Microsoft Word - 陳立偉 澳洲茶樹精油 封面大字版 浮水印 曾姊摘要.doc

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1 茶樹精油應用於痤瘡治療之 功效與安全性評估 Safety and efficacy evaluation of tea tree oil for acne 研究生 : 陳立偉 Li-Wei Chen 指導教授 : 王靜瓊博士 Ching-Chiung Wang Ph.D. 台北醫學大學生藥學研究所 碩士論文 Graduate Institute of Pharmacognosy Science Taipei Medical University Master Thesis 中華民國九十七年七月 July,

2 目錄目錄 i 附圖目錄 iv 附表目錄 v 縮寫表 vi 中文摘要 1 英文摘要 2 第一章緒論 4 第一節研究背景 4 第二節痤瘡之病因 10 第三節澳洲茶樹簡介 14 第四節澳洲茶樹精油 15 第五節研究目的 17 本實驗之流程圖 19 第二章茶樹精油之品質管制 20 第一節前言 20 第二節實驗部分 20 一 材料及設備 20 二 茶樹精油之製備 水蒸氣蒸餾 精油含量測定 21 三 茶樹精油之氣相層析質譜儀圖譜與指標成分之定量 利用 GC-MS 分析茶樹精油及其標準品 氣相層析質譜儀之條件 檢品配製 23 第三節氣相層析質譜儀指紋圖譜分析指標成分結果 25 一 澳洲茶樹各部位之精油萃取結果與產率 25 二 茶樹精油之成分分析結果 25 第四節討論 30 第三章茶樹精油之抗痤瘡療效評估 33 第一節前言 33 第二節茶樹精油作用之實證醫學探討 34 一 茶樹精油用於痤瘡治療之系統評價 文獻來源 文獻之納入標準 納入文獻之質量評值方法 35 二 茶樹精油作用之實證醫學探討結果 35 i

3 1. 茶樹精油用於痤瘡治療之系統評價結果 茶樹精油用於痤瘡治療之基礎研究文獻回顧 36 (1) 茶樹精油之抗細菌活性 36 (2) 茶樹精油之抗真菌活性 38 (3) 茶樹精油之抗病毒活性 38 (4) 茶樹精油之抗原蟲活性 38 (5) 茶樹精油之抗發炎反應 38 (6) 結論 39 第三節 實驗部份 42 一 實驗材料 試驗菌株 試藥 人工配方茶樹精油 儀器設備 42 二 實驗方法 培養液及培養基之製備 瓊脂井化擴散法 (agar well difusion method) 43 三 茶樹精油抑制金黃色葡萄球菌活性結果 茶樹精油之主成分抑制金黃色葡萄球菌活性 市售品及萃取茶樹精油抑制金黃色葡萄球菌活性 茶樹精油各主要成分比例調整後對金黃色葡萄球菌 之活性 47 四 討論 47 第四章 茶樹精油之安全性評估 49 第一節 前言 49 第二節 茶樹精油安全性之實證醫學探討 50 一 茶樹精油安全性之系統評價 文獻來源 文獻之納入標準 納入文獻之質量評值方法 50 二 茶樹精油安全性之實證醫學探討結果 茶樹精油安全性之系統評價結果 茶樹精油不良反應之文獻回顧 53 第三節 實驗部份 58 一 單一劑量皮膚毒性試驗 實驗材料 實驗動物 試藥 59 ii

4 1.3 實驗儀器 實驗方法 單一劑量皮膚毒性試驗結果 單一劑量皮膚毒性試驗正對照組 Neomycin 評估量 表之建立 Terpinen-4-ol 與 1,8-cineole 之單一劑量皮膚急性毒 性試驗結果 茶樹精油單一劑量皮膚毒性試驗結果 市售茶樹精油之單一劑量皮膚急性毒性試驗結果 63 二 塗抹茶樹精油 28 天之肝腎毒性評估 試驗材料 實驗動物 試藥 實驗儀器 實驗方法 塗抹茶樹精油 28 天之肝腎毒性評估結果 66 三 討論 70 第五章 結論 71 第六章 參考文獻 72 iii

5 附圖目錄 圖一 痤瘡致病之規則系統 10 圖二 不同類型痤瘡之治療方式 13 圖三 澳洲茶樹之外觀 (A) 樹型與 (B) 葉枝 15 圖四 水蒸氣蒸餾萃取裝置 21 圖五 茶樹精油含量測定之裝置 22 圖六 樣品 TTO-A 之 GC-MS 指紋圖譜 27 圖七 樣品 TTO-B 之 GC-MS 指紋圖譜 27 圖八 樣品 TTO-C 之 GC-MS 指紋圖譜 28 圖九 樣品 TTO-D 之 GC-MS 指紋圖譜 28 圖十 樣品 TTO-E 之 GC-MS 指紋圖譜 29 圖十一 樣品 TTO-F 之 GC-MS 指紋圖譜 29 圖十二 植物二次代謝物生合成主要途徑 31 圖十三 瓊脂井化擴散法及精油於平板培養基之抑菌圈外 觀 44 圖十四 蒸餾萃取茶樹精油及市售品之金黃色葡萄球菌抑 制 46 圖十五 1,8-Cineole (eucalyptol) 在大鼠及人體內之代謝 52 圖十六 單一劑量皮膚毒性試驗操作圖 60 圖十七 Neomycin 單一劑量皮膚毒性試驗評估 61 圖十八 長期塗抹 TTO-A 之後大鼠血清血清肝腎功能生化 數值 68 iv

6 附表目錄 表一 植物萃取物與抗痘相關之科學論文 6 表二 常用於抗痘化粧品之植物萃取物的毒性研究及其 使用濃度或劑量 8 表三 茶樹精油之組成 16 表四 茶樹精油成分之性質 17 表五 十二種購得茶樹精油成分標準品之名稱及其 GC-MS 滯留時間 24 表六 市售五種茶樹精油之品牌及樣品代號 24 表七 蒸餾萃取與市售之茶樹精油成分含量分析 26 表八 茶樹精油及組成之 Rideal-Walker coefficient 34 表九 Jadad Score Calculation 35 表十 茶樹精油用於痤瘡治療之文獻摘要及 Jadad 評分 36 表十一 茶樹精油之抗細菌活性 40 表十二 茶樹精油之抗真菌活性 41 表十三 蒸餾萃取及人工配方茶樹精油之組成 43 表十四 茶樹精油主成分之金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑比 及 MIC MBC 45 表十五 茶樹精油與人工配方精油 DF1, DF2 之抑菌圈直徑 比 46 表十六 茶樹精油之不良反應相關文獻回顧 51 表十七 精油植物主成分及潛在之接觸性過敏原 54 表十八 茶樹精油成分造成之毒性 56 表十九 皮膚紅腫評分表 (Draize-FHSA scoring System) 58 表二十 Neomycin 單一劑量皮膚刺激試驗紅腫比較 61 表二十一 Neomycin 紅腫程度評分比較表 62 表二十二 Terpinen-4-ol 與 1,8-cineole 之單一劑量皮膚急性毒 性試驗 62 表二十三 茶樹精油單一劑量皮膚刺激試驗紅腫比較 64 表二十四 茶樹精油之皮膚毒性利用 Draize-FHSA scoring System 分析 64 表二十五 市售品茶樹精油之單一劑量皮膚急性毒性試驗評 分表 64 表二十六 雌性 Wistar 大鼠血中肝腎功能之生化檢驗參考值 67 v

7 縮寫表 1. ACD Allergic contact dermatitis 2. BUN Blood urea nitrogen 3. CFU Colony-forming unit 4. COX Cyclooxygenase 5. CRE Creatinine 6. GC-MS Gas chromatography-mass spectrometry 7. GM-CSF Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor 8. GOT Glutamic Oxaloacetic Transaminase 9. GPT Glutamic Pyruvic Transaminase 10. IL Interleukin 11. ISO International Standards Organisation 12. LPS Lipopolysaccharide 13. MBC Minimum Bactericidal Concentration 14. MIC Minimum inhibitory concentration 15. PDII Primary Dermal Irritation Index 16. PGE2 Prostaglandin E2 17. ROS Reactive oxygen species 18. RW Rideal-Walker coefficient coefficient 19. TSA Tryptic soy agar 20. TSB Tryptic soy broth 21. TNF Tumor necrosis factor 22. TTO Tea tree oil (volatile oil of Melaleuca alternifolia) 23. TTO-A 萃自葉及嫩枝 (foliage & branchlet) 之茶樹精油 24. TTO-B 台中化工行之茶樹精油 25. TTO-C 西班牙 A 品牌之茶樹精油 26. TTO-D 台北化工行 1 之茶樹精油 27. TTO-E 台北化工行 2 之茶樹精油 28. TTO-F 網路商店之茶樹精油 vi

8 中文摘要精油普遍用於化妝品及保養品, 其中又以茶樹精油為廣泛用於 芳香療法的精油之一 其源自於澳洲茶樹具有抑制微生物 消炎作 用, 但是在高濃度時會引起皮膚刺激作用, 因此本研究將探討茶樹 精油的安全 有效劑量及主要成分中導致皮膚刺激反應之相關性 以實證醫學方式搜尋茶樹精油之臨床試驗文獻不多, 且 Jadad 評值偏 低, 因此將進行後續基礎實驗 首先取蒸餾萃取茶樹精油 ( 天然精油 ), 及市售品以氣相層析質 譜儀檢測其主要成分, 其品質均符合 ISO 4730 之成分規範 繼而進 行抑制金黃色葡萄球菌活性及皮膚局部使用之安全性探討 12 個標 準品 天然精油及市售品檢測抑制金黃色葡萄球菌活性, 結果顯 示 : 以 terpinolene (MIC 6.25%, MBC 100%) α-terpinene (MIC 6.25%, MBC 25%) 及 α-terpineol (MIC 10%, MBC 40%) 之抗菌效果最佳 再 以主要抗菌之成分調配人工配方精油, 抗菌作用提高, 且較天然精 油強, 但仍不及某廠商市售品之效果 皮膚接觸毒性檢測, 是利用 neomycin 建立皮膚刺激反應標準 天然茶樹精油及主要毒性成分 1,8-cineole 與活性成分 terpinen-4-ol 檢 測結果顯示 : 天然茶樹精油 2% 以上即產生顯著之皮膚刺激毒性, 而 1,8-cineole 及 terpinen-4-ol 則無顯著毒性 另外, 連續 28 天塗抹 2% 茶 樹精油於 Wistar 大鼠皮膚, 觀察血清中 GOT GPT BUN 及 creatinine 之變化, 相對於溶媒組, 亦無顯著影響肝腎功能 綜合實證醫學及基礎研究對於茶樹精油應用於痤瘡治療之功效 與安全性之探討結果 : 茶樹精油確實能有效抑制金黃色葡萄球菌, 並有抗發炎之機轉, 而達成治療痤瘡之效果 ; 且若低濃度塗抹局部 皮膚使用而非口服, 亦不會對身體造成毒性 關鍵字 : 澳洲茶樹精油 皮膚刺激 痤瘡 實證醫學 金黃色葡萄球菌 1

9 Abstract Tea tree oil (TTO) is one of the essential oils that are popularly used in cosmetics and mending agents. TTO, the essential oil of Melaleuca alternifolia, is used in aromatherapy and has been investigated as antimicrobial and anti-inflammatory agents. However, TTOs can cause skin irritation at high concentrations. In this study, we first explored the safety and efficient dosage of TTO and the mechanism of TTO-induced skin irritation. Previous limited studies of TTO related randomized and double blind clinical trials all showed low Jadad scores. Therefore, we executed following animal experimental researches in order to delineate the above questions. TTO were extracted by hydrodistillation and five brands of commercial TTOs were purchased from Taiwan retail market. All compositions fit with International Standard 4730 guideline for TTO. We determined anti-staphylococcal activity and safety evaluation for skin irritations of TTOs in rats. The antibacterial effects of 12 kinds of self extracted and commercial TTO s components were measured by agar well diffusion method. Terpinolene (MIC 6.25%, MBC 100%), α-terpinene (MIC 6.25%, MBC 25%), and α-terpineol (MIC 10%, MBC 40%) were the major components in TTOs and exhibited most potent antibacterial activity. According to the above results, we designed a TTO formula from these anti-bactieral compounds. TTO formula was more effective an-bacterial acitivity than extracted TTO but less effective than commercial one. Allergic contact dermatitis model was established by neomycin irritations. The extracted TTO showed significant skin irritation at more than 2%/site, while 1,8-cineole and terpinen-4-ol showed no significant dermal toxicity. Continued smear of 2%/site TTO on Wistar rats skin for 2

10 28 days showed no significant alteration of serum GOT, GPT, BUN and creatinine level in rats in. The above result suggested 2%/site of TTO smear on skin for 28 days did not cause damage in the liver and kidney function.. According to the evidence-based literature review about the efficacy and safety of TTO for acne treatment and our experimental research, TTOs showed antibacterial activity against Staphylococcus aureus. Topical used with low dose of TTOs rather than oral administration will not cause kidney or liver toxicity. Key words :Melaleuca alternifolia, tea tree oil, skin irritation, acne, evidence-based medicine, Staphylococcus aureus 3

11 第一章緒論 第一節研究背景痤瘡又名青春痘, 中醫古籍所稱肺風粉刺 ( 其他痤瘡 ) 面皰 ( 痘瘡狀痤瘡 ) 粉刺 嗣面 ( 其他痤瘡 ) 酒刺等 其好發於皮脂分泌旺盛之部位, 如臉部 頭皮 前胸 後背 頸項等, 自古以來一直困擾著諸多荳蔻年華的少男少女, 也是國人皮膚最常見的疾患之一 痤瘡因多發於面部, 不僅會影響外貌美觀, 更會讓患者產生尷尬 焦慮及羞愧之心, 造成嚴重之社交障礙及就業困擾 依據 Collier 等人針對 1013 個 20 歲以上成年人所作的研究顯示, 隨著年齡上升其盛行率逐年下降, 而年紀較長之女性則較同年齡男性有較高之痤瘡發生率 男性與女性發生率分別為 歲 42.5, 50.9 %;30-39 歲 20.1, 35.2 %; 歲 12.0, 26.3 %;50 歲以上 7.3, 15.3 % 1 痤瘡的流行病學研究在台灣尚不多見, 蔡旻情於 2006 年指出高雄縣 4076 名及澎湖馬公市 3274 名國小學童, 發炎性青春痘及粉刺之盛行率分別為 12.6 %, 5.0 % 及 6.9 %, 10.4 %, 而該次研究調查最早出現粉刺的年齡為六歲 Warner 依照痤瘡不同的分級給予不同的治療方式, 例如第一型的痤瘡主要為粉刺經常伴隨有小部分發炎的丘疹 (papules) 或膿疱 (pustules), 但未有疤痕存在時, 則可選擇外用 retinoid, benzoyl peroxide, azelaic acid 或 salicylic acid 等 3 痤瘡之治療通常除了抗生素與抗發炎用藥, 也有許多中草藥 民間或經驗療法 雖然解決面皰的問題, 應該由多個面向著手, 例如針對其抗發炎 抗菌 抑制皮脂分泌與角質軟化等 國內現狀有許多含藥化妝品 含中草藥宣稱有治療痤瘡效果之藥妝用品 清潔用品等, 但療效與不良反應是否有確切實證基礎, 以往並未有人討論 此外, 我們實驗室執行衛生署藥物食品檢驗局 植物萃取物 ( 含中藥成分 ) 化粧品安全性評估與檢驗方法之研究 2 4

12 (DOH96-FD-1004) 計畫時, 調查市售品最常使用於抗痘化粧產品相關之植物萃取物前 20 名, 結果如表一所示, 繼而利用美國國家生物技術資訊中心 4 Elsevier Science Direct On Site (SDOS) Database Ovid Medline Database PubMed 等資料庫搜尋 年間相關科學期刊論文, 結果發現植物萃取物用於進行抗痘研究之論文極多 因此我們針對市售品中最常添加的植物, 進行其抗痘活性論文的蒐集與評估, 其論文摘要整理如表一 利用此文獻整理, 分析常添加於抗痘產品的植物萃取物, 是否有其功能與必要性 其毒性相關論文摘要整理如表二, 藉以進行常用植物萃取物的風險評估 文獻結果顯示 : 茶樹精油具廣泛適用性及頗多的不良反應報告, 因此本論文將針對其抗痘活性及毒性進行系統之評估 5

13 表一 植物萃取物與抗痘相關之科學論文 排名 植物 中文名 實驗方式 Anti-inflammation Antimicrobial sebum or sebaceous keratolytic 參考文獻 No.1 Hamamelis virginiana 金縷梅 IA, IB AB, AE NA K [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ] No.2 Aloe barbadensis 蘆薈 IE, IF AA NA NA [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] Chamomilla recutita 洋甘菊 IC AB, AE NA NA [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] No.4 Camellia sinensis 綠茶 IB, IC, IE, IJ AA, AB, AE NA K [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ] No.5 Lavandula angustifolia 薰衣草 IB,IG, IH AB, AG, NA NA [ 22 ] [ 23 ] [ 24 ] [ 25 ] [ 26 ] [ 27 ] [ 28 ] [ 29 ] No.6 Rosmarinus officinalis 迷迭香 IB,IE AB, AE, AF NA NA [ 30 ] [ 31 ] 32 ] [ 33 ] Melaleuca alternifolia 茶樹 IC, IE, IF, IM, IP AA, AB, AD, [ 27 ] [ 33 ] [ 34 ] [ 35 ] [ 36 ] [ 37 ] NA NA AE, AF, AG [ 38 ] [ 39 ] [ 40 ] [ 41 ] No.8 Glycyrrhiza glabra 甘草 IC, IE, IF, IO AA, AB,AE NA NA [ 42 ] [ 43 ] [ 44 ] [ 45 ] [ 46 ] [ 47 ] No.9 Cucumis sativus 黃瓜 NA NA NA NA Citrus medica limonum 檸檬 IB AB NA NA [ 31 ] [ 48 ] No.11 Salvia officinalis 鼠尾草 IC, IH, IO AB, AE NA NA [ 49 ] [ 50 ] [ 51 ] [ 52 ] [ 53 ] [ 54 ] [ 55 ] [ 56 ] Morus bombycis 桑白皮 IB, ID, IJ AB NA NA [ 57 ] [ 58 ] [ 59 ] [ 60 ] No.13 Salix alba 白柳皮 IC, II AB NA NA [ 15 ] [ 61 ] Vitis vinifera 葡萄 IB, IC, ID, IE, IH, IJ NA NA NA [ 21 ] [ 62 ] [ 63 ] Cinnamomum zeylanicum 錫蘭肉桂 IC, ID, IJ AB, AE, AG NA NA [ 60 ] [ 64 ] [ 65 ] [ 66 ] [ 67 ] [ 68 ] No.16 Aesculus hippocastanum 馬栗 IB, IC, IH NA NA NA [ 69 ] [ 70 ] Mentha piperita 歐薄荷 IK, IL, IM AB, AE, AF, NA NA [ 33 ] [ 68 ] [ 71 ] [ 72 ] [ 73 ] [ 74 ] AG [ 75 ] [ 76 ] 6

14 表一 植物萃取物與抗痘相關之科學論文 ( 續 ) 實驗方式排名植物中文名參考文獻 Anti-inflammation Antimicrobial sebum or sebaceous keratolytic AA, AB, AE, [ 77 ] [ 78 ] [ 79 ] [ 80 ] [ 81 ] [ 82 ] No.16 Eucalyptus globulus 藍膠桉葉 IB, ID, IJ, IM NA NA AF [ 83 ] [ 84 ] [ 85 ] Calendula officinalis 金盞花 IM, IN AB, AE, AF NA NA [ 7 ] [ 86 ] [ 87 ] [ 88 ] [ 89 ] [ 90 ] No.20 Portulaca oleracea 馬齒莧 NA NA NA NA Cedrus atlanlica 銀雪松樹 IB AE NA NA [ 91 ] [ 92 ] Citrus aurantium dulcis 酸橙 ( 枳實 ) IB, IC, ID, IE, IJ, IN AB, AE NA NA [ 93 ] [ 94 ] [ 95 ] [ 96 ] [ 97 ] [ 98 ] [ 99 ] [ 100 ] 註 :Anti-inflammation: IA: UV erythema test, IB: carrageenan rat paw oedema, IC: Cyclooxygenase-2 (COX-2), ID: NO, IE: prostaglandin (PGE), IF: TNF-α, IG: Free radical scavenging activity, IH: Croton oil-induced ear edema in mice, II: air pouch model in rats, IJ: NOS, IK: Xylene-induced ear oedema, IL: cotton-pellet granuloma, IM: Reactive oxygen species (ROS), IN: 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-induced inflammation in mice, IO: 5-lipoxygenase (5-LO), IP: Histamine diphosphate Antimicrobial: AA: Propionibacterium acnes; AB: Staphylococcus aureus; AC: Propionibacterium granulosum; AD: Malassezia furfur, AE: Others, AF: Staphylococcus epidermidis, AG: Candida albicans Keratolytic: K NA: Not available 7

15 表二 常用於抗痘化粧品之植物萃取物的毒性研究及其使用濃度或劑量 排名 植物 中文名 潛在毒性 植物萃取物濃度或使用劑量 參考文獻 No.1 Hamamelis virginiana 金縷梅 NA NA No.2 Aloe barbadensis 蘆薈 1. 產生自由基, 降低 human skin fibroblast cells 存活率 10% Aloe vera [ 101 ] Chamomilla recutita 洋甘菊 1. 過敏性結膜炎 [ 102 ][ 103 ][ 104 ND 2. 接觸性蕁麻疹 ] No.4 Camellia sinensis 綠茶 1. 肝毒性 2. 產生自由基 750mg/day [ 105 ][ 106 ] No.5 Lavandula angustifolia 薰衣草 1. 光過敏性 ND 2. 水萃物之動物 ( 老鼠 ) 試驗有神經毒性 10mg/ml [ 29 ][ 107 ] No.6 Rosmarinus officinalis 迷迭香 1. 成分 1,8-cineole 注射誘發小鼠足腫發炎 20μl 1,8-cineole 2. 接觸及揮發毒性 ( 鞘翅目黯金針蟲之幼蟲 ) LC 50 = 15.9μg/cm 3 [ 108 ] [ 109 ] [ 110 ] 3. 導致癲癇 ND Melaleuca alternifolia 茶樹 1. 接觸過敏及刺激反應 2. 全身性反應 ( 憂鬱 虛弱 運動失調 肌肉震顫 ) 3. 耳毒性 5-100% 4. 細胞毒性 5. 運動失調 嗜睡 No.8 Glycyrrhiza glabra 甘草 1. Licorice-induced pseudoaldosteronism Glycyrrhizin 2. 影響 human cytochrome P450 3A4 酵素活性 mg/day No.9 Cucumis sativus 黃瓜 NA NA Citrus medica limonum 檸檬 1. 影響 digoxin 之傳送 5-50% 2. 刺激性皮膚炎 ND No.11 Salvia officinalis 鼠尾草 1. 增加四氯化碳的毒性 2. 導致癲癇 Morus bombycis 桑白皮 1. Drug interaction. Morin 與 cyclosporin(csa) 併用, 小鼠試驗 中會降低 CsA 濃度 3.5mg/ml ND [ 36 ] [ 111 ] [ 112 ] [ 113 ] [ 114 ] [ 115 ] [ 116 ] [ 117 ] [ 110 ] [ 118 ] 200 mg/kg morin [ 119 ] 8

16 表二 常用於抗痘化粧品之植物萃取物的毒性研究及其使用濃度或劑量 ( 續 ) 排名 植物 中文名 潛在毒性 植物萃取物濃度或使用劑量 參考文獻 No.13 Salix alba 白柳皮 1. 含 Salicylate 與 acetaminophen 併用會增加肝 腎毒性 2. 抗血小板活性 ND [ 120 ] Vitis vinifera 葡萄 1. 過敏性反應 GSPE 100 or 高劑量葡萄籽前花青素萃取物 Grape seed proanthocyanidin extract (GSPE) 會引起心肌細胞凋亡傷害 μg/ml 1 grape [ 121 ] [ 122 ] Cinnamomum zeylanicum 錫蘭肉桂 1. 過敏性反應, 口腔多型性紅斑 ND [ 123 ] [ 124 ] 2. 舌頭鱗狀細胞癌 0.5-3g/kg [ 125 ] 3. 小鼠血紅素下降 100mg/kg/day No.16 Aesculus hippocastanum 馬栗 1. 含 coumarin 增加出血危險 [ 120 ] Mentha piperita 歐薄荷 1. 靜脈注射歐薄荷油導致猛爆性肺水腫 2. 大鼠體內 FSH, LH 濃度增加,testosterone 濃度降低 3. 增加其它併用藥物之皮膚穿透力 4. 口服輕微短暫的皮膚紅疹 (skin rash) 5. 大鼠高劑量口服有腎毒性 Eucalyptus globulus 藍膠桉葉 1. 成分 1,8-cineole 注射誘發小鼠足腫發炎 2. 言語不清, 運動失調, 肌肉無力 3. 導致癲癇 Calendula officinalis 金盞花 NA NA No.20 Portulaca oleracea 馬齒莧 1. 大鼠服用水萃物後, 產生骨骼肌鬆弛作用 2. 高鉀離子濃度產生肌肉鬆弛作用 Cedrus atlanlica 銀雪松樹 NA NA Citrus aurantium dulcis 酸橙 ( 枳實 ) 1. 過敏反應 2. 急性側壁心肌梗塞 [ 126 ] [ 127 ] [ 128 ] [ 129 ] [ 130 ] [ 108 ] [ 110 ] [ 131 ] [ 132 ] [ 133 ] [ 134 ] [ 135 ] [ 136 ] [ 137 ] [ 138 ] [ 139 ] 9

17 第二節痤瘡的病因青春痘的發生原因在毛囊皮脂腺, 因推論發生原因之不同, 而有大異其趣的治療法則 ; 雄性激素之刺激會影響毛囊皮脂之結構, 加上遺傳或外在因素都可能造成毛囊角質細胞之過度角質化, 或皮脂細胞的皮脂過度增生分泌等 ( 圖一 ) 140, 最後造成毛囊平衡狀態之改變, 或表皮正常菌叢之增生等 圖一 痤瘡致病之規則系統 140 痤瘡有許多種的病因分類, 但大致上可分為下列四種造成之因素 : ( 一 ) 毛囊的角化異常 (Retention hyperkeratosis): 毛囊皮脂腺早期的改變是毛囊開口的過度角質化, 此與毛囊口細胞增生及角質細胞層脫屑作用降低兩者皆有關 結果皮脂及角質蛋白在毛囊通道形成了過度角質化的栓子 ( 微面皰 ), 其發生原因不明 ( 二 ) 皮脂分泌旺盛 (Increased sebum production): 身體各區域的皮脂腺分布密度及分泌活性並不相同, 若皮脂腺 10

18 處於極度活化的狀態, 將造成大量皮脂的分泌 而皮脂中的某些成分如鯊烯 (Squalene) 本身就具有導致粉刺的特性 皮脂腺變大伴隨腎上腺雄性素增加及皮脂產生增加, 而皮脂提供了皮膚厭氧性類白喉桿菌屬正常菌叢 痤瘡桿菌生長所需之介質 細微粉刺提供了厭氧且富脂質之環境而造成這些細菌旺盛生長, 它們利用三酸甘油酯將其水解後產生游離脂肪酸及甘油, 當作營養的來源 ( 三 ) 毛囊內細菌增生 (Propionibacterium acnes within the follicle): 痤瘡患者毛囊內的致病菌主要是痤瘡桿菌 (Propionibacterium acnes), 它又名初油酸桿菌是一種厭氣性細菌, 此外痤瘡也可能與其他種類的細菌或黴菌有關, 如金黃色葡萄球菌 表皮葡萄球菌及皮屑芽孢菌等 痤瘡桿菌平時即存在於人體毛囊中, 即使不長痤瘡的人也有痤瘡桿菌, 它是與肌膚共存的常在菌落 正常情況下, 並不會危害人體 但是當皮脂阻塞堆積於毛囊中, 使它過度繁殖並釋放出某些物質時, 就會產生青春痘 一些研究報告指出, 年輕的痤瘡患者每平方公分的皮膚含有數十萬隻的痤瘡桿菌, 遠遠高於正常的皮膚 痤瘡桿菌過度繁殖後, 可直接導致毛囊的發炎, 更重要的是, 此菌會釋放出多種發炎物質, 其中的脂化酵素會分解原先已存在於毛囊中的皮脂成為游離脂肪酸 這些游離脂肪酸對我們的皮膚有極強的刺激性, 會使毛囊及毛囊周邊皮膚紅腫發炎, 形成臨床上膿皰性或囊腫性痤瘡 ( 四 ) 發炎反應 (Inflammation): 由於阻塞的角質層與過度分泌之油脂, 加上細菌的孳生, 很容易在皮膚上引起發炎反應, 過多的發炎物質會造成皮膚的進一步刺激與傷害 11

19 痤瘡桿菌增生的發炎結果, 組織釋出趨化因子吸引嗜中性白血球, 藉由三酸甘油酯水解產生之游離脂肪酸, 及毛囊上皮細胞破裂後之嗜中性白血球溶酶體酵素釋出, 兩者皆會引發刺激反應 促發炎脂質及角質蛋白然後擠壓到周圍的真皮, 導致丘疹及結節形成 局部治療是痤瘡標準的治療方式, 通常使用維生素 A 酸衍生物 (retinoids) benzoyl peroxide 及抗生素等 erythromycin 與 clindamycin 等局部使用之抗生素雖然對治療痤瘡有效, 但單獨使用此類藥物可 能與細菌抗藥性之產生有關 141 Warner 等認為痤瘡治療大致上分為 四型, 依照不同之嚴重度選擇方式如圖二 3 12

20 Treatment of type 1 acne Treatment of type 2 acne Treatment of type 3 acne Treatment of type 4 acne 圖二 不同類型痤瘡之治療方式 3 13

21 第三節澳洲茶樹簡介 茶樹基原 域界門綱目科屬種 真核域 (Eukarya) 植物界 (Plantae) 被子植物門 (Magnoliophyta) 雙子葉植物綱 (Magnoliopsida) 桃金娘目 (Myrtales) 桃金娘科 (Myrtaceae) 千層樹屬 (Melaleuca) Melaleuca alternifolia 澳洲茶樹 (Tea tree, 舊稱 Ti tree) 是被子植物門, 雙子葉植物綱, 桃金孃目, 桃金孃科 (Myrtaceae), 千層樹屬 (Melaleuca), 又名白千層屬植物, 故澳洲茶樹又名互葉白千層 (Melaleuca alternifolia) 全世界同屬植物約有 236 種, 屬於澳洲原生種有 230 種, 其餘產於馬來西亞 印度尼西亞 新幾內亞 所羅門群島及位於大洋洲西南方的新喀里多尼亞, 台灣並無同屬原生植物 茶樹植物原產於澳洲新南 威爾斯省的北部及昆士蘭的南部, 但西澳等各省亦有栽培 142 澳洲茶樹為常綠喬木, 全株高約 6 至 7 公尺, 樹幹外皮色灰白形似台灣常見的行道樹白千層 ; 葉片呈披針狀 平滑革質全緣, 沿著嫩枝互生, 葉基及葉尖均呈銳形, 具平行葉脈 3 至 7 條, 葉長約 2 至 5 公分 ; 花色米白為叢生之圓柱形穗狀花序, 頂生於枝梢, 外觀驟視之狀如瓶 143, 刷 ; 其果為木質蒴果緊附於枝端 144 澳洲茶樹與國人用於泡茶之台灣山茶 (Camellia sinensis L. Kuntze) 園藝觀賞俗稱山茶花之日本山茶 (Camellia japonica L.) 或製作苦茶油之油茶 (Camellia oleifera Abel) 不同 14

22 (A) (B) 圖三 澳洲茶樹之外觀 (A) 樹型與 (B) 葉枝, 拍攝於行政院農業委員會種苗改良繁殖場 ( 台中縣新社 ) 第四節澳洲茶樹精油 茶樹精油是一種主要從澳洲原產植物茶樹 (Melaleuca alternifolia) 經蒸氣蒸餾取得的揮發性精油, 其廣泛使用於歐洲 北美洲, 但僅有少量精油為澳洲以外所生產 茶樹精油主要是以 4- 松油醇 (terpinen-4-ol) 和 1,8- 桉葉油素 (1,8-cineole) 的濃度規定控制其品質 Terpinen-4-ol 是茶樹精油主要的活性成分, 具有紫丁香之花香味, 且香氣柔和, 其含量不應低於 30%;1,8-cineole 則有清涼的草藥氣味, 往往會使茶樹精油帶有一定的刺激性氣味, 而影響油的香氣, 且多數 145, 研究者認為它對人體皮膚產生刺激性 146, 所以其在茶樹精油內之 15

23 含量應越低越好 國際標準化組織於 1996 年制定了最新的茶樹油國 際標準, 即 ISO , 規定了茶樹油中 14 種化合物的濃度, 如 表三 36, 147 表三 : 茶樹精油之組成 Components Composition (%) ISO 4730 range a Terpinen-4-ol 30 b γ-terpinene α-terpinene ,8-Cineole 15 c Terpinolene ρ-cymene α-pinene 1-6 α-terpineol Aromadendrene Trace-7 δ-cadinene Trace-8 Limonene Sabinene Trace-3.5 Globulol Trace-3 Viridiflorol Trace-1.5 a ISO 4730, International Organisation for Standardisation standard no b No upper limit is set, although 48% has been proposed. c No lower limit is set. 茶樹精油之主成分為萜類碳氫化合物, 含有單萜類 倍半萜及其 相關的醇化物 萜類是一種揮發性 芳香族的碳氫化合物, 亦可被視 為 isoprene ( 化學式為 C 5 H 8 ) 之聚合物 早期的研究報告指出茶樹精油 的組成包括 和 種成分 1989 年 Brophy 及同仁們 在一篇創新的文章中以氣相層析儀及氣相層析質譜儀檢驗了 800 種 茶樹精油的樣品, 報告指出約有 100 種成分及其濃度範圍 151 依照 ISO 4730 的規範, 茶樹精油相對密度介於 之間, 且僅微溶於水, 可混溶於非極性溶媒 茶樹精油成分的物理及化學 性質如表四 16

24 表四 茶樹精油成分之性質 Composition Type of compound Chemical Solubility formula (ppm) a Log K ow b Terpinen-4-ol Monocyclic terpene alcohol C 10 H 18 O 1, γ-terpinene Monocyclic terpene C 10 H α-terpinene Monocyclic terpene C 10 H ,8-Cineole Monocyclic terpene alcohol C 10 H 18 O α-terpinolene Monocyclic terpene C 10 H ρ-cymene Monocyclic terpene C 10 H (+)-α-pinene Dicyclic terpene C 10 H α-terpineol Monocyclic terpene alcohol C 10 H 18 O 1, Aromadendrene Sesquiterpene C 15 H 24 δ-cadinene Sesquiterpene C 15 H 24 (+)-Limonene Monocyclic terpene C 10 H Sabinene Dicyclic monoterpene C 10 H 16 Globulol Sesquiterpene alcohol C 15 H 26 O a Reference from Flav. Fragr. J. 14: b Kow octanol-water partition coefficient, reference from J. Chromatogr. A 864: 茶樹精油於現今市面上作為天然局部抗微生物及抗發炎製劑, 其使用濃度介於 0.5 % 到 100 % 之間 隨著使用濃度的增加就更會有茶樹精油相關的皮膚反應, 包括過敏性接觸皮膚炎, 但直到最近關 於茶樹精油造成過敏性接觸皮膚炎之報導個案仍少於 50 件 152 亦有 多位學者研究其精油製成含漱劑用於牙齒及口腔衛生 ; 其他外用劑型 可用於燒燙傷 刀傷 擦傷 被昆蟲叮咬與治療頭皮屑等 153 茶樹 精油亦曾進行包括痤瘡 足癬及陰道炎之體內臨床試驗 第五節研究目的根據上述文獻之回顧, 發現茶樹精油在痤瘡治療經驗上毀譽參半, 因此我們利用實證醫學文獻評值方式, 以確立療效及不良反應之效度 實證醫學之文獻評估方法講求以現有能取得之最佳證據, 經過嚴格評讀後, 運用於最適當之病患照護 有許多研究因為有意或無心的設計不佳, 如隨機分派之方式錯誤, 或根本未有隨機分派之機制, 17

25 有些則是雙盲設計付之闕如 如果實驗設計不當, 則再完美的數據呈現也不值一哂 ; 反之若經過良好隨機分配 雙盲設計的臨床試驗, 且有退出試驗之詳細規則及記錄, 則能夠除去人為操作之斧鑿痕跡, 而能真正呈現公正客觀的研究成果 鑒於替代療法之研究成果變異性頗大, 一些未有顯著療效之文獻常常未能付梓, 所以 Jadad 等學者於 1996 年發表了評估隨機臨床試驗品質之文章, 文中描述了依照隨機 雙盲 退出研究之內容, 若全部符合則品質最高為 5 分, 反之則最低為 0 分, 一般認為得分在 2 分 ( 含 ) 以下, 其研究品質就有待商榷了 Jadad 評分法及評估項目如表九 本研究即是利用 Medline, EMBASE, Cochrane 及 PubMed 等資料庫, 以茶樹精油及痤瘡為關鍵字, 經電腦搜尋相關對照試驗與個案報告文獻, 再以 Jadad score 作為研究品質評定之工具, 確認結果之效度 探討澳洲茶樹精油之治療活性成分及適當治療濃度, 以及經確認之各種影響人體之毒性成分與最低安全濃度, 並且根據 含中藥藥膠布臨床前 ( 動物 ) 安全性評估及人體貼膚測試規範 之基礎動物實驗來探討其潛在的不良反應, 且利用抑制金黃色葡萄球菌之能力做為評估抗痤瘡之活性 18

26 本實驗之流程圖 澳洲茶樹 水蒸氣蒸餾 茶樹精油 品質管制 文獻回顧 依照 ISO 4730 茶樹精油之成分分析 Jadad score 抗痤瘡療效評估 文獻回顧 抗金黃葡萄球菌活性 安全性評估 文獻回顧 Jadad score 1. 單一劑量皮膚毒性試驗 2. 塗抹 28 天之肝腎毒性評估 19

27 第二章茶樹精油之品質管制 第一節前言蒸氣蒸餾方式是萃取茶樹精油最適當之過程, 不僅是其在萃取過程中對精油組成之影響最小, 亦因為蒸氣具有易取得 價廉且無 ( 化學 ) 毒害之特性, 其僅需在較低的壓力 ( 大氣壓力 ) 下操作且可以回收 循環再利用 所以市售茶樹精油大多以水蒸氣蒸餾法 (water distillation 或 hydrodistillation) 取得 有些精油易溶於水, 但茶樹精油溶於水之程度有限, 其最有價值之成分 terpinen-4-ol 則微溶於水, 因此會有部分的 terpinen-4-ol 在蒸餾過程中隨著新鮮蒸氣被移除 茶樹精油主要產地澳洲在 1968 年規範茶樹精油萃取過程中不得破壞其內部組成, 而其定義亦被 International Standards Organisation (ISO) 所沿用, 若以其它技術取得, 茶樹精油的化學組成將會有些微差異 其後 茶樹精油的標準在澳洲 (Standards Australia 1997) 及國際間 (International Standards Organisation 1996) 皆更新定義為 以蒸氣蒸餾 澳洲茶樹 ( 互葉白千層 ) 狹葉白千層 疏花白千層及其他白千層屬之 葉及細枝獲得之精油, 且符合國際標準之對此油之要求者 147, 157 第二節 實驗部份一 材料及設備澳洲茶樹之葉 細枝 ( 直徑小於 0.3 公分 ) 及粗枝 ( 直徑大於等於 0.3 公分 ) 水蒸氣蒸餾萃取裝置 : 包含萃取槽 水蒸氣產生器 冷凝管與錐形瓶集液器等 精油含量測定之裝置 (Clevenger-type apparatus): 包含精油定量受器 ( 輕油集油器 ) 格拉罕氏冷凝管 (Grahm condenser) 及 1 公升磨 20

28 砂口圓底燒瓶 硬殼加熱包 (Glascol 及 Fargo, 容量 1000 ml) 二 茶樹精油之製備 1. 水蒸氣蒸餾以行政院農業委員會種苗改良繁殖場張定霖課長鑑定採集之澳洲茶樹之葉 (foliage) 及枝切碎後, 置入不鏽鋼圓形萃取槽中, 由水蒸氣產生器將蒸氣導入萃取槽中, 經冷凝管冷卻後, 由矽膠管導入集液器中, 蒸氣蒸餾 2 小時後收集精油, 隨後靜置 1 小時取油層 水蒸氣蒸餾萃取裝置如圖四, 依照上述實驗方法獲得之茶樹精油代號為 TTO-A ( 萃自葉及嫩枝之茶樹精油 ) 冷凝管 萃取槽 集液器 圖四 水蒸氣蒸餾萃取裝置 水蒸氣產生器 2. 精油含量測定澳洲茶樹之葉及枝切碎後, 置入圓底燒瓶中, 並加入 750~900 ml 之二次水, 經充份混合後, 加 1~2 ml 的二甲苯至精油定量受器中, 將燒瓶與精油受器及冷凝管相接, 然後加熱微沸 6 小時後收集精油, 並用乙醚洗滌集油器, 待乙醚揮發後計算精油的產率 精油含 21

29 量測定裝置如圖五 (A) 精油定量受器 ( 輕油集油器 ) (B) 冷凝管 (C) 精油蒸餾裝置 圖五 茶樹精油含量測定之裝置 三 茶樹精油之氣相層析質譜儀圖譜與指標成分之定量 1. 利用 GC-MS 分析茶樹精油及其標準品茶樹精油中的主要成分為具有揮發性的物質, 並且根據茶樹精油 ISO 4730 的規定, 購入十二種標準品 ( 如表五 ), 隨後利用 GC-MS 分析標準品的滯留時間與茶樹精油之指紋圖譜 2. 氣相層析質譜儀之條件茶樹精油及標準品分析之 GC-MS 分析條件採用 DB-5MS (0.25 mm x 30 m, film: 0.25μm) 氣相層析管柱以氣相層析儀 (GC-MS) 進行溫度梯度升溫沖提, 起始溫度為 50 維持 3 分鐘後, 以每分鐘 20.0 上升至 250.0, 並在 維持 5 分鐘, 再以相同速率上升至 維持 3 分鐘, 隨後將樣品沖洗乾淨, 並配合 NIST/EPA/NIH 質譜資料庫比對 其餘控制條件如下 : 22

30 Column Oven Temp. :50.0 C Injection Mode :Split Pressure :73.0 kpa Peak Report TIC Column Flow :1.27 ml/min [GCMS-QP2010] IonSourceTemp : C Solvent Cut Time :2.00 min Detector Gain :0.00 kv Injection Temp. : C Flow Control Mode :Pressure Total Flow :16.9 ml/min Purge Flow :3.0 ml/min Linear Velocity :40.8 cm/sec Interface Temp. : C Detector Gain Mode :Relative Threshold : 檢品配製由網路 化工材料行及百貨公司購買 5 種不同之茶樹精油如表六, 另購入十二種茶樹精油成分標準品 取茶樹精油及成分樣品 2μl 溶於 998μl 的甲醇中, 以 1:100 分流方式注入 1μl 樣品溶液於 GC-MS 中, 經上述控制條件分析後, 滯留時間如表五 23

31 表五 十二種購得茶樹精油成分標準品之名稱及其 GC-MS 滯留時間 Composition CAS No Chemical structures Molecular Weight (g/mol) Retention Time (min) Terpinen-4-ol γ-terpinene α-terpinene ,8-Cineole α-terpinolene ρ-cymene (+)-α-pinene α-terpineol Aromadendrene (+)-Limonene Sabinene Globulol 表六 市售五種茶樹精油之品牌及樣品代號 精油品牌台中化工行西班牙 A 牌台北化工行 1 台北化工行 2 網路商店 樣品代號 TTO-B TTO-C TTO-D TTO-E TTO-F 24

32 第三節氣相層析質譜儀指紋圖譜分析指標成分結果 一 澳洲茶樹各部位之精油萃取結果與產率 植物部位 葉 葉 + 細枝 枝 樹枝直徑 - <0.3 cm 0.3~0.7 cm 重 量 g g g 產 率 2.02 % 0.59 % 0 % 二 茶樹精油之成分分析結果利用水蒸氣蒸餾萃取之茶樹精油命名為 TTO-A, 其及市售品 (TTO-B~F) 之各別成分如表七所示, 結果顯示 : 所有茶樹精油含量皆符合 ISO 4730 之標準 市售之茶樹精油經過上述 GC-MS 分析後, 根據不同的滯留時間與質譜數據之分析比對後, 檢測得知蒸餾萃取及所有市售茶樹精油產品, 茶樹精油之活性主成分 terpinen-4-ol 含量皆大於 30 %, 其中以代號 TTO-B 之茶樹精油 terpinen-4-ol 含量最高達 %, 其次為 TTO-D TTO-F, 而蒸餾萃取之 TTO-A 含量最低僅 %, 但仍符合 ISO 4730 所訂定應大於等於 30 % 之規範 茶樹精油主要之毒性成分 1,8-cineole 之含量皆小於 15 %, 其中以代號 TTO-B 含 5.28 % 之 1,8-cineole 為最高, 結果顯示所有之茶樹精油樣品皆符合 ISO 4730 的標準, 有些標示為微量之成分如 aromadendrene δ-cardinene sabinene globulol viridiflorol 等以 GM-MS 檢測時未被檢出 各成分含量之分析統計與 ISO 4730 之比較如表七 市售品及蒸餾萃取茶樹精油 TTO-A~F 之 GC-MS 指紋圖譜如圖六至圖十一 25

33 表七 自行萃取與市售品之茶樹精油成分含量分析 成分 ISO 4730 成分含量 (%) range (%) TTO-A TTO-B TTO-C TTO-D TTO-E TTO-F Terpinen-4-ol γ-terpinene α-terpinene ,8-Cineole Terpinolene ρ-cymene α-pinene α-terpineol Aromadendrene Traces δ-cadinene Traces Limonene Sabinene Traces Globulol Traces Viridiflorol Traces 備註 : TTO-A: 葉及嫩枝蒸餾之茶樹精油,TTO-B: 台中化工行,TTO-C: 西班牙 A 牌,TTO-D: 台北化工行 1,TTO-E: 台北化工行 2,TTO-F: 網路商店 蒸餾萃取之茶樹精油 TTO-A 中 terpinen-4-ol 含量較低, 含量為 % 可能的原因是萃取過程中直接將新鮮茶樹葉部利用標準之精油蒸氣蒸餾方式萃取, 未添加任何有機溶媒作為輔助劑 ; 另一方面 terpinen-4-ol 微溶於水, 故在新鮮水蒸氣產生時, 亦有可能隨之溶於其中, 而再以分液漏斗分部分離時, 因 terpinen-4-ol 部分存在水層未被溶出 結果亦顯示 : 蒸餾萃取茶樹精油 TTO-A 中有毒性之 1,8-cineole 含量亦最低 1.73 %, 其次是市售品 TTO-C 含量為 3.03 % 同時觀察到市售品 TTO-B 茶樹精油之 1,8-cineole 含量最高達 5.28 %, 但仍然在 ISO 4730 規定小於等於 15 % 之標準範圍內 26

34 (x10,000,000) 1.75 TIC 圖六 TTO-A 之 GC-MS 指紋圖譜 (x10,000,000) TIC 圖七 TTO-B 之 GC-MS 指紋圖譜 27

35 (x10,000,000) 1.50 TIC 圖八 TTO-C 之 GC-MS 指紋圖譜 1.25 (x10,000,000) TIC 圖九 TTO-D 之 GC-MS 指紋圖譜 28

36 (x10,000,000) TIC 圖十 TTO-E 之 GC-MS 指紋圖譜 1.50 (x10,000,000) TIC 圖十一 TTO-F 之 GC-MS 指紋圖譜 29

37 第四節討論自然界精油依照化學結構分類可殆分為萜烯 酸 醇 醛 酯 酮 酚 醚 內酯 芳香烴類等, 而茶樹精油之主要成分以萜烯類之衍生物為主 單萜和倍半萜為具有高度揮發性與特殊氣味的油狀液體, 其分子量較小, 可用水蒸氣蒸餾獲得 此類的萜烯物質具有防腐 消炎 抗菌 抗氧化的作用, 但含高比例的萜烯化合物則不能直接用於皮膚, 需與基礎油合用 萜類化合物並非由異戊二烯 (isoprene) 在酶催化下直接聚合而成, 實際上則是在植物體內的 3(R)- 甲戊二羥酸經生物轉化形成焦磷酸異戊烯酯 (isopentenyl pyrophosphate, IPP), 經過焦磷酸異戊烯酯異構酶的催化下, 轉化為焦磷酸 3,3- 二甲基烯丙酯 (dimethylallyl pyrophosphate, DMAP),DMAP 再轉換為單萜 倍半萜, 或者在酶催化下合成其他萜類化合物 159 植物二次代謝物生合成主 要途徑如圖十二 160 桃金孃科植物精油多含有萜烯類化合物, 如白千層 (Melaleuca cajeputi) 精油含有 α-pinene (5.3 %),β-pinene (2.24 %),ρ-cymene (3.98 %), 1,8-cineole (75.48 %), α-terpineol (6.36 %) 等 ; 香桃木 (Mytus communis) 精油則含有 α-pinene (29.23 %), ρ-cymene (1.52 %), d-limonene (8.68 %), 1,8-cineole (38.84 %); 而易光輝等以 GC-MS 檢驗市售某品牌澳洲茶樹精油則含有 α-pinene (0.98 %),β-pinene (2.24 %), α-terpinene (5.89 %), m-cymene (9.81 %), 1,8-cineole (1.05 %), γ-terpinene (15.13 %), terpinolene (2.52 %), terpinen-4-ol (56.99 %), α-terpineol (3.62 %) 等 其中 ISO 4730 規範之含量未檢出者有 ρ-cymene, limonene, aromadendrene, cadinene, sabinene, globulol, viridiflorol 等, 而其檢出之 β-pinene, m-cymene, phellandrene 則未在 ISO 4730 之規範內 根據文獻指出市售茶樹精油之品質並非全然符合相關國際標準規範, 也更讓我們深切體會相關品管程序之重要, 所以本研究亦分析台 30

38 灣市售品 Respiration Photosynthesis, assimilation Polysaccharides, glycosides Monosaccharides Pyruvic acid Peptides Shikimic acid Prephenic acid Mevalonic acid ACETIC ACID (Acetyl CoA) Aliphatic amino acids Aromatic amino acids Alkaloids Cinnamic acid 3,3-Dimethylallyl pyrophosphate Malonic acid Polyketides Coumarins Terpenoids Fatty acids Fats Flavonoids, Other aromatics 圖十二 植物二次代謝物生合成主要途徑 160 茶樹精油主要成分之變化因收成季節 播種之茶樹狀況 甚至種植地區經緯度與高度而產生變化, 而 terpinolene, terpinen-4-ol, cis-sabinene hydrate,β-pinene 等主成分之關鍵濃度也與茶樹幼苗葉片萌發時間有關 因此採收後立即蒸餾萃取精油產率會較高, 反之若採收後未低溫保存且儲存超過數月就會影響精油之產率, 蒸餾萃取精油 TTO-A 之 terpinen-4-ol 及 1,8-cineole 含量都較低, 可能與精油工廠蒸氣蒸餾製程差異與分液漏斗靜置分層後之取樣有關 至於不同產地即使是相同之母株, 植栽採收後之精油含量也會有差異, 例如 2002 年張 31

39 孝祺等檢測廣東省產之茶樹精油其成分大致上都符合 ISO 4730 規範, 唯獨 terpinolene 含量低於 1.5~5 % 之範圍, 而濃度僅有 0.18 % 本次實驗市售品茶樹精油含量之純度皆符合 ISO 4730 標準, 蒸餾萃取之茶樹精油 TTO-A 完全符合 ISO 規定, 因此我們將利用此六種不同的茶樹精油樣品及其活性 毒性主要成分之標準品進行後續的安全性評估試驗 此外茶樹精油的有效成分之含量與市場售價沒有成正比的關係, 不會因價格差異而出現品質明顯差異的現象 32

40 第三章茶樹精油之抗痤瘡療效評估 第一節前言所有澳洲茶樹精油的性質裡最受矚目的就是其抗微生物活性, 早期文獻記載就推測澳洲新南威爾斯省北方的 Bundjalung 原住民有開採及使用茶樹植物傳統, 將澳洲茶樹葉搗碎吸入精油以治療咳嗽及感冒, 或灑在傷口當作敷藥使用 ; 或者以澳洲茶樹葉經浸泡後之浸液治療喉嚨痛及輕微的皮膚疾病 澳洲原住民的口述歷史也曾提及 治療湖 就是經年有澳洲茶樹葉掉落及腐爛的潟湖 先前並無單獨使用精油的記錄, 直到 Penfold 在 1920 至 1930 年代間發表了其抗微生物活性的第一篇報告, 他以當時最佳標準消毒劑石碳酸或酚進行測試, 比較茶樹精油及其各項組成之 Rideal-Walker (RW) 係數 ( 表八 ), 進而評估澳洲茶樹及其他精油的抗微生物活性 茶樹精油的活性與酚直接比較高出 11 倍, 茶樹精油內許多成分的 RW 係數也曾被研究報告過, 包括 cineole 是 3.5,cymene 是 8,linalool 是 13,terpinen-4-ol 是 13.3, 而 terpineol 是 因為此項結果, 而促使茶樹精油在二次世界大戰時成為沙場中之外傷治療劑 但這些文獻提供茶樹精油醫療價值之證據力不足, 以今日的標準觀之, 其所提供的數據僅能當作逸聞或趣談罷了 反之, 同時代的資料清楚顯示茶樹精油包括抗細菌 抗真菌 抗病毒及抗原蟲等廣效的抗微生物活性, 並非所有的體外活性皆被完整記載描述, 而僅有少數案例實際用於臨床, 數據上雖然看似有用, 但到目前為止並不充分 抗微生物的活性曾被茶樹精油本身之物理性質所妨礙 ( 如表四所示 ) 茶樹精油及其成分微溶於水, 因此限制了它們在培養基試驗時之可混溶性 有許多不同的實驗研究之調整策略曾被用於克服此類問題, 例如加入界面活性劑到肉湯或瓊脂 33

41 試驗培養基中使其運用更廣泛 茶樹精油散佈在液體的培養基中, 通常會產生混濁的懸浮液, 這使得要測定感受性之最終值變得困 難 通常以染料成功混合後, 可當作最小抑菌濃度之可視指標 表八 茶樹精油及組成之 Rideal-Walker coefficient Material RW coefficient ISO 4730 range Tea tree oil ,8-cineole ρ-cymene linalool 13.0 terpinen-4-ol α- terpineol 痤瘡桿菌 (Propionibacterium acne) 金黃葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 與表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis) 為痤瘡病灶常見的幾種菌株 而金黃色葡萄球菌與痤瘡之關係有著最 多的研究文章發表, 其次為痤瘡桿菌 本研究為探討茶樹精油抗痤瘡 之有效性, 選擇金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus), 以實驗來 驗證茶樹精油及其相關化合物對金黃色葡萄球菌的抑菌或殺菌能 力, 來探究其對抗痤瘡之作用 第二節茶樹精油作用之實證醫學探討一 茶樹精油用於痤瘡治療之系統評價 1. 文獻來源 2007 年 12 月以臺北醫學大學圖書館所購置之 Medline, EMBASE, Cochrane 及 PubMed 等資料庫作為搜尋基礎 澳洲茶樹之關鍵字為 tea tree 及 Melaleuca alternifolia, 痤瘡之關鍵字為 acne 及 acne vulgaris 2. 文獻之納入標準 34

42 關鍵字茶樹精油及痤瘡為以 Medline, EMBASE, Cochrane 及 PubMed 等資料庫搜尋, 排除非臨床試驗部份, 如文獻回顧及個案報 告等 3. 納入文獻之質量評值方法 以表九之 Jadad score 所規範, 提出隨機分配方法 雙盲方法及退 出實驗之機制 原因說明者皆給予一分, 隨機分配及雙盲方法不當者 各扣一分, 總分最高為五分, 最低為零分 上述第一篇僅有隨機分配 及雙盲方法而無退場機制說明, 所以僅評值二分 第二篇則為隨機但 單盲試驗, 所以僅能給予一分之評值 表九 Jadad score calculation Item Score Was the study described as randomized (this includes words such as randomly, random, and randomization)? 0/1 Was the method used to generate the sequence of randomization described and appropriate (table of random numbers, computer-generated, etc)? 0/1 Was the study described as double blind? 0/1 Was the method of double blinding described and appropriate (identical placebo, active placebo, dummy, etc)? 0/1 Was there a description of withdrawals and dropouts? 0/1 Deduct one point if the method used to generate the sequence of randomization was described and it was inappropriate (patients were 0/-1 allocated alternately, or according to date of birth, hospital number, etc). Deduct one point if the study was described as double blind but the method of blinding was inappropriate (e.g., comparison of tablet vs. injection with 0/-1 no double dummy). 資料來源 :Jadad, A.R., Moore, R.A., Carroll, D., Jenkinsen, C., Reynolds, D.J., Gavaghan, D.J., & Mcguay, H.J. (1996). Assessing the quality of reports of randomized clinical trials: Is blinding necessary? Controlled Clinical Trials, 17(1), 二 茶樹精油作用之實證醫學探討結果 1. 茶樹精油用於痤瘡治療之系統評價結果經過系統性文獻回顧有關茶樹精油用於痤瘡治療之相關臨床試驗 (clinical trials) 文章共兩篇,Jadad score 分別為 2 分及 1 分, 如表十所示 35

43 Enshaieh 等人的研究經過 45 天的觀察, 研究對象每 15 天回診一 次後, 指出 5 % 茶樹精油之組別降低痤瘡嚴重指數及病灶總數 ( 黑頭 粉刺 白頭粉刺 丘疹及結節等 ) 都較安慰組來得高, 分別為 5.75 倍 及 3.55 倍 而 Bassett 等人所做的單盲試驗則指出,5 % 茶樹精油較 5 % benzoyl peroxide lotion 有較低之不良反應發生率, 兩者對發炎及未發 炎痤瘡病灶 ( 白頭粉刺 黑頭粉刺 ) 都有顯著治療效果, 但是茶樹精油 發生作用時間較 5 % benzoyl peroxide lotion 來得慢 154 表十 茶樹精油用於痤瘡治療之文獻摘要及 Jadad 評分 Reference Enshaieh S, Jooya A, Siadat AH, Bassett IB, Pannowitz DL, Iraji F. (2007) 161 Barnetson RS. (1990) 154 Study Design RCT, (double-blind Single-blind, randomised clinical placebo-controlled study) trial Sample size N=60 N=124 Total lesion count (TLC) Acne severity index (ASI) Reducing the number of inflamed and non-inflamed lesions (open and Efficacy on comedones number closed comedones) Type of (CN) Intervention Efficacy on papules number (PPN) Efficacy on pustules number (PUN) Results/ Conclusion 5 % TTO 之降低 ASI 及 TLC 分別為安慰組之 5.75 及 3.55 倍 實驗組為 5 % TTO; 對照組為 5 % benzoyl peroxide lotion 5 %TTO: 10 % minimal pruritus, 實驗組較對照組少 Adverse effect 3.33 % little burning sensation, 3.33 % minimal scaling; Placebo: 6.66 % minimal pruritus, 6.66 % little burning sensation. Jadad score 茶樹精油用於痤瘡治療之基礎研究文獻回顧 (1) 茶樹精油之抗細菌活性在 1940 年至 1980 年間僅有極少的茶樹精油抗菌活性文章發表, 先前在別處曾綜述過 1990 年代初期起描述茶樹精油抗微生物活性之文章開始在許多科學文獻中發表, 雖然在不同研究中所使用的方法間依然存在不同程度的差異, 但最小抑菌濃度報告則經常相對地 36

44 相似 廣泛範圍的細菌及其對茶樹精油的感受性曾被測試, 有些已發表的感受性資料整理在表十一 金黃色葡萄球菌 MIC 為 0.5~1.25 %,MBC 為 1~2 %; 表皮葡萄球菌 MIC 為 0.45~1.25 %,MBC 為 4 %; 痤瘡桿菌 MIC 為 0.05~0.63 %,MBC 為 0.5 %;Malassezia furfur 之 MIC 為 0.03~0.12 %,MBC 為 0.5~1.0 % 一般而言其對厭氧性桿菌有較佳之抗菌效果, 如 : 中間普氏菌 (Prevotella intermedia) 之 MIC 及 MBC 均為 0.003~0.1 % 大多數細菌對茶樹精油之感受性在 1.0 % 或更低的濃度, 曾被報告過的如皮膚共生菌葡萄球菌 (Staphylococci) 微球菌 (Micrococci) 糞腸球菌 (Enterococcus faecalis) 及綠膿桿菌 (Pseudomonas aeruginosa) 等其最小抑菌濃度均大於 2 % 茶樹精油本質上絕大部分是殺菌劑, 雖然其在低濃度時可能是抑菌 早在 1925 年 Penfold 就針對澳洲茶樹及狹葉白千層研究, 並以酚係數 (RW coefficient) 指出 Terpinen-4-ol 與 α-terpineol 為主要活性成分 162 時至今日有許多研究者以 MICs 及 MBCs 或 MFCs, 確認此兩化合化在此濃度或稍低之濃度有抗菌及抗黴活性 但 α-terpineol 在茶 樹精油中所佔濃度並不高 (ISO 4730 規範 %) α-pinene, β-pinene 與 linalool 均有類似之 MICs, 但它們在茶樹精油中之含量亦 166, 不高 169 Nelson 於體外的短期實驗發現金黃色葡萄球菌對茶樹精油有抗藥性, 其中有三株金黃色葡萄球菌在 MICs 為 1 % 時, 另一株則在 2 % 及 16 % 之 MICs 170 Gustafson 等另發現有多重抗藥性 (Mar mutants) 之 E. coli 對茶樹精油之感受性亦降低 171 Davis 等亦發現家庭清潔者茶樹精油及 α-terpineol 對金黃葡萄球菌之感受性亦輕微降低 172 對 S. aureus, C. albicans, C. glabrata, P. aeruginosa 與 Enterococcus faecium 有抗藥性之菌株對茶樹精油體外亦有感受性 (without 37

45 cross-resistance) (2) 茶樹精油之抗真菌活性痤瘡的病源菌之一 Malassezia furfur 就是真菌, 除此之外茶樹精油亦對白色念珠菌有效, 其 MIC 及 MBC 分別為 與 ; 茶樹精油之抗真菌活性文獻摘要如表十二 (3) 茶樹精油之抗病毒活性菸草鑲嵌病毒 (Tobacco mosaic virus in tobacco plant) 以 100, 250 及 500 ppm 之茶樹精油灑在感染菸草鑲嵌病毒 10 天後與控制組相較, 植物葉片每平方公分有較少之損傷 173 Herpes simplex virus (HSV) 以茶樹精油及 eucalyptus oil 實驗對 HSV 之抑制濃度 4 天後茶樹精油與控制組相較, 分別以 % 及 % 抑制 HSV-1 及 HSV-2 百分之五十斑塊形成 (plaque formation) 以 % 之較高的濃度可分別降低 HSV-1 及 HSV-2 之病毒量達 98.2 % 及 93.0 % 174 Minami 在 2003 年也以茶樹精油針對綠猴腎細胞 (Vero cell) 之 HSV-1 活性做研究, 發現 0.1 % 茶樹精油可抑制 10 % 斑塊形成,1 % 則可完全抑制 175 (4) 茶樹精油之抗原蟲活性 Mikus 等人以茶樹精油分別在 403 mg/ml 及 0.5 mg/ml 降低利什曼原蟲 (Leishmania major) 與羅得西亞錐蟲 (Trypanosoma brucei) 50 % 生長, 其抗原蟲活性成分為 terpinen-4-ol 176 Viollon 等人則研究顯示茶樹精油在 300 mg/ml 濃度時可殺死陰道滴蟲 (Trichomonas vaginalis) 之所有細胞 Pena 在 1962 年就曾以體內試驗證實 177 (5) 茶樹精油之抗發炎反應 38

46 林佩儒曾進行精油之抗發炎活性評估, 茶樹精油及其水溶性成分均可明顯抑制由 LPS 誘導 THP-1 細胞分泌產生的 TNF-α 量 178 (6) 結論茶樹精油之抗痤瘡作用來自於其對毛囊狀態失衡後, 大量孳生之 四種主要痤瘡病源細菌 (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium acnes) 真菌 (Malassezia furfur) 都有抗菌作用, 而達成降低毛囊內細菌數量之目的, 進而能使痤瘡病灶儘速恢復正常 單萜類化合物結構式之官能基會影響抗菌活性, 一般而言, 抗菌強弱依次是酚類 > 醛類 > 酮類 > 醇類 > 醚類 > 碳氫化合物 醇類架構成分如 terpinen-4-ol 及 terpineol 可造成菌之蛋白質變性 破壞細胞膜及溶解脂質 茶樹精油於體外試驗對發炎之相關介質如 COX-2 PGE TNF-α ROS 及 histamine diphosphate 都有抑制作用 Graham 等人於 2004 年研究指出痤瘡桿菌會使角質細胞產生 IL-1α TNF-α 和 GM-CSF, 且會活化 CD4+ T 淋巴球, 而導致毛囊發炎 茶樹精油也存在著抑制 TNF-α 產生的活性, 而達到抗發炎的作用, 因此可推論茶樹精油對於發炎性痤瘡病灶, 能藉由減少 TNF-α 等發炎介質的產生, 而降低發炎反應, 因此有治療痤瘡的功效 體表之角質細胞屏障若遭破壞將會產生發 39

47 表十一 茶樹精油之抗細菌活性 Bacterial species % (vol/vol) MIC MBC Reference(s) Acinetobacter baumannii 1 1 Hammer KA, 1996 Actinomyces viscosus 0.6 > 0.6 Shapiro S, 1994 Actinomyces spp. 1 1 Hammer KA, 2003 Bacillus cereus 0.3 Griffin SG, 2000 Bacteroides spp Hammer KA, 1999 Corynebacterium sp Christoph F, 2000; Griffin SG, 2000; Hammer KA, 1996 Enterococcus faecalis 0.5->8 >8 Banes-Marshall L, 2001; Griffin SG, 2000 E. faecium (vancomycin resistant) Nelson RRS, 1997 Escherichia coli Banes-Marshall L, 2001; Carson CF, 1995; Gustafson JE, 1998; Mann CM, 1998 Fusobacterium nucleatum 0.6-> Shapiro S, 1994; Takarada K, 2005 Klebsiella pneumoniae Griffin SG, 2000; Hammer KA, 1996 Lactobacillus spp Hammer KA, 1999; Hammer KA, 2003 Micrococcus luterus Hammer KA, 1996 Peptostreptococcus anaerobius >0.6 Hammer KA, 1999; Shapiro S, 1994 Porphyromonas endodentalis Hammer KA, 2003 P. gingivalis >0.6 Shapiro S, 1994; Takarada K, 2005 Prevotella spp Hammer KA, 1999 Prevotella intermedia Hammer KA, 2003 Propionibacterium acnes Carson CF, 1994; Griffin SG, 2000; Raman A, 1995 Proteus vulgaris Banes-Marshall L, 2001; Christoph F, 2000; Griffin SG, 2000; Mann CM, 1998 Pseudomonas aeruginosa >8 Banes-Marshall L, 2001; Griffin SG, 2000; Hammer KA, 1996 Staphylococcus aureus Banes-Marshall L, 2001; Carson CF, 1995; Raman A, 1995 S. aureus (methicillin resistant) Carson CF, 1995; Christoph F, 2000; Mann CM, 1998; Nelson RRS, 1997 S. epidermidis Christoph F, 2000; Hammer KA, 1996; Raman A, 1995 S. hominis Hammer KA, 1996 Streptococcus pyogenes Banes-Marshall L, 2001; Carosn CF, 1996 Veillonella spp Hammer KA,

48 表十二 茶樹精油之抗真菌活性 Fungal species % (vol/vol) MIC MBC Reference(s) Alternaria spp Hammer KA, 2002 Aspergillus flavus Griffin SG, 2000; Hammer KA, 2002; Nenoff P, 1996; Shin S, 2003 A. fumigatus Hammer KA, 2002; Vazquez JA, 2000 A. niger Beylier MF, 1979; Griffin SG, 2000; Hammer KA, 2002 Blastoschizomyces capitatus 0.25 Oliva B, 2003 Candida albicans Banes-Marshall L, 2001; Christoph F, 2000; D'Auria FD, 2001; Ergin A, 2002; Hammer KA, 1998; Mondello F, 2003; Nenoff C. glabrata P, 1996; Oliva B, 2003; Vazquez JA, 2000 Banes-Marshall L, 2001; D'Auria FD, 2001; Ergin A, 2002; Hammer KA, 1998; Mondello F, 2003; Oliva B, 2003; Vazquez JA, 2000 C. parapsilosis D'Auria FD, 2001; Hammer KA, 1998; Mondello F, 2003; Oliva B, 2003 C. tropicalis D'Auria FD, 2001; Ergin A, 2002; Vazquez JA, 2000 Cladosporium spp Hammer KA, 2002 Cryptococcus neoformans Mondello F, 2003 Epidermophyton Christoph F, 2000; Hammer KA, 2002 flocossum Fusarium spp Hammer KA, 2002 Malassezia furfur Hammer KA, 2000 M. sympodialis Hammer KA, 2000 Microsporum canis D'Auria FD, 2001; Hammer KA, 2002; Nenoff P, 1996 M. gypseum D'Auria FD, 2001 Penicillium spp Hammer KA, 2002 Rhodotorula rubra Hammer KA, 2003 Saccharomyces cerevisiae Hammer KA, 2003 Trichophyton D'Auria FD, 2001; Griffin SG, 2000; Nenoff P, 1996 mentagrophytes T. rubrum Christoph F, 2000; D'Auria FD, 2001; Hammer KA, 2002; Nenoff P, 1996 T. tonsurans Hammer KA, 2002 Trichosporon spp Hammer KA, 2003; Nenoff P,

49 第三節實驗部份一 實驗材料 1. 試驗菌株本實驗所用之菌株為金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus BCRC 10781, ATCC 25923), 購自財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心 2. 試藥 Tryptic soy broth (TSB) 及 tryptic soy agar (TSA) 均購自 Difco 公司, terpinen-4-ol, 1,8-cineole (eucalyptol), terpinolene, γ-terpinene, limonene, aromadendrene, p-cymene, α-terpinene, sabinene hydrate, globulol 為購自 Fluka 公司,α-terpineol 購自 Extrasynthese 公司,α-pinene 購自 Aldrich 公司 3. 人工配方茶樹精油因為茶樹精油存在著主成分的差異, 且其成分間又有不同抑菌活性之差異, 因此激起我們藉由調整 提高抑制金黃色葡萄球菌作用較強之成分比率, 觀察是否有著更理想之抗菌活性 表十三之 DF1 及 DF2 是茶樹精油對抑制金黃色葡萄球菌有效的不同組成, 各成分總和分別為 88 % 及 85 %, 另外加入 12 % 及 15 % 之荷荷芭油 4. 儀器設備恆溫震盪培養箱 (Firstek) 水浴鍋 (Cherng Huei WDG-11) 電子分析天平 (AND HR-200) 高壓滅菌鍋 (Tomin) 自動乾燥機 ( 永億 ) 落地型高速冷凍離心機(Kubota 1720) 二 實驗方法 1. 培養液及培養基之製備金黃色葡萄球菌以 tryptic soy broth (TSB) (Difco, Sparks, MD, 42

50 USA) 培養, 取 30 g 之 TSB 溶於 1000 ml 之去離子水中, 加熱攪拌至完全溶解後, 置於高壓滅菌鍋中以溫度 121, 壓力 1.2 kg/cm 2 下滅菌 30 分鐘, 冷卻至室溫以供金黃色葡萄球菌之培養 ; 培養基之製備是以 40 g 之 TSA 溶於 1000 ml 之去離子水中, 加熱攪拌至完全溶解後, 置於高壓滅菌鍋中以溫度 121, 壓力 1.2 kg/cm 2 下滅菌 30 分鐘, 再以 1:9 比率加入濃度為 McFarland 0.5 濁度標準 (1.5 x 10 8 CFU/ml) 之金黃色葡萄球菌培養液, 於尚未凝固時將上述混合液每 15 ml 分裝於培養皿中, 於 37 恆溫培養 24 小時 表十三 蒸餾萃取及人工配方茶樹精油之組成 成分 ISO 4730 range (%) DF 1 DF 2 Terpinen-4-ol γ-terpinene α-terpinene ,8-Cineole Terpinolene ρ-cymene α-pinene α-terpineol Aromadendrene Traces δ-cadinene Traces Limonene Sabinene Traces Globulol Traces Viridiflorol Traces Subtotal (%) 瓊脂井化擴散法 (agar well diffusion method) 本實驗採用瓊脂井化擴散法, 因茶樹精油易揮發之特性, 故將原 本需製成紙錠之精油, 改良方法為製作平板培養基時, 預先以滅菌完 43

51 成直徑 8 mm 之不銹鋼圓環井化之, 再將欲試驗之精油 50μl 滴入預鑄完成之凹槽內 精油於平板培養基之抑菌圈外觀如圖十三 最小殺菌及最小抑菌濃度是將抑菌環直徑內之透明區域, 以用挑菌鉤環 (transfer loop) 取 1 loop 的菌液植入培養皿中, 於 37 恆溫培養 24 小時 培養皿未有細菌生長所加入的最小的試藥或化合物濃度為最小殺菌濃度 (MBC), 反之則為最小抑菌濃度 (MIC) Diameter of inhibition zone 圖十三 瓊脂井化擴散法及精油於平板培養基之抑菌圈外觀 三 茶樹精油抑制金黃色葡萄球菌活性結果 1. 茶樹精油之主成分抑制金黃色葡萄球菌活性茶樹精油活性及毒性之各主要成分共有 12 種化合物, 其對於金黃色葡萄球菌之抑菌圈直徑及 MIC MBC 值如表十四 以效果優劣順序依次為 terpinolene > α-terpinene > α-terpineol > (+)-α-pinene > terpinen-4-ol >γ-terpinene > aromadendrene Terpinolene 查詢歷年文獻並無抑制金黃色葡萄球菌之實驗結果記載, 而其餘成分包括 1,8-cineole,ρ-cymene, limone, sabinene 及 globulol 等五種成分並無明顯抑菌圈, 推測並無抑制金黃色葡萄球菌之活性 因為每個化合物各自有不同之抑制金黃色葡萄球菌之活性, 讓我們思考調整不同茶樹精油成分之組成, 是否會影響其抑菌活性, 進而 44

52 能藉由了解不同組成之比例, 而能先行推估其抑菌活性 表十四 茶樹精油主成分之金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑比及 MIC MBC Compounds Diameter of inhibition zone ratio a MIC MBC Terpinen-4-ol 0.50± % 50 % γ-terpinene 0.39± % 100 % α-terpinene 1.00± % 25 % 1,8-Cineole α-terpinolene 1.03± % 100 % ρ-cymene (+)-α-pinene 0.52± % 50 % α-terpineol 0.73± % 40 % Aromadendrene 0.27± % 100 % (+)-Limonene Sabinene Globulol a 茶樹精油與 penicillin 10 U 之抑菌圈直徑比值, 表示濃度達 100 % 時仍無抑菌圈 2. 市售品及蒸餾萃取之茶樹精油抑制金黃色葡萄球菌活性 茶樹精油 TTO-A 及市售品 TTO-B~F 對金黃色葡萄球菌之抑制實 驗中以市售品 TTO-F 抑菌效果最佳 ( 圖十四, 表十五 ), 甚至較 penicillin 10 U 之效果為強 ; 市售品之強度依序是 TTO-F > TTO-E > TTO-C > TTO-D > TTO-B; 蒸餾萃取之茶樹精油 TTO-A 抑制作用介於 TTO-F 與 TTO-E 之間, 其 100 % 濃度時抑制金黃色葡萄球菌之效果較 penicillin 10 U 稍弱 茶樹精油若運用於抗痤瘡, 則應考量其是否具有較佳的抗 痤瘡效果, 因此其針對金黃色葡萄球菌或痤瘡桿菌之抑菌 殺菌效果 就可以推論其表皮抗菌力優劣及相對品質, 所以主管機關或製造廠商 應考慮將各批次茶樹精油產品常態性進行抗菌活性試驗 蒸餾萃取茶樹精油 TTO-A 抑制金黃色葡萄球菌之效果雖略遜於 penicillin, 但較大部分之市售品強 45

53 2.5 Diameter of inhibition zone (cm) Control A B C D E F DF1 DF2 Penicillin 天然 市售品 人工配方 圖十四 蒸餾萃取茶樹精油及市售品之金黃色葡萄球菌抑制 ( 濃度 100%,n = 3) 表十五 茶樹精油與人工配方精油 DF1, DF2 之抑菌圈直徑比 TTO 與 penicillin 抑菌圈比值 * MIC (%) MBC (%) A 0.83 ± B 0.72 ± C 0.88 ± D 0.75 ± E 0.89 ± F 1.17 ± DF ± DF ± * Penicillin 10U 不同濃度的茶樹精油其抑制金黃色葡萄球菌之效果亦不同, 隨著 濃度遞增其抑菌圈直徑亦隨之漸增 蒸餾萃取茶樹精油 TTO-A 之 MIC 為 25 % 46

54 3. 茶樹精油各主要成分比例調整後對金黃色葡萄球菌之活性以 penicillin 10U 之抑制圈直徑為分母, 蒸氣蒸餾萃取 TTO-A 市售品 TTO-B~F 及人工配方 DF1, DF2 等不同茶樹精油為分子, 得到抑菌圈直徑比值如表十五 DF1 及 DF2 精油之抑制金黃色葡萄球菌活性優於蒸餾萃取之精油, 也較絕大部分市售品佳, 但仍略遜於市售品 TTO-F 實驗結果顯示 penicillin 10 U, DF1 及 DF2 對金黃色葡萄球菌之抑菌圈直徑 ( 單位 : 公分 ) 分別為 2.5, 2.45 ± 0.09 及 2.42 ± 0.08 彼此效果相近, 但仍較市售品 TTO-F 差, 推測抑制金黃色葡萄球菌之能力除了與抑菌效果最強的 terpinolene α-terpinene α-terpineol 有關之外, 尚需要茶樹精油中其它成分或微量物質的配合 ( 表七 ) 四 討論茶樹精油之濃度與抑制金黃色葡萄球菌能力成正比, 而茶樹精油內各個主成分間也存在著抑制金黃葡萄球菌強度之差異, 其中抑菌圈最大者依序為 terpinolene, α-terpinene, α-terpineol, α-pinene 及 terpinen-4-ol 等, 與 Penfold 在 1925 年針對澳洲茶樹及狹葉白千層以酚係數 (RW coefficient) 進行的研究有頗大的差異 162 市售茶樹精油中以 TTO-C, E 及 F 之 terpinolene,α-terpinene,α-terpineol 含量較高, 與這些成分之抑制金黃色葡萄球菌能力成正相關, 但 α-pinene 與 terpinen-4-ol 之濃度高低就和抑菌圈之大小較無關係 以茶樹精油各主要成分調整後之人工配方精油其外觀 氣味與市售品並無明顯差異, 且 DF1 及 DF2 之 terpinolene, α-terpinene, α-terpineol 亦相對較高, 但與市售品 TTO-F 相比並沒有較高之抑制金黃色葡萄球菌活性, 推論應該是茶樹精油之微量組成可能扮演協助抑 47

55 菌之角色, 或這些組成之濃度與抑菌能力有其最高值 (ceiling value), 超過此值後就再無加乘之效果 Terpinolene 單一成分之抑制金黃色葡萄球菌活性以往並未有人探討, 僅 Perez 等在 1999 年針對內含 terpinolene 之菊科植物 Senecio graveolens, 研究其對 oxacillin-sensitive 及 oxacillin-resistant Staphylococcus aureus 之活性 Cristani 於 2007 年研究指出 thymol, carvacrol, p-cymene 及 γ-terpinene 等化合物之抗菌活性與親脂性 水溶性等生理化學特徵相關, 而此效應與細菌膜外表面電荷及脂質組成有關, 亦即化合物穿透進入細胞內部, 干擾細胞內作用部位產生抗菌之活性 Sartorelli 及 Skocibusic 也曾探討過植物精油之組成與其抗菌活性之關係, 更揭櫫不同生長過程及採收部位有著精油組成之明顯差異, 而會影響抑菌活性 Raman 等在 1995 年針對金黃色葡萄球菌 表皮葡萄球菌及痤瘡桿菌探討茶樹精油各個組成之抗菌活性發現 MIC 值分別為 α-terpineol < terpinen-4-ol <α-pinene, 與本實驗依抑菌圈直徑 大小排列順序相同 168 除此之外,Hart 等人曾經探討茶樹精油的抗發炎反應機制, 發現茶樹精油的水溶性成分可藉由活化人類單核球來抑制發炎介質的產生, 諸多成分中僅有 terpinen-4-ol 在 40 小時後可藉由 LPS 活化單核球來抑制 TNF-α, IL-1β, IL-8, IL-10 及 PGE 2 產生 40 因此可以解釋茶樹精油用於痤瘡治療時, 除了抗菌活性之外, 尚有運用其抗發炎反應之效力 這也可以解釋 terpinen-4-ol 之抑制金黃色葡萄球菌能力雖然不是最強的, 但大部分學者都將其視為最主要活性成分物質之原因 48

56 第四章茶樹精油之安全性評估 第一節前言精油相較於其他大部分化學合成香料有較佳的氣味及較大的強度, 所以近來被大量生產製造 世界上大部分的精油用於製造芳香劑及矯味劑,Tisserand 等人估計約僅佔芳療總消費市場之 3-5 %, 近幾十年來驚人的成長, 肇因於西方國家對傳統及非常規醫療的再次重視, 人們對於疾病的治療及維持良好感受之個人責任, 體現於健康革命的新觀念中, 因此造成天然成分物質在非處方藥銷售市場的成長 179 許多精油用於芳療或醫療用途已達數千年歷史, 當以蒸餾形式加工處理後, 其被濃縮達百倍以上, 因此精油之性質與原植物相較變得非常顯著, 有些是我們不樂見的不良反應或毒性作用 大部分精油經調整用於芳香治療其呈現較低或無危害, 例如有毒的草本植物芹葉鉤 吻 (hemlock, Conium maculatum L.) 茄科植物龍葵 (nightshade, Solanum nigrum L.) 木本的歐洲紫杉 (yew, Taxus baccata) 及蕈類毒鵝 膏 (death-cap, Amanita phalloides) 及未經處理含有氰化物的有毒精油 苦杏仁油等, 也有意外大量誤食冬青油造成死亡的許多案例 179 一 般此類誤食之個案, 劑量是非常重要的關鍵, 因為看似無害的糖或鹽若大量攝食亦有可能致命 精油的天然來源並未能保證它們就是安全的, 因為天然永遠不能和安全畫上等號 要在精油中找到毒性物質或其毒性劑量需要通盤了解其服用劑量 頻次及服用方法等 例如 : 迷迭香精油含 % 的樟腦, 樟腦在特定劑量以上時, 對孕婦及癲癇患者而言是特別危險的, 雖然口服大量迷迭香精油很危險, 但是相同的劑量於按摩時, 由表皮吸收相對來得安全 因為精油的過量及不當使用有著潛在的危險性, 所以探討精油在有效的濃度下是否有毒性, 就成為刻不容緩的議題 49

57 第二節茶樹精油安全性之實證醫學探討一 茶樹精油安全性之系統評價 1. 文獻來源 2007 年 12 月以臺北醫學大學圖書館所購置之 Medline, EMBASE, Cochrane 及 PubMed 等資料庫作為搜尋基礎 澳洲茶樹之關鍵字為 tea tree 及 Melaleuca alternifolia, 副作用及不良反應之關鍵字為 toxic, adverse effect 及 side effect 2. 文獻之納入標準以茶樹精油及毒性 不良反應為關鍵字, 並以 Medline, EMBASE, Cochrane 及 PubMed 等資料庫搜尋, 排除昆蟲毒性或環境用藥文章, 本類文獻以回顧及個案報告為主 3. 納入文獻之質量評值方法以表九之 Jadad score 所規範, 提出隨機分配方法 雙盲方法及退出實驗之機制 原因說明者皆給予一分, 隨機分配及雙盲方法不當者各扣一分, 總分最高為五分, 最低為零分 二 茶樹精油安全性之實證醫學探討結果 1. 茶樹精油安全性之系統評價結果經過系統性文獻回顧有關茶樹精油毒性及不良反應之相關文章共七篇, 依照研究的對象整理如表十六所示 因皆為文獻回顧或個案報告, 而非臨床試驗所以無法以 Jadad score 評值 其中有六篇提及茶樹精油用於人體會產生局部不良反應, 如接觸性過敏和刺激反應 皮膚炎等 ; 或全身不良反應如運動失調及昏睡, 大量攝食甚至會引起中毒反應 至於在動物方面亦有中毒之狀況, 而有憂鬱 虛弱 共濟失調及肌肉震顫等全身性反應 加上表十中 Enshaieh 於 2007 年發表的文章指出以 60 人進行的隨機雙盲試驗, 50

58 共有 10 % 使用茶樹精油的試驗對象發生輕微搔癢及 3.33 % 發生輕度 燒灼感, 與對照組之上述發生率皆為 6.66 % 相較並無顯著差異, 惟因 人數不多, 雖實驗組有 3.33 % 輕微脫皮反應 161, 僅能證實茶樹精油 對特定人群會有較易感之皮膚毒性 所以在使用 包裝及儲存上都應 小心規範 表十六 茶樹精油之不良反應相關文獻回顧 研究對象 產生之毒性反應 濃度 參考資料 人類 接觸性過敏和刺激反應, 攝 Hammer KA. 2006, % 食高劑量導致中毒 Carson CF 人類 運動失調與昏睡 NA Del Beccaro MA. 1995, Jacobs MR 人類 皮膚炎 NA Willcox M 人類 植物性皮膚炎包括 : 刺激性植物皮膚炎 光毒性及光過敏性皮膚炎 過敏性皮膚 NA Schempp CM. Schopf E. Simon JC.2002 炎 空氣傳播之接觸性皮膚炎 狗, 貓 全身反應 ( 憂鬱, 虛弱, 共濟失調, 肌肉震顫 ) NA Hammer KA 天竺鼠 耳毒性 NA Hammer KA HeLa, K562, CTVR-1, Molt-4, Hep G2, HL-60, fibroblast and epithelial cells 細胞毒性 NA Hammer KA Soderberg TA. Johansson A. Gref R 至於茶樹精油之主要毒性成分 1,8-cineole (eucalyptol), 其代謝之 研究曾在多個動物實驗中被探討, 其在大鼠及人類體內之代謝分別經 由環之羥基化而形成 2-hydroxy-1,8-cineole 或 3-hydroxy-1,8-cineole 如 圖十五 180 精油類物質也容易因儲存不當或包裝不良而發生降解作用 (degradation); 空氣中的氧 高溫及光線是讓精油發生降解的主要原 因 179, 而 terpenes 類化合物如 :limonene 及 pinene 又是較易發生氧化反 應的成分 氧化作用會因為溫度上升及光線照射而加速, 而這些變化 51

59 影響某些精油的療效,Orafidiya 於 1993 年針對檸檬草精油 ( 含 citral 及 limonene) 研究, 發現蓄意氧化的精油與新鮮檸檬草精油相較, 會大幅失去抗菌作用 Terpinene 類發生降解反應會形成致敏物, 對皮膚發生危害 柑橘屬的精油在氧化後甚至會形成對齧齒類有輕微致癌性的物質 所以精油類產品一般建議在購買或開瓶後一年內需用畢, 若冰 存於冰箱等冷藏環境, 可以使用兩年 181 圖十五 1,8-Cineole (eucalyptol) 在大鼠及人體內之代謝 茶樹精油皮膚局部使用會發生不良反應之濃度介於 0.5~100 % 間, 急性口服毒性在 Sprague Dawley rats 之 LD 50 為 2.6 ml/kg, 而在 non-spf rats 則為 1.9 ml/kg, 而低於 1.5 g/kg 亦會引起無力及共濟失調症狀 分別有 個月兒童口服少於 10 ml 之 100 % 茶樹精油發生共濟失調 嗜睡 意識不清及暫時無法行走等現象

60 2. 茶樹精油不良反應之文獻回顧精油產品發生不良反應之個案報告所在多有, 而茶樹精油之不良反應報告也頗多 但是除了茶樹之外, 還有許多來自植物的精油是潛在的接觸性過敏原, 如表十七 若著眼於製造批次間產生的變異, 很幸運的市售茶樹精油有其精油成分類型的標準化, 包含 terpinen-4-ol 等 14 種成分設定最大值及最小值之國際標準規範 ( 表三 ) 值得注意的此標準未規定茶樹精油其原植物種類之來源, 而是以描述其化學結構 (chemotype) 之物理及化學規範, 是否有業者在批次之間以欠缺之單一成分加入萃取完成精油中, 以求能符合 ISO 4730 標準之規範或相關單位之檢驗就不得而知了 而茶樹精油所含化學成分之中, 包含有效成分 terpinen-4-ol, 亦有其不常被提及會引起接觸性皮膚炎的成分 1,8-cineole ( 亦即 eucalyptol),1,8-cineole 亦是從許多桉屬 (Eucalyptus) 包括 Eucalyptus globulus 及 E. polybractea 等植物收成的桉葉油之主要成分, 雖然桉屬及白千層屬均為桃金娘科植物, 但其精油組成明顯不同, 所以澳洲茶樹仍然是市售茶樹精油的主要商業來源 1994 年 Van der Valk 等人描述茶樹精油過敏的四個個案, 進一步揭示桉葉油及茶樹精油之混用 歐盟登錄的三種 Melaleuca 類型組成分別是 :Melaleuca alternifolia oil ( 抗微生物 ),Melaleuca cajuputi 萃取物 ( 身體調理,tonic),Melaleuca leucadendron 萃取物 ( 身體調理 ) 53

61 表十七 精油植物主成分及潛在之接觸性過敏原 精油 ( 植物名 ) 主成分 Tea tree (Melaleuca alternifolia) 澳洲茶樹 Terpinen-4-ol, 1,8-cineole(eucalyptol) 桉葉醇, γ-terpinene, α-terpinene, α-terpineol, ρ-cymene, terpinolene, α-pinene 蒎烯, d-limonene 檸檬烯 Melissa (Melissa officinalis) 香蜂草 Geraniol 香葉醇, linalool, citronellol, citronellal Ginger (Zingiber officinale) 薑 Sesquiterpenes, linalool, phellandrene Thyme (Thymus vulgaris) 銀斑百里香 Geraniol, linalool, parachymene, thujanol Rose (Rosa damascena) 大馬士革玫瑰 l-citronellol, geraniol 香葉醇, nerol, linalool, farnesol, esters Lavender (Lavandula angustifolia) 薰衣草 Linalyl acetate, linalool, geraniol 香葉醇 Eucalyptus (Eucalyptus radiata) 澳洲尤加 Cineol, Monoterpenes, 1,8-cineole (eucalyptol) 桉葉醇 利 Bay (Laurus nobilis) 月桂 Cineol, eugenol 丁香酚 (small amount), pinene Rosemary (Rosmarinus officinalis) 迷迭香 Pinene, camphene, cineol, camphor, borneol, sesquiterpenes, carnosol 鼠尾草苦內酯 Lemon (Citrus limonum) 檸檬 Pinene, geraniol 丁香酚, d-limonene 檸檬烯, citral 檸檬醛 Cypress (Cupressus sempervirens) 絲柏 Monoterpenes, sesquiterpenes, such as 7 % cedrol Clove (Eugenia caryophyllata) 丁香 Eugenol 丁香酚, isoeugenol 異丁香酚 Neroli (Citrus aurantium bigarade) 橙花 Monoterpenes, alcohol tepenes, jasmine, nerol 橙花醇 Cinnamon (Cinnamomum zeylanicum) 錫 Eugenol 丁香酚, cinnamaldehyde 蘭肉桂 Jasmine (Jaminum sambac) 茉莉花 Jasmine, linalool, geraniol 香葉醇, nerol 橙花醇, benzyl acetate, linalyl acetate, benzyl alcohol, indole Citronella oil (Cymbopogon nardus) 香茅 Citronellal, geraniol 香葉醇 Nutmeg (Myristica fragrans) 肉豆蔻 Monoterpene (pinenes, camphene, limonenes, geraniol, α-terpineol), phenylpropane derivatives (myristicine, elemicine, safrol, eugenol, methoxy-eugenol, isoeugenol, methylisoeugenol), isopropyl myristate 異丙基肉豆蔻酸鹽 * The potential contact allergens of essential oils were marked in italic type on the column of the major compositions. 54

62 根據 Rutherford 等針對茶樹精油回顧性的過敏研究, 在超過 4.5 年觀察澳洲 2320 位貼膚試驗的患者有 41 位對氧化茶樹精油有過敏反應 (positive reaction) 發生率約為 1.8 %, 其中與茶樹精油相關的皮膚炎有 17 件 (41 %), 那些過敏反應的患者中, 有 27 位 (66 %) 再次使用先前的茶樹精油, 而其中 8 位 (20 %) 先前使用的茶樹精油濃度為 100 % 大氣中的氧 光線或高溫會引起新鮮茶樹精油的變質,α-terpinene γ-terpinene 及 terpinolene 會氧化成 p-cymene 或水解形成 terpinen-4-ol 而濃度降低,p-cymene 則會增加高達 10 倍, 而氧化過程則會形成 peroxides endoperoxides 及 epoxides 等 茶樹精油過敏性接觸皮膚炎 (allergic contact dermatitis, ACD) 文獻報導不多, 但是在澳洲是十分常見, 通常以 10 % 濃度加入石蠟油 (petrolatum) 中進行標準的貼膚試驗 (patch-test) 新鮮剛開封抽出的茶樹精油產品是無反應或反應較弱的, 而氧化態的茶樹精油則常被用於貼膚試驗 所有在 2000 年 1 月至 2004 年 6 月間經澳洲墨爾本的皮膚癌症基金會接觸性皮膚炎和職業性皮膚炎資料庫確認的患者, 無論是 5 % 或 10 % 濃度的茶樹精油貼膚試驗中均為有反應 茶樹精油 10 % 是 Rutherford 依照歐盟標準提供, 而 5 % 則是由瑞典 Malmo 公司提供稱作 Chemotechnique Diagnostics 商業化的過敏原也運用於某些病患的貼膚試驗 10 % 貼膚試驗的製備方式是由藥局購買純茶樹精油經藥師以白軟石蠟 (white soft paraffin) 稀釋後, 將其開瓶放置於窗架數天氧化後, 再將移至密封罐放置於冰箱, 需要貼膚試驗時再將其置入注射器中 病患貼膚試驗使用之過敏原由 Chemotechnique Diagnostics (Malmo, Sweden) 及 Trolab Hermal (Reinbek, Germany) 與其經適當稀釋之產品獲得, 以 Finn Chambers on Scanpore (Epitest OY, Tuusulam, Finland) 貼敷於上背放置 48 小時 依照國際接性皮膚炎研 55

63 究指引在 48 及 96 小時或 120 小時於敷料移除 30 分鐘後記錄 經測量後分為刺激的 (irritant, irr), 疑似的 (equivocal, +/ ), 輕微反應 (weak positive, +), 強反應 (strong positive, ++) 或極強反應 (extreme positive, +++) 等, 病患唯有輕微反應以上才運用於後續分析 2007 年伊朗的 Enshaieh 等人以 5 % 的茶樹精油針對 60 個門診病患進行的隨機雙盲試驗, 茶樹精油治療組 30 人中有 3 人 (10 %) 抱怨輕微的皮膚搔癢, 有 1 人 (3.33 %) 報告在使用此藥品及另一種時略有燒灼感 安慰組有 2 人 (6.66 %) 抱怨輕微的皮膚搔癢,2 人 (6.66 %) 報告在使用此藥品時略有燒灼感 161 茶樹精油成分造成之毒性如 表十八 表十八 茶樹精油成分造成之毒性 ISO 4730 規範之成分 其它成分 成分 α-terpinene 1,8-Cineole (i.e., eucalyptol) α-pinene α-terpineol (Terpineol) Limonene R-(+)-Limonene b-myrcene Phellandrene α-thujene 毒性試驗 Maternally toxic [125 and 250 mg/kg body weight orally] No observed adverse effect level [at 30 mg/kg orally] Induction of the liver microsomal activities of CYP 2B1/2 & CYP 3A1/2 Potentiate thioacetamide-induced hepatotoxicity and immunosuppression Induction of protein droplet (alpha 2 mu-globulin) nephropathy in rats Induction of hypersensitivity Toxic to salmonids (coho salmon) and rainbow trout Slight (but dose-related increase) mutagenic in the Ames test Might be toxic to the respiratory tract in horses Exposure result in toxic effects Induction of hypersensitivity Induction of protein droplet (alpha 2 mu-globulin) nephropathy in rats Important allergen result in allergic contact dermatitis Induction of liver monooxygenases (CYP2B1/B2) Peritonitis Genotoxicity by inhibiting certain forms of CYP450 in vitro Absence of genotoxic activity of beta-myrcene in vivo not mutagenic in the Ames test Induction of hypersensitivity Neurotoxicity 茶樹精油成分 terpinene 口服 125~250 mg/kg 懷孕大鼠體重, 在第 6~15 天呈現顯著體重下降, 而 1,8-cineole 在 Sprague Dawley 雄性大鼠及 BALB/c 雌性小鼠皆發現在 cytochrome P450 (CYP) 有誘導作用, 而可 56

64 能在化學物質引發的肝毒性 免疫毒性扮演代謝活化之角色 α-pinene α-terpineol 及 limonene 皆會引發過敏 (hypersensitivity) 或毒性反應, 雖然無實驗數據證實茶樹精油能經皮吸收, 但由於其主要成分之親脂性, 所以推論其能被皮膚迅速吸收, 而經由體循環傳送至全身, 這也就說明了為何局部外用之後會有全身性的神經毒性反應 有鑑於此, 歐盟各國組成的歐洲化妝品協會 (European cosmetic toiletry and perfumery association, COLIPA) 建議茶樹精油濃度大於 1 % 不應用於化妝品 瑞士皮膚科門診 1216 位經茶數精油貼布試驗 (patch test) 之患者, 有 7 位發生了接觸性皮膚炎, 其中的 2 位也對香水或松香有第四型的過敏反應 (type IV hypersensitivity) 茶樹精油引起皮膚毒性可能機制為使用者對精油成分產生過敏反應, 而引發此反應之過敏原可能是 1,8-cineole, limonene, α-pinene 等, 或是精油成分氧化後之產物, 如 :endoperoxide ascaridole, 1,2,4-trihydroxymenthane 等 57

65 第三節實驗部份毒性評估及統計方法是參考行政院衛生署 中藥藥膠布 臨床前動物安全性評估及人體貼膚測試規範, 刺激性評估 / 利用目視或皮膚色差儀記錄皮膚發紅程度及其他反應, 如表十九 ( 評分標準參考 Draize-FHSA scoring system) 表十九 皮膚紅腫評分表 (Draize-FHSA scoring system) Skin Reaction ( 皮膚反應 ) Value ( 刺激值 ) Erythema and Eschar Formation ( 紅斑及痂皮生成 ) No erythema ( 無紅斑 ) 0 Very slight erythema (barely perceptible) ( 剛可辨認之輕微紅斑 ) 1 Well-defined erythema ( 明顯紅斑 ) 2 Moderate to severe erythema ( 中至強度紅斑 ) 3 Severe erythema (beet redness) to slight eschar Formation (injuries in depth) ( 強度紅腫及輕微痂皮生成 ) 4 Necrosis (death of tissue) ( 組織壞死 ) +N Eschar (sloughing or scab formation) ( 痂皮生成 ) +E Edema Formation ( 浮腫形成 ) No edema ( 無浮腫 ) 0 Very slight edema (barely perceptible)( 剛可辨認之輕度浮腫 ) 1 Slight edema (edges of area well-definde by definite raising) ( 與周圍可明顯區別之浮腫 ) 2 Moderate edema (raised approximately one definite raising) ( 中至強度浮腫即約 1mm 左右的浮腫 ) 3 Severe edema (raised more than one millimeter and extending Beyond the area of exposure) ( 超過 1mm 且擴散至周圍區域之浮腫 ) 4 刺激指數 (Primary Dermal Irritation Index, PDII) = 刺激值 / 觀察次數 PDII=0.0 nonirritant ( 完全無刺激性 ) > negligible irritant ( 幾乎無刺激性 ) > mild irritant ( 弱刺激性 ) > moderate irritant ( 中度刺激性 ) > severe irritant ( 強刺激性 ) 一 單一劑量皮膚毒性試驗單一劑量 ( 急性 ) 毒性試驗主要是探討藥物於 24 小時內投予單次或多次劑量後所產生毒性作用的試驗, 任何即將運用於人類的藥物都需要有動物急性毒性試驗 這些試驗的結果有助於重覆劑量試 58

66 驗 皮膚過敏性試驗 皮膚刺激性試驗及光過敏性試驗的設計, 也可用來預測特定器官的毒性作用, 有時甚至也可看出延遲性毒性的反應 急性毒性試驗之結果也可幫助第一期人體試驗之劑量選擇, 避免人體試驗產生藥物過量反應 1. 實驗材料 1.1 實驗動物品系 : 由國科會實驗動物中心購入,6-8 週齡的雄性或雌性 Wistar 大鼠, 飼養於 12 小時光照 12 小時無光照循環交替之環境中, 溫度控制於 25±1, 給予充足的水與飼料 數量 : 每個劑量組 3 隻 1.2. 試藥空白組 : 市售荷荷芭油 (Fleur aromatherapy) 實驗組 : 蒸餾萃取之茶樹精油 100 % ( 製備如 23 頁 ) 茶樹精油利用荷荷芭油稀釋後觀測茶樹精油皮膚刺激的強弱, 使用濃度為 0.25~10 % 等倍稀釋 標準品 : Terpinen-4-ol 為茶樹精油中之主成分, 1,8-cineole 為茶樹精油中可能產生毒性之物質, 因此以高濃度 1.5 % /site (100 mm/site) 為測試劑量 市售品 : 由化工材料行與百貨公司購得數種茶樹精油 : TTO-B~F 1.3. 實驗儀器檢測工具 :Scalar USB shot 檢測軟體 :USB Digital scalar 1.0E 2. 實驗方法 59

67 將測試動物 Wistar 大鼠於測試前將背部之毛剔除 剔毛 24 小時後, 先行檢測皮膚是否完整無過敏現象, 再將製備適當濃度的標準品及各種茶樹精油, 塗抹於老鼠背上, 每隻塗抹 3 處, 每處塗抹面積為 cm 2 之正方形, 塗藥時觀察大白鼠是否有異狀, 並先測量塗藥前 Wistar 大鼠皮膚的基礎顏色 ( 如圖十六 ) 待塗藥以後每隔 24 小時測量, 利用 Scalar USB shot 及檢測軟體 USB Digital scalar 1.0E 觀察是否有皮膚過敏現象, 並參考 Draize-FHSA scoring system 觀察敷藥部位的皮膚反應, 評估每隻測試動物之皮膚過敏反應程度 紅斑與紅腫的發生頻率與程度可藉由與正對照組與空白組的比較加以評估 標示 2.5 cm X 2.5 cm 的框 給藥 塗藥後皮膚顏色測量 0.48% 圖十六 單一劑量皮膚毒性試驗操作圖 60

68 3. 單一劑量皮膚毒性試驗結果 3.1. 單一劑量皮膚毒性試驗正對照組 neomycin 評估量表之建立在塗抹 10 % neomycin 48 小時後, 可觀察到在此劑量有輕微的過敏產生, 但以 Fraize-FHSA 評分則為幾乎無刺激性, 隨著劑量增加至 20 % 及 40 % 皆能有效產生皮膚弱刺激反應 本實驗定義皮膚刺激的程度是以 Primary dermal irritation index 為準, 刺激指數大於 0 至 0.5 % 為幾乎無刺激性, 刺激指數大於 0.5 至 2.0 % 為弱刺激性, 刺激指數大於 2.0 至 5.0 % 為中度刺激性, 若紅腫程度大於 5.0 至 8.0 % 以上為強刺激性, 建立以此 neomycin 作為正對照組, 確立本實驗可以有效的引發老鼠皮膚過敏的現象, 且有濃度與時間的依存性, 如圖十七 表二十 表二十一所示 0 小時 24 小時 48 小時 Solvent control 10 % Neomycin 20 % Neomycin 40 % Neomycin 圖十七 Neomycin 單一劑量皮膚毒性試驗評估表二十 Neomycin 單一劑量皮膚刺激試驗紅腫比較 solvent control 10% neomycin 20% neomycin 40% neomycin 0 hr 1.32 ± ± 0 0 ± ± hr 2.26 ± ± ± ± hr 0.48 ± ± ± ± 2.33 Mean ± SD 61

69 表二十一 Neomycin 紅腫評分比較表 (Draize-FHSA scoring system) solvent control 10% neomycin 20% neomycin 40% neomycin 0 hr 0.00 ± ± ± ± hr 0.17 ± ± ± ± hr 0.00 ± ± ± ± 0.41 Mean ± SD 由表二十 二十一發現 neomycin 在本研究中單一劑量皮膚刺激紅 腫比較與 Draize-FHSA 之評分, 在塗抹 20, 40 % neomycin 48 小時後分 別有 11.57~13.51 之倍數相關 本實驗將以 100 % 茶樹精油為標準樣 品, 做為建立茶樹精油安全性評估模式 並利用上述建立之皮膚急 性毒性評量表, 向下探尋茶樹精油標準樣品之最低致皮膚急性毒性 的濃度, 以提供日後市售茶樹精油樣品毒性之參考依據 3.2. Terpinen-4-ol 與 1,8-cineole 之單一劑量皮膚急性毒性試驗結果 茶樹精油中主成分 terpinen-4-ol 以不同濃度進行皮膚刺激試驗 本實驗所使用之濃度為 100 mm 之濃度, 換算成為 1.5 %; 此濃度較 ISO 4730 之換算濃度略高,2 % ( 具有輕微皮膚刺激之濃度 ) * 30 % (ISO 4730 之規範最低含量 ) = 0.6 %, 評估 terpinen-4-ol 之皮膚毒性 主要毒性成分 1,8-cineole 也是利用相同濃度進行評估 Terpinen-4-ol 在濃度 1.5 % /site (100 mm) 不具有皮膚刺激的毒 性, 目前也無文獻指出 terpinen-4-ol 會造成皮膚毒性 1,8-Cineole 在 濃度 1.5 % /site (100 mm) 具有輕度的皮膚刺激的毒性, 當濃度低於 % /site 時, 不會對皮膚造成影響, 此濃度也低於 ISO 4730 所規 範之濃度 如表二十二 表二十二 Terpinen-4-ol 與 1,8-cineole 之單一劑量皮膚急性毒性試驗 Terpinen-4-ol 0.19 % /site % /site 0.75 % /site 1.5 % /site (Mean ± SD) 0 hr 2.39± ± ± ± hr 2.84 ± ± ± ± hr 3.20 ± ± ± ±

70 表二十二 Terpinen-4-ol 與 1,8-cineole 之單一劑量皮膚急性毒性試驗 1,8-Cineole 0.19 % /site % /site 0.75 % /site 1.5 % /site 0 hr 3.13 ± ± ± ± hr 3.48 ± ± ± ± hr 3.66 ± ± ± ± 2.02 (Mean ± SD) 3.3. 茶樹精油單一劑量皮膚毒性試驗結果 我們利用自行萃取符合 ISO 4730 規範之茶樹精油 TTO-A 作為標 準品, 探求不會造成皮膚毒性的濃度, 再依此結果進行市售之茶樹 精油的毒性評估 塗抹不同濃度之茶樹精油 24 小時後, 即可觀察到有不同程度之皮膚 過敏反應產生, 隨著劑量與時間的增加產生皮膚刺激反應也越趨明 顯 實驗結果顯示 : 以荷荷芭油為稀釋劑, 在相同濃度下比較皮膚毒 性的強度 ; 荷荷芭油稀釋之茶樹精油 TTO-A 在濃度為 2 % 時仍然會 產生中度之皮膚刺激性, 而 0.5 及 1 % 之 TTO-A 則有弱刺激性, 小於 0.25 % 之濃度則為幾乎無刺激性 因此我們選用坊間芳香療法中較 盛行之基底油荷荷芭油為後續實驗的稀釋溶劑 茶樹精油單一劑量 皮膚刺激試驗紅腫比較如表二十三 表二十四所示 3.4. 市售茶樹精油之單一劑量皮膚急性毒性試驗結果我們以蒸餾萃取之茶樹精油 TTO-A 為標準對照樣品, 找尋出適合評估茶樹精油對於皮膚的毒性的濃度為 2 % 時有中度刺激性, 因此我們利用此濃度去評估市售之茶樹精油的單一劑量毒性試驗, 如表二十五所示 結果顯示 TTO-B 及 TTO-C 等產品所造成的皮膚刺激較明顯, 但在抑制金黃色葡萄球菌效果不佳 ( 表十五 ),TTO-B 之 terpinen-4-ol 1,8-cineole ρ-cymene limonene 含量較高, 而 TTO-C 則以 α-terpinene terpinolene 及 α-terpineol 較高 ( 表七 ) 63

71 表二十三 茶樹精油單一劑量皮膚刺激試驗紅腫比較 ( 濃度 /site) 濃度 0 % 0.25 % 0.5 % 1 % 2 % 5 % 10 % 0 hr 1.53 ± ± ± ± ± ± ± hr 2.10 ± ± ± ± ± ± ± hr 2.89 ± ± ± ± ± ± ± 5.50 (Mean ± SD) 表二十四 茶樹精油之皮膚毒性利用 Draize-FHSA scoring system 分析 濃度 0 % 0.25 % 0.5 % 1 % 2 % 5 % 10 % 0 hr 0.00 ± ± ± ± ± ± ± hr 0.17 ± ± ± ± ± ± ± hr 0.17 ± ± ± ± ± ± ± 1.21 表二十五 市售品茶樹精油之單一劑量皮膚急性毒性試驗評分表 (2% /site) 市售品 TTO-B TTO-C TTO-D TTO-E TTO-F 0 hr 3.85 ± ± ± ± ± hr 6.09 ± ± ± ± ± hr ± ± ± ± ± 0.77 (Mean ± SD) 64

72 茶樹精油在許多的網路文章提到是可以直接塗抹於皮膚上的精油, 但濃度的選擇卻需要更仔細的標示 本實驗利用以 TTO-A 做為標準樣品, 建立茶樹精油單一劑量皮膚刺激試驗的評分標準, 確立茶樹精油有引發老鼠皮膚過敏的現象, 且有濃度與時間之依存性, 可提供未來茶樹精油添加於化妝品之接觸性及毒性檢驗依據 以 TTO-A 檢測茶樹精油在 2 % /site 的濃度下, 為誘發皮膚中度刺激性的劑量, 因市售品成分雖大致上均符合 ISO 4730 規範, 但仍存在微量的個別差異足以引發潛在的皮膚刺激性, 消費者在使用時需要特別注意 而濃度低於 0.25 % /site 以下則為安全的使用濃度 本實驗檢測使用市面上容易購得之 5 種茶樹精油產品, 利用單一劑量毒性實驗分析, 其造成皮膚刺激的濃度相近, 可能與其主成分類似皆符合 ISO 4730 的標準, 因此市面上之銷售產品, 未來在標示其使用方式時應添加警語, 提醒消費者茶樹精油的安全濃度 目前在茶樹精油的建議使用量為 1 %~10 %, 且宣稱茶樹精油為少數可以直接塗抹於皮膚上之精油, 這些類似的標語或濃度也應該加以規範 二 塗抹茶樹精油 28 天之肝腎毒性評估依據中藥新藥臨床試驗作業準則草案總說明, 進行重複劑量毒性試驗時, 臨床第一 二 三階段及查驗登記時必須提供重複劑量毒性試驗之最短給藥期間, 在囓齒類動物為依照藥品在臨床試驗使用期間之長短, 規定為最少應為 2 星期至 1 個月 我們利用蒸餾萃取的茶樹精油 TTO-A 作為標準品, 尋找出在 2 % /site 的劑量下會造成皮膚輕微毒性 因此我們利用此劑量重複投予在 Wistar 大鼠背上, 藉此觀察茶樹精油是否會造成肝腎毒性, 並以 Wistar 大鼠血清中肝腎功能之 65

73 指數 GOT, GPT, BUN, CRE 為標的 1. 試驗材料 1.1. 實驗動物品系 : 由國科會實驗動物中心購入,6-8 週齡的雌性 Wistar 大鼠, 飼養於 12 小時光照 12 小時無光照循環交替之環境中, 溫度控制於 25±1, 給予充足的水與飼料 數量 : 每個劑量組 3 隻 1.2. 試藥空白組 : 荷荷芭油實驗組 :TTO : 2 % 1.3. 實驗儀器 :Fujiflim Dry-Chem 3500s (Fujifilm Co., Tokyo, Japan) 2. 實驗方法以會引起輕微皮膚過敏之茶樹精油 TTO (2 % /site), 連續 28 天塗抹於剃毛 Wistar 大鼠之背部, 除每日觀察其皮膚過敏的狀態外, 並於每七日採血一次, 分析肝腎功能之生化數值變化 利用 glutamic oxaloacetic transaminase (GOT) 及 glutamic pyruvic transaminase (GPT) 之生化檢驗數值評估肝功能, 並以 blood urea nitrogen (BUN) 及 creatinine clearance (CRE) 評估腎功能 3. 塗抹茶樹精油 28 天之肝腎毒性評估結果本實驗使用 10 至 18 週齡之雌 Wistar 大鼠其血中肝腎功能之生化檢驗參考值如表二十六 長期塗抹溶於荷荷芭油之茶樹精油, 在第零天時測量老鼠的肝腎功能的基準值, 兩組之間並無顯著的差異 隨著觀測時間的延長, 在肝功能指數中 GOT 在第 7 及 21 天有些許下降, 但由於茶樹精油組與控制組同時降低, 兩組之間並無顯著差異 66

74 (p 值介於 0.09~0.89 之間 ), 但茶樹精油組的 GOT 值在第 7 及 21 天與基準值相較有顯著差異的下降 (p = 0.038, 0.017), 其原因為何尚待更進一步之探討 而 GPT 則是在測試第 7 天時兩組同時都有下降之現象, 但於第 天時升高至塗抹茶樹精油前之水準, 且無論是茶樹精油組與控制組之間, 或同一組各自與開始塗抹之基準值相較皆無顯著差異, 因此推測茶樹精油可能不會對肝功能造成不利之影響 如圖十八 (A) 和 (B) 腎功能的評估是藉由長期塗抹茶樹精油之大鼠血中尿素氮 (blood urea nitrogen, BUN) 與血清肌酸酐 (Creatinine, CRE) 觀測, 而探求茶樹精油長期局部外用對大鼠腎功能所造成之影響 經 28 天塗抹並於每 7 天分別採血檢驗發現對照組與茶樹精油之間 BUN 值均無顯著差異 (p 值介於 0.49~0.81 之間 ) 如圖十八 (C) 和 (D) 表二十六 雌性 Wistar 大鼠血中肝腎功能之生化檢驗參考值 Items Unit 7 Weeks 10 Weeks 18 Weeks 52 Weeks AST (GOT) U/L *54.9 ± ± ± ± 68.4 ALT (GPT) U/L 24.7 ± ± ± ± 10.7 BUN mg/dl ± ± ± ± 4.08 CREA mg/dl 0.39 ± ± ± ± 0.07 *Mean ± SD 67

75 180 TTO-A Solvent control GOT (U/L) Day 0 Day 7 Day 14 Day 21 Day 28 圖十八 長期塗抹 TTO-A 之後大鼠血清 GOT 值 (A) TTO-A Solvent control 80 GPT (U/L) Day 0 Day 7 Day 14 Day 21 Day 28 圖十八 長期塗抹 TTO-A 之後大鼠血清 GPT 值 (B) 68

76 25 TTO-A Solvent control 20 BUN (mg/dl) Day 0 Day 7 Day 14 Day 21 Day 28 圖十八 長期塗抹 TTO-A 之後大鼠血清 BUN 值 (C) TTO-A Solvent control Creatinine (mg/dl) Day 0 Day 7 Day 14 Day 21 Day 28 圖十八 長期塗抹 TTO-A 之後大鼠血清 CRE 值 (D) 69

77 三 討論依據文獻搜尋可以得知過量之茶樹精油有引發人類及貓 狗 天竺鼠等神經毒性之個案報導, 分別產生運動失調 昏睡 憂鬱 虛弱 肌肉震顫及耳毒性等不良反應, 而在建議劑量或安全使用濃度之下, 長期表皮塗抹是否會影響肝腎功能也是我們應正視的課題, 而以往並未有研究針對此方面探討 本實驗以 neomycin 作為引發皮膚刺激之標準方法, 並以其在 40 % 24 小時及 20 % 48 小時之單一劑量皮膚刺激試驗紅腫程度, 再加上紅腫程度評分比較表為基準加以評估 發現 terpinen-4-ol 相對於 1,8-cineole 對皮膚而言是較安全的, 因為坊間許多精油都有 1,8-cineole 之成分, 所以應該對最高建議局部使用之濃度加以明文規範, 抑或廠商應在包裝外盒標示相關警語, 以維護廣大消費者的安全 高濃度茶樹精油可能對皮膚造成刺激有許多個案報導, 但即便是完全符合 ISO 4730 規範之茶樹精油以 2 % 以上濃度進行塗抹, 就有可能對皮膚造成中重度的傷害 市售品中抑制金黃色葡萄球菌效果最佳之 TTO-F, 其皮膚刺激性並不是最高, 而 1,8-cineole 含量最高的 TTO-B 其在 48 小時有輕微刺激, 但 TTO-C 之 1,8-cineole 含量並不特別高, 卻在 48 小時後有中度的刺激, 顯示茶樹精油對皮膚刺激除了 1,8-cineole 之外, 可能與茶樹精油組成間之不同比例有關, 抑有可能是微量的氧化物質所造成 我們以茶樹精油 TTO-A 2 % 進行 Wistar 大鼠皮膚 28 天連續塗抹, 觀察到茶樹精油組與溶劑對照組之 GOT GPT BUN 與 CRE 間會隨著塗抹時間逐週改變, 但兩者之間並無顯著差異, 推論茶樹精油在此濃度下, 局部長期塗敷並不會對肝腎功能造成影響 70

78 第五章結論 茶樹精油產品的品質管制, 已有國際標準值 ISO4730, 因此建議茶樹精油產品都應進行品質管制, 並於產品包裝上標示各成分之含量 茶樹產地 採收部位 製程對精油成分之影響極大, 而茶樹精油的保存條件攸關療效與不良反應發生之機會, 因此除應明訂相關精油製程 容器之規範外, 更應鼓勵製造廠商標示消費者淺顯 易懂的仿單或說明書, 以教導正確的阻光 放置陰涼處所及避免接觸空氣等方法, 以有效提升治療效果及降低皮膚刺激反應發生之機率 茶樹精油之治療用途極為廣泛, 但即使是符合 ISO 4730 規範之不同產品, 亦隨著其中抑制金黃色葡萄球菌最強的前三個成分 terpinolene α-terpinene 及 α-terpineol 之比例不同, 而存在著顯著的抑菌差異, 因此可以藉此檢驗茶樹精油組成差異, 來推估其潛在的抗金黃色葡萄球菌活性 茶樹精油目前原料化工廠建議茶樹精油使用量為 1 %~10 %, 依用途不同而有所差異, 但根據本研究之毒性試驗結果, 即使是 2 % 濃度下亦會對皮膚造成嚴重程度不等的刺激反應, 因此建議茶樹精油使用時應加入適量荷荷芭油等基底油, 並以不超過 2 % 為較安全之劑量 塗抹 2 % 茶樹精油可明顯誘導皮膚過敏, 連續塗抹 28 天, 未發現肝腎毒性, 顯示會誘導皮膚過敏之劑量與肝腎毒性無直接關係 根據實證醫學及基礎研究對於茶樹精油應用於痤瘡治療之功效與安全性之探討, 我們發現茶樹精油確實能有效抑制金黃色葡萄球菌, 並有抗發炎之機轉, 而達成治療痤瘡之效果 ; 且若僅表皮低濃度局部使用而非口服, 亦不會對身體造成毒性 71

79 第六章參考文獻 1. Collier CN, Harper JC, Cafardi JA, et al. The prevalence of acne in adults 20 years and older. J Am Acad Dermatol 2008;58: 蔡旻倩, 賴志昇, 王振宇, et al. Acne Prevalence in Elementary School Students-A Comparative Epidemiological Study between Kaohsiung County and Magong Township. 中華皮膚科醫學雜誌 2006;24: Warner GT, Plosker GL. Clindamycin/benzoyl peroxide gel: a review of its use in the management of acne. Am J Clin Dermatol 2002;3: National Center for Biotechnology Information (Accessed October 16, 2007, at 5. Hughes-Formella BJ, Filbry A, Gassmueller J, Rippke F. Anti-inflammatory efficacy of topical preparations with 10% hamamelis distillate in a UV erythema test. Skin Pharmacol Appl Skin Physiol 2002;15: Duwiejua M, Zeitlin IJ, Waterman PG, Gray AI. Anti-inflammatory activity of Polygonum bistorta, Guaiacum officinale and Hamamelis virginiana in rats. J Pharm Pharmacol 1994;46: Iauk L, Lo Bue AM, Milazzo I, Rapisarda A, Blandino G. Antibacterial activity of medicinal plant extracts against periodontopathic bacteria. Phytother Res 2003;17: Gloor M, Reichling J, Wasik B, Holzgang HE. Antiseptic effect of a topical dermatological formulation that contains Hamamelis distillate and urea. Forsch Komplementarmed Klass Naturheilkd 2002;9: Deters A, Dauer A, Schnetz E, Fartasch M, Hensel A. High molecular compounds (polysaccharides and proanthocyanidins) 72

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