteran probing behavior. pp In:Walker GP, Backus EA (eds). Principles and Applications of Electronic Monitoring and Other Techniques in the Study of Homopteran Feeding Behavior. Entomological Society of America. Wang YM, Zhang PF, Chen JQ Host-preference biotypes of the cotton aphid, Aphis gossypiiglover and the behavioral mechanism in their formation. Acta Entomol Sin 47: Zehnder GW, Nichols, A. J., Edwards, O. R., Ridsdill-Smith, T. J Electronically monitored cowpea aphid feeding behavior on resistant and susceptible lupins. EntomolExpAppl 98: 昆蟲刺探電位圖譜 (EPG) 71

74 Electropenetrography: A New Diagnostic Technology for Study of Feeding Behavior of Piercing-sucking Insects Elaine A. Backus 1, Po-An Lin 2, Chung-Jan Chang 3, 4, and Hsien-TzungShih 2* USDA Agricultural Research Service, San Joaquin Valley Agricultural Sciences Center, 9611 So. Riverbend Ave, Parlier, CA U.S.A. Taiwan Agricultural Research Institute, Applied Zoology Division, 189 Chung-Cheng Rd., Wufeng, Taichung 413, Taiwan, R.O.C. Department of Plant Pathology, University of Georgia, Griffin Campus, Georgia, U.S.A. Department of Plant Pathology, National Chung Hsing University, Taichung 402, Taiwan ABSTRACT Studying the feeding, plant damage, and transmission (i.e. acquisition, retention, and inoculation) of plant pathogens caused by hemipteran insect pests has always been a challenge. This is primarily because their specialized, piercing-sucking mouthparts, the stylets, perform probing/penetrating action into opaque plant tissues in which the stylets cannot be directly visualized. This challenge was overcome by a technological revolution over 50 years ago; the invention of electropenetrography, or electrical penetration graph (EPG) monitoring, the most rigorous method to identify feeding behaviors of hemipteran crop pests. Today, EPG is used in three main areas for the development of novel integrated pest management (IPM) tactics for hemipteran pests. Firstly, in cases where the fundamental mechanisms of feeding damage or transmission of a plant pathogen are unknown, EPG is instrumental in identifying such mechanisms. Secondly, once the feeding-related causes of damage or pathogen transmission are understood, EPG can be used to demonstrate the effects of insecticides, antifeedants, or other chemical compounds on specific feeding behaviors responsible for the damage or transmission. Thirdly, EPG can similarly identify the effects of resistant vs. susceptible varieties of crop plants, including transgenic plants genetically engineered to express biopesticides. The purpose of this paper is to review: 1) principles and history of EPG, especially development of the new and improved, third-generation AC-DC monitor, 2) what waveforms and types of information can be gained via EPG, using aphid pests as a model system, and 3) how EPG can be applied to the special needs of Taiwanese agriculture, especially for some species of aphids of economic significance in Taiwan. For the first time in print, our review describes and discusses in details the information of all three types of EPG monitors used for researches on aphids. Key words: electrical penetration graph (EPG), Hemiptera, feeding behavior 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會 * Corresponding [email protected]

75 研究報告 2015 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會 P Symposium on Trans-Century Plant Protection and Quarantine Technologies P73-86 寡核苷酸微陣列鑑定檢疫害蟲 路光暉* 陳嬿后 國立中興大學昆蟲學系 402 臺中市南區國光路 250 號 摘 要 隨著農產品進出口的頻繁 害蟲隨之自國外入侵本土的機會也大增 為防堵害蟲 的入侵 以避免造成國內農業生產的損失 多數國家訂定有嚴格的植物檢疫規範 在 檢疫過程中 如何能夠精確且快速地鑑定被檢出害蟲的種類 即成為一項相當重要的 工作 因為其結果對後續檢疫程序的裁決具有決定性的影響 傳統上 害蟲種類的鑑 定多採形態特徵為根據 但由於特徵的鑑別需要具相當程度的專業與訓練背景 再加 上 許多害蟲的為害期為其幼蟲時期 其形態特徵更加難以區辨 非一般植物檢疫人 員能夠勝任 近年來 由於分子生物學知識與技術的長足進步 許多技術亦已被應用 於生物物種的鑑定 其中核酸微陣列 (DNA microarray) 或稱之為 DNA 晶片 (DNA chip) 即為其一 本文主要即在綜述本研究室過去幾年來開發 DNA 晶片的概念與過 程 藉以闡述此等技術在植物檢疫害蟲鑑定上之開發概念與應用 關鍵詞 植物檢疫 害蟲鑑定 寡核苷酸微陣列 DNA 晶片 前 言 侵 確保我國農業之生產安全 列名我國重要之檢疫害蟲中 許多屬雙翅 臺灣加入世界貿易組織 (World Trade 目 (Diptera) 果實蠅科 (Tephritidae) 之世 Organization; WTO) 後 隨著國際貿易的發 界 性 害 蟲 如 地 中 海 果 實 蠅 (Ceratitis 達與旅運的頻繁 致使境外害蟲伴隨著進口農 capitata) 木瓜果實蠅 (Bactrocera papaya) 產品伺機入侵的機會也隨之提高 我國防檢疫 昆士蘭果實蠅 (B. tryoni) 楊桃果實蠅 (B. 單位依據國際疫情隨時修訂植物檢疫規定 加 carambolae) 墨 西 哥 果 實 蠅 (Anastrepha 上農產品輸入時在國內機場 港口有檢疫的嚴 ludens) 格把關 阻絕重大疫病蟲害於境外 確實能發 pomonella) 等等 由於果實蠅寄主範圍廣 揮最大的效果 有效防杜國外疫病害蟲之入 泛 繁殖快且飛行能力強 可在短期內發生嚴 *論文聯繫人 Corresponding 及 蘋 果 果 實 蠅 (Rhagoletis 寡核苷酸微陣列鑑定檢疫害蟲 73

76 重疫情, 造成龐大的農業損失, 因此受到世界各國的重視 過去, 於 1995 年澳洲北昆士蘭發現木瓜果實蠅入侵, 為此澳洲政府花費澳幣 3354 萬元進行防治 又如,2004 年日本發現茄實蠅 (B. latifrons) 入侵琉球群島後, 政府隨即啟動撲滅計劃, 釋放不孕性雄蟲以期降低野外族群數量, 至今仍持續進行 而東方果實蠅 (B. dorsalis) 在臺灣地區所造成的為害, 若不加以防治, 預估每年會造成將近 40~50 億元的損失 由於, 當外來果實蠅入侵時, 在第一時間並無天敵或防治資料及方法, 不易控制而易造成重大損失, 因此在所有檢疫害蟲中, 果實蠅類便成為其中受重視的一群 鱗翅目 (Lepidoptera) 薔薇科害蟲包括蘋果蠹蛾 (Cydia pomonella) 及桃蛀果蛾 (Carposina sasakii) 等, 也是我國極力防堵之重要檢疫害蟲 牠們以幼蟲侵入果實內蛀食造成為害 ; 此外, 初齡幼蟲在尋得適當鑽入處前, 亦會隨處啃咬果皮而造成果實表面的傷害 這兩種為害都會影響鮮果實產量與商品價值 一旦遭其入侵臺灣, 可能受到之寄主作物涵蓋我國重要經濟作物包括蘋果 桃 李 梨 棗等鮮果實, 造成農業重大損失 ; 所幸, 我國尚未發現上述兩種檢疫害蟲之紀錄, 而蘋果為本國水果進口之大宗, 為杜絕害蟲入侵, 故而將之列為重要之檢疫害蟲 木蝨 (psyllids) 為半翅目 (Hemiptera) 腹吻亞目 (Sternorrhyncha) 木蝨總科 (Psylloidea) 之昆蟲 木蝨多以木本植物為食, 在溫帶及亞熱帶地區對不少經濟作物, 如柑橘 梨樹 蘋果 柿子 無花果 棉花 馬鈴薯等, 造成為害 ; 另有些會為害觀賞植物或行道樹, 如白楊 黃楊木與樟樹等 木蝨對於植物的影響是多層面的, 牠們以刺吸式口器吸取植物韌皮部汁液, 直接造成植物傷害, 導致嫩芽或葉片捲曲與萎凋 ; 而許多種類亦會排放 出的大量蜜露, 引發煤煙病, 大量覆蓋葉片表面時會阻斷植物光合作用, 造成樹勢衰弱 ; 尤有甚者, 有些扮演傳播植物病原的媒介, 導致植物罹病, 甚至死亡, 最著名者為傳播立枯病的柑橘木蝨 (Diaphorina citri Kuwayama) 與傳播梨衰弱病的梨木蝨 (Cacopsylla chinensis (Yang and Li)) 由於臺灣梨產業特殊, 藉由嫁接方式可將不同溫帶品系的優質梨果生產於中低海拔的本土橫山梨上, 此種高接梨多需仰賴進口接穗, 長年以來日本合法進口接穗皆經嚴格檢疫把關, 多數認為梨衰弱病與梨木蝨的發生乃經由非法走私之接穗所導致, 此一案例, 更突顯害蟲鑑定與檢疫之重要性 上述幾種為國內重要防檢疫害蟲種類, 為了杜絕害蟲侵入造成農業經濟的損失, 導致我國農產品外銷品質與競爭力的降低, 植物檢疫工作的重要性日漸升高 對於檢疫害蟲之鑑定, 長久以來, 都是運用傳統的外部形態鑑定 ; 由於昆蟲外部形態特徵需由有經驗的鑑識人員加以判定, 對於港口與機場的檢疫人員是一項困難的工作 有時農產品中被發現的害蟲僅剩一些殘肢碎片, 缺乏足夠之外部特徵以供種類鑑定 ; 此外, 當檢疫害蟲為卵 幼蟲或蛹等較難由外觀鑑定的時期, 往往會使種類鑑定工作更為困難, 大多需將其飼育至羽化為成蟲才得以鑑定, 如此便喪失了檢疫的時效, 造成貿易的紛爭與損失 為了掌握檢疫時效及確保貨品的經濟利益, 必須開發出速度快 準確性及穩定性高 操作簡易, 而且適用於各個生長階段及不同蟲體部位的鑑定技術 近年來, 利用分子生物學技術為基礎開發鑑定檢疫害蟲方法有很多, 如逢機增幅核酸多形性 (random amplified polymorphic DNApolymeraase chain reaction, RAPD- PCR) 序列特徵化增幅區域 (sequence 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

77 characterized amplified regions, SCAR) 限制酵素圖譜 (restriction fragment length polymorphism, RFLP) 及增幅片段長度多形性 (amplified fragment length polymorphism, AFLP) 等等 ; 這些方法確實可以達到快速鑑定蟲種的目的, 唯這些方法均是藉由比對 PCR 反應結果之有無產物或圖譜異同, 以判定蟲種 由於 PCR 每一反應僅能鑑定單一種 ( 或少數幾種 ) 蟲種 ; 倘若無法鑑別種類時, 則必須再次以其他可能之專一性引子, 重複進行 PCR 檢測, 如此反覆篩檢所耗費的時間將因而延長 儘管 PCR 鑑定已發展至可利用 multiplex-pcr, 即將多組專一性引子對混合進行 PCR 反應, 藉以一次鑑別多種蟲種 ; 然而 multiplex-pcr 仍有其缺點, 如當需要鑑定害蟲種類愈多時, 相對所要加入的專一性引子對亦愈多, 反而增加 PCR 反應過程所受到的干擾, 而且檢測過程相對更加複雜, 反而增加第一線檢疫人員操作上的困擾 為了克服此一問題, 具有一次篩選多種蟲種的鑑定方法的 DNA 微陣列 (DNA microarray) 或稱 DNA 晶片 (DNA chip) 即具有此方面的應用潛力 生物晶片 (Biochip) 簡介生物晶片緣起於 1980 年代, 主要應用生物分子於電腦晶片上 本文所敘述之生物晶片則是將大量生物材料, 如 DNA RNA 細胞 組織或蛋白質藉由機械點陣 (array) 方式密集點佈在一小範圍的承載物包含薄膜 (Rudi et al. 2000; Wang et al. 2002) 玻璃(Yim et al. 2005; Liu et al. 2006) 或矽晶片上 由於在玻片上的點陣密度非常密集, 因此又稱之為微陣列 (microarray) 生物晶片技術含的優點包括, 體積小 具有多功能 自動化分析及大量分析樣本等 ; 簡言之, 它可以經由一次的反 應同時獲得大量的基因或生物訊息 近年來生物晶片技術被廣泛地應用於各種生物研究, 特別是在醫藥方面 生物晶片種類與基本原理生物晶片種類很多, 依使用的材料或目的不同大致可分為 cdna 晶片 (complementary DNA chip) 寡核苷酸晶片 (oligonucleotide chip) 蛋白質晶片 (protein chip) 組織晶片 (tissue chip) (Merseburger et al., 2006) 微實驗室晶片 (lab-on-a-chip) 等 ; 其中又以 cdna 晶片和寡核苷酸晶片發展研究較多 (Lucchini et al. 2001; Chou et al. 2004; He et al. 2005), 兩種均統稱為 DNA 晶片 DNA 晶片之基本原理是藉 DNA 兩互補股間相互配對黏合的特性, 加上此配對具序列專一性, 做為判別彼此間相關性的依據 (Kucho et al. 2004) 應用於檢測工作的 DNA 主要可分為部分 : 一為點佈在晶片上的 DNA, 通稱為探針 DNA (probe DNA), 它是利用不同的方法將已知基因 ( 或 DNA) 片段的單股序列合成或固定在晶片上 (Wang et al. 2003); 另一為受檢測的 DNA, 通常稱為標的 DNA (target DNA), 即指所欲檢測檢體的 DNA 生物晶片技術所能檢測的檢體範圍, 從原核生物 (Wilson et al. 2002) 到真核生物之酵母菌 (Harrington et al. 2000) 植物 昆蟲到哺乳動物 ( 包括人類 ) 等等, 所有的物種均可 進行 DNA 晶片分析時, 係先將 target DNA 萃取後, 進行 PCR 增幅, 此反應一方面為了增加 DNA 的量, 以強化敏感度 (Ye et al. 2001); 另一方面則是藉此步驟將 target DNA 標定上特定螢光 (Yim et al. 2005) 同位素化 寡核苷酸微陣列鑑定檢疫害蟲 75

78 合物或其他的呈色物質 藉由同時標定兩種不同螢光 (Lucchini et al. 2001) 使之與 probe DNA 結合, 藉觀察之呈色位置, 以判斷 target DNA 為何 ; 或者, 利用呈色的深淺或不同的顯色來判斷其基因表現量 (Epstein and Butow 2000; Kucharski and Maleszka 2002; Tan et al. 2003; Mee 2005) 生物晶片之應用近年來, 生物晶片的應用層面逐漸增加, 所發表的文獻隨著生物科技的發展越來越多, 由人類基因表現或是醫學方面的應用, 到昆蟲行為, 以至到病毒或環境微生物鑑定等等, 均有所涵蓋 生物晶片技術可以同時快速檢測大量生化樣本, 如組織 蛋白質 DNA RNA 或細胞等生物或醫學檢體, 目前已廣泛被應用在 (1) 基因體學 (genomics) 研究, 如基因表現和基因功能分析 (Harrington et al. 2000; Liu et al. 2003; Gao et al. 2004; Wheeler et al. 2004; Kawada et al. 2006), (2) 癌症的研究 (Brentani et al. 2005; Yim et al. 2005; Merseburger et al. 2006; Tinker et al. 2006), 如引起癌症的原因為多基因或單一基因突變所致 (Tan et al. 2003),(3) 環境微生物 (Peplies et al. 2003; Zhou 2003; Ehrenreich 2006) 及引起人類疾病之病源為生物之研究 (Jin et al. 2005; Tobler et al. 2006), 以及其它如 (4) 藥劑開發 (Fu 2006) (5) 毒理學 (Ju et al. 2007) (6) 物種演化 (Fitzgerald et al. 2001; Dobrindt et al. 2003) 等等相關研究與應用 生物晶片運用於鑑定害蟲方面研究, 近幾年來也陸續有成果發表 (Kucharski and Maleszka 2002; Cash et al. 2005; Chung et al. 2011; De Luca Ferrari et al. 2013; Lee et al. 2013; Chen et al. 2014; Yeh et al. 2015) Chen et al. (2014) 利用生物晶片以三種 DNA 標誌 COI ND4 與 ND5 同時鑑定 11 種雙翅目瓜果實蠅害蟲, 此套晶片可經由一次的反應, 鑑定超過 10 種以上的檢疫害蟲 ;Yeh et al. (2015) 利用生物晶片以核醣體第一轉錄區間同時鑑定 11 種重要蓟馬害蟲 探針的專一性為生物晶片開發上最重要且必須的條件, 而反應條件, 如濃度 離子強度與溫度等, 也會影響其專一性和靈敏度 (Kane et al. 2000; Wang et al. 2003; He et al. 2005; Sunkara et al. 2007) 影響探針專一性的因素, 包括探針的長度 G+C 比例 不匹配 (mismatch) 核苷酸所在位置等 ; 此外, 還有序列的同源性 (sequence homologous) 與雜合反應的條件 (hybridization condition), 包括雜合溫度 時間 探針和檢體的濃度及雜合後清洗的溫度等 晶片雖可經由一次的測試檢測大量的基因, 但也由於這樣則更需要最佳的條件來進行各種不同的應用 (Letowski et al. 2004) 鑑定物種之 DNA 標誌 (DNA markers) 篩選 由於形態鑑定方面之專家不多, 以及物種在某些發育時期之形態特徵難以辨識 ; 此外有些原生生物, 如微生物 病毒或細菌, 形態特徵稀少, 這些都有賴建立新的分類鑑定技術, 許多學者已經廣泛利用 DNA 分子輔助傳統形態鑑定方法 目前, 用於種間或近緣種的分類鑑定大多選用變異較大的區段, 如核糖體第一和第二內轉錄區間 (Internal transcribed spacer, ITS1 and ITS2), 做為 DNA 標誌 ; 此區域演化速率較快, 在同屬內種間都有變異存在 (Li and Wilkerson 2005; Farris et al 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

79 2010; Kamau et al. 2011; Dang et al. 2012) Douglas and Haymer (2001) 利用 ITS1 進行果實蠅類 C. capitata 與 C. rosa 之分類鑑定, 根據 ITS1 之序列將此兩種歸為同一群 Vidigal et al (2004) 利用 ITS1 和 ITS2 做為蝸牛 Biomphalaria tenagophila complex 分類鑑定之 DNA 標誌 另外, 也有選用 28S 和 16S rrna 做為分類鑑定之 DNA 標誌 (Small et al. 2001; Kelly et al. 2005); 粒線體之 COI 基因區段 DNA 目前也是廣為運用的區段 (Apte et al. 2007; Shih et al. 2007) 由於 COI 基因之保守性引子已在許多目昆蟲取得, 可複製多數昆蟲之五端 ; 另外 COI 具有較廣的演化訊息, 其第三密碼位具有高度的突變率, 具有快速演化的特性, 因此目前 COI 廣泛被運用在多方面的研究 (Prabhakar et al. 2012; Frey et al. 2013; Jiang et al. 2013) 寡核苷酸晶片之開發與運用近年來本研究室亦從事寡核苷酸晶片開發, 所使用之晶片平台為三孔盤研究用之生物晶片 開發基本流程 :(1) 初步先進行蟲體 DNA 萃取, 爾後 (2) 依所設計之通用性 PCR 引子 (universal primer) 對進行 PCR 反應 ( 註 : 若是 PCR 產物將用於晶片測試者, 則改採具 biotin 標定的引子對 ), 之後 (3) 將 DNA 片段回收純化 選殖與定序,(4) 序列經解序後, 利用分析軟體比對各蟲種之 DNA 序列, 並取各種蟲之間變異較明顯的區域做為設計探針的對象, 設計時需注意探針序列之理想條件為 GC 比例需在 45% 左右,Tm 值為 45~55 之間, 而所設計探針長度為 18~25 bps 設計所得之各探針序列, 經測試若具種蟲種專一性者, 則可供本檢測晶片之用 本生物晶片的基本原理, 係先以 PCR 增幅並標誌 (labeling) 欲檢測之樣本 DNA ( 即 target DNA), 令之與晶片上之探針 DNA 進行雜合 (hybridization) 反應, 最後洗去未雜合的 DNA, 再將之顯色, 以出現色斑的有無判定蟲種類 此晶片開發過程大致為六個步驟, 簡述如下 : PCR 增幅 : 進行生物晶片測試前, 需先將樣本進行 PCR 增幅 由於本生物晶片需藉呈色位置來判定結果, 因此需使用有 biotin 標定之引子進行 PCR 增幅, 一方面可以將標的 DNA 數量增加 ; 另一方面也可藉 PCR 反應進行 biotin 標定 探針溶液的配製 : 取 10 μl 濃度為 40 μμ 合成的寡核苷酸探針與 10 μl 2X 探針溶液 (probe solution) 混合置入 0.6 ml 之微量離心管中以備用 探針之點佈與固定 : 先將空白晶片放置於手動點片機之特定位置上, 取 10 μl 配製好的探針溶液分別加入點孔盤中, 再利用點片機上所放置的細針點陣在已設定的位置, 之後將以點製完成之晶片置於 45 烘烤 1-2 分鐘, 再以紫外光核酸固定儀 (cross linker) (UVitec, EEC), 以 1 J, 6 分鐘進行 UV 照射將探針固定在晶片上 接著加入 500 μl 無菌水清洗, 靜置 6 分鐘後倒掉, 重複兩次, 最後取 100 μl 99.5% 酒精加入每一晶片反應槽後馬上倒掉, 之後置於 45 下烘烤 10 分鐘以乾燥 雜合反應 : 在晶片每一反應槽先加入 200 μl 雜合反應液, 再將 10 μl 經 94 5 分鐘加熱變性的 PCR 產物 ( 有 biotin 標定者 ) 與之混合, 置於 42 雜合反應 1 小時 清洗與顯色 : 雜合反應後, 以 200 μl washing buffer 分別清洗 3 次各停留 1 分鐘後, 以一個反應槽為一個單位配製 blocking buffer, 將 0.2 μl streptavidin conjugated 寡核苷酸微陣列鑑定檢疫害蟲 77

80 (B. alkaline phosphatase (Strep-AP) 與 200 μl 地鑑別包括東方果實蠅 瓜實蠅 blocking reagent 混合激烈震盪 10 秒 接著 cucubitae) 南瓜實蠅 (B. tau) 橄欖果實蠅 每個反應槽加入 180 μl blocking buffer 反應 (B. oleae) 茄實蠅 (B. latifrons) 木瓜果實 30 分鐘 再以 200 μl washing buffer 清洗 3 蠅 昆士蘭果實蠅 楊桃果實蠅 次 之後再配製顯色劑 (以 4 μl NBT/BCIP carambolae) 地中海果實蠅 墨西哥果實蠅 與 196 μl detection buffer 混合並緩慢搖 及蘋果果實蠅等 11 種重要檢疫害蟲之種類 勻) 加入 180 μl 於晶片反應槽中 置於暗室 2014 年已發表此篇研究(Chen et al. 2014) 反應 5~10 分鐘 反應後以 500 μl 逆滲透純水 (圖一) 重複清洗 3 次 置於 45 下烘乾 最後放在 室溫保存即可 (B. 除此之外 我們亦業已開發得鱗翅目與木 蝨類重要害蟲之鑑定晶片 目前整準備發表相 結果的分析 其結果主要是以色斑的有 關報告中 鱗翅目鑑定晶片可同時鑑定蘋果蠹 無 配合其所出現的位置 以做為判別結果的 蛾 東方果蛾 (Grapholita monesta) 桃蛀果 依據 蛾 淡棕色蘋果蠹蛾 (Epiphyas postvittana) 過去幾年 本研究室利用此方法已成功開 和栗小卷蛾 (Cydia splendana) 五種重要鱗 發可鑑定果實蠅類 鱗翅目與木蝨類害蟲等共 翅目薔薇科害蟲 (圖二) 至於木蝨類害蟲鑑定 三套生物晶片鑑定系統 果實蠅類害蟲可同時 晶片 則係利用核糖體 ITS2 基因區段進行 利用粒線體 COI ND4 和 ND5 基因區段進行 PCR 增幅 並以已可準確 快速與穩定地鑑 multiplex-pcr 增幅 可以準確 快速與穩定 別出包括八種 Cacopsylla 屬木蝨 包括中國 圖一 十一種瓜果實蠅害蟲之晶片鑑定之結果 每種蟲種以矩陣方式呈現有 4 個專一性探針 上面 2 點為 COI 探針 左 下為 ND4 探針 右下為 ND5 探針 Bd 東方果實蠅 (Bactrocera dorsalis) Bcu 瓜實蠅 (B. cucubitae) Bta 南瓜實蠅 (B. tau) 茄實蠅 (B.latifrons) Bo 橄欖果實蠅 (B. oleae) Bp 木瓜果實蠅 (B. papaya) Btr 昆士 蘭果實蠅 (B. tryoni) Bca 楊桃果實蠅 (B. carambolae) Cc 地中海果實蠅 (Ceratitis capitata) 墨西哥果實蠅 (A. ludens) 及 Rp 蘋果果實蠅 (Rhagoletis pomonella) 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

81 圖二 五種鱗翅目害蟲之晶片鑑定結果 每種蟲種有 4 個 COI 區段設計之專一性探針 以矩陣型式呈現 Cp 蘋果蠹蛾 (Codling moth, C. pomonella) Gm 東方果蛾 (Oriental fruit moth, G. molesta) Cs 桃蛀果蛾 (Peach fruit moth, C. sasakii) Ep 淡棕色蘋果蠹蛾 (E. postivittana) Csp 栗小卷蛾 (C. splendana) 梨 木 蝨 (C. chinensis) 山 枇 杷 木 蝨 (C. 物晶片使用之便利性 本研究室進一步與合作 eriobotryacola) 梨 木 蝨 梨 黃 木 蝨 (C. 廠商進行晶片產品化開發 96 孔雛型鑑定晶 pyricola) 黔梨木蝨 (C. qianli) 臺灣海桐木 片 即可搭配 96 孔生物晶片自動清洗機共同 蝨 (C. oluanpiensis) 海桐木蝨 (C. tobirae) 使用 更簡化操作之過程 可完全達到簡便 與蔬果海桐木蝨 (C. multijuga)及七種其他 快速與準確之目的 (圖四) 屬木蝨 包括柑桔木蝨 檬果木蝨 (Microceropsylla nigra) 龍 眼 木 蝨 (Neophacopteron euphoriae) 桑 木 蝨 (Paurocephala sauteri) 巴 西 蒲 桃 木 蝨 (Trioza outeiensis) 象 牙 木 木 蝨 結 語 多年來 國內各檢疫單位會將所攔截到之 (T. 蟲體 (主要為鱗翅目 少數為雙翅目) 送至本 magnicauda) 與 Bactericera cockerell ( 圖 單位進行檢疫鑑定 其中部份檢體曾依照本研 三) 究室所建立之生物晶片鑑定害蟲之 SOP 實際 為縮短害蟲鑑定所需的時間 本研究期間 進行檢測 包括雙翅目 7 件與鱗翅目 13 件 我們亦完成可搭配檢驗晶片所使用之簡易且 其結果均顯示晶片之結果與序列分析之結果 快速 DNA 萃取方法之穩定度與效果 並訂定 完全符合 足以證實所開發之生物晶片確實具 SOP 提供與檢測晶片搭配使用 鑑定過程由抽 有高度之準確度與穩定度 取 DNA 到鑑定結果呈現 僅需 5~6 小時即可 由於本 DNA 晶片鑑定操作方法簡單 且 知道鑑定結果 再者 為更進一步提升此套生 在 4-5 個小時內可以獲得穩定的結果 現場植 寡核苷酸微陣列鑑定檢疫害蟲 79

82 圖三 十五種木蝨之 ITS2 晶片鑑定結果 (A) 每種木蝨專一性探針之矩陣陳列示意圖 (B) 晶片測試結果 Ne 龍眼木 蝨 (N. euphoriae) To 巴西蒲桃木蝨 (T. outeiensis) Tm 象牙木木蝨 (T. magnicauda) Ps 桑木蝨 (P. sauteri) Mn 檬果木蝨 (M. nigra) Dci 柑桔木蝨 (D. citri) Cch 中國梨木蝨 (C. chinensis) Cq 黔梨木蝨 (C. qianli) Cer 山枇杷木蝨 (C. eriobotryacola) C. pyric 梨黃木蝨 (C. pyricola) C. pyri 梨木蝨 (C. pyri) Bc Bactericera cockerell Co 臺灣海桐木蝨 (C. oluanpiensis) Ct 海桐木蝨 (C. tobirae) 與 Cum 蔬果海 桐木蝨 (C. multijuga) 物檢疫工作同仁經訓練亦多可穩定操作 顯見 Paranephrops spp. Mol Ecol 16: 其應適用於現場害蟲的檢測與鑑定 Brentani RR, Carraro DM, Verjovski- 誌 謝 Almeida S, Reis EM, Neves EJ, de Souza SJ, Carvalho AF, Brentani H, 本研究多年來得行政院農委會動植物防 Reis LF Gene expression arrays 疫檢疫局及科技部的計畫經會補助 以及許多 in cancer research: methods and 同仁與朋友們提供各種昆蟲樣本 供本試驗使 applications. Crit Rev Oncol Hematol 用 使相關研究得以順利進行 特此謹致謝忱 54: Cash 引用文獻 AC, Whitfield CW, Ismail N, Robinson GE Behavior and the limits of genomic plasticity: power and Apte S, Smith PJ, Wallis GP replicability in microarray analysis of Mitochondrial phylogeography of New honeybee brains. Genes Brain Behav Zealand 4: freshwater crayfishes, 2015 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

83 圖四 96 孔盤生物晶片檢測流程之全自動清洗與呈色反應 Chen YH, Liu LY, Tsai WH, Haymer DS, Lu KH Using DNA chips for identification of tephritid pest species. in the whitefly Bemisia tabaci. Pest Manag Sci 67: Dang HT, Park HK, Myung SC, Kim W Development of a novel PCR Pest Manag Sci 70: Chou CC, Chen CH, Lee TT, Peck K assay based on the 16S-23S rrna Optimization of probe length and the internal transcribed spacer region for number of probes per gene for optimal the detection of Lactococcus garvieae. microarray J Fish Dis 35: analysis of gene expression. Nucleic Acids Res 32: e99. De Luca Ferrari M, Ribeiro Resende M, Chung IH, Kang S, Kim YR, Kim JH, Jung Sakai K, Muraosa Y, Lyra L, Gonoi T, JW, Lee S, Lee SH, Hwang SY Mikami Y, Tominaga K, Kamei K, Development of a low-density DNA Zaninelli Schreiber A, Trabasso P, microarray for diagnosis of target-site Moretti ML Visual analysis of mutations DNA microarray data for accurate of pyrethroid and organophosphate resistance mutations molecular identification of non- 寡核苷酸微陣列鑑定檢疫害蟲 81

84 albicans Candida isolates from patients with candidemia episodes. J Clin Microbiol 51: Dobrindt U, Agerer F, Michaelis K, Janka A, Buchrieser C, Samuelson M, Svanborg C, Gottschalk G, Karch H, Hacker J Analysis of genome plasticity in pathogenic and commensal Escherichia coli isolates by use of DNA arrays. J Bacteriol 185: Douglas LJ, Haymer DS Ribosomal ITS1 polymorphisms in Ceratitis capitata and Ceratitis rosa (Diptera: Tephritidae). Ann Entomol Soc Am 94: Ehrenreich A DNA microarray technology for the microbiologist: an overview. Appl Microbiol Biotechnol 73: Epstein CB, Butow RA Microarray technology - enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol 11: Farris RE, Ruiz-Arce R, Ciomperlik M, Vasquez JD, Deleon R Development of a ribosomal DNA ITS2 marker for the identification of the thrips, Scirtothrips dorsalis. J Insect Sci 10: 26 (doi: / ). Fitzgerald JR, Sturdevant DE, Mackie SM, Gill SR, Musser JM Evolutionary genomics of Staphylococcus aureus: insights into the origin of methicillinresistant strains and the toxic shock syndrome epidemic. Proc Natl Acad Sci U S A 98: Frey JE, Guillen L, Frey B, Samietz J, Rull J, Aluja M Developing diagnostic SNP panels for the identification of true fruit flies (Diptera: Tephritidae) within the limits of COI-based species delimitation. BMC Evol Biol 13: 106. Fu LM Exploring drug action on Mycobacterium tuberculosis using affymetrix oligonucleotide genechips. Tuberculosis (Edinb) 86: Gao H, Wang Y, Liu X, Yan T, Wu L, Alm E, Arkin A, Thompson DK, Zhou J Global transcriptome analysis of the heat shock response of Shewanella oneidensis. J Bacteriol 186: Harrington CA, Rosenow C, Retief J Monitoring gene expression using DNA microarrays. Curr Opin Microbiol 3: He Z, Wu L, Li X, Fields MW, Zhou J Empirical establishment of oligonucleotide probe design criteria. Appl Environ Microbiol 71: Jiang F, Li ZH, Deng YL, Wu JJ, Liu RS, Buahom N Rapid diagnosis of the economically important fruit fly, Bactrocera correcta (Diptera: Tephritidae) based on a species-specific barcoding cytochrome oxidase I marker. Bull Entomol Res 103: Jin LQ, Li JW, Wang SQ, Chao FH, Wang XW, Yuan ZQ Detection and identification of intestinal pathogenic 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

85 bacteria by hybridization to oligonucleotide microarrays. World J Gastroenterol 11: Ju Z, Wells MC, Walter RB DNA microarray technology in toxicogenomics of aquatic models: methods and applications. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol 145: Kamau J, Salim B, Yokoyama N, Kinyanjui P, Sugimoto C Rapid discrimination and quantification of Theileria orientalis types using ribosomal DNA internal transcribed spacers. Infect Genet Evol 11: Kane MD, Jatkoe TA, Stumpf CR, Lu J, Thomas JD, Madore SJ Assessment of the sensitivity and specificity of oligonucleotide (50 mer) microarrays. Nucleic Acids Res 28: Kawada J, Kimura H, Kamachi Y, Nishikawa K, Taniguchi M, Nagaoka K, Kurahashi H, Kojima S, Morishima T Analysis of gene-expression profiles by oligonucleotide microarray in children with influenza. J Gen Virol 87: Kelly JJ, Siripong S, McCormack J, Janus LR, Urakawa H, El Fantroussi S, Noble PA, Sappelsa L, Rittmann BE, Stahl DA DNA microarray detection of nitrifying bacterial 16S rrna in wastewater treatment plant samples. Water Res 39: Kucharski R, Maleszka R Evaluation of differential gene expression during behavioral development in the honeybee using microarrays and northern blots. Genome Biol 3: Research Kucho K, Yoneda H, Harada M, Ishiura M Determinants of sensitivity and specificity in spotted DNA microarrays with unmodified oligonucleotides. Genes Genet Syst 79: Lee WS, Choi H, Kang J, Kim JH, Lee SH, Lee S, Hwang SY Development of a DNA microarray for species identification of quarantine aphids. Pest Manag Sci 69: Letowski J, Brousseau R, Masson L Designing better probes: effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays. J Microbiol Methods 57: Li C, Wilkerson RC Identification of Anopheles (Nyssorhynchus) albitarsis complex species (Diptera: Culicidae) using rdna internal transcribed spacer 2-based polymerase chain reaction primes. Mem Inst Oswaldo Cruz 100: Liu HH, Cao X, Yang Y, Liu MG, Wang YF Array-based nano-amplification technique was applied in detection of hepatitis E virus. J Biochem Mol Biol 39: Liu Y, Zhou J, Omelchenko MV, Beliaev AS, Venkateswaran A, Stair J, Wu L, 寡核苷酸微陣列鑑定檢疫害蟲 83

86 Thompson DK, Xu D, Rogozin IB, Gaidamakova EK, Zhai M, Makarova KS, Koonin EV, Daly MJ Transcriptome dynamics of Deinococcus radiodurans recovering from ionizing radiation. Proc Natl Acad Sci U S A 100: Lucchini S, Thompson A, Hinton JC Microarrays for microbiologists. Microbiology 147: Mee CJ Microarray methods in Drosophila neurobiology. Invert Neurosci 5: Merseburger AS, Anastasiadis AG, Hennenlotter J, Schilling D, Simon P, Machtens SA, Serth J, Stenzl A, Kuczyk MA Tissue microarrays: applications in urological cancer research. World J Urol 24: Peplies J, Glockner FO, Amann R Optimization strategies for DNA microarray-based detection of bacteria with 16S rrna-targeting oligonucleotide probes. Appl Environ Microbiol 69: Prabhakar CS, Mehta PK, Sood P, Singh SK, Sharma P, Sharma PN Population genetic structure of the melon fly, Bactrocera cucurbitae (Coquillett) (Diptera: Tephritidae) based on mitochondrial cytochrome oxidase (COI) gene sequences. Genetica 140: Rudi K, Skulberg OM, Skulberg R, Jakobsen KS Application of sequence-specific labeled 16S rrna gene oligonucleotide probes for genetic profiling of cyanobacterial abundance and diversity by array hybridization. Appl Environ Microbiol 66: Shih HT, Ng PK, Schubart CD, Chang HW Phylogeny and phylogeography of the genus Geothelphusa (Crustacea: Decapoda, Brachyura, Potamidae) in southwestern Taiwan based on two mitochondrial genes. Zoolog Sci 24: Small J, Call DR, Brockman FJ, Straub TM, Chandler DP Direct detection of 16S rrna in soil extracts by using oligonucleotide microarrays. Appl Environ Microbiol 67: Sunkara V, Hong BJ, Park JW Sensitivity enhancement of DNA microarray on nano-scale controlled surface by using a streptavidinfluorophore conjugate. Biosens Bioelectron 22: Tan ZJ, Hu XG, Cao GS, Tang Y Analysis of gene expression profile of pancreatic carcinoma using cdna microarray. World J Gastroenterol 9: Tinker AV, Boussioutas A, Bowtell DD The challenges of gene expression microarrays for the study of human cancer. Cancer Cell 9: Tobler NE, Pfunder M, Herzog K, Frey JE, Altwegg M Rapid detection and species identification of Mycobacterium spp. using real-time PCR and DNA 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

87 microarray. J Microbiol Methods 66: Vidigal TH, Spatz L, Kissinger JC, Redondo RA, Pires EC, Simpson AJ, Carvalho OS Analysis of the first and second internal transcribed spacer sequences of the ribosomal DNA in Biomphalaria tenagophila complex (Mollusca: Planorbidae). Mem Inst Oswaldo Cruz 99: Wang HY, Malek RL, Kwitek AE, Greene AS, Luu TV, Behbahani B, Frank B, Quackenbush J, Lee NH Assessing unmodified 70-mer oligonucleotide probe performance on glass-slide microarrays. Genome Biol 4: R5. Wang RF, Kim SJ, Robertson LH, Cerniglia CE Development of a membrane-array method for the detection of human intestinal bacteria in fecal samples. Mol Cell Probes 16: Wheeler DB, Bailey SN, Guertin DA, Carpenter AE, Higgins CO, Sabatini DM RNAi living-cell microarrays for loss-of-function screens in Drosophila melanogaster cells. Nat Methods 1: Wilson WJ, Strout CL, DeSantis TZ, Stilwell JL, Carrano AV, Andersen GL Sequence-specific identification of 18 pathogenic microorganisms using microarray technology. Mol Cell Probes 16: Ye RW, Wang T, Bedzyk L, Croker KM Applications of DNA microarrays in microbial systems. J Microbiol Methods 47: Yeh WB, Tseng MJ, Chang NT, Wu SY, Tsai YS Agronomically important thrips: development of species-specific primers in multiplex PCR and microarray assay using internal transcribed spacer 1 (ITS1) sequences for identification. Bull Entomol Res 105: Yim SC, Park HG, Chang HN, Cho DY Array-based mutation detection of BRCA1 using direct probe/target hybridization. Anal Biochem 337: Zhou J Microarrays for bacterial detection and microbial community analysis. Curr Opin Microbiol 6: 寡核苷酸微陣列鑑定檢疫害蟲 85

88 Identification of Quarantine Pests with Oligonucleotide Microarray Kuang-Hui Lu *, and Yen-Hou Chen Department of Entomology, National Chung Hsing University, Taichung City 402, Taiwan ABSTRACT With the increasing frequency of import and export of agricultural commodities, the chances of pest invasion from abroad along with these activities are also increased. To prevent pest invasion resulting in losses of domestic agricultural production, most countries have strict phytosanitary regulation. Therefore, accurate and quick identification of the species of the intercepted pests is required during quarantine process because the results have decisive influence on making the subsequent decision. Traditionally, species identification is mostly based on morphological characteristics, which is usually needed to be handled by well-trained personnel; moreover, most quarantine pests intercepted at their larval stages that are even more difficult to be distinguished. Usually it is not easy to be done by most quarantine officers. In recent years, due to the advances of molecular biology knowledge and technology, many techniques have been applied to the biological species identification, in which nucleic acid microarray (DNA microarray), or so-called DNA chips (DNA chip), is a widely used one. In this paper, we briefly reviewed the development of DNA chips in our laboratory over the past few years to elaborate the concepts and applications of using such techniques on quarantine pest identification. Key words: plant quarantine, pest identification, oligonucleotide microarray, DNA chip 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會 * Corresponding [email protected]

89 研究報告 2015 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會 P Symposium on Trans-Century Plant Protection and Quarantine Technologies P 臺灣重要檢疫害蟲偵察調查 陳健忠 1* 蕭旭峰 2 石憲宗 1 吳文哲 2 1 行政院農業委員會農業試驗所應用動物組 413 臺中市霧峰區中正路 189 號 2 國立臺灣大學昆蟲學系 106 臺北市羅斯福路四段 1 號 摘 要 由於國際間農產品貿易日增和觀光旅遊發達 使得入境農產品夾帶外來害蟲入侵 臺灣的風險增加 為了保護農業生產環境 臺灣在 1989 年建立了一個外來檢疫害蟲 偵察網 這個偵察網由大學院校 農業研究單位 地方政府機關共同組成 調查範圍 涵蓋臺灣本島及澎湖 金門 馬祖等外島 主要是為了早期發現入侵的重要檢疫害蟲 並在其立足之前啟動撲滅作業 予以消滅 偵察調查工作持續至今 (2015) 已有 26 年 尚未發現 19 種標的檢疫害蟲入侵 確立臺 澎 金 馬地區的非疫狀態 促進 我國鮮果外銷並提升國際地位 這個偵察網的調查結果 同時可以做為國際農產品貿 易諮商談判及植物有害生物風險評估之佐證 本文爰就此項偵察系統的建立與進展情 形作一說明 關鍵詞 檢疫害蟲 偵察調查 臺灣 前 言 溫帶果樹均適合種植 主要栽培的果樹如柑 桔 芒果 荔枝 番石榴 釋迦 蓮霧 木瓜 國際農產品貿易日益頻繁 入境旅客連年 印度棗 枇杷 楊桃 桃 李 梨 梅 柿 增長 加強關口檢疫防堵外來害蟲入侵 一直 蘋果等 均為重要經濟作物 也是果實蠅等多 是植物防疫的重要工作 然而從世界各國的檢 種檢疫害蟲的寄主 新興水果如紅龍果 酪 疫實務經驗得知 再嚴格的把關仍然無法完全 梨 波蘿蜜 榴璉蜜 黃金果 楊梅果 仙桃 杜絕外來害蟲入侵 此外 外來害蟲尚可隨著 山竹等陸續加入栽培行列 雖然面積較小但也 氣流 水流 走私農產品或種苗等其他管道傳 都是果實蠅喜好的作物 入 更增外來害蟲入侵風險 Elson-Harris, 1992; Liu et al., 2011) 這些 臺灣地處亞熱帶但高山林立 因此熱帶及 *論文聯繫人 Corresponding [email protected] (White and 果樹散布全臺各地 交替開花結果 終年不 臺灣重要檢疫害蟲偵察調查 87

90 斷, 大幅增加外來害蟲立足的機會 為了保護農作物, 避免遭到新入侵害蟲為害, 許多國家均已針對特定作物與特定害蟲進行偵察, 以期及早發現入侵的害蟲, 並謀求滅絕之對策 這些特定害蟲多屬本國尚未發生之檢疫害蟲, 偵察結果亦可確立非疫狀態 (pest-free status), 做為農產品進出口風險評估及貿易諮商談判之佐證資料 我國於 1989 年開始執行果樹檢疫害蟲調查, 並逐步建立完成有系統的檢疫害蟲偵察網, 為了因應貿易自由化與國際化之趨勢, 須持續強化現有偵察作業與效率, 以確保臺灣地區農業生產環境之安全, 維護農產品外銷之競爭力 各國檢疫害蟲偵察現況美國美國農業部動植物健康檢驗局 (USDA- APHIS) 常年執行農業有害生物協同調查 (Cooperative Agricultural Pest Survey, CAPS), 認定這項有害生物偵察計畫是聯結境外檢疫 境內關口檢疫 以及全美鄉村與城市調查點間的重要偵察系統, 並以多管齊下之方式, 由主管當局 學界 政府部門 州農業部 大學 業界等共同完成以下任務 :(1) 以透明有系統的評估方式確認有害生物的威脅,(2) 訂定合乎科學的診斷與調查規範,(3) 提供調查資材 ( 誘器 誘餌等 ),(4) 實地執行調查, (5) 於指定的資料庫上定期回報調查結果,(6) 確認調查資料的品質與正確性,(7) 透過法定程序公布重大偵獲訊息 經費主要來源為美國農部, 由 APHIS 和各州的合作單位在 CAPS 計畫下執行調查工作, 構成防止有害生物入侵除了關口檢疫外的第二道防線 CAPS 每年制定國家調查準則 (National Survey Guidelines), 並做內容的調整 例如 2011 年 的工作焦點 政策 調查形式維持與 2010 年相同, 但以 包裹式調查 (bundled survey) 的概念為核心, 調查重點除了商品外, 同時考量環境 棲所 工業 商業 以及有害生物入侵途徑的連續性, 以便提高調查成效與經濟效益 州政府 CAPS 委員會負責規劃最適合的包裹式調查方案, 以符合當地有害生物風險 農業 環境等需求, 早期發現入侵的外來害蟲 其中, 有害生物入侵途徑的研究, 是規劃與執行調查時必要的工作項目, 州政府所提供配合款的多寡, 亦是國會補助該項計畫的重要參考 (APHIS, 2015) 以加州為例, 該州農業產值全美第一, 非常重視外來害蟲入侵, 但也經常發現外來害蟲, 陸續啟動撲滅計畫予以消滅 2013 年在農村 市郊與市區的偵察總經費為 2,850 萬美元 ( 聯邦與州政府 1890 萬, 各郡 960 萬 ), 針對 26 種特定外來害蟲以及一般的果實蠅種類, 總共懸掛了 175,000 個誘蟲器 ( 誘餌 ) (CACASA, 2014) 其中, 果實蠅誘蟲器為 86,000 個約占總懸掛數的一半 (49%), 顯示果實蠅為重要偵察標的, 主要的標的為蘋果果實蠅 (Rhagoletis pomonella) 歐洲櫻桃果實蠅 (R. cerasi) 瓜實蠅 (Bactrocera cucurbitae) 東方果實蠅 (B. dorsalis) 地中海果實蠅 (Ceratitis capitata) 等 (CACASA, 2014) 2013 年總共偵察到 9 種標的害蟲, 其中包括加勒比果實蠅 (Anastrepha suspensa, 1 次 ) 番石榴果實蠅 (B. correcta, 6 次 ) 東方果實蠅 (141 次 ) 桃果實蠅 (B. zonata, 13 次 ), 共啟動執行了 28 項定界計畫 (delimitation projects) 與 12 項撲滅計畫 州政府持續執行偵察計畫同時確保經費來源, 以保護美國的農業與環境, 這項計畫同時也協助第一線的檢疫工作, 提升其防堵外來有害生物的效率 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

91 澳洲澳洲為一島洲, 擁有阻隔害蟲入侵之優勢, 唯幅員廣大, 涵蓋熱帶至溫帶氣候, 有利害蟲立足 1995 年至 2003 年就有數百件有害生物入侵案, 其中超過 20 件嚴重威脅澳洲生態與農業生產, 均曾啟動國家級的撲滅計畫, 耗費超過 2 億澳幣, 有名的案例包括入侵昆士蘭省的木瓜果實蠅 (B. papayae) 和入侵紅火蟻 (Solenopsis invicta) (Pheloung, 2003) 澳洲具有完備且廣泛的國家果實蠅偵察調查計畫, 最主要者為澳洲檢疫及檢查局 (Australian Quarantine and Inspection Service, AQIS) 的 北澳檢疫策略 (Northern Australia Quarantine Strategy, NAQS) 計畫與昆士蘭省政府的 看守北方 (Northwatch) 計畫, 主要是針對國際口岸入侵的果實蠅種類 (Bactrocera spp.) 澳洲政府與五省政府總共支助懸掛超過 1600 個誘蟲器, 北澳由 NAQS 執行, 塔司馬尼亞與南澳省則由轄內港市及城鎮執行調查工作, 確認其非疫狀態 澳洲管理有害生物入侵的重要特色為調查行動從境外 (offshore) 開始, 藉與境外地區的合作偵察, 瞭解有害生物之入侵風險與威脅所在並減輕其威脅, 同時可以進一步規劃配套的境內偵察計畫 合作對象包括東南亞及太平洋地區國家 巴布亞新幾內亞 東帝汶等, 合作的內容為訓練植保人員 加強有害生物的採集與管理 利用網路平台 (PestNet) 進行資訊交流等, 以及早發現潛在的立即性威脅 中國近年為了促進農產外銷, 積極制定符合國際規範的法規, 同時執行防止外來害蟲入侵的相關計畫 以果實蠅為例, 中國國家質檢總局頒佈 檢疫性實蠅監測技術指南 (AQSIQ, 2009), 規範監測區域 監測時間 監測資材與使用方法 誘蟲器懸掛密度 檢查方法 標本鑑定與記錄 獨立捕獲事件定界調查方案等 由於中國大陸南北氣候差異大, 參照標的果實蠅的生物學及當地氣候條件訂出 : 日平均溫度超過 15 時, 需展開監測 ; 低於 10, 不需監測 ; 介於 10 與 15 間, 視情況開展監測 並且建議 34 個省直屬局之監測啟止時間, 例如 : 海南島全年 ; 廣東 福建等 4 月至 11 月 ; 廣西 四川 江蘇 山東等 4 月至 10 月 ; 天津 河南等 5 月至 9 月 ; 河北 吉林等 6 月至 9 月 ; 內蒙古 5 至 8 月 各類誘蟲器 ( 誘餌 ) 懸掛密度為史氏誘蟲器 ( 地中海果實蠅誘餌 甲基丁香油 克蠅 ) 3-12 個 /km 2, 麥氏誘蟲器 ( 蛋白質水解物 ) 5-12 個 /km 2 偵察作物 害蟲標的 以及偵察區域等則由各省視實際需要規劃執行 印度印度有 116 種外來種昆蟲, 近年入侵種的數量日漸增多, 其中包括一些熟知的害蟲如煙草粉蝨 Bemisia tabaci 吹綿介殼蟲 Icerya purchasi 非洲菊斑潛蠅 Liriomyza trifolii 螺旋粉蝨 Aleurodicus disperses 銀葉粉蝨 B. argentifolii 蘋果蠹蛾 Cydia pomonella 等 (Mandal, 2011) 為了防止重要的外來害蟲入侵, 印度政府在 2003 年頒佈一項新的植物檢疫法規以調整現行法令符合國際規範, 並成立貨品有害生物風險評估單位, 著手列出潛在具有重大威脅性的外來害蟲名單 外來害蟲的偵察工作由國家害蟲綜合管理計畫主導, 各省政府 非政府組織 研究單位 農民團體等均參與執行調查 印度也與聯合國糧農組織 (FAO) 及鄰國合作, 進行有害生物偵察 由於發現國內的果實蠅種類逐漸侵入新的地區, 因此在 2005 年推行國家綜合果實蠅調查計畫 臺灣重要檢疫害蟲偵察調查 89

92 (National Integrated Fruit Fly Surveillance Project; Anonymous, 2005), 該計畫也包括了外來入侵果實蠅的調查項目 這項調查在國際機場和港口 邊境檢查站 外交領事區 觀光區 都會市場區 空廚廢棄物放置點等 1000 個偵察點, 總共設置 2000 個地中海果實蠅誘餌與克蠅誘蟲器, 每週調查一次, 捕獲的果實蠅立即送印度園藝研究所 (Indian Institute of Horticultural Research, IIHR) 鑑定 如果發現外來的果實蠅, 隨即在發現點增設誘蟲器加強調查, 並嚴格檢查旅客的行李內是否攜有鮮果 根據本計畫之調查結果確立印度果實蠅的非疫狀態, 依據國際規範外銷鮮果至已開發國家, 促進印度水果產業的發展 德國以德國北部的下薩克森邦為例, 這個中歐最大的蘋果產區為了外銷蘋果到臺灣, 必須先確認該邦的地中海果實蠅非疫狀態 德國曾在 年於南德與法國交界的巴登沃坦堡邦以誘餌調查地中海果實蠅, 結果顯示在夏秋偶會捕獲地中海果實蠅, 但次年春季及初夏則未發現任何果實蠅, 因此主張地中海果實蠅可能隨被害果入侵, 但是無法在該地區存活 除此之外, 德國其他各邦並無針對此蟲的偵察行動, 顯示並無疫情發生 下薩克森邦的試驗人員每年都進行半年的果園有害生物調查, 過去 35 年來並未發現地中海果實蠅為害 年間該邦以地中海果實蠅誘餌及 Delta 誘蟲器於 11 處生產果園偵察該蟲, 偵察期間為 5 月至 11 月, 每週檢查一次, 並未捕獲果實蠅 加以北德的氣溫低於南德, 因此德國薩克森邦的蘋果產區被認定為地中海果實蠅非疫區 (C. C. Chen, unpublished report) 德方的偵察作為, 佐證其蘋果產區的地中海果實蠅非疫狀態, 使其蘋果可能在不久 的將來獲准開始輸臺 日本在 年間, 平均每年約有 4 種外來害蟲在日本立足, 其中 74% 為經濟害蟲 (Kiritani, 2001) 由於日本大量進口切花 植栽 及蔬菜, 因此入侵的害蟲多屬溫室發生的害蟲 國際旅客與攜帶的行李則為果實蠅重要的入侵途徑, 在一些入境口岸平均每天至少有一件行李中夾帶了果實蠅 日本管理外來害蟲入侵的模式為注意鄰國 ( 或貿易國 ) 的疫情並進行風險評估, 執行早期預警系統偵察新入侵害蟲, 同時提醒社會大眾留意入侵者以防堵外來害蟲 (Kiritani, 2001), 實務上對於局部分布的新入侵害蟲, 以撲滅為第一考量 另外, 立即啟動防止其擴散與降低衝擊的緊急措施, 也是絕對必要的 以日本琉球縣為例, 該縣在 1986 與 1993 年分別以甲基丁香油與釋放不孕性蟲撲滅東方果實蠅與瓜實蠅, 之後每年仍然懸掛甲基丁香油與克蠅誘蟲器偵察入侵的果實蠅, 偶而仍會捕獲此二種果實蠅 (M. Yamagishi, personal communication), 顯示果實蠅再度入侵的風險很高 因此, 偵察工作持續進行, 並且定期減量釋放不孕性瓜實蠅, 以維持琉球的非疫狀態 由以上實例顯示, 凡是 WTO 的會員國均積極制定符合國際規範的法令, 並且經常性的執行重要外來害蟲的偵察, 以早期發現其入侵並予撲滅或將 零發現 的調查結果做為非疫狀態的佐證資料, 促進農產品外銷 臺灣檢疫害蟲偵察調查體系之建置政府為了蒐集與確認我國法定檢疫害蟲的發生現況, 做為國際農產品貿易諮商談判的佐證資料, 同時針對大量進口蘋果 桃 李 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

93 梨等鮮果, 以及國人自行攜帶入境水果數量劇增所引發的害蟲入侵風險, 認為有必要長期偵察重要檢疫害蟲, 俾於其立足為害之前予以撲滅 乃於 1989 年 11 月由農委會補助農業試驗所執行 溫帶果樹新入侵害蟲調查 計畫, 開啟我國系統化的檢疫害蟲偵察調查工作 該計畫的偵察對象包括九種在國外嚴重為害溫帶果樹且已列為我國檢疫規定中之 檢疫害蟲 - 蘋果蠹蛾 Cydia pomonella 地中海果實蠅 C. capitata 昆士蘭果實蠅 B. tryoni 南美果實蠅 A. fraterculus 西印度果實蠅 A. oblique 墨西哥果實蠅 A. ludens 蘋果果實蠅 R. pomonella 李象鼻蟲 Conotrachelus nenuphar 桃枒蛾 Anarsia lineatella 第一年的重要工作項目與內容包括 :(1) 選定及採購國外監測或防治上述標的害蟲所普遍使用的誘餌和誘蟲器,(2) 利用國內現有材料設計及組裝燈光誘集裝置,(3) 規劃偵察地點並設置偵察資材,(4) 定期執行田間調查與更新偵察資材,(5) 檢視捕獲的害蟲並保存部分田間調查後攜回的資材,(6) 記錄調查結果,(7) 開始向國外專家索取相關檢疫害蟲標本以供比對可疑的樣本 初步於臺中縣東勢 梨山 武陵農場及苗栗縣卓蘭各設置 3 個偵察點, 偵察點間隔 500 m, 四個地點總共設置 12 個偵察點 ; 各點均位於私人果園內, 以確保偵察資材的安全 每個偵察點懸掛蘋果蠹蛾誘蟲器 ( 翼型誘蟲器內置性費洛蒙誘餌, 購自美國 Zoecon 公司 ) 果實蠅誘蟲器 ( 中興式誘殺器內置 Trimedlure 甲基丁香油 克蠅) 誘蟲燈 ( 黑光燈 + 毒劑 ) 誘集李象鼻蟲與桃枒蛾, 每 10 天調查一次 執行過程中詳細評估偵察資材 偵察方法 偵察點配置 偵察路線與人力等項目, 做為提升偵察效率與未來擴大偵察規模的參考 翌年 (1990 年 ) 主管輸入商品檢驗及檢 疫的經濟部商品檢驗局 ( 臺中分局 ) 曾義雄先生加入 主要果樹新入侵害蟲調查 偵察計畫, 依照前一年的偵察規劃與執行方式, 將偵察地區由溫帶果樹栽培區擴及臺灣各主要水果產地 機場 港口及市郊地 偵察點增為 64 點, 偵察標的增加香蕉果實蠅 B. musae 與番茄果實蠅 R. lycopersella 二種, 成為 11 種 果實蠅之誘集, 增加麥氏誘蟲器盛裝果汁 ( 蘋果 柑桔 鳳梨或紅糖發酵液加上防腐劑與農藥 ) 調查工作改為每二週調查一次, 少部分山區偵察點每 4-6 週調查一次 我國第一個系統性的檢疫偵察網於焉成形, 奠定此後持續性的檢疫害蟲偵察基礎 年的調查並未發現蘋果蠹蛾與地中海果實蠅等重要果樹檢疫害蟲, 期間除了偵察標的檢疫害蟲外, 亦積極調查臺灣本地的果實蠅種類, 同時對國內重要果樹之害蟲相進行系統性的清查 調查期間曾在高雄機場以甲基丁香油捕獲 5 隻雄性 B. pedestris, 疑似入侵害蟲 (Chen and Tseng, 1993) 此種果實蠅發生在東南亞地區, 如錫蘭 印尼 馬來西亞 菲律賓, 為害芒果 番石榴 柑桔 楊桃 番茄等, 顯示臺灣確實曝露在外來果實蠅侵入之風險中 計畫執行期間並自美國 南非 匈牙利等取得六十餘種果實蠅標本, 以供比對調查所得的果實蠅 偵察點除了設在一般平地果園與機場港口外, 亦深入北橫公路 中橫公路 南橫公路 南迴公路等沿線山區果園與觀光景點, 偵察點數至 1993 年已達 108 點 調查資料總共發表三篇臺灣果實蠅的分類報告 (Tseng et al., 1992a, b, c), 對於入侵果實蠅的鑑定與檢疫果實蠅非疫狀態的確認助益極大 當時我國參加關稅及貿易總協定 (GATT) 迫在眉睫, 為了因應貿易自由化所帶來的檢疫害蟲入侵風險, 善用 GATT 第二十條第二項 遂行維護人類 動物或植物生命或健康所必要之檢疫相關措施, 臺灣重要檢疫害蟲偵察調查 91

94 以及技術性貿易障礙協定 (ATBT) 第二條第六項之逃避條款, 必須迅速強化檢疫害蟲偵察網, 乃於 1993 年邀請臺灣大學加入協助執行調查計畫, 擴大團隊陣容 1994 年配合政策需求, 偵察對象增加番石榴果實蠅 甜瓜實蠅 (Dacus ciliatus) 桃果實蠅, 刪除番茄果實蠅, 總共成為 13 種 由於燈光誘集到的昆蟲種類很多, 處理與鑑定過程耗時且困難, 因此偵察李象鼻蟲改以打落法與目視被害狀為之, 桃枒蛾則採用性費洛蒙誘餌 偵察點除了原來的 108 點外, 增加走私嚴重地區 ( 新竹南寮, 桃園大園 觀音 竹圍, 苗栗後龍 竹南 ) 海邊 18 點, 熱帶與溫帶水果種植區 ( 桃園東眼山, 新竹尖石 觀霧, 花蓮天祥 大禹嶺, 臺南關仔嶺, 嘉義大埔 大同農場 ) 30 點, 以及其他山區 ( 北橫明池 桃園復興 新竹五指山 苗栗馬拉邦山, 臺中大坑 南投信義 南橫天池 關山, 嘉義梅山 瑞里 奮起湖大凍山, 臺東知本 ) 22 點, 總共 178 點 各偵察點每 2-4 週調查一次, 偵察結果並未發現 13 種標的檢疫害蟲 ; 寡毛實蠅屬 (Bactrocera) 之種類除已發表之 35 種 (Tseng et al., 1992c) 外, 並未有新的發現 1998 年防檢局成立後接手主管檢疫害蟲偵察計畫, 計畫更名為 重要檢防疫害蟲之偵測與調查, 偵察工作仍依原來的工作項目與調查時間持續進行 該計畫開始使用農試所技轉的改良型麥氏誘蟲器, 搭配甲基丁香油 克蠅及蛋白質水解物用於檢疫果實蠅的偵察 本年度計畫結束後, 商檢局曾義雄先生不再參與本計畫 曾先生為果實蠅分類專家, 熟稔商品檢疫工作, 對於本計畫的偵察調查 果實蠅分類與檢疫果實蠅風險分析等相關工作貢獻厥偉 1999 年本計畫擴大邀請桃園區農業改良場 臺東區農業改良場 金門縣動植物防疫所 連江縣農業改良場 高雄區農業改良場澎 湖分場 農試所嘉義分所 農試所鳳山熱帶園藝分所加入團隊, 使得偵察範圍涵蓋臺 澎 金 馬地區 納入外島地區的檢疫害蟲偵察, 可以降低中國大陸發生的害蟲經由外島侵入臺灣的風險, 偵察點數增為 191 點 本年度開始使用國產的黃色黏板加繫碳酸銨偵察果實蠅, 其餘蘋果蠹蛾與桃枒蛾性費洛蒙誘餌 地中海果實蠅誘餌 以及搭配使用的翼型誘蟲器仍購自美國 2002 年我國正式加入世界貿易組織 (WTO), 為了強化檢疫害蟲偵察工作, 執行單位進一步增加為 17 個, 整個偵察團隊包含臺灣大學 嘉義大學 屏東科技大學 宜蘭技術學院 花蓮師範學院 臺東師範學院 農業試驗所 澎湖縣農漁局 金門縣動植物防疫所 連江縣農業改良場 以及桃園 苗栗 臺中 臺南 高雄 花蓮 臺東區農業改良場, 偵察點數增為 552 點 偵察對象增加柑桔大實蠅 B. minax 楊桃果實蠅 B. carambolae 木瓜果實蠅 B. papayae 菲律賓果實蠅 B. philippinensis 印度果實蠅 B. caryeae 斯里蘭卡果實蠅 B. kandiensis 梨果實蠅 B. pyrifoliae 黑果實蠅 A. serpentina, 刪除香蕉果實蠅, 總共成為 20 種 2003 年執行單位續增防檢局基隆 新竹 臺中 高雄分局專注機場與港口地區, 以及臺灣香蕉研究所與桃園 新竹 苗栗 臺中 南投 臺東縣政府 至此, 我國檢疫害蟲偵察網佈建更為完整, 執行單位共 25 個, 負責調查人員近百名, 偵察點達 1011 點 除了縣市政府單位負責的偵察點懸掛蘋果蠹蛾與地中海果實蠅二種誘餌外, 其餘各點再加掛桃枒蛾誘餌 甲基丁香油 克蠅誘餌以及黃色黏板, 共 6 種誘蟲資材, 每二週調查一次 所有的偵察點均完成 GPS 定位, 以便結合地理資訊系統與作物疫情等相關資訊進行整合, 發揮預警功能與啟動撲滅行動 為了提高外來害蟲的偵察效率與團隊合 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

95 表一 2015 年偵察調查之重要檢害蟲種類 Table 1. The target quarantine insect pest species for the detection survey in 2015 Serial no Chinese common name 南美果實蠅 墨西哥果實蠅 西印度果實蠅 黑果實蠅 楊桃果實蠅 印度果實蠅 番石榴果實蠅 斯里蘭卡果實蠅 柑桔大實蠅 木瓜果實蠅 菲律賓果實蠅 梨果實蠅 昆士蘭果實蠅 桃果實蠅 地中海果實蠅 甜瓜實蠅 蘋果果實蠅 蘋果蠹蛾 桃蛀果蛾 Scientific name Anastrepha fraterculus (Wiedemann) Anastrepha ludens (Loew) Anastrepha obliqua Macquart Anastrepha serpentina Wiedemann Bactrocera carambolae Drew & Hancock Bactrocera caryeae (Kapoor) Bactrocera correcta (Bezzi) Bactrocera kandiensis Drew & Hancock Bactrocera minax (Enderlein) Bactrocera papayae Drew & Hancock Bactrocera philippinensis Drew & Hancock Bactrocera pyrifoliae Drew & Hancock Bactrocera tryoni (Froggatt) Bactrocera zonata (Saunders) Ceratitits capitata (Wiedemann) Dacus ciliatus Loew Rhagoletis pomonella (Walsh) Cydia pomonella L. Carposina sasakii Matsumura 作 於 2003 年出版 檢疫害蟲偵測調查標準 為果實蠅科害蟲 作業手冊 (Chen et al., 2003) 供所有執行 2014) 在歐洲暨地中海地區植物保護組織 人員參考 並於 2007 年修訂二版 (Chen et al., (EPPO) 所列舉的檢疫害蟲中有 16%為果實 2007) 為了有效運用偵察人力與資材 停止 蠅科害蟲 (EPPO, 2014) 歐洲地區所列的檢 桃枒蛾和李象鼻蟲的偵察 另外為了因應日韓 疫 害 蟲 中 也 有 33% 屬 於 果 實 蠅 科 (CABI/ 進口溫帶鮮果的風險 於 2008 年在 100 處偵 EPPO, 1997) 顯見其在檢疫上的重要性 全 察點增掛桃蛀果蛾 Carposina sasakii 誘餌 世界已知有超過 500 屬 4,000 種的果實蠅 除 並出版 桃蛀果蛾偵察調查標準作業手冊 了極地之外 廣泛分布於各地 果實蠅幼蟲能 (Chen et al., 2010) 此後至今 (2015 年) 26 危害植物的莖 葉 花 果實及種子 以危害 年間 執行單位未再增減 執行人員略有變 果實所造成的經濟損失最大 其中較具經濟重 動 偵察點數則因經費刪減 從 2009 年的 1015 要 性 的 果 實 蠅 分 別 屬 於 Anastrepha 點大幅降為 656 點並維持至今沒有太大的變 Bactrocera Ceratitis Dacus 及 Rhagoletis 動 (2015 年為 620 點) 五個屬 雌蟲以發達的產卵管將卵產於果實 ( 表 一 ) (Anonymous, 內 孵化的幼蟲蛀食果肉使果實潰爛或落果 檢疫果實蠅及其重要性 常造成重大的危害 果實內的卵或幼蟲能隨寄 主鮮果的進出口而散布到各地 由於成蟲飛行 臺灣的 36 種法定檢疫害蟲中有高達 17 種 力強 一旦在新地區立足便會迅速擴散 短期 臺灣重要檢疫害蟲偵察調查 93

96 表二 歷年來參與偵察網之單位與偵察點數量 Table 2. Number of institutions and survey sites involved in the detection survey network from the program established till the present Year No. of institutions involved No. of survey sites Year No. of institutions involved No. of survey sites 間內即可成為新的重要害蟲 所以各國均將果 誘引劑 翼型誘蟲器內置蘋果蠹蛾性費洛蒙誘 實蠅列為重要的檢防疫害蟲 嚴加管制以遏止 餌 麥氏誘蟲器分別內置甲基丁香油誘殺板和 其入侵 防止作物受到威脅 在臺灣地區單就 克蠅誘殺板 以及黃色黏板加繫內裝碳酸銨的 本地的東方果實蠅和瓜實蠅 每年造成瓜果的 指形瓶等五種誘引資材 部分偵察點加掛翼型 損害 估計高達數十億元 此外 疫區的鮮果 誘蟲器內置桃蛀果蛾性費洛蒙誘餌 每二週調 常無法外銷或需經過檢疫處理 處理後的鮮果 查標的檢疫害蟲 (如表一) 一次 執行流程如 品質降低 陳售期短 常失去市場競爭力 因 下 此 各國無不極力防堵外來果實蠅入侵 避免 淪為疫區而形成農產品外銷的障礙 一 大學院校 試驗改良場所 離島地區執行 單位 檢疫害蟲偵察工作項目及實施方法 (一) 田間調查 1. 疫情調察員於各偵察點檢查上述五 (或六) 為了及早發現入侵的檢疫害蟲 依據防檢 種誘蟲器內是否捕獲標的檢疫害蟲 並收回 局編印的 檢疫害蟲偵察標準作業手冊 (修訂 捕獲的果實蠅及黃色黏板 同時依標準偵察 二版) 與 桃蛀果蛾偵察調查標準作業手冊 作業手冊更新誘引資材 於臺灣全島及金門 馬祖 澎湖離島地區之重 2. 麥氏誘蟲器所採到的蟲體寄至臺灣大學昆 要港站 主要農作物產區 果菜市場及觀光景 蟲學系 黃色黏板連同蟲體 寄至農業試驗 點等地 設置偵察點並完成各點 GPS 定位 所應用動物組進行複檢 傑克森 翼型誘蟲 歷年設置的偵察點數如表二 目前 (2015 年) 器的蟲體由各負責單位自行檢查 負責執行調查的單位與點數詳如表三 每一偵 3. 寄送麥氏誘蟲器捕獲之蟲體前先行初步檢 察點懸掛傑克森誘蟲器內置地中海果實蠅性 視 若發現可疑者需另外裝存 再一併寄 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

97 表三 2015 年參與偵察調查之單位及負責之偵察點數 Table 3. Institutions involved in the detection survey and number of survey sites each institution being responsible for in 2015 Serial no. Institution No. of survey sites 1 1 Bureau of Animal and Plant Health Inspection and Quarantine - 23 (11) Keelung Branch, Hsinchu Branch, Taichung Branch, Kaohsiung Branch 2 Department of Entomology, National Taiwan University 2 50 (7) 3 National Chiayi University 30 (7) 4 National Pingtung University of Science and Technology 40 (7) 5 National Ilan University 30 (7) 6 National Dong Hwa University 30 (7) 7 I-Shou University 30 (7) 8 Taiwan Agricultural Research Institute 3 36 (19) 9 Taoyuan District Agricultural Research and Extension Station 20 (7) 10 Miaoli District Agricultural Research and Extension Station 10 (7) 11 Taichung District Agricultural Research and Extension Station 14 (7) 12 Tainan District Agricultural Research and Extension Station Kaohsiung District Agricultural Research and Extension Station Hualien District Agricultural Research and Extension Station Taitung District Agricultural Research and Extension Station Taiwan Banana Research Institute 40 (7) 17 Taoyuan City Government Hsinchu County Government Miaoli County Government Taichung City Government Nantou County Government Taitung County Government Penghu County Government Bureau of Animal and Plant Health Inspection, Kinmen County Lienchiang County Government 18 Total 620 (100) 1 Number in the parentheses indicates number of survey sites for the peach fruit moth Carposina sasakii. 2 Also responsible for fruit fly identification and specimens preservation. 3 Also responsible for verification of the fruit flies trapped by the yellow sticky trap and distribution of the survey materials. 送, 黃色黏板上的樣本則直接以麥克筆標記, 並註明調查時間 偵察點編號 調查者 4. 每次調查後, 由各負責單位於防檢局 植物疫情管理資訊網 填報調查結果 ( 二 ) 標本處理 登錄 建檔 1. 收到調查樣本後先做登錄給予流水號 2. 將無問題的蟲體放入烘箱烘乾 3. 可疑種類先行鑑定後記錄鑑定結果並烘乾 4. 將烘乾的蟲體在解剖顯微鏡下做進一步檢查 5. 將處理完的樣本編號後放入保存盒中, 再置於昆蟲標本櫃存放在臺大昆蟲系 6. 黃色黏板上的蟲體直接與黏板存放在農試所應用動物組, 由於受限於保存環境之條件 臺灣重要檢疫害蟲偵察調查 95

98 表四 各偵察點改良型麥氏誘蟲器與黃色黏板較常捕獲之果實蠅種類 Table 4. Fruit fly species commonly trapped with the McPhail trap and the yellow sticky trap at the survey sites Chinese common name 東方果實蠅 瓜實蠅 南瓜寡毛實蠅 巨斑寡毛實蠅 臺灣長角實蠅 六條尖帶實蠅 腹帶實蠅 長鞘寬頭實蠅 黃斑尖角實蠅 普西黑翅實蠅 黑楯板寡毛實蠅 Scientific name Bactrocera (Bactrocera) dorsalis (Hendel, 1912) Bactrocera (Zeugodacus) cucurbitae (Coquillett, 1899) Bactrocera (Zeugodacus) tau (Walker, 1849) Bactrocera (Zeugodacus) synnephes (Hendel, 1913) Dacus formosanus Tseng and Chu, 1983 Acrotaeniostola sexvittata Hendel, 1915 Gastrozona fasciventris (Macquart, 1843) Dioyna sororcula (Wiedemann, 1830) Acroceratitis lumose Hendel, 1913 Ptilona persimilis Hendel, 1915 Bactrocera scutellata (Hendel, 1912) 與空間 調查樣品只保存三年做為憑證 1. 調查期間並未發現 19 種標的檢疫害蟲入 侵 確定臺 澎 金 馬地區為非疫區 二 桃園市 新竹縣 苗栗縣 臺中市 南投 2. 完成建構完整有系統的檢疫害蟲偵察網 持 縣及臺東縣政府 續發揮外來害蟲入侵的預警功能與提供撲 各縣市政府協調相關農會及產銷班之熱 滅行動之依據 心農友 於轄區重要水果產地設置 50 個以上 3. 長期的偵察結果確立我國非疫狀態 同時提 的偵察點 每一偵察點懸掛傑克森誘蟲器內置 供農產品進出口風險評估及貿易諮商談判 地中海果實蠅性誘引劑及翼型誘蟲器內置蘋 之佐證資料 訂定進口鮮果檢疫條件 保護 果蠹蛾性費洛蒙誘餌進行偵察 農友每二週檢 我農業生產環境 強化農產品競爭力 促進 查誘蟲器一次 調查是否捕獲地中海果實蠅和 農產外銷 蘋果蠹蛾 並將調查結果電話通報縣市政府防 4. 先進國家均已建立相關之外來害蟲偵察系 疫人員 並由主辦人員於 植物疫情管理資訊 統 我國為世界貿易組織 (WTO) 之成員 網 填報建檔 檢查時若發現可疑蟲體則立即 擁有完善的檢防疫體系 展示我們努力維護 電話通報 並將標本限時郵寄到臺灣大學或農 檢疫害蟲非疫區的決心 有助於提升我國的 業試驗所鑑定確認 國際地位 5. 一旦發現外來害蟲 可以提供分析入侵途徑 偵察成果與效益 的資料 進行溯源與管理 降低後續的檢疫 風險 我國的檢疫害蟲偵察調查從 1989 年開始 6. 引進及改良偵察資材如麥氏誘蟲器 翼形誘 至今 2015 年已 26 年 偵察區域由臺灣本島擴 蟲器 傑克森誘蟲器等 並輔導國內廠商生 展至金門 馬祖和澎湖 偵察點由最初的 12 產 大幅節省偵察成本 點最高增至 1022 點 目前為 620 點 歷年的 執行成果彙整如下 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會 7. 有助本地果實蠅之蟲相調查 (表四) 增強 辨識比對檢疫果實蠅的能力 提升偵察效

99 率 8. 參與人員於訓練與執行過程中, 可以體認檢疫害蟲偵察之重要性並獲得相關知識與技能 未來的展望關口檢疫是防止外來害蟲入侵, 保護本國農業生產與環境最重要的第一道防線 然而, 證諸以往各國的經驗, 即使是先進國家亦頻傳外來害蟲入侵的案例, 臺灣則幾乎每年都有新的害蟲出現, 顯示我們正曝露在高度的外來害蟲入侵風險中, 因此田間的偵察工作益顯重要, 可以填補檢疫的缺口, 成為第二道防線, 實有必要繼續維持 有害生物非疫區可以視為農業的一項無形資產, 一旦失去很難再回復 政府重視檢疫害蟲的偵察, 在人力與經費方面持續投入, 使我們農業生產環境獲得多一層保障, 產業界與農民如能配合參與並共同加以維護, 更能發揮嚴密的防堵效用 外來害蟲的偵察是一項連續性的工作, 主政單位宜編列公務預算穩定支應所需的經費, 避免造成空窗期, 影響偵察效率 如確有經費上的困難, 應以風險為考量, 依風險評估之結果保持計畫的彈性, 增減偵察標的害蟲種類或偵察點, 但應維持起碼的偵察點數, 持續執行不要中斷, 以保持害蟲發生記錄的完整性 檢疫害蟲為高威脅性的害蟲, 一旦發生常迅速蔓延, 因此設置少量偵察點但長期記錄, 比短期內在局部地區設置多量偵察資材, 更能反應非疫狀態的維持 檢疫與防疫單位需密切合作, 隨時掌握臺灣進口農產品的情形和輸出國的疫情, 評估最可能入侵的地點和立足區域, 適當調整偵察計畫, 進行重點偵察以為因應 害蟲鑑定需要專業的昆蟲分類人員, 因此本國人才的培養以及與國外相關機構或專家 建立良好的合作關係殊為重要 針對標的害蟲, 應隨時留意國際上廣為各國採用之新開發的偵察資材, 以提高偵察效率與公信力 偵察計畫參與的人數眾多, 疫情調查員也會更動, 定期舉辦講習會, 可以加強參與人員的執行能力 總之, 目前雖然我們的檢疫害蟲偵察網已具規模, 也獲得國際間的肯定, 但是一個害蟲偵察網的功能和效率會受到時空環境的變化而改變 面對日益增加的害蟲入侵風險, 惟有隨時保持警覺, 持續提升偵察效率, 同等重視每一個偵察點, 並謹慎進行每一次的調查, 才能發揮偵察網的最大預警功能 誌謝 26 年來參與過 重要檢防疫害蟲之偵測與調查 計畫的工作伙伴, 有人從約雇助理變成大學教授, 有人高就, 有人轉行 有人退休, 有人仍堅守崗位, 有人則剛接手, 看似做些單調無趣的工作, 確是臺灣農園的守護者 謹以此文感謝所有工作伙伴的辛勞 堅持與奉獻 引用文獻 Anonymous National Integrated Fruit Fly Surveillance Project. Department of Agriculture & Cooperation, Ministry of Agriculture, Government of India. Available from 20fly%20Surveillance%20Programme. doc Anonymous Quarantine Requirements for the Importation of Plants or Plant Products into the Republic of China. 臺灣重要檢疫害蟲偵察調查 97

100 Bureau of Animal and Plant Health Inspection and Quarantine, Council of Agriculture, Executive Yuan, Taiwan. 98 pp. AQSIQ of the PRC Technical Guidelines for Detection of Fruit Flies of Concern. General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People s Republic of China. (in Chinese) CABI/EPPO Quarantine Pests for Europe. 2 nd edition. CAB International, Wallingford pp. CACASA California Exotic Pest Detection Program. Available from 014/03/Pest-Detection-Fact-Sheet pdf Chen CC, Dong YJ, Yen SH, Wu WJ Guideline Series 13- Surveillance of Carposina sasakii Matsumura. Published by Bureau of Animal and Plant Health Inspection and Quarantine, Council of Agriculture, Executive Yuan; Taiwan Agricultural Research Institute, COA, Executive Yuan; Department of Entomology, National Taiwan University; Department of Biological Sciences, National Sun Yat-sen University. 31 pp. (in Chinese) Chen CC, Tseng YH Monitoring and survey for insects with potential to invade Taiwan. Proceedings of Symposium on Plant Quarantine in Asia and the Pacific; 1992 Mar 17-26; Taipei, Republic of China. Asian Productivity Organization, Tokyo, Japan. pp Chen CC, Wu WJ, Shiao SF, Dong YJ Guideline for Detection Survey of Plant Quarantine Pests. Published by Bureau of Animal and Plant Health Inspection and Quarantine, Council of Agriculture, Executive Yuan; Taiwan Agricultural Research Institute, COA, Executive Yuan; and Department of Entomology, National Taiwan University. 61 pp. (in Chinese) Chen CC, Wu WJ, Shiao SF, Dong YJ Guideline Series 1- Detection Survey of Plant Quarantine Pests (2 nd Edition). Published by Bureau of Animal and Plant Health Inspection and Quarantine, Council of Agriculture, Executive Yuan; Taiwan Agricultural Research Institute, COA, Executive Yuan; and Department of Entomology, National Taiwan University. 71 pp. (in Chinese) EPPO EPPO A1 List of Pests Recommended for Regulation as Quarantine Pests. European and Mediterranean Plant Protection Organization. Kiritani K Invasive insect pests and plant quarantine in Japan. Available from library/ /eb498.pdf Liu PC, Fang HH, Chang LH Special Publication of Cultivation and Management of New Fruit Crops. Taiwan Agricultural Research Institute, 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

101 Council of Agriculture, Executive Yuan. 144 pp. (in Chinese) Mandal FB The management of alien species in India. Int J Biodivers Conserv 39: Pheloung P Contingency planning for plant pest incursions in Australia. Proceedings of the Workshop on Identification of Risks and Management of Invasive Alien Species Using the IPPC Framework; 2003 Sept 22-26; Braunschweig, Germany. Secretaria of the International Plant Protection Convention. pp Tseng YH, Chu YI, Chen, CC. 1992a. A new genus Cervarita of fruit flies from Taiwan (Diptera: Tephritidae: Trypetinae). Chinese J Entomol 12: Tseng YH, Chu YI, Chen, CC. 1992b. A new genus Neomyolija of fruit fly from Taiwan. Plant Prot Bull 34: Tseng YH, Chen CC, Chu YI. 1992c. The fruit flies, genus Dacus Fabricius (Diptera: Tephritidae) of Taiwan. J Taiwan Mus 45: USDA-APHIS Cooperative Agricultural Pest Survey (CAPS) 2011 National Survey Guidelines. Available from aphis/ourfocus/planthealth White IM, Elson-Harris MM Fruit Flies of Economic Significance: Their Identification and Bionomics. C.A.B. International, Wallingford. 601 pp. 臺灣重要檢疫害蟲偵察調查 99

102 Detection Survey of the Important Quarantine Insect Pests in Taiwan Chien-Chung Chen 1*, Shiuh-Feng Shiao 2, Hsien-Tzung Shih 1, and Wen-Jer Wu Applied Zoology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Wufeng Dist., Taichung 413, Taiwan Department of Entomology, National Taiwan University, Taipei 106, Taiwan ABSTRACT With increasing international agricultural trade and tourism, it accompanies increased risks of introduction of exotic pests. A detection survey network of the exotic quarantine insect pests has therefore been built in Taiwan since 1989 to protect our agricultural production environments. This network consists of universities, research institutions, and local governments, and survey areas cover the whole Taiwan island as well as the islands of Kinmen, Matsu, and Penghu. It would detect the new invasive quarantine insect pests at the early stage, so that eradication programs can be applied before the pest has become established. This network executed so far has been 26 years, and the 19 target quarantine pests were never found. With this comprehensive survey system and determination of our pest-free status, it enhanced the Taiwanese international prestige, and facilitated the exports of our fresh fruits. The survey results have also provided important bases and evidences for international trade negotiations and the relative plant pest risk assessments. This report describes the establishment and progress of this quarantine pests detection system. Key words: quarantine insect pests, detection survey, Taiwan 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會 * Corresponding [email protected]

103 研究報告 2015 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會 P Symposium on Trans-Century Plant Protection and Quarantine Technologies P 有害生物資料庫介紹 蕭旭峰* 國立臺灣大學昆蟲學系 106 臺北市羅斯福路四段 1 號 摘 要 在行政院農業委員會動植物防疫檢疫局的計畫支持下 臺灣已著手發展具有自己 特色之有害生物資料庫 近年來已整合病 蟲 草害等各類專家逐步建置資料內容 並在後端管理及前端使用上發展合用之系統架構 並根據資料特色及使用需求開發各 種不同功能之搜尋工具 本文主要討論臺灣農作物有害生物暨天敵資料庫查詢系統之 發展現況 簡介系統建置過程之困難及解決方案 在資料類別上 介紹從分類 作物 類別 病蟲草害 地理分布到文獻資料等之建置要點 並在跨資料類別間之轉換及關 聯上提出解決看法 除此之外 也針對前台使用者導向所規劃之檢索平台及後台資料 提供者之管理介面提出因應及改善之道 文中並介紹有害生物資料庫之近代相關應 用 發展趨勢及未來將面臨之問題 如可攜式應用 線上學習 網路介接服務等 並 對後設資料標準化及分散式公眾網域發展方向等提出建議 關鍵詞 農業害蟲 天敵 資料庫 查詢系統 臺灣 前 言 相當完整的國內作物有害生物及天敵資料 (Shih et al., 2006; Wu and Shih, 2006; 為了設立專門收集本國及全球檢防疫資 Shih et al., 2009) 訊資料庫 作為作物安全及農業貿易政策擬定 目前全球植物有害生物資料庫 以 CABI 之重要參考情報 本計畫於 2003 年在吳文哲 Plant protection compendium 最先進且完 教授的主持下結合臺大 中興 成大 農藥所 整 其功能已擴展至線上鑑定系統等多元服 農試所等學者專家組成的團隊 開始我國有害 務 是一商業運轉的作物有害生物資料庫 至 生物資料庫建置計畫 (Shih et al., 2009) 本 於許多國家級研究機構所建置的綜合或專門 計畫自 2003 年開始執行至今 已建立一完整 類群的植物有害生物資料庫 則完整度及使用 的系統及資料庫架構 並於各資料庫內 輸入 方便性 均有不同的情況 例如美國農部所屬 *論文聯繫人 Corresponding [email protected] 有害生物資料庫介紹 101

104 農業研究院之真菌資料庫 ( gov/fungaldatabases/index.cfm), 是一個國際知名的開放性資料庫, 提供一般使用者進入查詢全球真菌生物的相關資訊, 其基礎資料庫有真菌分類 地理分布 寄主範圍等, 尤其分類資料庫最為完整, 由於有非常優秀的真菌學者專責維護, 其分類權威性全球知名 ; 紐西蘭生物安全局的資料庫 ( nz/biosecurity-animal-welfare/pests-diseas es/ppin): 僅提供限定的使用者進入, 為一管制資料庫, 須申請並經審核通過成為會員方能進入使用 ; 澳洲植物健康管理局的有害生物資料庫 ( com.au/index.cfm), 也僅提供限定的使用者使用, 並不提供一般人進入 上述紐西蘭及澳洲的有害生物資料庫, 除提供資料搜尋外, 均與該國相關博物館或生物蒐藏機構合作, 整合成為一個綜合性兼具診斷鑑定與資訊提供的系統 材料與方法資料庫的建置與規劃工作, 約可概分為資料蒐集 功能設計及系統架構三個步驟, 以下僅以此三個步驟, 簡介本資料庫的建置過程與方法 一 資料蒐集 : 本資料庫的資料蒐集方向, 以農作物為主軸 地區為輔軸, 然後再訂出各年度資料收集的目標及範圍 從 2003 年至今可概分為三個時期, 第一期從 年以蒐集國內所有重要農作物有害生物為範圍 ; 第二期為 年, 加入雜草 天敵資料及開始規劃並準備以東南亞地區及熱帶作物之有害生物為蒐集目標 ; 目前為第三期 年, 擴大為以全球亞熱帶及熱帶作物之有害生物為範圍 2010 年完成的作物種類有芒果 荔枝 香蕉 蓮霧 木瓜等 5 種熱帶果樹,2011 年則為蘭科 柑橘屬 紅龍果 龍眼 葡萄 椰子等 6 種經濟作物,2012 年為柿 文心蘭 洋桔梗 小麥及香菇之相關資料,2013 年針對主要出口亞熱帶作物及花卉糧食作物等 二 功能設計 : 建置資料庫的系統分析首先要定義主要使用者, 然後以此為主軸, 依序決定資料庫的功能, 基礎與功能資料庫的種類及內容, 然後訂定各資料庫間的關聯 ( 一 ) 資料庫的主要使用者 : 有害生物資料庫計畫執行初期, 主要使用者為防檢局, 後陸續加入我國植物保護學界的學者專家, 最後再加入農民及一般民眾 以防檢局 學者專家為主要使用者時期的資料庫功能, 主要為提供國內各類作物的有害生物清單 正確的學名資訊 相關參考文獻 國內危害及分佈情形等, 但其中國內危害分佈的相關資料, 蒐集相對困難, 較難有效呈現 加入農民類別使用者後, 資料的呈現複雜度增加, 必須加上大量實用性高的田間應用資訊, 目前以超連結方式, 提供國內相關網站之資訊 ( 二 ) 資料庫主要功能 : 資料庫的主要使用者決定後, 即可依據各使用者的需求, 逐步規劃資料的主要功能, 同時資料庫的特色 呈現方式及展示畫面, 也同時顯現 本資料庫的功能從一開始就是以彙整有害生物各面向資料為主, 其中最重要的面向有 1. 生物性資料 ;2. 危害作物種類 ;3. 地理分布 ;4. 文獻資料 呈現的方式則以單筆資料表及使用者搜尋後的各種列表為主, 如作物有害生物清單 其他次要功能有 1. 有害生物名錄, 目前以臺灣植物病害名彙最為完整 ;2. 新 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

105 發生有害生物, 蒐集最近發生的有害生物種類及其防治資訊 ;3. 有害生物管理資訊, 專門放置應用性資料, 提供農民及一般民眾病蟲害防治方面的訊息 ( 三 ) 建立基礎及功能資料庫 : 從資料庫的主要功能, 即可歸納所需之基礎的類別, 例如, 生物性資料中須要先有分類資料庫, 以便唯一識別各種生物, 然後是建立有害生物的生物資料庫, 儲存該生物的各類生物特性資訊, 上述各類的資料, 都是從各類科學文獻擷取, 所以當然就要建立文獻基礎資料庫, 最後建立各類基礎資料之工作流程, 包含收集 審查 校對 建置及維護機制等流程 這類資料庫有分類資料庫 有害生物資料庫 文獻資料庫 圖片庫 作物生物資料庫及國家基礎資料庫等 何謂功能資料庫, 是用來歸類 定義 連結基礎資料庫, 提供程式設計師呈現基礎資料庫各種不同面向的需求, 例如, 植物類別資料庫儲存作物應用面向的類別架構, 具有作物應用歸類的功能, 當使用者想要搜尋蔬菜類的作物時, 就必須先從作物類別資料庫中找出蔬菜類的特定編碼, 再以此編碼從分類基礎資料庫中找出符合蔬菜類別的植物種類 這類的資料檔案通常很小, 但卻是資料庫系統能具有多樣面貌呈現的重要功臣 在本資料庫中有有害生物類別資料庫 作物類別資料庫 雜草類別資料庫 地理分布資料庫等 ( 四 ) 關聯性 : 關聯性資料庫最強大的功能就是能連結各個分離的單一資料庫, 從而達到簡易管理維護及提供現實世界所需的各種複雜關聯性資訊 有害生物資料庫的主要關連, 就是從上述第二點之主要功能的四大面向所引導, 連結各種基礎及功能性資料庫, 提供使用者的各種需求 三 系統架構 : 本資料庫之系統架構分為前台網頁使用架構 ( 圖一 ) 及後台管理架構 ( 圖二 ), 其細部的各個系統, 則逐年有改善修訂, 分別說明如下 : ( 一 ) 前台架構 : 前台為資料展示用網頁的功能區, 為使用者操作的區域, 修改的範圍及次數較頻繁 ( 二 ) 後台架構 : 後台為資料管理維護功能區, 為資料管理者 輸入者 提供者所使用之資料輸入維護區域 計畫初始時, 本區域為資料管理者及全國各地專家學者所共用的區域, 因此, 也建立後台使用者之密碼管理功能, 將來將擴大為前台及後台 2 種使用者帳號管理的區域 ; 同時, 也設計一網路上共供用的資料儲存區, 供有權限的使用者可遠端存取 結果與討論一 系統功能 ( 一 ) 資訊展示端 : 提供使用者查詢有害生物單筆資料表, 可依作物種類 ( 糧食作物 特用作物 果樹 蔬菜瓜果菇蕈類 花卉 景觀園藝植物 林木植物 其他類別 ) 地理分佈 ( 共包含全球 6 大洲 29 個洲分區與 221 個國家名稱 ) 或有害生物的種類 ( 病害 蟲害 草害 蟎害 其他有害生物 ) 來查詢 ( 圖二 ) 也可利用 T-Pests 字串蒐尋功能, 以有害生物或作物之普通名或學名查詢 ( 圖三 ) 雜草則特別再提供利用雜草類別來查詢 ( 圖四 ) 除了查詢單筆資料外, 也可瀏覽所有有害生物的名彙資料, 目前有病害 ( 圖五 ) 及雜草兩類, 未來則擬繼續開放蟲害 蟎害及有害動物均有名彙資料可供查詢 其他擬於今年加入 有害生物資料庫介紹 103

106 圖一前端網頁系統架構圖 Fig. 1. System structure of front-end webpage of the pest databases. 的功能尚有相關的植物保護資料連結 ( 電子書 ), 則連至國內作物病蟲害與肥培管理技術光碟資料, 包含國內稻作 特用作物 雜糧作物 果樹 花卉 蔬菜等相關之病蟲害防治 肥培管理及用藥資訊等 另為提供防檢局同仁線上學習局內曾經辦理的各類檢防疫相關課程, 今 年特別開始規劃將課程內容數位化, 逐步錄製相關課程影音資訊後提供線上學習之用 ( 二 ) 資料管理端 : 主要功能為各種參數設定 ( 例如 : 帳號管理 系統公告管理 各資料庫的相關設定等 ), 且有資料暫存及進階搜尋的功能, 供資料管理 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

107 圖二 有害生物單筆資料表查詢功能 左邊功能區可分為有害生物 寄主及地理分布等三個方式查詢 其顯示結果則如 圖右所示 Fig. 2. Individual data sheet search function of the pest databases. The function area on the left is divided into three search methods, pests, hosts, and geographical distribution. The search result output display is as shown on the right. 者彙整後 呈現於資訊展示端 在同質性資料 資料 都將從有害生物資料庫(單筆資料表) 庫的整併方面 未來擬將有害生物資料庫 蟲 中 選出有害生物學名 寄主植物學名 參考 害名錄資料庫以及病害名彙資料庫合併 建立 文獻等欄位 以清單方式組合條列出各種害物 單一的有害生物資料庫 提供正確的統計功 之名彙 其次 為管理人員部分 由先前多專 能 且讓使用者更易於查詢 另 病害名彙功 家輸入方式 改為統一的輸入團隊 把專家蒐 能將擴大為有害生物名彙 各種有害生物名彙 集 彙整的專業資料 分別上傳至有害生物資 有害生物資料庫介紹 105

108 圖三利用 T-Pests 字串查詢功能, 查詢東方果實蠅單筆資料表 Fig. 3. T-Pests string search result - Oriental fruit fly data sheet. 圖四利用雜草類別查詢莎草科的水虱草 Fig. 4. Weed category search of the lesser fimbristylis in the Cyperaceae family 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

109 圖五 病害名彙資料顯示畫面 Fig. 5. Disease directory data output display. 料庫 寄主植物資料庫 地理資料庫等 這種 (部) 科 (群) 屬 種等分類階層 另外尚包 資料蒐集 與 資料上傳 的專業分工方式 含同物異名 種下階 (含亞種 品系等) 作者 可更有效率的進行資料庫的擴充 且增加系統 及參考文獻關聯等欄位 目前資料庫中共有 7 內部維護和訂正的頻率 界 28 門 49 綱 198 目 617 科 3154 屬 6299 個種小名 目前資料庫中共有 7 界 28 二 資料庫 門 49 綱 198 目 617 科 3154 屬 6299 (一) 分類資料庫 個種小名 資料庫各界之簡要數據資料如表 分類資料庫為本系統所有生物種類的身 分識別資料庫 內容包含有害生物種類 作物 一 (二) 有害生物資料庫 種類 天敵種類等 這些生物種類與其他資料 目前資料庫內有 2687 種有害生物 其中 庫的連結 例如地理分布 以及生物種類間的 病害有 1819 種 包含了真菌 細菌 病毒 關連 例如有害生物為害作物的範圍等 均須 原藻等 蟲害共 592 種 目前共有鞘翅目 彈 依賴分類資料庫正確標誌出該生物的唯一 尾目 雙翅目 半翅目 膜翅目 等翅目 鱗 性 才能有效的發揮各資料庫間的關聯關係 翅目 蜻蜓目 直翅目 嚙蟲目 纓翅目 共 因此分類資料庫可為本系統的核心關連資料 11 目昆蟲 蟎害 84 種 包括真蟎目 疥蟎目 庫 絨蟎目 共 3 目的蟎蜱類 草害 183 種和其他 分類資料庫的分類階層有界 門 綱 目 有害生物 (鳥類 鼠類 蝸牛等) 9 種 各主要 有害生物資料庫介紹 107

110 *1 表一各類生物界 門及其綱目之簡要數據資料表 界 門 綱的數量 目的數量 動物界 節肢動物門 2 14 脊索動物門 2 2 軟體動物門 1 2 線蟲門 2 4 細菌界 放線菌門 1 1 厚壁菌門 3 3 變形菌門 3 6 原藻界 卵菌門 3 6 真菌界 子囊菌門 5 28 擔子菌門 3 17 壺菌門 1 2 接合菌門 1 1 Mitosporic fungi 2 3 植物界 蘚類植物門 2 2 毬果門 1 2 蘇鐵門 1 1 木賊門 1 1 銀杏門 1 1 石松門 1 3 木蘭植物門 2 78 蕨類植物門 1 7 原生生物界 Cercozoa 1 1 病毒界 未確定階層名 未確定階層名 3 *1: 不包含分類階層未確定者 類別與細項類別種類數量如表二 有害生物資料庫所儲存的資料內容, 包含了有害生物之基礎生物學資料 危害資料 檢疫資料及防治資料等, 詳如下述 : 1. 基礎生物學資料 分類學 同物異名 無性世代 通用俗名 型態描述 生活史等 2. 危害資料 危害作物 危害描述 地理分佈等 3. 檢疫資料 經濟影響 檢疫風險 他國檢疫規定 傳播方式等 4. 防治資料 防治方法 植物抗性 天敵資料等 ( 三 ) 作物及作物類別資料庫 : 作物資料庫為有害生物資料的兩大重要 關連資訊之一, 主要的功用是聯結作物與有害生物, 目前作物資料庫僅儲存作物的分類資訊 類別資訊 同物異名及參考文獻關聯等 ; 將來亦擬發展成完整的作物基礎資料庫, 增加作物的一般生物學 經濟利用性以及地理分佈等資料 作物類別資料庫是連結作物學術分類與應用分類的介面性功能資料庫, 一般使用者在搜尋有害生物資料時, 最常使用的搜尋邏輯, 是以作物在生活上的應用類別來搜尋, 例如搜尋豆菜類的有害生物等 為達到上述功能, 本計畫首先收集各方面對於經濟作物的一般性應用分類文獻, 嘗試彙集成具實用性的分類 初步的分類是依作物的應用功能及特性區分 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

111 表二有害生物資料庫主要類別與細項類別單筆資料數簡表 有害生物類別 單筆資料數 細項 單筆資料數 病害 1,815 線蟲類 33 細菌類 61 原藻類 89 真菌類 1,528 原生生物類 2 病毒類 102 蟲害 592 鞘翅目 115 彈尾目 1 雙翅目 48 半翅目 231 膜翅目 12 等翅目 2 鱗翅目 132 蜻蜓目 1 直翅目 13 嚙蟲目 2 纓翅目 35 草害 183 百合綱 69 木蘭綱 114 蟎害 84 真蟎目 75 疥蟎目 9 其他有害生物 9 鳥類 2 鼠類 4 蝸牛類 3 為下列 8 大作物類別, 並再區分成 54 種細項 ( 表三 ) 本工作的困難度極高, 應用性分類本身就是一個具有極大歧異性的主觀性研究, 又本計畫所牽涉的範圍太廣, 更增加其困難度 因此, 這部份的工作, 常隨著作物種類資料的增加, 呈現一種常態的變動特性, 特別會發生在細項類別 但是, 本計畫將持續在目前已有的基礎上, 同時尋求更多學者的力量加以改進, 以增加其可用性 ( 四 ) 草害類別資料庫 : 由於雜草的共生性危害特性有別於其他寄生性有害生物, 為讓使用者在搜尋雜草類有害生物時, 能更貼近實際應用的思考模式, 特別規劃一個雜草的類別資料庫, 並與作物資料 庫相對應 ( 表四 ), 提供使用者欲搜尋某一作物所有有害生物種類時能有更完整的資訊 ( 五 ) 地理分布資料庫 : 地理分布為有害生物資料的兩大重要關聯資訊之一, 也是政策參考的重要資料, 目前地理資料庫分成 洲 洲分區 國家 行政區 ( 僅國土面積較大國家及我國有行政區資料 ) 等 4 個階層 目前該資料庫的資料概況及國家數如表五 地理分布資料除有助於瞭解有害生物的分佈範圍, 另以國家劃分該有害生物的基本檢疫特性, 同時展現該有害生物在國際間的檢疫狀態 ( 圖六 ) ( 六 ) 文獻資料庫 : 文獻為本資料庫的重要基礎資料庫之 有害生物資料庫介紹 109

112 表三作物類別庫主要類別及次要細項表 作物類別 細項 糧食作物 水田作物 旱田作物 其他糧食作物 特用作物 藥用作物 ( 中草藥 西藥等 ) 保健食用中草藥 香料作物 ( 香料 調味料等 ) 纖維作物 油 料作物 糖料作物 飼料作物 綠肥作物 嗜好作物 ( 飲品 消遣 乾果等 ) 能源作物 染 料作物 橡膠作物 化妝品原料作物 其他特用作物 果樹 熱帶果樹 亞熱帶果樹 溫帶果樹 蔬菜瓜果菇蕈類 根菜類 莖葉類 蔥類 豆菜類 葉菜類 花菜類 果瓜菜類 菇蕈類 其他蔬菜 花卉 切花植物 球根植物 盆栽草花植物 觀葉植物 蘭科植物 其他花卉 景觀園藝植物 花壇植物 庭園苗木 環境路樹 草皮 景觀園藝植物 林木植物 環境保護林 經濟林木 竹類 木材製品 野生林木 其它類別 野生草本 野生木本 ( 喬木 ) 野生灌木 ( 小喬木 ) 野生藤本 ( 蔓生 ) 蕨類 水生植物 海 濱植物 水濱植物 其他寄主 一, 其重要性絕不亞於有害生物及分類資料庫 因為, 本資料庫之內容均擷取自研究學者之著作, 資料庫內容之正確性, 以及是否需要再做更詳細的蒐尋修訂, 均須不斷的由專家核對 而專家核對資料的第一項工作, 就是要知道該資料的原始來源, 才能用更新的文獻資料修訂舊資料 所以, 從文獻擷取資料所建置的資料庫 ( 如本資料庫 ), 必須不斷的以新的研究內容更新原有的資料, 更新工作的頻度則視所擁有的資源多寡決定 嚴格來說, 這類資料庫的內容, 永遠不可能完全正確, 而該資料庫之價值, 則端視原始引用文獻是否正確而定, 爰此可知, 文獻資料庫的重要程度 目前本資料庫的文獻資料內容, 為便利輸入及管理, 僅粗分為 作者 發行年代 篇名 或 書名 出處 等 4 個欄位 三 資料庫應用與發展 ( 一 ) 可攜式應用及社群功能由於近年來智慧手機的普及, 使得硬體障礙的門檻得以解除 ( 如過去的有線網路及視訊電腦等設備 ), 手機的可攜性大大超越電腦, 可作為即時及隨身的工具 ; 隨著使用手機上網的比率增加, 越來越多的網友利用手機來搜尋 瀏覽官網資訊, 讓使用者快速瀏覽相關資訊, 已成為一種必然趨勢 資訊行動化提供更多的便利性, 讓使用者不論身處何時 何地, 都能透過手機 平板電腦隨時隨地取得相關作物有害生物相關資訊 本資料庫在 2013 年底推出 Android 版 APP 功能, 提供使用者免費下載, 擴大系統使用效益 本系統提供有害生物資料庫 作物資料庫 有害生物名彙及電子書 ( 在有網路連線狀態下 ) 之查詢 在作物有害生物查詢項包含 : 作物名稱 ( 查詢通用俗名 ) 相關病蟲害資料 ( 寄主植物 傳播方式 防治方法 參考圖檔 參考文獻 其他寄主 等相關資料 ) 等 此外, 農委會過去曾開辦過農業遠距診斷視訊諮詢服務提供農民更便捷的農業診斷諮詢服務, 研發網路視訊技術讓農民就可以透過電腦及網路在產銷班或農會, 免費與專家諮詢 這一個計畫藉由網路的協助作為農民與專家的諮詢橋樑, 是一個立意甚佳的構想, 然而執行上有一些問題在當初仍然有執行上的困難與缺陷 除了硬體普及的門檻外, 一對一即時的諮詢模式往往造成人力不足的困窘, 大多數專家並無法隨時待命於系統之前, 導致系統執行不能完全符合預期 手機軟體的開發應用 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

113 表四雜草為害範圍類別與寄主植物類別對應表 雜草危害範圍分類 寄主植物分類次類別主類別 水田區 水田作物 糧食作物 糧食作物田區 旱田作物糧食作物其他糧食作物糧食作物 特用作物 - 蔗田區 甘蔗 特用作物 - 茶園 茶 果樹 - 常綠果樹林區 熱帶果樹果樹亞熱帶果樹果樹 果樹 - 落葉果樹林區 溫帶果樹 果樹 蔬菜 - 葉菜類田區 葉菜類 蔬菜瓜果菇蕈類 蔬菜 - 瓜果類田區 果瓜菜類 蔬菜瓜果菇蕈類 蔬菜 - 豆類田區 豆菜類 蔬菜瓜果菇蕈類 蔬菜 - 根莖類田區 根菜類蔬菜瓜果菇蕈類莖葉類蔬菜瓜果菇蕈類 蔬菜 - 花菜類田區 花菜類 蔬菜瓜果菇蕈類 切花植物 花卉 球根植物 花卉 花卉田區 盆栽草花植物花卉觀葉植物花卉 蘭科植物 花卉 其他花卉 花卉 環境保護林 林木植物 林地 經濟林木 林木植物 竹類 林木植物 非耕地 尚未定案 水域 水生植物其它類別水濱植物其它類別 草皮 草皮 景觀園藝植物 其他 環境路樹 景觀園藝植物 強化了各種功能執行的可能性, 包括攝影 無線網路上傳與下載等 加上社群網站功能在近幾年強力擴張, 使得我們衍生出整合行動載具 社群功能 非同步諮詢及後端查詢資料庫的構想 以社群概念及即時通訊或設論壇方式設置雲端植物防疫資訊討論專區, 提供一個開放討論與意見交流的園地, 不僅縮短民眾與專家的距離, 且不論專家或農業從業人員, 每個人皆可自此平台互換實務經驗 並藉由社群網路提供線上診斷系統診斷服務, 以非即時諮詢 方式服務民眾 ( 二 ) 線上學習近代的資料庫除了提供查詢之外, 也逐漸扮演了教育及支援服務的角色 寬頻網路建立後一個以圖像思考的年代開始流行, 資料庫艱澀冗長的文字知識遂逐漸不被社會大眾接受, 就更難推廣給整日在田間工作的農民 本計畫於是建立數位學習學程內容及項目, 並於各年度選定全國各地區所舉辦之防檢疫相關課程研討會 演講, 拍攝並錄製成 PowerCam 有害生物資料庫介紹 111

114 表五地理分布資料狀態表洲 洲分區 國家數 東亞 6 西亞 14 亞洲 南亞 7 北亞 1 中亞 10 東南亞 11 東歐 5 西歐 11 歐洲 南歐 16 北歐 6 中歐 7 北美大陸 4 北美洲 中美地峽 8 加勒比海群島 21 東南美 2 南美洲 西南美 5 南南美 3 北南美 4 東非 17 西非 9 非洲 南非 10 北非 16 中非 7 澳大利亞 1 大洋洲 密克羅尼西亞 7 美拉尼西亞 5 波里尼西亞 8 南極洲 南極洲大陸區 0 南極洲島嶼區 0 線上數位串流課程, 提供全國農友 防檢局及植物保護工作相關同仁上網學習 ; 設法解決資料庫使用率及應用性方面的困境, 強化資料庫加值應用, 並配合線上教學與教育訓練, 推廣使用線上資料庫及線上交流功能 本計畫從開始只有單純錄製上課簡報與講解內容 ;101 年度開始正式啟用線上學習網站, 將防檢局每年於各處舉辦的研討會及教育訓練課程上網 ;102 年有講師使用台語上課, 則特別增加中文字幕, 便於社會大眾觀看 ;103 年同步錄製講師上課動態, 以子母視窗呈現 目前平台已經有 32 堂防疫相關演講 ( 病害 -13 部 蟲害 -9 部 蟎害 -2 部 其它防治 -1 部 專題演講 -3 部 ) 植物保護手冊用藥部分與有害生物資料庫內容連結 ( 目前已連結 330 筆資料 ) 完成防檢局出版 22 本植物保護圖鑑與資料庫相關連結 (512 個連結 ) 將來擬進行教育訓練平台設計與推廣 ; 設計教育訓練專案, 以本資料庫為依據籌劃並拍攝專題提供教育訓練之用 ; 辦理或協助教育訓 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

115 圖六 地理分布資訊及基本檢疫資料展示圖 Fig. 6. Front-end display of geographical distribution and basic quarantine data. 練 提昇便用資料庫加值功能並設計開發雲端 元件 透過 Web 通訊協定及資料格式的開放 及多平台應用 最終目標為形成更多線上教案 標準 就可以為其他應用程式或網頁提供更好 並協助線上教學應用 拍攝及蒐集完整影音教 的服務 因此任一個網站就如同在網上整合了 學檔案 形成線上影音資料庫 主動或協助辦 Web service 元件的應用程式 透過 Web 理農業應用之教育訓練活動 以完成雲端有害 service 的使用 不用擔心資料提供者使用何 生物資料庫及落實多平台應用功能 種平台或技術 皆可順利取得資料 以有害生 (三) 網路介接服務 物資料庫作為資料提供者角色 所提供的服 完備的資料庫功能必須包括對外介接之 務 有可能來自任何網頁或平台的使用者 特 Web service 服務及對外介接之網址 隨著各 別對於作物 病蟲草害等名稱資訊的提供 將 類型網站的快速新增 使用者需求與網路習慣 可使使用者不用特意進入本資料庫 而可以輕 多樣性提高 資料庫逐漸無法再扮演入口網站 易並及時的獲得本資料庫有用的訊息 的功能 理論上一個發展成熟的資料庫 更應 該扮演幕後支持的角色 展望與結論 於系統開發對外介接之 Web service 服 務 使用者可藉由參數的指令透過網址取得相 資訊保存以及交換最主要的目的 在於將 關資料 以利其他系統介接 於系統開發對外 這些資料或資訊轉化為最能為人所利用的知 介接之網址 外部使用者可藉由本系統的網址 識 (knowledge) 利用這些知識我們可以解答 及參數的指令 連結到本系統相關資料 以利 全球性 長期性之問題 甚至作為決策之擬 其他系統介接 簡而言之 開發 Web service 訂 將資料或資訊分為 保存 以及 交換 有害生物資料庫介紹 113

116 兩種層面 ; 首先要能把所持有的資料有系統的整理, 而資料庫 (database) 則提供了保存資料與資訊的最佳方法, 有效管理的資料庫便可提供資料搜尋的功能 資料庫簡單的定義是指一組資料有系統的整理便是一種資料庫的形式, 更嚴謹的定義則是強調這組資料必須是經過電腦格式化的檔案, 所以組成資料庫的元件為 : 資料 (datasets) 介面 (interface) 以及搜尋工具 (searching tools), 而資料庫最核心的功能便是要提供搜尋功能 (Green, 1994), 讓使用者取得需要的資訊 發展多年的臺灣農作物有害生物暨天敵資料庫已經初步建立了完善的資料庫要件, 在資料單元 介面及搜尋工具上已漸臻成熟 然而在長遠的資料庫發展之下, 有一些基本元素及執行面上的考量必須逐步納入考量, 以符合時代進步的潮流 首先是資料格式化的問題 資料庫在資料的檔案處理上必須進行格式化的動作, 其中標籤欄位格式化 (tagged field format) 的動作是相當重要的一步, 標籤欄位格式化主要是將資料分為元素 (element field) 以及資料值 (data value) 兩個欄位, 利用不同元素項目描述某筆資料也就是資料值的部分 從原始資料到標籤格式化的資料形式其實是建立了所謂的後設資料 (metadata); 後設資料是指用來描述一組資料的內容 文字內容 架構 品質 等的資料形式 所以不同的資料類型便需訂定不同的元素項目才能精準的描述此類型資料, 因此發展出針對不同類型的後設資料格式 有害生物資料庫雖為防檢疫服務之功能性導向而設, 但畢竟其核心仍為一生物資料庫, 對於與其他生物資料庫, 特別如物種資料庫之間跨平台之資料交流與傳遞, 其後設資料格式的互通性, 勢必是將來不得不面對的問題 除此之外, 建立分散式公眾網域資料庫也 是一個重要的發展方向 公眾網域資料庫最核心的概念就是大眾可以自由使用的資料庫, 因此公眾網域資料庫的網路協定 (protocol) 明訂 :1. 投稿者的所有通訊以電子之形式,2. 投稿者必須負責所有的編輯工作,3. 提交的過程必須要能夠自動化 (Green, 1994) 所謂的分散式公眾網域資料庫包含了不同功能網站的參與, 因此必須對於提交資料的屬性標準 品質監控標準及程序作相關的訂定 對於有害生物資料庫將來在增加資料提供者 資料提交流程 資料備份 資料品質控管及檔案傳輸效率上, 及在整合其他國內外相關病蟲草害資訊資料庫上, 分散式公眾網域資料庫的觀念都是非常值得學習與應用的方向 誌謝本文改寫自 Shiao et al., 2012 英文原文內容 本研究承行政院農業委員會動植物防疫檢疫局計畫補助 (104 農科 檢 -B2), 感謝防檢局張瑞璋組長 顏辰鳳科長及計畫承辦同仁之支持 感謝歷年來為計畫付出的專家學者 : 吳文哲教授 方尚仁組長 石憲忠博士 徐玲明博士 陳啟予教授 陳淑佩博士 鄧汀欽博士等及所有計畫的工作夥伴們 引用文獻 Chen SP, Wang CL A knowledge platform for pest organisms control strategies the establishment of Taiwan crop pest and natural enemy database and query system. In: Special Report: Prospects of Taiwan Plant Protection Development Conference, Formosan Entomologist, Special Editions 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

117 9: (available in Mandarin only) Green DG Databasing diversity a distributed, public-domain approach. Taxon 43: Shiao SF, Chang RRJ, Chen CY, Hsu LM, Deng TC, Chen SP, Fang SJ Current status and outlook of the Taiwan agricultural pest and natural enemy database and query system. AFITA/WCCA 2012, Taipei, Taiwan. Shih HT, Ko NW, Wu WJ Brief introduction to Taiwan Crop Pest Database and query system. p. 14. The 2009 International conference of agricultural applications of information technologies. 128 pp. Taipei, Taiwan. (available in Mandarin only) Shih, HT, Wu WJ, Fang SJ, Chen CC, Chou YC, Chou HC Introduction of Taiwan Agricultural Pest Database. pp In: Proceedings of International Workshop on Development of Database (APASD) for Biological Invasion. Taipei, Taiwan. Wu WJ, Shih HT The functionalities and development outlook of the Taiwan Crop Pest Database, BAPHIQ Quarterly 8: (available in Mandarin only) 有害生物資料庫介紹 115

118 Introduction to the Agricultural Pest Database Shiuh-Feng Shiao * Department of Entomology, National Taiwan University, Taipei 106, Taiwan ABSTRACT The development status of an agricultural pest and natural enemy database and query system for Taiwan are discussed in the current study. Taiwan has begun developing our own characteristic database of pests through projects supported by the Bureau of Animal and Plant Health Inspection and Quarantine, Council of Agriculture. In recent years, disease, pest and weed experts have progressively compiled the database s contents, developed a shared system framework for back-end management and front-end usage, and built search tools of various functions according to the data characteristics and usage requirements. The challenges faced during the system-building process and their solutions form the focus of the current study. In terms of data categorization, key elements such as classifications, crop types, diseases, pest and weed invasions, geographical distributions, and informational literature are introduced; solutions for cross-data category transformation and linkages were also raised. In addition, the current study also raised mitigations and improvements specifically for the front-end user search platform and the back-end data provider management interface. The future development trends and possible future challenges for the database are discussed at the end of the study, including the portable application, e-learning and development of web service, where recommendations are made for meta-data standardization and distributed public domain database development prospects. Key words: agricultural pest, natural enemy, databasing, query system, Taiwan 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會 * Corresponding [email protected]

119 研究報告 2015 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會 P Symposium on Trans-Century Plant Protection and Quarantine Technologies P 植物醫師在技術研發與推廣上扮演的角色 - 以高雄區農業改良場為例 黃昌 * 陳以錚 曾敏南 周浩平 行政院農業委員會高雄區農業改良場 908 屏東縣長治鄉德和路 2-6 號 摘 要 植物醫師的工作主要是植物保護, 包括有害生物監測預警 診斷鑑定 防治技術研發與推廣應用 本文以高雄區農業改良場為例, 介紹農業改良場在植物保護相關工作的角色與未來展望 我國各區農業改良場設立大多已超過一百年, 長久以來, 均配置正式編制或約聘 ( 僱 ) 之植物保護專業工作人員, 扮演形同植物醫師的角色, 是直接面對農民之第一線服務人員, 一直肩負各地區重要作物有害生物診斷鑑定及防治技術研發與推廣之責任, 目的在提升農作物產量 品質與安全 農改場之植物醫師在農作物有害生物之鑑定及管理作為, 關係著作物疫情控制是否得當 ; 除作物生產外, 植物保護工作人員, 藉由講習教育及田間示範, 在環境保育及生態維護方面, 亦具有不可取代之重要性 同時, 高雄場植物保護工作人員, 亦針對多項重要作物病害, 持續開發出經濟安全有效的化學防治方法與非農藥及生物防治資材與技術, 經由田間試驗的驗證, 已確認對多種病蟲害具有良好的防治效果, 並已有多項研發成果完成技術移轉, 除確保作物的安全生產, 也為自己增添了不少榮譽與實質利益 近年來, 由於國際貿易日趨頻繁, 外來有害生物入侵的威脅與日遽增, 各區農業改良場植物保護工作人員更扮演外來有害生物偵測與鑑定之關鍵角色 但由於氣候變遷, 農作物種類及主 次要病蟲害相屢有更迭, 各區農業改良場目前的植物保護專業人力已逐漸吃緊 除了籲請政府增加人力外, 如何提升現有人力的知能, 並整合學術研究單位的專家, 同時建立植物醫師證照制度, 以全面提升作物有害生物診斷鑑定及防治技術研發之效能, 是目前必須嚴肅面對的課題 關鍵詞 : 植物醫師 高雄區農業改良場 有害生物監測 診斷鑑定 防治技術 推廣 * 論文聯繫人 Corresponding [email protected] 植物醫師在技術研發與推廣上扮演的角色 117

120 前言農業發展為人類文明的基礎, 然而在作物生產過程中, 任何作物皆可能因氣候或有害生物等限制因子而減產 其中病蟲害輕微時, 影響不顯著, 但若發生嚴重時, 常使得該項農產業乃至於整個社會遭到嚴重的衝擊 歷史上最為著名的案例應屬 1845 年愛爾蘭發生的 馬鈴薯晚疫病 疫情, 此病害造成愛爾蘭地區 100 多萬人死亡, 龐大的難民潮湧向美洲新大陸, 其對美國社會的影響直至今日 而為了解決愛爾蘭晚疫病的問題, 英國政府修改法令准許農作物自由進口, 也成為今日農產品自由貿易的先驅 隨後由 De Bary 等人對晚疫病的研究, 更成為今日植物病理和真菌學的濫觴 (Ko, 1996) 另一著名案例為木瓜輪點病毒病, 該病首先於 1975 年時在高屏地區木瓜栽培園被發現, 隨後幾年間即蔓延至全臺木瓜栽培區域, 一度使得全臺之木瓜產業面臨崩解 但本病害傳播途徑經確認主要為蚜蟲後 (Fulton, 1986), 農業試驗研究單位即開始試驗推廣, 於迎風面使用細網或間植玉米阻檔蚜蟲, 最後使用網室栽培木瓜來, 而使得木瓜產業得以復甦, 目前網室栽培已成為臺灣木瓜栽培最主流的栽培方式 臺灣植物病蟲害防治之研究始於日治時代, 發展至今, 已建立起完整的作物防疫體系 目前國內包括臺灣大學 中興大學 嘉義大學及屏東科技大學等大專院校皆設有植物醫學科系或學程, 培養專業的作物保護及植物醫師人才 而在政府機關, 則有農業委員會動植物防疫檢疫局 ( 以下簡稱防檢局 ), 應用各地農業研究單位及學術研究單位所開發之各種監測技術, 形成一個聯結全國的診斷鑑定及疫情監控系統, 精準診斷鑑定有害生物, 將田間發生之疫情資訊正確傳送予農友及各植物保 護工作人員, 並集合各單位力量, 擬定對策進行適當防治, 消弭可能爆發或擴大的疫情 在此體系中, 全國各區農改場處於作物防疫工作之第一線, 均配置正式編制或約聘 ( 僱 ) 之植物保護專業工作人員, 扮演形同植物醫師的角色, 直接肩負地區性重要作物有害生物診斷鑑定 疫情監測 防治技術開發及農民教育指導的重任, 長久以來, 各區農改場的植物保護工作人員與農友關係緊密 根據統計, 臺灣地區農民從事栽培工作遭遇問題時, 對外尋求協助時, 病蟲害相關者約占 75% (Sun, 2013); 而經正確診斷, 並有效即時防治病蟲害, 可以降低農藥等相關成本約 27% (Chen, 2011) 各區農改場除了有植物病蟲害專業人員外, 同時具備土壤肥料專業人才, 當遭遇營養因素造成的作物生理病害時, 不同領域專長人員可快速支援, 加以釐清原因, 達到實際解決田間問題之目的 高雄區農業改良場高雄區農業改良場 ( 以下簡稱高雄場 ) 創立於 1902 年, 場址設於今日之屏東市 日治時代舊名為 高雄州農事試驗場,1945 政府來臺後改制, 稱為 高雄區農林改良場,1950 年再改為 臺灣省高雄區農業改良場, 隸屬於臺灣省政府 1989 年精省後, 改隸行政院農業委員會, 並更名為 行政院農業委員會高雄區農業改良場, 並在 2006 年遷場至屏東縣長治鄉迄今 高雄場主管高屏及澎湖地區之作物品種及栽培技術改良和農業推廣工作, 目前轄區內耕地面積為 12 萬 4 千多公頃, 占臺灣可耕地 15%; 農戶數 13 萬 3 千多戶, 約占臺灣農業戶口 17% 高雄場業務單位包括作物改良課 作物環境課 農業推廣課 旗南分場以及澎湖分場 植物保護業務由作物環境課植物 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

121 保護研究室負責, 主要工作在研發作物病蟲害綜合防治技術和協助推廣教育等, 主旨為降低化學農藥用量 提升有害生物防治成效 增加農民收益及提高農產安全性 (Yang, 2014) 而植物保護研究人員實際扮演植物醫師之角色, 協助農民正確診斷鑑定病蟲害, 並指導農民採用作物有害生物整合管理 (integrated pest management, IPM) 技術, 生產安全健康的農產品 有害生物監測預警植物疫情首重預防, 因此監測有害生物在田間的分布情形相當重要 1997 年, 前臺灣省農林廳督導前省屬農業試驗改良場所建立 植物疫情監測體系, 全面整合全國疫情監測 調查 通報與疫病蟲害鑑定工作, 並透過電腦網路的聯結, 使我國的植物疫情監測工作邁入資訊化階段 1998 年, 防檢局成立, 全國各區農改場乃積極配合防檢局與農業試驗所 農藥物毒物試驗所 大專院校相關系所 縣市政府及法人團體等相關單位結合, 共同架構植物疫情監測通報體系, 積極辦理疫情通報 偵測調查 主動監測 預警及診斷服務等工作 2001 年 植物疫情通報系統 ( 建置後, 現已成為涵蓋全國的診斷服務 主動監測及疫情通報之資訊網絡, 而各區農改場更成為該系統運作, 最重要的樞紐單位, 使疫情訊息的聯繫與傳布更有系統與效率 在此體系下, 各區農改場除仍作為各地區疫情的監測單位外, 更擔負外來入侵有害生物之鑑定偵測任務 以荔枝癭蚋 (Litchiomyia chinensis) 為例, 該蟲主要分布在中國南部 澳洲東部, 危害作物僅有荔枝一種 臺灣於 2008 年 9 月首先在嘉義地區荔枝園發現該蟲 (Hung et al., 2009), 由於其成蟲可藉風力散布, 自入侵點快速擴散, 在嘉義地區發現後, 即由動植物防疫檢疫局聯繫各區農業改良場全面調查, 發現已擴散至南投 彰化 雲林, 臺南等縣市 高雄場亦於 2010 年 10 月份的鑑定監測工作中, 在屏東內埔地區的荔枝園發現此蟲的蹤跡, 高雄場除發布警報外, 並於講習會中, 籲請農友加強防範此害蟲 ; 此外, 高雄場長年執行高屏地區稻熱病 (Magnaporthe grisea, Rice blast) 等水稻病蟲害之疫情監測, 並於必要時立即發布警報, 減少農損, 以維護國家糧食安全 再以小黃薊馬 (Scirtothrips dorsalis Hood) 為例, 該蟲雖早有危害檬果的紀錄 (Mound and Palmer, 1981), 但以往危害程度輕微 然而近年來, 小黃薊馬卻開始成為檬果栽培期間的重要害蟲, 防治不當時直接影響鮮果的品質與產量, 此薊馬幼蟲及成蟲均具危害能力, 喜危害新梢嫩葉及幼果, 危害葉片時常潛藏於葉脈主肋二側刺吸汁液危害, 雌成蟲亦常以產卵管插入此部位之葉肉組織產卵, 受害葉片常出現黃褐色凹陷斑點, 嚴重者扭曲變形 ; 危害幼果時, 最常刺吸近果蒂處, 而在果皮表面留下焦枯狀疤痕, 輕微者影響果實外觀與商品價值, 嚴重者常導致提早落果而影響產量 2008 年起高雄場即與國立中興大學昆蟲學系及國立屏東科技大學植物醫學系合作, 在檬果栽培區調查鑑定葉蟬類及薊馬類害蟲的族群動態消長及薊馬類害蟲的發生種類, 並著手薊馬類害蟲田間監測技術之改進與探討, 期能改善近年來薊馬類害蟲的危害情形 根據 2009 年在屏東枋寮地區的愛文檬果外銷供果園中, 應用黃色黏板調查結果顯示, 開花期至結果期鑑定發現的薊馬種類包括 : 小黃薊馬 臺灣花薊馬 (Frankliniella intonsa (Trybom)) 菊花薊馬 (Microcephalothrips 植物醫師在技術研發與推廣上扮演的角色 119

122 abdominalis (D. L. Crawford)) 花薊馬 (Thrips hawaiiensis (Morgan)) 及管尾薊馬亞科 (Phlaeothripinae) 的薊馬等, 經鑑定分析, 其中以小黃薊馬所占的比例最高, 達 97.9%, 為主要危害檬果的薊馬種類 2010 年起高雄場於屏東縣新埤 長治及枋寮等三鄉鎮進行小黃薊馬族群密度監測, 當年度發現新埤鄉自 2 月中旬起此蟲密度即迅速攀升, 至 3 月上旬達密度最高峰時, 平均每張黃色黏板可誘捕 2,507 隻薊馬, 高雄場隨即透過手機簡訊及新聞稿發布警報, 呼籲農友加強防治後, 此蟲密度亦迅速下降至 200~400 隻上下, 顯示, 準確的監測和正確的施用藥劑可有效降低害蟲密度 高雄場也在於檬果栽培區定期監測本害蟲的族群變動, 適時發布警報, 提醒農友加強防治, 現已有效控管其族群密度, 達到減少果實受害的目標 另一方面, 在監測過程中發現, 小黃薊馬亦開始危害蓮霧嫩葉及果實, 成為降低蓮霧品質的重要害蟲, 高雄場亦採取類似於檬果栽培區的各項措施, 包括 : 定期監測族群變動 適時發布警報, 有效控管其族群密度, 減少蓮霧果實受害 診斷鑑定服務植物健康出現異常時, 正確診斷引發的原因為管理工作上最重要的第一步 作物健康異常的發生原因, 除有害生物引起外, 尚有營養缺乏 物理傷害 藥物或化學傷害及天候環境不良等, 正確診斷原因, 方可採取有效的因應措施 如果為病蟲害所引起, 則可正確且快速的由現有資料庫中了解害物的特性, 包括生活史以及最佳的防治時機與方法, 正確提供建議予栽培者應用 如為營養缺乏 物理 化學性的傷害或其他因素引起, 則可避免農民進行不需要的施藥, 並可針對引起的原因, 進行栽培 管理措施的改善與調整 錯誤判斷而造成問題持續發生的案例比比皆是, 甚至長時間造成農友個人的經營困境或整體產業的問題 因此, 診斷工作對產業興衰影響重大 若誤判病徵, 以致於採取錯誤的處置方法, 則防治工作之結果將適得其反 在高雄場轄內, 有許多因農民或農藥業者因誤判成因, 使得受害情況無法獲得改善甚至加劇, 最後是經由擔負植物醫生角色的植物保護人員, 正確診斷並建議適當的處置方法, 才改善作物受害的情況 例如,2010 年初在高雄美濃及大寮等地區, 農友於防治一期稻作的稻熱病時, 可能因施用三塞唑稀釋倍數不正確, 或者施用的間距過短, 以致於在廣大區域造成水稻葉片不規則的斑點狀藥害, 農友誤判為稻熱病病斑, 繼而再加重施藥, 導致藥害更加嚴重 後經高雄場植物保護工作人員進行田間診斷, 確認發生原因, 緊急發布新聞稿, 並密集進行宣導正確用藥方法後, 才使得藥害事件沒有持續發生 此外, 芒果畸形病是長久以來發生於田間的病害, 造成芒果樹的營養器官及花穗畸形, 所以農民常稱之為 瘋花 或 瘋欉, 受感染的花穗幾乎不著果, 所以也有人稱為 公花, 一旦得病的花穗數量多時, 對產量造成嚴重影響 過去誤判此畸形徵狀為生理性因素, 但經過臺南區農業改良場鑑定, 確認芒果畸形病是由鐮孢菌所引起的病害, 高雄場亦旋即於相關講習會並發布相關訊息, 加強芒果畸形病的宣導, 請農友及時採取有效防治措施, 才得以減少損失, 確保芒果品質及產量 在 2010 年 11 月 ~2011 年 2 月間, 屏東南部的蓮霧產區發生嚴重的腐果疫情, 經高雄場植物保護工作人員調查及鑑定確認, 主要為蓮霧黑腐病 (Lasiodiplodia theobromae) 及果腐病 (Pestalotiopsis euginae) 所危害 蓮霧果實受 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

123 黑腐病菌危害後, 可快速在 3~4 天內產生大面積水浸狀病徵, 此一病害常被農友誤認為疫病, 並施用卵菌類的殺菌劑 ; 然而, 這樣的防治措施徒勞無功 高雄場經確認病因後, 立即進行藥劑篩選, 選出已核准使用於蓮霧, 並能有效抑制黑腐病菌的化學藥劑, 隨即透過密集的教育講習及訊息發布, 推廣給農民使用 此外, 近年來栽培面積持續成長的紅龍果, 常受潰瘍病危害而在肉莖上或果皮造成黑褐色斑點 ; 然而, 於高溫多雨時, 病斑容易擴大成為大面積的水浸狀軟腐, 最後肉莖腐爛只剩維管束 此病害通常被農民判定為疫病或細菌性軟腐病, 後經高雄場植保人員自軟腐組織進行病原菌分離, 並回接至紅龍果肉莖後, 確認為 Neoscytalidium dimidiatum 所造成, 並進一步試驗篩選出有效的合法藥劑, 迅速提供給農友採用 近年, 來高屏地區葉用甘藷亦發生大面積的萎凋病害, 罹病的植株首先呈現矮化 葉片失水或萎凋, 進而於莖部出現黑色壞疽及水浸狀腐敗, 削開患部可見維管束褐化, 嚴重時全株萎凋死亡 此病徵與前人描述由尖鐮胞菌 (Fusariun oxysporum f. sp. batatas) 引起的甘藷蔓割病 (Fusarium wilt) 非常類似, 然經詳細觀察可在患部傷口, 可見疑似細菌菌泥湧出, 再經進一步診斷, 確定為 Ralstonia solanacearum 引起之青枯病 (bacterial wilt) (Chen et al., 2012), 本病害在高屏地區造成超過 30% 的葉用甘藷損失 青枯病雖為植物絕症, 然經正確診斷後, 先期以輔導農民採取健康種苗方式, 即大幅延緩病害的發生, 爾後再經高雄場植物保護人員努力, 已開發出有效的生物製劑, 可在田間成功防治青枯病 有鑑於診斷鑑定工作之重要性, 農委會在 1980 年於全國各個農業改良場 藥毒所及農試所等試驗機構共成立了 10 處 作物病蟲害 診斷服務站, 提供農作物病蟲害診斷及防治技術指導等多項服務 各診斷服務站均有駐站專家扮演植物醫師的角色, 接受農友以電話或親送等方式詢問各種病蟲害相關問題 1992 年後, 診斷服務站擴編到 20 處 87 年防檢局成立, 統籌管理及推動全國植物防疫工作, 爰賡續結合農業試驗所 農業藥物毒物試驗所 全國各區農業改良場 大專院校相關系所 縣市政府等單位, 共擴編至 30 處 作物病蟲害診斷服務站, 積極辦理診斷服務等工作, 並結合植物疫情管理資訊系統輔助管理, 使疫情資訊能迅速傳達交流, 俾有效指導農民安全使用農藥, 改善部份農民聽信農藥商不實促銷廣告, 造成誤用或超量使用農藥的不良後遺症, 確保上市農產品的品質安全 後續經過整併及重新編制, 目前運作中的診斷服務站診斷共有 26 個, 鑑定服務每年超過 4000~5000 件 (Chen et al., 2007; Chen, 2008); 以高雄場為例, 自 2007 年 1 月至 2014 年 12 月, 植物病蟲害診斷服務案件共有 9,904 件 ( 圖一 ); 其中, 果樹類為 5,396 件, 約占總件數之 54.5%, 其次則為蔬菜及瓜果類為 2,406 件, 約占 24.2%, 花卉及觀賞作物及林木之案件為 1,635 件, 約佔 16.5%, 此外亦有少數特用或未歸類之作物為 467 件, 約佔 4.8%; 診斷出之原因, 則以病蟲害為主, 生理障礙等其他原因占少數 防治技術的研發一 抗病育種利用種植抗病 ( 蟲 ) 品種防治作物有害生物, 是最直接有效且避免農藥使用的策略 (Lin et al., 2004), 惟抗病蟲品種的選育需耗費相當人力與時間 臺灣各試驗改良場所及種苗業者, 長久以來都將其列為育種目標 以高雄場為例, 育種人員結合植物保護工作人員進 植物醫師在技術研發與推廣上扮演的角色 121

124 診斷鑑定服務件數 件 ) ( 年度 圖一 2009~2014 高雄場病蟲害診斷鑑定服務案件 Fig. 1. The numbers of plant healthy clinic services in Kaohsiung District Agricultural Research and Extension Station during 2009 to 行 抗 病 育 種 工 作 例 如 由 Fusarium 經命名推廣種植後 將可減少防治藥劑之使 oxysporum f. sp. tracheiphilum 所引起的豇 用 此外 高雄場對於水稻抗病育種方面 亦 豆萎凋病為豇豆栽培的重要限制因子 且無有 有顯著成果 高雄場育成的水稻高雄 145 號不 效化學藥劑可供防治 高雄場經過多年努力 但具有碾米品質米粒外觀與食味品質良好 產 蒐集各種豇豆種原 於建立的萎凋病病圃中進 量及穩定性佳 適應性廣 株型優良 氮肥利 行抗病品種篩選 共篩得 13 個抗病種原 配 用效率高等優點 其對於稻熱病與白葉枯病具 合豇豆嫁接技術的研發 將抗病種源作為嫁接 有中抗之特性 徒長病亦發生極少 於每一年 根砧與主要栽培品種 (三尺青皮) 進行嫁接組 度所舉辦之全國十大經典好米比賽更是屢創 合 評估嫁接在萎凋病防治上的可行性 結果 佳績 獲獎無數 近年來已成為農友栽培有機 發現數個具良好嫁接親合性的組合 且配合園 良質米的優先選擇 藝性狀的檢定 發現嫁接後對食味品質及外觀 品質皆無不良影響 這些品種當中 表現最優 二 非農藥資材之研究與應用 秀的抗病根砧嫁接商業化的豇豆品種後 於定 隨著環保意識抬頭 非農藥病蟲害防治資 植後 16 週 罹病率僅為 4.4% 而未嫁接處理 材之開發與應用已成為重要趨勢 經過多年努 為 86.7% 具有優異的抗病力 抗組合的產量 力 臺灣植物保護學者根據病蟲害的特性 已 為對照組的 2.3 倍 顯示 嫁接抗病根砧對長 開發出多種效果優良之非農藥防治技術 有效 豇萎凋病防治具有高度可行性 (圖二) 另 針 減少了化學藥劑之使用頻率 以疫病菌 對洋香瓜進行抗白粉優良品系選育 目前已選 (Phytophthora spp.) 引 起 的 作 物 疫 病 出 6 個極抗品系 而且各品系園藝性狀良好 (Phytophthora blight) 為例 疫病菌可危害 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

125 圖二 利用抗病根砧防治長豇豆萎凋病 (A) 嫁接處理 (B) 對照組 Fig. 2. The effect of grafting with resistant rootstock on controlling of Fusarium wilt of asparagus bean caused by Fusarium oxysporum f. sp. tracheiphilum in fields; grafting treatment (A), and control (B). 多種經濟作物如果樹 蔬菜 花卉作物 臺灣 護資材 分年進行多次田間試驗 已確認其防 地區因氣候多雨潮濕 有利於疫病菌孢囊 治瓜類作物白粉病之效果 (表一 表二) 這些 (sporangium) 與游走子 (zoospores) 之形成 安全資材包括 碳酸鹽類 (carbonate) 磷酸 與傳播 致使疫病之發生十分猖獗 而農試單 鹽類 (phosphate) 礦物油劑 (mineral oil) 位經過多年研究發現 使用亞磷酸 (H3PO3) 銅劑 (copper agent) 硫磺劑 (sulfur agent) 是對植物疫病菌類非常有效的預防方法 目前 及安全的農用抗生素類 (antibiotics) 例如碳 農民已可自行以市售之 95 99% 的工業級亞 酸 氫 鉀 (potassium bicarbonate) 窄 域 油 磷酸與氫氧化鉀 (KOH) (95%) 等量 (1:1) (narrow range oil) 三元硫酸銅 (tribasic 溶於水後即可使用 使用時稀釋 1,000 倍噴佈 copper sulfate) 保粒黴素 (甲) 保粒黴素 (丁) 或 200 倍灌注土壤 可刺激寄主植物啟動防禦 (polyoxins) 硫磺劑 (sulfur agent) 及亞磷酸 機制 預防包括露菌病菌 (Downy mildew) 等 均屬於衛福部公告免訂殘留容許量 毒性 露疫病菌 (Peronophythora downy blight) 低 安全性高的資材 而其防治白粉病之效 及白銹病 (Albugo white blister) 等卵菌類 果 不遜於其他化學農藥 若為有機栽培 在 (Oomycetes) 病害 亞磷酸目前列為有機農業 秋冬季使用窄域油 200 倍混合亞磷酸 800 倍 可用資材 (Ann, 2001; Chen, 2012) 經多重 可同時有效防治露菌病 白粉病及蚜蟲等小型 管道推廣後 高屏地區農民已經普遍使用 再 昆蟲效果可維持到採收後期 這些安全資材的 以高雄場研究的小胡瓜白粉病非農藥防治技 研究與推廣應用 大幅提升了連續採收蔬菜之 術為例 因小胡瓜為連續採收作物 因此農藥 安全性 殘留過量情形時有所聞 高雄場植物保護工作 東方果實蠅 (Bactrocera dorsalis Hendel) 人員特別選定數種免定殘留容許量的植物保 為臺灣果樹重要害蟲 主要分布於大平洋及東 植物醫師在技術研發與推廣上扮演的角色 123

126 表一 利用安全資材防治胡瓜白粉病 (1) Table 1. Control of powdery mildew on cucumber by using safe materials (1) Treatments Disease severity (%)* 7 days after 7 days after 7 days after 7 days after 7 days after 1st spray 2nd spray 3rd spray 4th spray 5th spray H3PO3+KOH (1:1) (800X) Narrow range oil (200X) % Potassium bicarbonate SP (500X) % Wettable sulfur WDG (1,000X) Bacillus subtilis (400X) % Tribasic copper sulfate SC (800X) % Azoxystrobin SC (2,000X) CK (Water) * The disease severity is 0% before treatment. Each experiment was conducted with 3 replicates. 表二 利用安全資材防治胡瓜白粉病 (2) Table 2. Control of powdery mildew on cucumber by using safe materials (2) Treatments Bacillus amyloliquefaciens PMB01 WP 35.15% Sulfer + copper oxychloride SC (600X) 10% Polyoxins WP(800X) Extract of plant ash (150X) H3PO3+KOH (1:1) (800X) Narrow range oil (500X) 80% Potassium bicarbonate SP (1,000X) CK * Each experiment was conducted with 3 replicates. Before spraying Disease severity (%)* 7 days after 7 days after 1st spray 2nd spray days after 3rd spray 南亞地區 寄主植物多達 117 種 (Drew and 的使用意願 高雄場據以在各重要果樹栽培區 Raghu, 2002) 臺灣地處亞熱帶 氣候及環境 推動區域性共同防治工作 實施時每公頃懸掛 極適合其孳生 近年來隨著果樹種植面積與種 3-4 個 密度高時則每公頃增至 6 個 並配合 類大幅增加 加上栽培及產期調節等技術蓬勃 田間衛生管理工作 已大幅降低高屏地區的東 發展 多種果樹終年結實不斷 致其為害逐年 方果實蠅密度 (Chuang and Hou, 2005) 該 猖獗 政府與果農每年投入大量的人力誘殺資 方法目前在臺灣已普遍被農民採用 再配合果 材及農藥進行防治 但成效不彰 經高雄場開 實套袋或網室栽培 可大幅減少農藥使用及果 發東方果實蠅長效型誘殺器 使應用含毒之甲 實蠅危害 基丁香油 (5% 乃力松乳劑 + 90% 甲基丁香 油) 誘殺雄蟲的時間及效能得以提升 每次懸 三 生物防治技術的開發 掛後的誘殺效期達 6 個月以上 因而增加農民 (一) 病害防治 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

127 開發應用有效且安全的資材與技術管理作物病蟲害, 是每一位植物醫生心中最大的期待 利用有益微生物防治作物病蟲害, 在國內外皆有長久時間的研究, 亦是高雄場在植物保護工作上重要的研發目標之一 目前高雄場已開發出數種利用有益微生物的防治技術, 如含有放線菌 (Streptomyces saraceticus KH400) 的抑病栽培介質或液化澱粉芽孢桿菌 (Bucillus amyloliquefaciens PMB01) 的生物製劑等 ; 此外, 亦正研發廣效的防病枯草桿菌 (Bucillus subtilis KHY08) 製劑 放線菌屬於革蘭氏陽性細菌, 為病害防治上最常被用來使用的有益微生物之一, 其能產生某些酵素與抗生物質如幾丁質分解酵素 (chitinase) 或纖維分解酵素 (cellulase) 等, 對於土壤傳播性病原菌 (soil-borne pathogen) 及線蟲 (nematodes) 具有一定之防治成效, 且其廣泛分布於土壤中, 僅需以蝦蟹殼粉 (srimp and crab shell powder) 等物質, 就能誘導其生長並產生酵素, 達到病害或寄生性線蟲防治之效果 (Shih et al., 2006), 而高雄場研發的放線菌 (S. saraceticus KH400) 抑病介質, 能夠有效防治由 Rhizoctonia solani 引起的蔬菜苗期猝倒病 (dampping-off), 該菌株長期使用, 也可以顯著抑制番石榴立枯病 (Myxosporium psidii Sawada et Kurosawa) 的發生 臺灣本土液化澱粉芽孢桿菌 (B. amyloliquefaciens PMB01) 則有效的防治了一向被稱為作物絕症的青枯病 (bacterial wilt) 與萎凋病 (Fusarium wilt), 此一研究也開創了植物保護新頁 液化澱粉芽孢桿菌屬於革蘭氏陽性細菌, 外觀及特徵與枯草桿菌 (B. subtilis) 極為相似, 可產生多種胞外分解酵素, 如纖維素分解酵素 (cellulose) 蛋白質分解酵素 (protease) 脂質分解酵素 (lipase) 澱粉分解酵素 (amylase) 等, 以及多種抗生物質如伊枯草菌素 (iturin A) 豐原素 (fengycin) 表面活性素 (surfactin) 等, 對防治作物病害深具潛力 (Kuo, 2014) 青枯病菌 (Ralstonia solanacearum) 寄主範圍甚廣, 目前已知被危害的寄主植物超過 200 種, 尤其在番茄 馬鈴薯 茄子 甜椒等茄科作物上危害最劇 青枯病菌可在土壤中存活長達 10 年以上, 是全世界熱帶 亞熱帶以及夏季溼熱溫帶地區最致命的作物病害 萎凋病則為土壤傳播性真菌病害, 病原菌為尖鐮孢菌 (Fusarium oxysporum), 具有多種生理分化型 (forma specialis, f. sp.), 此病害目前為豆菜類與瓜菜類等作物栽培最大限制因子, 病原菌會棲息於土壤及種子上, 由根尖或皮層部直接侵入根部, 並沿維管束向上蔓延, 植株最後枯死, 於潮濕高溫季節最容易發生 ; 上述二種土壤傳播性病害目前皆無有效的化學防治方法 高雄場植物保護研究人員, 經長期田間試驗評估及眾多農友試用, 發現 B. amyloliquefaciens PMB01 對 青枯病 與 萎凋病 的防治率皆可達 70% 以上, 當番茄不處理對照組罹病度達 43.2% 時, 菌液處理區僅 8.2% ( 表三 圖三 ); 此外, 在萎凋病的防治效果同樣顯著, 以瓜類萎凋病為防治對象, 當小胡瓜不處理對照組罹病度達 47.7% 時, 菌液處理區僅 11.6% ( 表四 圖三 ); 後續將本菌株製成可濕性粉劑及液劑生物製劑, 於田間對青枯病仍有很好防治效果 ( 表五 ), 目前本菌株及技術已以歷史天價完成技轉, 並備齊各項生物農藥登記資料, 期望於短時間內完成生物農藥登記, 上市供農民使用 此外, 亦初步發現枯草桿菌 (Bucillus subtilis KHY8) 菌株, 對蓮霧及棗子等重要果樹之果實病害, 如由 Lasiodiplodia theobromae 引起的蓮霧黑腐病菌 番石榴黑星病 (Guignardia psidii 植物醫師在技術研發與推廣上扮演的角色 125

128 表三利用液化澱粉芽孢桿菌 Bacillus amyloliquefaciens PMB01 防治青枯病 Table 3. Application of Bacillus amyloliquefaciens PMB01 to control bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum. 1 Treatments Disease severity (%) 7 days after 1 st spray 7 days after 2 nd spray 7 days after 3 rd spray 7 days after 4 th spray 7 days after 5 th spray 14 days after 21 days after 5 th spray 5 th spray BaPMB01 2.4a 3 3.2a 4.5a 5.4a 6.8a 7.3a 8.2a Blank 2 4.1b 7.7b 13.4b 19.0b 26.4b 32.6b 39.5b CK 5.8b 10.1c 15.6c 22.7c 29.4.c 37.5c 43.2c 1 Experiment was conducted with randomized complete block design (RCBD), each treatment was 120 plants with 3 replicates. BaPMB01 broth with 200~300 ml of 10 7 cfu / ml was drenched around the base of each tested plant. The disease severity is 2~3% before treatment. 2 The treatment Blank was culture medium only. 3 The same letters in the same column followed by the same letters were not significantly different according to LSD (p 0.05) analysis. Ullasa & Rawal) 與瘡痂病 (Pestalotiopsis psidii (Pat.) Mordue) 及棗炭疽病菌, 都具有具有良好的抑制效果 ( 圖四 ), 高雄場植物保護工作人員正積極研發相關應用技術中 除上述有益微生物案例, 拮抗植物之應用亦屬於廣義之生物防治 此概念近年來於作物線蟲病害的防治已被廣為應用, 依據高雄場防治番石榴根瘤線蟲試驗, 種植拮抗植物 - 萬壽菊, 可大幅降低根瘤線蟲二齡幼蟲密度, 根瘤線蟲二齡幼蟲密度可由每 100 公克土壤 128 隻二齡幼蟲, 大幅降低至每 100 公克土壤 32 隻二齡幼蟲 經試驗結果證明, 萬壽菊確是既環保又有效之土壤線蟲防治植物, 經示範推廣後, 目前在臺灣番石榴果園已逐漸被普遍利用 ( 二 ) 蟲害防治利用天敵防治害蟲可以降低農藥的使用, 在臺灣除苗栗區農業改良場設有生物防治分場, 專門研究天敵昆蟲大量繁殖與應用外, 各個試驗改良場所及學術單位亦有不少學者投入相關研究與推廣 目前可用於防治害蟲的生物防治資材包括有益微生物與昆蟲天敵 等 微生物如蘇力菌 黑殭菌及白殭菌等 天敵則包含有昆蟲寄生性天敵 (parasitic predator) 與捕食性天敵 (predatory predator) 等 (Chiu et al ), 其中, 蘇力菌已在臺灣長期被廣泛利用 而寄生性天敵種類繁多, 目前在臺灣已普遍應用人工大量繁殖之赤眼卵寄生蜂 (Trichogramma ostrinae), 釋放至田間控制亞洲玉米螟 (Ostrinia furnacalis) (Houand Lai, 2013) 捕食性天敵如基徵草蛉 (Mallada basalis) 或黃斑粗喙椿象 (Cantheconidea furcellata) 等 基徵草蛉為為脈翅目 (Neuroptera) 草蛉科 (Chrysopidae) 之昆蟲, 可捕食葉蟎類 蚜蟲類 粉蝨類 介殼蟲類 木蝨類, 以及多種鱗翅目及鞘翅目昆蟲之初齡幼蟲及卵 經高雄場試驗結果顯示, 將基微草蛉幼蟲分別釋放至栽培胡瓜與長豇豆之溫室, 可明顯減少蚜蟲與葉蟎等有害生物 ; 而黃斑粗喙椿象屬於半翅目 (Hemiptera) 椿象科 (Entatomidae), 亦為常見之捕食性天敵, 可捕食鱗翅目幼蟲及多種鞘翅目 半翅目 同翅目等昆蟲, 高雄場調查結果也顯示, 將若蟲及 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

129 圖三 利用液化澱粉芽孢桿菌防治番茄青枯病 (A) 與胡瓜萎凋病 (B) 的效果 Fig. 3. The effect of treated with Bacillus amyloliquefaciens PMB01 on controlling of tomato bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum (A), and Fusarium wilt caused by Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum (B) in infested fields. 成蟲分別釋放至露地栽培的小胡瓜與毛豆田 量飼養及釋放模式 鼓勵農民自行培育利用 中 小胡瓜與毛豆上常見的害蟲 如瓜螟 豆 此外 高雄場亦發展座殼菌 (Aschersonia sp.) 莢螟及臺灣黃毒蛾均明顯減少 上述二種捕食 防治粉蝨技術 (圖五) 銀葉粉蝨 (Bemisia 性天敵均可藉由直接取食方式達到蟲害控制 argentifolii) 為同翅目 (Homoptera) 粉蝨科 之效果 (Houand Lai, 2013) 且其飼養成本 (Aleyrodidae) 之昆蟲 自 1990 年入侵臺灣 低 高雄場為嘉惠轄區農民 亦大力推廣其大 後 危害之作物種類愈來愈多 包括蔬菜 果 植物醫師在技術研發與推廣上扮演的角色 127

130 表四 利用液化澱粉芽孢桿菌 Bacillus amyloliquefaciens PMB01 防治胡瓜萎凋病 Table 4. Application of Bacillus amyloliquefaciens PMB01 to control Fusarium wilt caused by Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum.1 Treatments Disease severity (%) 7 days after 7 days after 7 days after 7 days after 7 days after 14 days after 21 days after 1st spray 2nd spray 3rd spray 4th spray 5th spray 5th spray 5th spray 3 BaPMB01 5.1a 6.7a 7.2a 1.8a 9.4a 10.2a 11.6a Blank2 8.9b 18.3b 22.6b 29.0b 36.7b 40.7b 43.7b CK 12.5c 20.6b 25.5c 32.0b 38.5b 43.0c 47.7c 1 Experiment was conducted with randomized complete block design (RCBD), each treatment was 120 plants with 3 replicates. BaPMB01 broth with 200~300 ml of 107 cfu / ml was drenched around the base of each tested plant. The disease severity is 2~3% before treatment. 2 The treatment Blank was culture medium only. 3 The same letters in the same column followed by the same letters were not significantly different according to LSD (p 0.05) analysis. 表五 B. amyloliquefaciens PMB01 可濕性粉劑防治番茄青枯病的效果 Table 5. The effect of B.amyloliquefaciens PMB01 product (wettable powder; WP) on disease severity of tomato bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum in fields1 Disease severity (%) AVG 3 Diff (rep ) BaPMB WP 200X b BaPMB WP 100X a BaPMB WP 50X a Water c Un-treatment c 1 Experiment was conducted with Randomized Completely Block Design (RCBD), each treatment was 120 plants with 4 replicates. 2 rep = replicates 3 AVG = average 4 Diff = difference 5 The different letters mean the averages of disease severities to each treatment were significantly different according to LSD analysis (p 0.05). Treatments 樹及花卉等 雖有多種防治藥劑被核准使用 四 農藥經濟安全使用 但目前國內外皆已發現銀葉粉蝨對殺蟲劑產 農藥為植物保護不可或缺之資材 但若使 生抗藥性 導致農友加重施藥量 造成環境及 用不當 可能危害人體健康 農產品安全及環 生態破壞之問題 高雄場近年來著手菌種採 境生態 為確保農作物之產量 品質與環境生 集 期望利用座殼菌作為生物防治因子 目前 態 臺灣各個農業改良場及農政單位均極為重 持 續 改 進 培 養 基 配 方 及 量 產 流 程 (Tseng, 視經濟安全用藥之技術研究與宣導 這些正確 2010, 2011) 期待未來座殼菌得以廣泛推廣田 用藥的要領包括有 (1) 選用正確及合適之防 間使用 治資材 絕不使用未核准的農藥或是禁藥 同 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

131 圖四 Bucillus subtilis KHY8 防治蓮霧黑腐病的效果 Fig. 4. The effect of Bucillus subtilis KHY8 treatment on waxapple black spot disease caused by Lasiodiplodia theobromae at postharvest stage. 時經由正確診斷 選擇合理用藥 並輪流使用 有害生物的藥劑 經田間示範及教育講習 推 不同作用機制之藥劑 以延緩有害生物產生抗 廣予農民應用 有效減少農藥使用之種類及次 藥性 (2) 適時施藥 配合病蟲害監測 於有 數 例如 高雄場針對紅龍果 蓮霧 番石榴 害生物發生初期 把握時機及時防治 以最少 等作物的重要病害進行藥劑篩選 紅龍果莖潰 量之農藥有效控制有害生物 (3) 適量用藥 瘍病 (Neoscytalidium dimidiatum) 為近年 依照登記核准之濃度使用 不任意提高或降低 新興病害 受感染初期莖部及果實上會產生凹 濃度 以避免防治無效或導致農藥殘留問題 陷的紅色圓形斑點 之後病斑會逐漸擴大成潰 (4) 確實了解病蟲害發生部位 且將藥劑用於 瘍狀 雖然本病目前尚無核准藥劑可使用 但 主要發生部位 以獲得最佳防治效果 以及 (5) 經過測試 已登記核准於紅龍果炭疽病防治的 遵守安全採收期 嚴格遵守藥劑之安全採收 得克利 免得爛及賽普護汰寧等藥劑 也可有 期 已屆採收期之作物盡量選擇安全採收期較 效抑制紅龍果莖潰瘍病菌生長 此結果直接可 短或是免訂安全採收期之防治資材 以避免農 供農民參考選擇防治藥劑 同時防治炭疽病及 藥殘留 生產健康安全之產品 莖潰瘍病 蓮霧是高屏地區重要的果樹 時常 高雄場為協助農民 落實農藥之經濟安全 會遭到果腐病 (Pestalotiopsis eugniae) 炭疽 使用 除提供免費且精確的診斷鑑定與安全用 病 (Colletotrichum gloeosporioides) 及黑腐 藥的技術指導服務外 也針對重要作物有害生 病 (Lasiodiplodia theobromae) 等常見之重 物密切監測 適時透過多重管道發布警報 另 要病原菌感染 經由高雄場藥劑篩選結果顯 外 特別加強安全防治資材之研究及核准藥劑 示 賽普護汰寧與扶吉胺對於上述三種病原菌 有效性評估 篩選效果優良且可同時防治多種 均有顯著的抑制能力 番石榴也同為高屏地區 植物醫師在技術研發與推廣上扮演的角色 129

132 圖五 應用座殼菌 (Aschersonia spp.) 防治銀葉粉蝨 (Bemisia argentifolii) (A) 座殼菌之子座 (B) 銀葉粉蝨 (C) 分 生孢子腔 (D) 分生孢子 (E) 於田間施用於毛豆對銀葉粉蝨之效果 Fig. 5. Application of Aschersonia spp. for controlling white fly; the stroma (A), pycnidia (B), and conidia (C) of Aschersonia spp.; white fly (Bemisia argentifolii) (D); the effect of application of Aschersonia spp. treatment on controlling of white fly on soybean in a field (E). 重要果樹 易受瘡痂病 黑星病與炭疽病等病 用藥種類與次數 原菌危害 高雄場篩選出得克利 免得爛 賽 普護汰寧 扶吉胺 鋅錳乃浦 快得寧等藥劑 教育推廣 可以同時有效抑制上述三種病害 透過上述的 篩選工作 並多管道宣導 而有效且大幅減少 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會 近年來人口老化及外流為農村普遍之問

133 圖六 高雄場發行之刊物 Fig. 6. The publications issued by Kaohsiung District Agricultural Research and Extension Station. 題 為確保農業永續發展 政府特別重視建立 外 亦將植物保護手冊核准的用藥依各作物分 農民終身學習及培養青年農民 現行農民教育 類 整理張貼於官方網頁 除方便農友隨時參 訓練主要包括 技術講習 示範觀摩及農民學 考 亦於各講習中直接發放供農友參考使用 院等 內容著重作物健康管理技術及安全用藥 以達安全用藥教育之目標 並同時出版各種重 之相關資訊及實務 主旨在提升農民栽培技術 要作物健康管理手技術專刊 (蓮霧 木瓜 棗 與經營管理能力 (Tseng et al., 2012) 以高雄 長豇豆與番石榴) 農技報導 農業專訊及農情 場為例 於 101 年即辦理 9 班次之農民學院專 月刊等出版品 (圖六) 強調合理化施肥及健康 業課程 102 年度則增加至 13 班次 (Tseng et 管理措施 並轉為電子檔 張貼於官方網站及 al., 2012; Yang, 2013) 103 年則辦理 11 班 臉書 隨時供農民參考採行 有效達到實施及 次 其他有關作物健康管理與農業產銷班技術 良好農業作業規範 以生產安全農產品之目標 講習每年度亦超過 30 場次 超過 2,000 名農 (Yang, 2014) 除農民與一般民眾之教育訓 友實際參與 此外 於 103 年度並機動性地辦 練 高雄場植物保護研究室每年亦提供大專院 理建構農業優質安全生產體系之相關教育講 校相關科系學生實習 藉由實驗室技術的訓練 習 有效推廣健康農業之精神與相關技術 此 和田間實務的操作 為臺灣植物醫生的培育盡 植物醫師在技術研發與推廣上扮演的角色 131

134 一份心力 結論植物醫師的工作主要是植物保護, 其職責在於協助農民有效進行作物健康管理 一套完整的植物保護工作流程, 從預防性的病蟲害監測預警, 到病蟲害發生後的診斷鑑定, 乃至於防治技術開發及管理策略的教育推廣, 各階段環環相扣, 缺一不可 而農改場在臺灣的作物防疫體系中, 提供了類似地區教學醫院的平台 各農改場及農業試驗單位的植保工作人員, 除針對農友提供即時性的服務及幫助, 例如診斷鑑定乃至於防治藥劑處方開立等, 更是具有開發植物防疫相關技術能力的專業人員 這些植保人員同時具有豐富的教育訓練經驗, 可對農民及農藥販賣業者, 進行專業的有害生物整合管理知識教育推廣 而目前政府的制度, 植物防疫技術或資材開發成功後, 有些可無償提供農民應用, 有些則可技術轉移予植保業者商品化, 除可嘉惠農民及農產業外, 廠商亦可從中獲得合理利潤, 而研發技術的植物醫師亦可獲得部分技轉金, 得到實質的鼓勵 以高雄場發展液化澱粉芽孢桿菌生物製劑為例, 自基礎研究 田間試驗乃至於技術移轉及積極協助廠商商品化, 研發人員充分發揮專業技能 敏銳觀察力及田間豐富經驗, 是生物農藥研發成功的最佳範例 臺灣氣候高溫多濕, 農作物種類複雜, 且各類植物有害生物種類繁多 而在全球氣候變遷的趨勢下, 未來病蟲害相更迭的情況勢必更加頻繁 ; 另外, 國際貿易關係日益緊密, 外來入侵有害生物也將更加複雜與嚴重, 因此具有植物醫生身分的研究人員, 都將逐漸面對更多的陌生有害生物 為保護我國農業生產不受外來入侵種的危害, 如何增進植物保護工作人員 的偵測及鑑定技術, 是必須嚴肅面對的重要課題 ; 而如何有效結合國內各個試驗改良場所及學術單位分類診斷鑑定人才, 充分利用各單位之專長, 讓整個作物防疫網絡更加緊實, 也是未來要持續努力的方向 各區農改場在我國設立已相當久遠, 而各區主要作物隨社會變遷及民眾飲食習慣的改變亦有很大更動 然而, 不論在任何年代, 協助農民生產品質佳 高產量且健康安全的農產品, 一直是農改場不變的目標 農改場的業務範圍極為廣泛, 雖長年來致力於提供農友優良的服務, 但人力資源卻相當有限, 因此常有力有未逮之憾 再者, 世界農業潮流已從二十世紀中葉使用高劑量藥劑 化肥的習慣, 逐漸轉變為合理與友善環境的耕作策略, 欲得到精準有效的害物防治效果, 第一線植物醫師的診斷與處方著實不可或缺 目前國內 26 個診斷服務站每年雖可處理大量診斷服務案, 但仍遠低於全國病蟲害診斷的需求, 且受限於設置地點及人力, 植物醫生時常只能憑藉極為有限之樣本甚至照片進行鑑定工作, 難以親至田間診察 上述現況凸顯了數個重要問題 :1. 植物醫師人數不足, 無法為全國農友提供充足妥善的服務 2. 各診斷服務站過於分散, 植保人員需服務的區域過廣, 導致交通往返時間成本高昂, 極難進行許多必需的田間診斷工作 3. 各診斷服務站的植物醫師常需兼辦其他工作, 如日益繁雜的行政業務及臨時交辦任務, 大幅限制所能提供的服務能量 ; 而農友因求診管道過少或過於遙遠, 常無法及時獲得協助, 因而發生誤用或超量用藥的情形, 不僅造成經濟損失, 更影響我國的食品安全及導致環境污染 因此, 增加專職植物醫師的聘用, 乃為目前強化國內作物有害生物防治工作的要務 目前, 我國多所大專院校已設有植物醫師類科系所或學程, 每年訓練出許多具有專業技能的植 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

135 物醫師, 如能建立周延的植物醫師證照制度, 提供穩定的植物保護專職工作, 將可更有效提升我國農業品質, 減少食安問題 其具體作法, 或許可參考獸醫師的模式, 於各地方政府編制下增設 公職植物醫師 職位, 並於各鄉鎮區公所或各農會系統中配置植物醫師, 以建立綿密的地區植物醫療網, 若能達成此一目標, 將極有助於落實臺灣的健康農業政策 引用文獻 Chen CY Appraisal of performance and economic benefit of plant doctor system in Taiwan [Theses]. Taipei: National Taiwan University. 128 pp. (in Chinese) Chen JF Application of plant immunity. Hualien District Agricultural Issue 82: 2-5. (in Chinese) Chen TY The analysis on achievement of crops clinic service. Harvest 58: (in Chinese) Chen YJ, Lin YS, Chung WH Bacterial wilt of sweet potato caused by Ralstonia solanacearum in Taiwan. J Gen Plant Pathol 78: Chen YJ, Yen CF, Kuo KC The analysis on achievement of crops clinic service between 2005 and BAPHIQ quarterly 12: (in Chinese) Fulton, RW Practices and precautions in the use of cross protection for plant virus disease control. Ann Rev Phytopathol 24: Ko Y Plant pathology. Taichung: National Chung Hsing University. 550 pp. (in Chinese) Lin CY, Ann PJ, Chang CA, Lo CT, Hsieh TF The non-chemical methods for control of crop diseases. Taichung: Taiwan Agricultural Research Institute. 53 pp. (in Chinese) Sun EJ Plant medicine and tree medicine. NTU Alumni Bimonthly 88: (in Chinese) Tseng YH, Yang WJ, Chen JJ, Huang CC Farmer s professional training in farmer academy. pp In: Anonymous (ed). 101 Year book of Kaohsiung District Agricultural Research and Extension Station. Kaohsiung District Agricultural Research and Extension Station, Pingtung. (in Chinese) Yang WJ (ed) Introduction of Kaohsiung District Agricultural Research and Extension Station. Pingtung: Kaohsiung District Agricultural Research and Extension Station. 27 pp. Yang WJ The study of effectiveness on training for young farmers in Kaohsiung and Pingtung areas. p. 75. In: Anonymous (ed). 102 Year book of Kaohsiung District Agricultural Research and Extension Station. Kaohsiung District Agricultural Research and Extension Station, Pingtung. (in Chinese) Ann PJ Control of plant diseases with non-pesticide compound: phosphorous 植物醫師在技術研發與推廣上扮演的角色 133

136 acid. Plant Pathology Bulletin 10: (in Chinese) Shih HD, Huang JW, Hsieh TF The research and application of biological plant protection agents in Taiwan. pp In: Proceedings of the symposium on new techniques for control of plant diseases in safe agricultural system. (in Chinese) Kuo CC Development and application of Bacillus amyloliquefaciens to control plant disease. Special Publication of Taichung District Agricultural Research and Extension Station 121: (in Chinese) Chiu YC, Ho CJ, Wang CL Application of natural enemies in controlling pests. Sustainable Agriculture 23: (in Chinese) Hou BF. Lai JM Introduction of feeding predatory insects -- Mallada basalis and Cantheconidea furcellata. Kaohsiung District Agricultural Technology 112: (in Chinese) Tseng MN The benefits of natural enemies of whitefly - Ascehrsonia spp. Kaohsiung District Agricultural Issue 71: (in Chinese) Tseng MN Discussion of cultural conditions of Ascehrsoniaaleyrodis. P. 65. In: Anonymous (ed). 102 Year book of Kaohsiung District Agricultural Research and Extension Station. Kaohsiung District Agricultural Research and Extension Station, Pingtung. (in Chinese) Drew RAI. Raghu S The fruit fly fauna (Diptera: Tephritidae: Dacinae) of the rainforest habitat of the Western Ghats, India. Raff Bull Zool 50: Chuang YY. Hou FN Field tests and evaluation of effectiveness using the long efficiency trap for Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis. Research Bulletin of Kaohsiung District Agricultural Improvement Station16: (in Chinese) Hung SC, Ho KY, Chen CC Preliminary report on the occurrence of litchi gall midge, Litchiomyia chinensis (Diptera: Cecidomyiidae) in the Chiayi Area, Taiwan. Formosan Entomol 28: Mound LA, Palmer JM Identification, distribution and host-plants of the pest species of Scirtothrips (Thysanoptera: Thripidae). Bull Entomol Res 71: 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

137 The Roles of Plant Doctors on Technologies Development and Extension - the Cases Study of Kaohsiung District Agricultural Research and Extension Station Tze-Chung Huang *, Yi-Jeng Chen, Min-Nan Tseng, and Hau-Ping Chou Kaohsiung District Agricultural Research and Extension Station, Council of Agriculture, Executive Yuan, Pingtung County 908, Taiwan ABSTRACT Plant doctors manage the crop health in fields, including pest diagnosis and identification, the coordination of experts of different fields, and the development and extension of pest control measures. Under the supervision of the Council of Agriculture, all the seven District Agricultural Research and Extension Stations (DARESs), consisting of professional plant protection researchers playing as plant doctors, have been in charge of the management of local crop pests since their establishment mostly more than a hundred years ago. The DARESs with the mission of serving farmers in the forefront work on the research and extension of crop protection measures. The DARESs provide free crop pest diagnosis and consultation service, which helps facilitate agricultural production, improve farmers livelihoods, and assure food safety for consumers. In practice, whether a pest situation can be well-managed depends largely on the development and extension of effective control measures by the DARESs. The DARESs therefore play a crucial and irreplaceable role in crop production and conservation of natural resources; they also have a great influence on the development of plant protection technologies. For example, Kaohsiung DARESs has developed and transferred several safety crop protection technologies, such as non-pesticide control materials and bio-control agents, etc. In recent years, with higher risk of introducing foreign pests due to increasing international trade, more emphasis has been put on the DARESs task of early detection and accurate identification of invasive pests. On the other hand, the impact of climate change on the incidence and spread of major/minor crop pests also raised the alarm of insufficient professional plant protection workers in the DARESs. To cope with the growing demand for professional manpower, it is advocated that plant protection officials in the DARESs be increased. Future solutions may also include the optimum use of available human resources and the improvement of competence of researchers in the DARESs, as well as the promotion of closer cooperation with experienced researchers in the universities and research institutes. Besides, it is suggested that the Plant Doctor Certification Act be established in Taiwan so that the graduates from the department of plant medicine of different universities can officially join nationwide plant protection system to enrich the human resources of plant doctors. Key words: plant doctor, Kaohsiung District Agricultural Research and Extension Station, pest monitoring, diagnosis and identification, pest control, extension * Corresponding [email protected] 植物醫師在技術研發與推廣上扮演的角色 135

138 研究報告 2015 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會 P Symposium on Trans-Century Plant Protection and Quarantine Technologies P 中興大學植物醫學體系的建構與未來展望 * 詹富智 國立中興大學植物病理學系 植物醫學暨安全農業碩士學位學程 402 臺中市南區國光路 250 號 摘 要 病蟲草害的有效防治關係著近 40% 全球農業總產值之是否能確保, 進入新世紀以來由於人口持續飛快成長以及氣候變遷農業經營上環境劣變之多重影響, 全球性糧食短缺問題愈來愈趨嚴峻, 病蟲害管理的重要性也與日遽增 有病就醫診治自古即然, 傳統的植物醫護病蟲害防治, 咸以保護性 廣譜域作用範圍之種類為主, 用藥該有的專業一直未受到應有的重視, 以致用藥不當所衍生的農藥殘留嚴重威脅食安 生態破壞嚴重腐蝕農業根基等層出不窮的負面影響, 再再無法見容於當今社會 有鑑於植物醫護專業建立為維繫農業永續發展與捍衛食安之關鍵, 國立中興大學於 101 年開始籌畫,103 年向教育部申請設立 植物醫學暨安全農業碩士學位學程, 主要擬招收經農學院校有心投入植物醫學產業建設之學子, 培訓專業植物臨床醫護所需具備之技藝涵養 - 包括作物栽培管理 生物性與非生物性病因診斷 兼顧食安與產值的農藥藥理與處方以及病蟲害綜合管理等技術 本校素以農業全方位產業發展相關教學研究著稱, 為強化植物臨床醫護專業技能, 農資學院植物病理 昆蟲 農藝 園藝與土壤環境科學等各相關系所已就植物臨床醫護專業所需種原培育與作物栽培健康管理以及病因診斷與處方技術等課程與實務訓練內容及實施方式等, 完成跨系所整合, 本校 植物醫學暨安全農業碩士學位學程 也於 103 年 9 月獲教育部核准於 104 學度正式成立 現階段初期教育目標端在作物安全生產與整合性健康管理 病蟲草害與營養障礙臨床診斷 / 處方專業醫師及其相關法規規劃與推動 以及植物防疫檢疫業務執行等有關專業人力之培育, 整體課程理論與實務並重, 配合學程之推動, 將有 植物臨床診斷醫療中心 之設立, 一則以強化學生未來職場業務執行專業能力, 增加其於農業各相關領域服務之競爭力, 另則並提供國內農企業病蟲害管理診療服務, 彌補長久以來農業經營上一直空無植物醫師加持之缺憾 配合植物醫師法之通過及國家認證專業植物醫師證照之授與, 本學程所培育植物醫護專業人力一旦投入職場, 就內需而言, 由其帶動臺灣農業脫胎換骨顯可期待, 專業處方籤制度之建立, 必將有助於達到作物生產上品質與產量提昇 農藥殘留與生態破壞杜絕 以及食品安全與國民健康福祉確 * 論文聯繫人 Corresponding [email protected] 中興大學植物醫學體系的建構與未來展望 137

139 保之理想目標 此外透過國際合作交流, 經由國家認證的專業醫師並有機會到世界各地提供植物醫療與健康管理的專業服務, 打造全球化就業市場, 領航國際植物醫療事業之發展 關鍵詞 : 植物醫學 安全農業 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

140 Development and Prospects of Plant Medicine Program in National Chung Hsing University Fuh-Jyh Jan * Department of Plant Pathology, Master Program for Plant Medicine and Good Agricultural Practice, National Chung Hsing University, Taichung City 402, Taiwan ABSTRACT Effective control of pathogens, insects, and weeds could have a profound impact on maintaining nearly 40% of global agricultural production. A continuing increase in world population along with climate change could slowly but surely deteriorate agricultural productivity and result in global food shortage. As such, demands for the integrated pest management in plants will keep growing in the future. To protect plants from pests, a broad-spectrum pesticide is often applied. However, restrictions of pesticide use are increasing due to concerns about safety, pesticide resistance of the pests and environmental hazards. All of these concerns regarding negative perceptions of pesticides by general public should be explored for constructive changes. Safe and effective use of pesticides recommended by well-trained professionals is critical for the integrated pest management in modern agriculture. This can be achieved by better education and training of key personnel involved in agricultural production, so that agricultural sustainability and food safety can be guaranteed in the 21st century and beyond. To achieve the above-mentioned goals, NCHU laid out a blueprint of creating plant medicine program in 2012, which was later approved by the Ministry of Education to establish a Master Program for Plant Medicine and Good Agricultural Practice in Through the program, we hope to attract, educate, and enhance the sustainability of the next-generation agricultural producers. The program will train plant clinical care expertise via implementing a wide range of agricultural knowledge and skills. Those courses may include but not limited to: crop cultivation and health management, breeding, diagnosis of biotic and abiotic diseases, pesticide pharmacology and its close links to food safety, production, and marketing, general principles of the integrated pest management, regulations and operations of plant disease quarantine, etc. NCHU has strong academic departments of Plant Pathology, Entomology, Horticulture, Agronomy, and Soil and Environmental Science that are well-known for training skilled and dedicated agricultural producers. Through inter-departmental cooperation, the program will have no problems to implement all required curriculums, practical training contents and exercises to train modern agricultural producers. As of 2015, the program has the first class of 10 students who will be educated through vigorous curriculums. A plant clinical center (plant hospital) will be established in the near future to better assist students in terms of 中興大學植物醫學體系的建構與未來展望 139

141 theory and practice. Through a complete training program, students will have all-around skills and knowledge to prepare for their professionals in agriculture. Upon completion of their training, these well-equipped students will be able to enhance global competition in all areas of agricultural production in general as well as elevate the quality of the pest management in particular. Establishing plant clinical professionals, passing laws for the requirement of certification and plant physician (plant doctor) licenses along with the establishment of a professional prescription system could create ripple effects on human society. Only through this system can the qualities and yields of food production and safety be improved. We are confident that the long-term outcomes from the plant medicine program will greatly enhance Taiwan s food exportation and global economic competition, as well as the overall benefits for human health. Key words: plant medicine, good agricultural practice 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會 * Corresponding [email protected]

142 研究報告 2015 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會 P Symposium on Trans-Century Plant Protection and Quarantine Technologies P 從柑橘黃龍病談植醫的重要性與未來展望 * 洪挺軒 國立臺灣大學植物病理與微生物學系 植物醫學碩士學位學程 植物醫學研究中心 106 臺北市羅斯福路四段 1 號 摘 要 柑橘黃龍病 (citrus huanglongbing, HLB) 是臺灣也是全球最重要的柑橘病害, 由寄生在維管束靭皮部的薄壁細菌 (phloem-limited fastidious bacteria, 目前暫定學名為 Candidatus Liberibacter asiaticus) 所引起, 主要經由帶病種苗來傳播, 而在種植後又可經柑橘木蝨媒介傳播, 成為嚴重的植物傳染病 多年來普遍危害國內外各柑橘品種, 使橘株樹勢衰弱甚至致死, 嚴重影響柑橘產量與品質, 成為柑橘生產之限制因子 此病 1943 年首次於中國大陸發生, 因罹病柑橘接穗有生長黃化之現象, 而以黃龍病稱之 ;1947 年在南非也發生, 因當地罹病甜橙果實轉色不完整, 成熟後部分果皮仍呈綠色, 故以 greening 病名稱之, 此病名一直廣在世界沿用至今 1995 年第 13 屆國際柑橘病毒學家組織 (IOCV = International Organization of Citrus Virologist) 確認中國大陸首次發現此一病害, 而建議以 huanglongbing 取代原 greening 病名 原本此病僅肆虐於亞洲與非洲的柑橘產區, 然而在 2004 年南美洲的巴西開始發現黃龍病, 這是西半球黃龍病發生的第一次報導 ;2005 年黃龍病更入侵美國佛羅里達州,2008 年蔓延至墨西哥及中美洲, 造成全世界柑橘產量明顯下滑 黃龍病的防疫工作首重正確的病害診斷與病原追蹤 黃龍病潛伏期長, 病菌至今無法培養, 而在寄主體內含量少且分佈不均, 因此不易以傳統的方法進行診斷 本研究室利用分子生物學方法, 以核酸雜配法與 PCR 技術, 建立一套標準偵測方法, 為此病研究之先驅, 也協助檢疫工作多年 近年來, 為實際解決黃龍病的危害問題, 我們已將觸角伸展至媒介昆蟲的傳病特性研究, 藉以找出病害傳播的關鍵因素與重點時期, 擬訂有效的病蟲協同防治策略 最近又改良先前研發的抗生素注射技術, 應用到文旦罹病株的治療工作上, 發現治病效果相當顯著 由上述可知, 欲克服黃龍病的危害, 落實植物醫學跨領域科技的整合將是絕佳良方, 從生產健康種苗出發, 發展品種多樣性, 以良好的營養管理為基礎, 導入更多先進的病害管理方法, 避免媒介昆蟲傳播, 發展有效的藥劑防治技術, 如此必能將黃龍病的衝擊減至最低 關鍵詞 : 植醫 ( 植物醫學 ) 柑橘 黃龍病 * 論文聯繫人 Corresponding [email protected] 從柑橘黃龍病談植醫的重要性與未來展望 141

143 前言柑橘黃龍病 1943 年首次於中國大陸發生, 因罹病柑橘接穗有生長黃化之現象, 而以黃龍病稱之 ;1947 年在南非也發生, 因當地罹病甜橙果實轉色不完整, 成熟後部分果皮仍呈綠色, 故以 greening 病名稱之, 此病名一直廣在世界沿用至今 1995 年第 13 屆國際柑橘病毒學家組織 (IOCV = International Organization of Citrus Virologist) 確認中國大陸首次發現此一病害, 而建議以 huanglongbing 取代原 greening 病名 此病在臺灣自 1951 年起開始嚴重發病, 近三分之一的柑園都受危害, 病株黃萎, 傳播快速, 對柑橘產業構成極大威脅 本研究室松本巍教授開始病因之研究, 而確定此病為藉由接穗嫁接傳播之系統性擬病毒病害 (virus-like disease), 於 1961 年以立枯病 (Likubin) 之名稱發表, 爾後證實它與大陸黃龍病 南非 Greening 是相同病害 1976 年 Su 和 Chang 證實此病原對 penicillin 及四環黴素等抗生素所做的治療試驗結果推定此病原為有細胞壁之原核菌 1980 Bové 等人亦得到相似之結果, 而依據 Gibbons and Murray 對原核生物之分類法, 將此病原歸屬於 Gracilicute-like bacterium 1987 Huang and Su 利用電子顯微鏡確定了此菌的形態屬性 : 它是多型性 (pleomorphic) 的特殊細菌 (fastidious bacteria), 呈長桿狀, 大小約 350~ ~1500 nm, 外包薄壁 ( 厚約 nm), 通常行出芽生殖, 寄生於維管束之篩管細胞, 菌體可變形通過篩管而做移動 柑橘黃龍病屬於世界性的流行病, 在熱帶亞洲地區危害相當嚴重, 亞洲地區包括臺灣 中國大陸 日本琉球 菲律賓 越南 泰國 印尼 馬來西亞 印度 斯里蘭卡 沙烏地阿 拉伯等國皆已證實受害嚴重 (Hung et al., 1999b), 非洲的南非亦然 2004 年黃龍病被發現入侵南美洲的巴西, 此為西半球此病害發生的第一次報導 (Teixeira et al., 2005) 2005 年黃龍病侵入美國佛羅里達州 (APHIS news release, 2005),2008 年蔓延至墨西哥與中美洲貝里斯 目前全世界只剩歐洲地區與澳洲尚未發現黃龍病危害 1974 年 Bové et al. 依照溫度對病徵表現之影響, 將黃龍病分為兩大類型, 熱敏感型 (heat-sensitive group) 及耐熱型 (heattolerant group) 熱敏感型 ( 又稱非洲型 ) 在 22~24 時引起嚴重病徵,30 以上病徵會減輕 ; 耐熱型 ( 又稱亞洲型 ) 在低溫 (22~24 ) 高溫 (27~32 ) 均適宜繁殖為害柑樹 亞洲型黃龍病與非洲型黃龍病在發病條件 病徵表現和傳播媒介等方面均有不同, 由分子生物學資料發現二者具有差異, 並已開發出特異的檢測方法 (Hung et al., 1999a, 1999b; Subandiyah et al., 2000) 黃龍病病原菌因此可區分為兩種 :Candidatus Liberibacter asiaticus, 亞洲病菌系統屬於此種 ; 以及 Candidatus Liberibacter africanus, 南非病菌系統屬於此種 (Garnier et al., 2000) Candidatus Liberibacter africanus 另有一亞種 Candidatus L. africanus subsp. capensis, 發現於南非西岸地區的原生種植物 Calodendrum capensis Thunb. 上, 此亞種之病原菌也會感染柑橘植株 (Garnier et al., 2000) 2004 年南美洲巴西地區發生黃龍病為害, 經分子生物學資料分析發現與非洲型或亞洲型黃龍病皆有差異, 另命名為美洲型黃龍病 (Candidatus Liberibacter americanus) (Teixeira et al., 2005) 以往有關黃龍病之研究, 常因缺乏高效率的偵測技術與追蹤方法, 許多學術上的問題或 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

144 防治策略皆無法獲得定論, 因此發展良好的偵測技術一直是此病害研究之重要工作項目 黃龍病病原菌至今無法培養, 而在寄主體內因含量少且分布不均, 因此以傳統的方法, 如指示植物之生物檢定法 (Miyakawa, 1980) 及電顯觀察法皆不易偵測到病原菌且費時而又效率低 1987 年 Garnier et al. 亦製備單元抗體, 但只與印度 菲律賓一部份菌株有反應, 與臺灣 泰國及中國大陸之菌株皆不反應, 而且有反應之 ELISA 值亦很低, 只有螢光抗體之效果較佳 (Korsten et al., 1992; Gao, et al., 1993) 直至 1994 年 Hung 等利用分子生物學方法, 製備 DNA 探針, 才能正確而敏感的診斷此病害 DNA 探針配合應用點漬雜配法 (Dot hybridization) 提供了一套高敏感度且高專一性的黃龍病菌偵測法 (Hung et al., 1999a) Hung 等更利用聚合酶鏈鎖反應 (Polymerase Chain Reaction,PCR) 技術, 自選殖到的黃龍病菌特異性 DNA 片段之序列中, 找出特異性引子對, 進行 PCR 增幅反應, 大幅提高了偵測敏感度, 此技術業已發展成熟 (Hung et al., 1999b), 協助國內外的檢疫工作已行之有年, 且對臺灣柑橘健康種苗體系之建立助益甚多 然而, 為求更高偵測敏感度與專一性的分子檢測技術, 本研究室現正致力改良現行黃龍病菌之偵測方法, 導入更先進的偵測技術, 使檢測流程更加簡化 省時, 又能更精準 黃龍病防治方面, 首重生產無病健康種苗供農民種植, 而田間應執行病蟲協同防治策略, 預防田間再感染 臺灣受此病之危害已逾 60 年, 至今仍保有柑橘產業主要是農民自主管理意識強烈, 定期執行病蟲害防治, 直接或間接壓制木蝨的增殖, 並且勤於更新補植新的柑株, 維持柑橘一定的生產 未來若可落實植醫跨領域科技的整合, 導入更多先進的管理方 法, 發展品種多樣性與提升品質, 柑橘產業將有更好的前景 柑橘黃龍病基本特性之研究一 病徵雖其病徵群因柑橘品種略有差異, 此病一般病徵為葉脈及相鄰組織黃化, 隨著全葉變黃或萎黃, 有時葉脈木栓化 遂隨落葉 稍枯 細根及側根之腐朽, 樹勢衰弱而終於全株死亡 病葉變硬而向外彎曲, 未熟落葉後長出細長幼葉呈缺鋅症狀 ( 圖一 ) 罹黃龍病樹株矮化, 產生季節外多花, 多半花落而結不整形小果, 色淡略帶綠, 皮厚, 果軸硬化質劣 二 病原菌引起黃龍病之病原係不能培養的特殊細菌 (fastidious bacteria), 存於篩管在病株中成為系統性, 近年來亦暫時被命名為 Candidatus Libaeribacter asiaticus 由連續超薄切片之電顯相片顯示此菌之立體構造, 證實此菌成熟體通常為直桿狀 350~ ~1,500 nm, 由兩層外膜包圍,20~25 nm 厚 ( 圖二 ) 此菌體係多形性, 生出彎曲性長桿體, 新生菌體大小約 100~ ~2,500 nm, 當其衰老後成為球狀體, 直徑 700~800 nm 含有稀薄細胞質 此菌通常以出芽式繁殖, 罕見以雙裂法或連珠狀增殖 此病原分為兩型, 南非黃龍病分類為熱敏感型, 在 22~24 涼溫下引起嚴重病徵, 亞洲黃龍病則屬於耐熱型, 在 27~32 高溫或涼溫下均可引起病徵 亞洲型之病原菌亦演化複雜而可分為感染寬皮柑及橙類之系統 (Mandarin strain), 為害柚類及柑 橙類之柚系統 (Pummelo strain) 及無病徵弱系統 (Symptomless strain) 此病菌往往與柑橘萎縮病毒 (Citrus tristeza 從柑橘黃龍病談植醫的重要性與未來展望 143

145 圖一 柑橘黃龍病之葉部病徵 由左至右第 1 2 片為健康葉 第 3 4 葉為成熟病葉產生黃化 葉脈木栓化 病徵 右 三片為病株新生葉 萎縮細小 變硬而向外彎曲 呈萎黃缺鋅症狀 圖二 引起柑橘黃龍病的病原細菌之電顯照片 取罹病葉的葉脈經超薄切片後 置於穿透式電子顯微鏡下觀察 此菌寄 生於篩管細胞中 成熟體通常為直桿狀 350~ ~1,500 nm 由兩層外膜包圍 20~25 nm 厚 (臺大植物病 理與微生物學系蘇鴻基名譽教授提供) virus) 複 合 感 染 加 重 病 徵 (Tsai et al., 害主要的傳病途徑 另外在果園中又有亞洲木 2008) 蝨 (Diaphorina citri kuwayama) 可以永續 性方式傳播此病菌 因柑橘為多年生作物 長 三 發生生態 以染病的芽穗經嫁接來繁殖柑苗是本病 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會 期暴露於野外受帶菌木蝨傳染機會大 若無有 效預防辦法則感染率會持續增加 七里香

146 (Murraya paniculata) 係木蝨生殖最喜好的寄主, 但經研究發現它並非為此菌之中間寄主 中國大陸與美國佛羅里達州皆曾發表七里香應為黃龍病的中間寄主, 這可能與七里香不同品系有關 此病菌在柑樹中轉移慢, 而感染初期僅侷限於木蝨傳染的部分枝條中, 經年累月才逐步在樹中轉移蔓延全株 經人工接種及田間調查發現野生之木蝨寄主烏柑仔 (Severinia buxifolia Oliver) 及柬埔寨野生植物 Cochin China atalantia (Atalantia citroides) 為此病菌之中間寄主 (Feng et al., 2015), 能做為傳染源而經木蝨傳染到柑橘株 柑橘木蝨之其他兩種喜好寄主 - 木蘋果 (Limonia acidissima Linn) 及山黃皮 (Murraya euchrestifolia Hay) 經接種試驗證實並非為此病原之寄主 屬於耐熱性亞洲型之本地病菌, 在高低溫下均可發病呈現病徵 各病菌系統對國內所種所有品種品系均具感病性, 此病菌在臺灣常因與疫病菌 (Phytophthora sp) 複合感染, 造成植株迅速黃化 萎凋甚至死亡 四 診斷技術之研發黃龍病之田間診斷主要根據葉部及果實病徵來判別, 而進一步之鑑定工作則有賴精確而敏感之診斷技術 黃龍病在寄主體內含量低且分佈不均, 電顯檢驗常無法竟功 傳統的生物檢定法 (bioassay) 因病原潛伏期長, 往往費力而耗時 先前由本研究室所研發之核酸探針 (DNA probes) 法與聚合酵素連鎖反應 (PCR) 鑑定法, 可供快速而正確之病原偵測, 對此病之檢疫及無病種苗管理有莫大助益, 也可應用在流行病學研究上 黃龍病原核酸探針乃得自病原 DNA 之純化 選殖 (cloning) 選殖所得之具有病原特異性 DNA 片段經生物素或毛地黃素標誌 (labeling) 而成為一非放射性核酸探針, 並搭配點漬雜配法 (dot hybridization), 可正確而敏感偵測病原 此法已被廣泛應用於黃龍病原之鑑別與生態研究 ; 唯因此法所包括步驟較多, 自抽取病原核酸 雜配以至呈色約需時兩天 為求更快速敏感的診斷方法, 近年來已開發出 PCR 鑑定法 病原特異性 DNA 片段經定序 (sequencing) 後, 從中尋找一對引子對 (primer pair), 作為 PCR 增幅之用 此引子對 ( 命名為 226- primer pair) 證實具有病原專一性, 並對亞洲型黃龍病原, 包括臺灣 日本琉球 中國大陸 馬來西亞 越南 泰國 沙烏地阿拉伯等皆可反應 PCR 鑑定法將病原偵測時間縮短至 6 小時 : 核酸抽取需 2.5 小時 ;PCR 增幅反應需 3 小時 ; 電泳分析 (agarose gel) 需 0.5 小時 此為目前較迅速之黃龍病診斷法 此一偵測方法日前更加以修改而應用在追蹤媒介昆蟲體內帶毒情況與傳染特性研究上, 使得多項流行病學相關因子已被解明 上述各項方法幾年來已陸續發表於國際學術期刊, 提供國內外檢疫與防疫之參考 (Hung et al., 1999a, 1999b, 2004) PCR 檢測確實為目前黃龍病診斷最正確的方法, 但需仰賴實驗儀器, 無法於田間進行現場立即診斷 因應此一缺點, 本研究室研發 碘試液快速診斷套組, 可供田間病害初診 此套組乃利用柑橘黃龍病菌會造成維管束堵塞 導致澱粉粒累積在葉部組織的原理, 以碘化鉀溶液進行澱粉測試, 有澱粉累積者將形成黑色反應, 藉以間接證實黃龍病之感染 ( 圖三 ) 此檢測法經多年樣本的累積統計, 平均可達 85% 的診斷正確率, 適合做為病害初步判斷之用, 重要的樣本仍應進一步做 PCR 檢測以資確定 從柑橘黃龍病談植醫的重要性與未來展望 145

147 圖三 柑橘黃龍病碘試液快速診斷套組 以砂紙刮取葉組織置於封口袋內 加水讓組織釋出如 A 圖 加入碘液之後圖 B 左可見明顯黑色反應為病葉組織 健葉組織則呈淺黃褐色 五 防治策略 蟲媒的黃龍病至今尚無有效之農藥可防 這些天敵已經穩定立足於國內田間 無須再施 放 治 但目前臺灣可依據流行病學上所獲致之研 近年來 本研究室改良先前研發的抗生素 究結果 洞悉病害傳播的幾項關鍵因素 進而 注射技術 改變原來抗生素的配方及濃度 增 研擬一套綜合防治對策如下 (一) 建立無病 加施打點 並以分子檢測方法進行密集的病菌 柑苗之生產與繁殖體系 將頂稍微體嫁接法脫 追蹤 找出病菌躲藏死角 結果發現實驗的文 毒的優良柑橘品種 以檢疫技術驗證無病後 旦罹病株經三次施打治療後 治病效果相當顯 用於建立無病原種圃 (網室) 採穗圃及防蟲網 著 黃化情況復原到接近健康樣貌 且效果可 室欲苗圃 以供給柑農無病苗 建立健康種苗 持續一年半以上未再復發 之驗證制度 (health certificate) 來管理無病 苗生產體系 (二) 確實執行田間衛生 於無 植物醫學之發展 病種苗定植前 砍除田間病株及拔除中間寄主 烏柑子以杜絕傳染源 若能在未種柑橘之無病 人的疾病有醫師可以診療 動物生病也有 源地區全面新植無病種苗更是一良策 (三) 獸醫師可以把關 植物也是一樣的 面對週遭 媒介昆蟲木蝨之防除 因臺灣的柑橘木蝨族群 生物與環境因子的衝擊 植物也會生病 此時 消長情況與柑橘萌芽期息息相關 研究結果證 也應該要有 植物醫師 為其健康做把關 過 實三 四月春芽期是病害傳播的重點期 此時 去這樣的角色皆由農學領域植物病理學或農 恰逢木蝨族群高峰期 也是木蝨帶菌率最高的 業昆蟲學專長者來擔綱 亦即由 植物保護 時期 (圖四) 若及時施以適當殺蟲劑防治 即 專家來協助農民解決問題 長期大多處於 植 可有效防止健株再受感染而確保柑橘生產 延 物病蟲害防治 的被動諮詢 通常是疑難雜症 長樹齡 另外國內也已引進木蝨的外寄生之天 出現後才前往救援 甚至許多農民及農企業憑 敵 亮腹釉小蜂 (Tamarixia radiata) 用於 經驗自行粗略診斷 選藥及防治 加上某些販 媒介木蝨之生物防治 可在每年夏末至冬季期 售農藥者非具專業背景 無法提供精確的處方 間有效降低木蝨密度 減少使用殺蟲劑 而且 籤 使農藥濫用及殘留之情況層出不窮 在國 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

148 圖四 柑橘木蝨 (Diaphorina citri Kuwayama) 終年族群消長與帶菌率動態變化調查 (以 2004~2005 年嘉義農業試驗分 所柑橘試驗園為例) (A) 柑橘木蝨成蟲與若蟲終年族群消長動態 (嘉義農業試驗分所洪士程博士提供) (B) 柑橘 木蝨族群終年帶菌率變化 內外 目前對農產品安全之重視 更隨著 全 國家的抵制與退運 這除了造成業者與農民無 球化 與 資訊透明化 之盛行而動見觀瞻 以彌補的鉅額損失外 更可能影響就業或妨礙 例如任何一國之農產品只要被檢驗出有超量 經濟成長 故目前世界各國無不卯足全力確保 的農藥殘毒 或有流行疫病 立即會遭到其他 農林漁牧產品之優質與安全 並嚴格執行進出 從柑橘黃龍病談植醫的重要性與未來展望 147

149 口產品之檢疫與防疫, 以防境外疫病蟲害之入侵 為達成優質農產品之生產與運銷, 植物醫學 的研發與相關人才之培養極為重要 沿襲自 植物健康管理 (plant health management) 觀念, 植物醫學強調不同農學領域的知識需做進一步的整合, 從 適地適種 出發, 先做好 肥培管理 與 水分管理, 創造出一個健康的生長環境, 選擇健康的種子或種苗來種植, 接著循專業化的預測或監測技術追蹤各種病蟲害的發生, 快速診斷並採取預防性或立即性的防治措施, 以 對症下藥 且 減少用藥 為最高指導原則, 達成符合經濟效益 友善生態環境與維護食品安全的防治目標 相較於過去的 植物保護 或 植物健康管理 的概念, 植醫更強調 臨床醫學 快速診斷鑑定技術 與 處方籤 等方面的專業訓練, 並注重 農業科技產業化 的落實, 推動專業證照制度之建立 植物醫學 (plant medicine) 一詞正式而具體被提出, 應溯及 1990 年美國植物病理學年會時任主席的 Dr. George N. Agrios 宣稱他將著手於佛羅里達大學設立植醫學程 (Plant Medicine Program), 經 9 年的準備 籌畫與整合, 佛大植醫學程正式於 1999 年成立 這是一個 專業醫生學位 學程, 共計有 120 學分, 其中 30 學分為臨床實習 ( 即田間實習 internships), 學成後授予 植物醫生學位 (Doctor of Plant Medicine degree) 在其帶動下, 迄今除美國外, 臺灣 日本 韓國 中國 泰國與埃及都已有植醫相關學程之設立, 主要都與因應農企業或精緻農業之現代化需求有關, 而且明確界定其產業應用價值 臺灣目前屏東科技大學與嘉義大學設有植物醫學系, 臺灣大學與中興大學則成立植醫碩士學位學程, 整個專業教育體系在世界上居前導之位, 未來應會逐漸開花結果, 值得期待 植物醫學對柑橘黃龍病防治之重要性柑橘品種複雜, 栽培期長, 病蟲害繁多, 其中尤其以柑橘黃龍病最為棘手 黃龍病藉由種苗與媒介昆蟲來傳播, 容易氾濫成災 綜觀目前國內外對黃龍病束手無策的地區, 大多導因於缺乏病蟲害相關技術專家, 或是病害與蟲害兩方專家技術整合不完整, 因而形成防治上的缺口 例如缺乏病菌檢測技術時, 就無法掌握媒介昆蟲的帶菌 獲菌與傳菌的傳播行為 ; 而沒有媒介昆蟲的終年族群消長動態資料, 也難以界定防治的重點時期 因此, 兼具病害與蟲害專業背景的人才, 乃是黃龍病防治上最渴望的資源 另外, 柑橘的品種與營養因素也常與黃龍病的發病情況息息相關, 園藝學及土壤學的知識亦不可或缺 例如黃龍病的葉部病徵與缺乏微量元素 ( 如鋅 ) 情況類似, 容易誤判, 需進一步診斷釐清 2011 年中美洲友邦巴拿馬西部重要柑橘產區 Chiriqui 疑似遭黃龍病入侵, 擬全面砍除做緊急防治之前, 透過外交管道請求我國協助鑑定, 經實地現場診斷與 PCR 分子檢測, 證實是微量元素缺乏症 ( 圖五 ), 除了避免錯砍外, 也藉機傳授友邦改善土壤營養的方法, 這便是植醫功能的發揮 再如前所述, 柑橘黃龍病的現行防治四大策略為 : 建立無病柑苗之生產與繁殖體系 砍除田間病株及拔除中間寄主 防除媒介昆蟲木蝨與四環黴素注射治療 ( 尚未獲官方正式許可 ) 無病柑苗之繁殖生產需要園藝方法, 病株之鑑定有賴病理診斷技術, 媒介昆蟲的防治應以蟲害防治策略為本, 四環黴素注射法更需農藥學專業的評估與操作 植物醫學的內容即可結合上述各不同農學領域, 選擇田間可實際應用的部分, 構築成核心課程, 培育出跨領域的專家 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

150 圖五 巴拿馬 Chiriqui 省柑橘植株疑似遭黃龍病入侵 (2011 年) 產生葉脈間黃化病徵 經現場診斷發現葉片無硬化 葉 脈未凸起 經 PCR 分子檢測 證實是微量元素缺乏症 非黃龍病感染 巴拿馬迄今仍是黃龍病的非疫區 結 語 術也應不斷與時俱進 更高效率的檢疫方法仍 應持續研發 更嶄新的防疫技術也要逐步開 臺灣在柑橘黃龍病的研究上一直受到全 拓 此外 因黃龍病已經蔓延至美洲地區 正 世界的重視與肯定 除了研發出快速而正確的 式成為泛世界性的重大病害 日後防治柑橘黃 診斷技術之外 也已經知曉這個蟲媒流行病的 龍病的植醫技術也必須朝向國際合作及佈局 主要傳播特性 解明病菌在寄主體內的移動 海外的道路發展 擴大學術交流基礎 並且力 消長與分布情況 摸清媒介木蝨的傳播角色 行產學合作 將優良技術推廣至國際 創造更 而能防止病害的感染 蔓延與擴散 雖然當前 大的產業利益 防治效果未達至善 但至少已經扭轉 柑橘黃 龍病是柑橘不治之症 的概念 植物醫學的興 引用文獻 起恰能全面落實跨領域的農業技術整合 引導 以柑橘健康種苗制度出發 搭配整地 清園與 Bové JM, Calavin EC, Capoor SP, Cortez 田間衛生的落實 再施以經濟 省力 科學而 RE, Schwarz RE Influence of 有效的木蝨綜合防治策略 再研發有效的殺菌 temperature on symptoms of California 藥劑與技術 遠離黃龍病的危害並達成柑橘產 stubborn, South Africa greening, India 業優質化的目標將不再是夢想 而隨著生物技 citrus decline and Philippine leaf 術的日新月異 研究黃龍病的各項植醫相關技 mottling disease. pp In: 從柑橘黃龍病談植醫的重要性與未來展望 149

151 Weathers, L. G., Cohen M. (eds). Proc. 6th Conf. Int. Org. Citrus Virol., Riverside. da Graca JV Citrus greening disease. Ann Rev Phytopathol 29: Feng YC, Tsai CH, Vung S, Hung TH, Su HJ Cochin China atalantia (Atalantia citroides) as a new alternative host of the bacterium causing citrus Huanglongbing. Austral Plant Pathol 44: Garnier M, Jagoueix S, Cronje PR, Le Rous GF, Bové JM Genomic characterization of a Liberibacter present in an ornamental rutaceous tree, Calodendrum Capense, in the Western Cape province of South Africa. Proposal of Candidatus Liberibacter africanus subspl capensis. Int J Syst Evol Microbiol 50: Garnier M, Jagoueix S, Toorawa P, Grisoni M, Mallessard R, Dookun A, Saaumtally S, Autrey JC, Bové JM Both huanglongbing (greening) Liberibacter species are present in Mauritius and Réunion, pp In da Graça, J. V., Moreno, P. and Yokomi, R. K. [eds.] Proc. 13th Conference of the International Organization of Citrus Virologists (IOCV). University of California. Riverside. Garnier M, Jagoueix-Eveillard S, Cronje PR, Roux HF, Bove JM Genomic characterization of a liberibacter present in an ornamental rutaceous tree, Calodendrum capense, in the Western Cape Province of South Africa. Proposal of Candidatus Liberibacter africanus subsp. capensis. Int J Syst Evol Microbiol 50: Halbert SE, Núñez CA Distribution of the Asian citrus psyllid, Diaphorina citri Kuwayama (Phynchota: Psyllidae) in the Caribbean basin. Florida Entomol 87: Halbert SE, Manjunath KL Asian citrus psyllids (Sternorrhyncha: Psyllidae) and greening disease: A literature review and assessment of risk in Florida. Florida Entomol 87. Hocquellet A, Toorawa P, Bové JM, Garnier M Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the beta operon. Mol Cell Probes 13: Hung TH, Wu ML, Su HJ. 1999a. Detection of fastidious bacteria causing citrus greening disease by nonradioactive DNA probes. Ann. Phytopath. Soc. Japan 65: Hung TH, Wu ML, Su HJ. 1999b. Development of a rapid method for the diagnosis of citrus greening disease using the polymerase chain reaction. J. Phytopathol. 147: Hung TH, Wu ML, Su HJ Identification of alternative hosts of the fastidious bacterium causing citrus Greening disease. J Phytopathol 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

152 148: Hung TH, Wu ML, Su HJ Identification of the Chinese box orange (Severinia buxifolia) as an alternative host of the bacterium causing citrus Huanglongbing. Euro J Plant Patholo 107: Hung TH, Hung, SC, Chen, CN, Hsu MH, Su HJ Detection by PCR of Candidatus Liberibacter asiaticus, the fastidious bacterium causing citrus Hunaglongbing in vector psyllids: application to the study of vectorpathogen relationships. Plant Pathology 53: Jagoueix S, Bové JM, Garnier M The phloem-limited bacterium of Greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol 44: Jagoueix S, Bové JM, Garnier M PCR detection of the two Candidatus Liberobacter associated with Greening disease of citrus. Mol Cell Probes 10: Jagoueix S, Bové JM, Garnier M Comparison of the 16S/23S ribosomal intergenic regions of Candidatus Liberobacter asiatium and Candidatus Liberobacter africanum, the two species associated with citrus huanglongbing (greening) disease. Amer Soc Microbiol 47: Lee IM, Davis RE, DeWitt, ND Nonradioactive screening method for isolation of disease-specific probe to diagnose plant diseases caused by mycoplasmalike organisms. Applied Environm Microbiol 56: Lee IM, Davis RE, Hammond R, Kirkpatrick RB Cloned riboprobe for detection of a mycoplasmalike organism (MLO). Biochem Biophys Res Commun 155: McClean APD Greening disease of sweet orange: its transmission in propagative parts and distribution in partially diseased trees. Phytophylactica 2: Miyakawa T Experimentally induced symptoms and development of citrus likubin (greening disease). Ann Phytopathol Soc Jpn 46: Moll JN, Martin MM Electron microscope evidence that citrus psylla (Trioza erytreae) is a vector of greening disease in South Africa. Phytophylactica 5: Planet P, Jagoueix S, Bové JM, Gariner M Detection and characterization of the African citrus greening Liberobacter by amplification, cloning, and sequencing of the rplkajl-rpobc operon. Curr Microbiol 30: Sambrook J, Fritsch ET, Maniatis TI Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Subandiyah S, Iwanami T, Tsuyumu S, Ieki H Comparison of 16S rdna and 16S/23S intergenic region 從柑橘黃龍病談植醫的重要性與未來展望 151

153 sequences among citrus greening organisms in Asia. Plant Dis 85: Su HJ, Chang SC The responsed of the Likubin pathogen to antibiotics and heat therapy. Pp In: Proc. 7th Int. Org. Citrus Virol. (E. C. Calavan ed) IOCV, Univ of California, Riverside. Teixeira DC, Saillard C, Eveillard S, Danet L, Costa PI, Ayres J, Bové JM Candidatus Liberibacter americanus associated with citrus huanglongbing (greening disease) in São Paulo State, Brazil. J Syst Evol Microbiol 55: Tsai CH, Hung TH, Su HJ Strain Identification of Citrus Huanglongbing Bacteria (HLBB) by pathogenicity characterization in Taiwan. Bot Stud 49: Tsai CH, Su HJ, Liao, YC, Hung TH First report of the causal agent of Huanglongbing (Candidatus Liberibacter asiaticus) infecting kumquats in Taiwan. Plant Dis 90: Wang LY, Hung SC, Hung TH, Su, HJ Population fluctuation of Diaphorina citri Kuwayama and incidence of citrus likubin in citrus orchards in Chiayi area. Plant Prot Bull 38: 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會

154 Statement of Importance and Future Prospect of Plant Medicine Based on the Case of Citrus Huanglongbing Ting-Hsuan Hung * Department of Plant Pathology and Microbiology, Research Center for Plant Medicine, Master Program for Plant Medicine, National Taiwan University, Taipei 106, Taiwan ABSTRACT Huanglongbing (HLB) is the most important disease of citrus either in Taiwan or in the world. It is caused by the phloem-limited fastidious bacterium, tentatively name Candidatus Liberibacter asiaticus. This disease transmitted through vegetative propagation and insect vectors, Asian citrus psyllid (Diaphorina citri Kuwayama), has become a serious epidemic and main limiting factor for the citrus industry by infecting various citrus cultivars and leading decline and lethal symptoms in them. HLB (meaning yellow shooting disease in Chinese) was first found and named in the southern China in It also appeared in South Africa in 1947 when it was called greening meaning the symptom of incomplete color-turning on mature citrus fruits. The 13 th proceeding of IOCV (International Organization of Citrus Virologist) suggested Huanglongbing should be the formal and universal name for this disease instead of greening in HLB invaded Brazil in 2004, which is the first record of HLB appeared in Western Hemisphere. It also invaded the USA in 2005 and then Mexico as well as Central America in HLB brings the huge losses in citrus production on earth now. The accurate diagnosis and pathogen-monitoring were considered to be the most indispensible for the control of HLB. The pathogen inhabits citrus hosts with low concentration and uneven distribution, which usually leads a long latent period. Therefore, HLB is not easily to be diagnosed by conventional methods. The dot blot hybridization and PCR assays based on the molecular techniques were developed by us for the establishment of standard operating procedure in the HLB detection. These methods have assisted domestic and international quarantine for many years. To actually solve the HLB problem in citrus industry, the ecological studies associated with vector-transmission have been started. The targets focus on the development of efficient strategies through joint control measures for the psyllids and HLB together. Recently, the injection method with antibiotics was further improved and applied in the therapy in several HLB-infected trees of Wenten pummelo, and the results were satisfactory. The concept derived from plant medicine with multidisciplinary integration of agricultural sciences may be able to provide the better way to overcome HLB and decrease its impact in citrus industry by using different measures such as production of pathogen-free seedlings, utilization of diverse citrus cultivars, adequate nutrient treatment, advanced and efficient methods for vector control, and development of new chemicals against pathogens. Key words: plant medicine, citrus, huanglongbing * Corresponding [email protected] 從柑橘黃龍病談植醫的重要性與未來展望 153

155 跨世紀植物防疫及檢疫技術回顧及展望研討會專刊 Proceeding of Symposium on Trans-Century Plant Protection and Quarantine Technologies 主編 : 黃榮南 蕭旭峰 吳文哲 發行人 : 楊恩誠 出版者 : 台灣昆蟲學會 地址 : 台北市羅斯福路四段 113 巷 27 號台大昆蟲館 電話 : 傳真 : 電子郵件 :[email protected] 網址 : 出版年月 :2015 年 12 月初版 定 價 :300 元 ISBN 檔案格式 :PDF