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皿图花
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1 亚硝胺检测的整体解决方案以及方法包介绍赛默飞世尔科技三重四极杆串接气质

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3 目录一. 方法包简介 4 二. 仪器简介 5 三. 化合物简介 6 四. 相关政策及法规 7 五. 仪器和设备 7 六. 样品前处理方法 8 七. 方法包使用简介 1 八. 应用文章 14 3

4 一. 方法包简介方法包是赛默飞世尔科技色谱质谱部应用部门针对客户需求提出的简易仪器使用流程, 方法包内所涉及的化合物均为常见的能在 GC/MS 上检测的化合物, 如农药残留多环芳烃多氯联苯多溴联苯和多溴联苯醚邻苯二甲酸酯等方法包的作用就是能使客户更快更简便地使用仪器, 尽快上手方法包包括进样方法数据处理方法 (TraceFinder 方法文件夹 ) 相关应用文章相关标准色谱柱信息前处理方法数据文件等, 客户可以直接调用进样方法和数据处理方法完成化合物的定性定量分析由于 Thermo Scientific TM TSQ 8 Evo 采用 T-SRM 进样方法而不是分时间段的扫描方法, 原来的进样的方法可以直接调用, 即使保留时间会有微小的偏差, 也不会影响最终的结果另外,TraceFinder 软件自带的数据库可以直接编辑数据处理方法, 数据库里包括化合物的名称离子对碰撞能量定量离子定性离子 CAS 号等信息同时,TraceFinder 软件可以根据数据处理方法自动关联生成 TSQ 8 Evo 的方法文件这样应用 TraceFinder 就可以直接生成数据处理方法和进样方法整个过程都是自动化的, 几乎不需要操作者手动输入任何操作信息方法包 (Method Kit) 对于常用分析化合物, 我们可以提供方法包包括 : 邻苯二甲酸酯 PCB PAH PBDE 农残筛查 GB2763 烟草中农残 PM2.5 香港规管方案药典中农残检测亚硝胺二恶英等目的 : 上手方便, 直接使用方法包仪器方法数据处理方法色谱图 RT 色谱柱信息前处理方法相关文献 C1 保留时间 RT: SM: 7G NL: 4.5E5 TIC F: + c EI SRM ms2 37.@cid6. [ ] MS 5ppb-1 NL: 4.5E5 TIC F: + c EI SRM ms2 163.@cid26. [ ] MS 5ppb-1 NL: 4.5E5 TIC F: + c EI SRM ms2 149.@cid34. [ ] MS 5ppb-1 NL: 4.5E5 TIC F: + c EI SRM ms2 149.@cid32. [ ] MS 5ppb-1 NL: 4.5E5 TIC F: + c EI SRM ms2 149.@cid3. [ ] MS 5ppb-1 NL: 4.5E5 TIC F: + c EI SRM ms2 279.@cid22. [ ] MS 5ppb-1 NL: 4.5E5 TIC F: + c EI SRM ms2 225.@cid34. [ ] MS 5ppb-1 NL: 4.5E5 TIC F: + c EI SRM ms2 293.@cid8. [ ] MS 5ppb Time (min) 4

5 二. 仪器简介 TSQ 8 Evo 三重四极杆串接气质联用仪秉承着在气相色谱三重四极杆质谱中技术的一贯领先优势,Thermo Fisher Scientific 在推出 TSQ 8 之后再次创新, 推出了更新的一款气相串接质谱仪 TSQ 8 Evo, 该款高效的 GC/MS/MS 提供了永不停机的生产率, 其出色的灵敏度, 超快的扫描速度, 简便的 MS/MS 功能, 满足最苛刻的定量定性分析要求, 为食品安全环境分析法医和制药应用分析提供基础 TSQ 8 Evo 主要特点 : AutoSRM 功能自动优化二级离子对信息定时保留时间 SRM 功能 (T-SRM) 和定时保留时间 SIM 功能 (T-SIM) 使高通量检测成为可能, 并且优化方法设置参数, 无需分配时间段最新的 TraceFinder 软件, 提供最新的技术平台, 界面友好的色谱分析软件, 可以直接调用数据库信息自动建立数据处理方法及进样方法高达 8 MRM/s 的扫描速度, 即使在极限高速扫描条件下仍不会过多损失灵敏度在质谱不泄真空的情况下, 更换整个离子源, 节省常规系统维护时间, 简化操作双灯丝设计, 并且灯丝在同一侧离子源上具有双加热区, 有效去除基质对离子源的污染, 节省维护时间弯曲的预四极杆, 有效去除中性噪音, 减少背景并提高灵敏度方法桥, 可以读取 Thermo Scientific TM ISQ 单四极杆气质联用仪的方法或者其他公司的 SRM 方法 5

6 三. 化合物简介 N- 亚硝胺物质是国际上公认的一类强致癌物, 其化学式常写作 R 2 N-NO, 在大气水土壤食品烟草化工产品农药和药物等人类环境介质中广泛存在食物中的亚硝胺主要是由亚硝酸生成的亚硝酸通常作为防腐剂被添加到肉及肉制品中, 以避免肉毒杆菌造成的中毒亚硝胺的另一个来源是由氮的氧化物与生物碱反应产生, 这一反应在啤酒生产时干燥已萌发的麦芽的过程中已有报道在熏腊食品中, 同样含有大量的亚硝胺类物质, 某些消化系统肿瘤, 如食管癌的发病率与膳食中摄入的亚硝胺数量相关另外, 在食品接触类橡胶制品中, 也含有大量的亚硝胺物质下表列举了食品和化工产品中通常存在的一些亚硝胺表 1: 食品和化工产品中常检测的亚硝胺编号缩写英文名中文名 CAS No. 1 NDMA N-Nitrosodimethylamine 二甲基亚硝胺 NEMA N-Nitrosomethylethylamine N- 亚硝基甲乙胺 NDEA N-Nitrosodiethylamine 二乙基亚硝胺 NDPA N-Nitrosodi-n-propylamine 二丙基亚硝胺 NDBA N-Nitrosodibutylamine N- 二正丁基亚硝胺 NMPhA N-Methyl-N-nitrosaniline N- 甲基 -N- 亚硝基苯胺 NEPhA N-Ethyl-N-phenylnitrosamine N- 亚硝基 -N- 乙基苯胺 NPIP N-Nitrosopiperidine N- 亚硝基哌啶烷 NPYR 1-Nitrosopyrrolidine N- 亚硝基吡咯烷 NMOR N-Nitrosomorpholine N- 亚硝基吗啉 NDPhA N-Nitrosodiphenylamine N- 亚硝基二苯胺 NDiNA N-nitrosodiisononylamine N- 亚硝基二硝基苯胺 NDiPA N-nitrosodiisopropylamine N- 亚硝基二异丙胺 NDBzA N-nitrosodibenzylamine N- 硝基联苄基胺

7 四. 相关法规及政策美国环境保护局 (USEPA) 认为 N- 亚硝基二甲胺 (NDMA) 在极低的浓度 (.7 ng/l) 下就会致癌, 已将其列为优先控制污染物许多国家及国际组织都对相应制品中 N- 亚硝基胺的检测制定了严格的标准, 如中国出台了 GB 婴幼儿安抚奶嘴安全要求中氮亚硝胺的释放量为.1 mg/kg; 欧盟玩具安全新指令 (29/48/EC) 中, 对其中的 N- 亚硝基胺含量及迁移量有着极为严格的规定, 其总亚硝胺的迁移量也不得高于.5 mg/kg, 总可亚硝化物质 ( 即亚硝胺前体物 ) 的迁移量不得高于 1 mg/kg 同时, 与该指令配套的欧盟协调标准 EN71-12 要求至少检测 13 种 N- 亚硝基胺, 包括脂肪族亚硝胺脂环族亚硝胺及芳香族亚硝胺等关于食品中的亚硝胺限量, 我国的 GB 食物中污染物限量标准规定肉类及肉制品中二甲基亚硝胺限量为 3 µg/kg, 水产制品中的限量标准为 4 µg/kg 五. 仪器和设备仪器 :Thermo Scientific TM TSQ 8 Evo 气相色谱三重四极杆串接质谱仪色谱柱 :TG-5 MS(3 m*.25 mm*.25 µm) 毛细管色谱柱 (Thermo Fisher Scientific) C1 保留时间为 min 7

8 六. 样品前处理关于亚硝胺的前处理, 不同基质可以采取不同的前处理, 下面列举几种常用的前处理方法 : 1. 按照 GB/T 食品中 N- 亚硝胺类的测定的前处理方法 : 1.1 提取 ( 水蒸馏装置蒸馏 ) 2 g( 精确至.1 g) 试样, 加入 1 ml 水和 12 g 氯化钠于蒸馏管中, 混匀 ; 平底烧瓶或锥形瓶中加入 4 ml 二氯甲烷及少量冰块用以接收冷凝液 ; 开启蒸馏装置加热蒸馏, 收集 4 ml 冷凝液后关闭加热装置, 停止蒸馏 ; 1.2 萃取净化在盛有蒸馏液的平底烧瓶中加入 8 g 氯化钠和 3 ml 的硫酸, 搅拌溶解 ; 转移至 5 ml 分液漏斗中, 振荡 5 min, 静置分层 ; 将二氯甲烷层转移至另一平底烧瓶中, 再用 15 ml 二氯甲烷分三次提取水层 ; 合并 4 次二氯甲烷萃取液, 总体积约为 25 ml; 1.3 浓缩将二氯甲烷萃取液用 1 g 无水硫酸钠脱水后, 进行旋转蒸发 ; 于 4 水浴上浓缩至 5-1 ml 改氮吹 ; 准确定容至 1. ml, 摇匀后待测定 8

9 2. 啤酒中的亚硝胺前处理方法 : 按照 AOAC 官方方法 (2), 并略有改动, 使用 Celite 硅藻土柱并用 DCM 系统的固相萃取方法来分离亚硝胺 3. 橡胶材料中的亚硝胺前处理方法 : 3.1 样品提取准确称取 5. g ( 精确到.1 g) 样品于 4 ml 棕色玻璃瓶中, 加入 3 ml 甲醇, 室温超声萃取 3 min; 过滤转移溶液至 25 ml 平底烧瓶中, 加入 2 ml 甲醇溶剂, 重复超声和转移步骤, 并用少量甲醇洗涤棕色瓶 2-3 次, 合并两次超声和洗涤溶液 ; 将溶液旋转蒸发 (35, 15 mbar) 至 4 ml 左右, 于涡旋混匀器上充分旋转振荡 1 min, 样品溶液转移至 1 ml 具塞离心管中 ; 另取 1 ml 甲醇分 2-3 次洗涤平底烧瓶壁, 并于涡旋混匀器上充分旋转振荡 1 min, 合并洗涤液于 1 ml 具塞离心管中 3.2 净化 C18 固相萃取小柱置于固相萃取装置上, 用 5 ml 甲醇预淋洗 C 18 小柱 ; 将样液注入小柱, 流出液收集于离心管中, 待样液液面下降至小柱填料的上层面时, 再加入 5 ml 甲醇进行洗脱, 收集合并全部流出液于离心管中 ; 3.3 浓缩样液于 25 ml 的平底烧瓶中, 并用少量甲醇淋洗离心管壁 2-3 次, 合并洗涤液于平底烧瓶中 ; 将溶液旋转蒸发 (35, 15 mbar) 至 4 ml 左右, 取下平底烧瓶, 于涡旋混匀器上充分旋转振荡 1 min; 然后将平底烧瓶中的样液转移溶液至 5 ml 棕色容量瓶中用少量甲醇淋洗平底烧瓶 2-3 次, 并于涡旋混匀器上充分旋转振荡 1 min, 合并洗涤液于棕色容量瓶中, 用甲醇定容至刻度 ; 经.45 μm 滤膜过滤后进行分析 9

10 七. 方法包的使用 1. 进样方法使用 : 直接使用方法包中 meth 结尾的文件, 进行进样分析不同仪器配置可能稍有不同, 可以参考以下方法截图 1

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12 2. 数据处理方法建立 : 直接拷贝方法包中的文件夹到 C:\TraceFinderData\32\ Methods 或者 C:\TraceFinderData\3.3\Methods 中 ( 根据自己 TraceFinder 的版本寻找相对应的路径 ), 方法就可以直接在 TraceFinder 软件中打开, 这个方法包括数据处理方法和进样方法 3. 将步骤 1 中的进样方法拷贝粘贴到 C:\TraceFinderData\InstrumentMethods 中, 在 Instrument Methods 中选择这个文件, 然后保存这个 TraceFinder 的 Master Method 12

13 4. 将按照步骤 1 进样完成的数据文件与 TraceFinder 方法相关联, 得到完整的数据处理方法按需要更改保留时间等参数进一步对数据处理方法进行优化, 得到准确的数据处理方法整个过程无需输入化合物信息, 离子对信息, 挑选离子对信息找到化合物, 所有的步骤均是自动完成, 一点即可, 极大得提高分析效率, 简化方法流程最终只需要再输入定量的标准曲线各浓度点和具体浓度即可完成数据处理方法的建立 13

14 八. 应用文章 14

15 利用气相色谱 - 质谱 / 质谱联用仪进行高灵敏度的亚硝胺分析 Alex Chen 1, Hans-Joachim Huebschmann 2, Li Fangyan 3, Chew Yai Foong 3 and Chan Sheot Harn 3 1 Alpha Analytical Pte. Ltd., Singapore; 2 Thermo Fisher Scientific, Singapore, 3 Health Sciences Application Note 1315 Authority, HSA Singapore 关键词亚硝胺 ; 食品安全 ; 啤酒 ;TSQ 8; 气相色谱 - 质谱 / 质谱 ; 定量分析 ; 确认 ; 自动 SRM;TraceFinder 简介亚硝胺是 N- 亚硝基烷基胺一类化合物的通用名已知的含有不同烷基基团的这类化合物有很多最简单的 N- 亚硝基烷基胺含有两个甲基, 即 N- 亚硝基二甲基胺 (NDMA) 亚硝胺是常见的剧毒化合物, 对人和动物都有强致癌性, 高剂量的摄入会导致严重的肝损伤和内出血食物中的亚硝胺主要是由亚硝酸生成的亚硝酸通常作为防腐剂被添加到肉及肉制品中, 以避免肉毒杆菌造成的中毒维生素等有抗氧化作用的添加剂能抑制亚硝酸向亚硝胺的转化亚硝胺的另一个来源是由氮的氧化物与生物碱 (alkaloids) 反应产生, 这一反应在啤酒生产时干燥已萌发的麦芽的过程中已有报道由于麦芽和啤酒中的亚硝胺水平在发酵过程中已大幅降低, 需要更好的分析表现才能胜任此检测任务而除了其它各项日常食品的常规控制项目之外, 啤酒中麦芽的低剂量亚硝胺检测也是必须的已采用多年的经典亚硝胺检测方法是利用串接热能分析仪 (TEA) 检测器的气相色谱进行分析的选择特殊的 TEA 检测器是由于该检测器能够从亚硝胺生成 NO,NO 又能与臭氧进行特异性的化学发光反应, 从而实现特异性的亚硝胺检测而如今, 随着对检测方法的灵敏度的要求不断增加,TEA 的检出限及其复杂的操作程序, 已无法满足目前的低检出限和高样品化功能的离子阱质谱仪的气质联用检测方法, 而不是标准的带有外部离子源的四极杆或离子阱质谱仪如今随着技术的发展,GC-MS 三重四极杆也可以在低分子量区域提供高灵敏度和高选择性的分析, 使得非常低浓度的亚硝胺检测, 甚至是在复杂样品中的低浓度检测, 成为可能这一可能性源于使用更为简便的利用常规的电子轰击源 (EI) 的标准技术, 来建立低浓度亚硝胺检测的便捷方法本应用说明文章描述了一套完整的使用 GC-MS/MS 进行食品中亚硝胺类化合物常规检测和定量的方法本工作中的食品基质包括多种不同的麦芽啤酒产品以及作为最终食品产物销售的啤酒本身在方法开发过程中, 我们特别注意优化, 以在达到对亚硝胺化合物检测所需的高灵敏度的同时, 提供一种迅速易于实现的常规检测方法样品处理方法基于 AOAC 官方方法 (2), 并略有改动我们建立了一种使用 Celite 硅藻土柱并用 DCM 洗脱的固相萃取方法来从啤酒样品中分离亚硝胺通量要求质谱仪已在不断取代 TEA 由 Munch 和 Bassett 于 24 年建立的 EPA 方法 521 提供了一个适应当时要求的基于化学电离 (CI) 和带有内部离子 15

16 实验条件 GC-MS/MS 仪器 TRACE 131 GC ic 进样模块分流 / 不分流进样口进样器温度 25 进样模式不分流加压模式 3 KPa 不分流时间 1. 分钟分析柱 TG-WAX MS,3 m.25 mm.5 µm 载气 He(99.999% purity) 流速 1. ml/min, 流速不变柱温箱程序 45 3 min, 25 / 分至 13, 12 / 分至 23, 保持 1 min 传输线温度 25 总分析时间 14.7 分钟总循环时间 18.4 分钟 TriPlus RSH 自动进样器进样体积 1 µl 溶剂二氯甲烷标准运行程序每个样品重复进样 3 次标准溶液稀释 1 ppb,5 ppb,1 ppb,25 ppb, 1 ppb,25 ppb,5 ppb 内标每次加入 5 ppb NDPA TSQ 8 三重四极杆 GC-MS/MS 系统离子化模式 EI 质量分辨率设定正常源温度 22 扫描模式 SRM, 基于保留时间的 SRM 模式 SRM 方法建立我们使用了 Thermo Scientific TSQ TM 8 GC-MS/MS 软件套件中的 AutoSRM 软件进行了三重四极杆质谱方法的建立, 且并未对 AutoSRM 生成的方法进行任何手动修改一个装有待分析亚硝胺化合物标准品溶液的自动进样器样品瓶专供 AutoSRM 程序使用 AutoSRM 程序自动进行以下三个步骤 : 1. 首先对标准品溶液进行全扫描分析 ( 图 1.) 从全扫中得到的信号最强的离子将被作为一级离子 2. 对上一步确定的一级离子 ( 母离子 ) 进行二级离子 ( 子离子 ) 谱图获取 ( 可以根据分析需求设定一级离子的个数 ) 找出每个一级离子产生的信号最强的二级离子 ( 可以手动选择最感兴趣的一级离子进行进一步优化 ) 表 1. AutoSRM 生成的 SRM 方法设置 Precursor Product Collision Energy (ev) Retention Time (min) Time Window (min) NDMA NDEA NDPA(ISTD) NDBA NPIP NPYR NMOR * 灰色标记的离子对是用于定量的离子 16

17 3. 对所有化合物的选定的母离子 / 子离子对进行碰撞能的优化, 以获得最大化合物响应及最佳方法灵敏度 ( 图 2) AutoSRM 程序能够根据需要从一个标准品样品瓶启动, 完成所需的进样次数表 1 就是由 AutoSRM 自动生成的 SRM 离子对表格该表同时还显示了 TSQ 8 GC-MS/MS 在 Timed-SRM 模式下在化合物洗脱时间左右用一个 6 秒的短采集窗口进行采集的 SRM 采集方法无需对扫描时段进行任何其他的设置, 或者说如果需要在某化合物的洗脱时间之外对其进图 1. AutoSRM 对 NDMA 从 EI 全扫谱图中进行一级离子选择行监测, 则需要手动添加该化合物样品测定在大量各种可能的亚硝胺化合物之中, 本方法涵盖了那些被报道与发芽麦芽干燥的过程相关的亚硝胺化合物被分析的样品包括未添加标样的麦芽啤酒样品, 以及作为空白样的 4% 乙醇如需对其他食物基质进行分析, 其它化合物可以随时参照前述 AutoSRM 方法建立的步骤添加至本方法中实验结果图 2. AutoSRM 对所有亚硝胺一级离子进行碰撞能优化本方法中包含的亚硝胺类化合物的色谱呈现了较快的流出, 从 7.87 的 NDMA 到分, 能够实现较短的循环时 RT: 7.87 AA: 6336 SN: 31 RT: 8.55 AA: SN: 231 间并提高样品通量图 3 显示了用校准曲线中的最低浓度 1 ppb 的样品得到的峰强度从图中可见 NDMA 检测 NDMA RT: 9.75 AA: SN: 2695 RT: AA: SN: 26 RT: 11.8 AA: SN: 1 的信噪比依然很好 NDEA RT: 12.6 AA: SN: 4 1 NDPA (ISTD) NDBA NPIP RT: AA: 1389 SN: NPYR NMOR Time (min ) 图 3. 浓度为 1 ppb 的标准品混合物的色谱图 17

18 我们在 1 ppb 到 5 ppb 这一较宽的浓度范围内进行了定量校准图 4 展示了从所有的校准检测中得到的亚硝胺色谱峰在所有情况下,NDMA 的峰形都是完全对称的, 没有拖尾, 而且无需任何手动修正就得到了非常可靠的峰面积积分值图 5 所示为用于样品定量的 NDMA 校准曲线, 曲线 R 2 大于.99, 可见线性极佳本 TSQ 8 GCMS/MS 方法对所有亚硝胺都达到了相同水平的校准精度 RT: 7.87 AA: SN: 5489 RT: 7.87 AA: SN: 6272 RT: 7.87 AA: SN: 412 RT: 7.87 AA: SN: 333 RT: 7.87 AA: 4381 SN: 183 RT: 7.87 AA: SN: 39 RT: 7.87 AA: 6336 SN: Time (min) 图 4. NDMA 从 1 ppb ( 底部 ) 至 5 ppb ( 顶部 ) 的校准曲线测定结果 LOQ 测定最低定量限 (LOQ) 和最低检出限 (LOD) 的计算都基于色谱峰的信噪比 LOQ 的计算基于的信噪比为 1,LOD 基于的信噪比为 3 表 2. 本方法 LOQ 和 LOD 的计算 Compound 结果确认 1ppb 化合物确认是通过 Thermo Scientific TraceFinder TM 定量分析软件提供的离子比检查功能实现的, 该功能比较了用于定量的 SRM 与定性 SRM 的离子强度覆盖 1 ppb 到 5 ppb 浓度区间的标准品被进行了三次重复进样检测并用于计算离子比的精确度, 结果显示在表 3 中虽然所有被检测的离子都处于低质量数范围并可能受到多种干扰, 二级离子的离子比的精确度一直很好的保持在 1-4% Calculated LOQ (ppb) Calculated LOD (ppb) NDMA NDEA NDBA NPIP NMOR NPYR 为了在样本分析中进行质量控制, 在用 TraceFinder 软件进行定量数据处理时, 阳性结果都会通过离子比检查进行确认 Area Ratio ng/ml 图 5. NMDA 从 1 ppb 到 5 ppb 的校准曲线对所有化合物来说, 采集的两个二级离子的离子比例需保持在 ± 5%(1%) 范围内, 符合从标准品得到的校准值这为常规的样品检测提供了坚实的安全保障表 3 列出了所有本研究中涉及到的亚硝胺的平均离子比值样品检测我们对多种样品进行了检测, 包括空白样和添加了标准品的啤酒样品等空白样的检测结果如表 4 所示该样品中检出的低浓度 NDMA 经计算发现低于校正曲线浓度, 也低于 LOQ 故在此 LOQ 下, 空白样品可以被确认为不含亚硝胺化合物 18

19 另一个样品通过在啤酒中添加不同浓度的亚硝胺制备而成所有的亚硝胺化合物都被检出, 并在低浓度区间进行了定量, 如表 5 所示每个用于定量的峰都通过了离子比质量控制, 并且能够在这样的低浓度通过计算离子比对每个检测为阳性的化合物进行确认结论通过本文描述的基于 TSQ 8 系统的 GC-MS/MS 方法, 所有研究涉及的亚硝胺化合物都能在食品安全控制所要求的低浓度被安全地检出并实现精确的定量在定量校正曲线所用的最低浓度为 1 ppb 的情况下, 所有化合物的 LOD 都低于 1 ppb TSQ 8 GC-MS/MS 在 1-5 ppb 的范围内显示出宽广的线性区间和优异的准确度所有校正曲线的线性都非常好,R 2 大于.99 基于 GC-MS/MS 的亚硝胺检测方法的使用建立, 以及维护都很简单哪怕是在分析新的未知物时, 我们独有的 AutoSRM 软件也能够自动找出并优化 SRM 离子对和碰撞能基于本文所示的 GC-MS/MS 方法,TSQ 8 GC-MS/MS 能够准确可靠地测出真实样品中的亚硝胺含量本文所述的利用 TSQ 8 GC-MS/MS 进行食品中的亚硝胺检测的 GC-MS/MS 方法可以直接用于常规的食品安全控制本方法使用的标准 GC-MS/MS 三重四极杆仪器也被广泛应用于常规食品安全控制的其他领域, 例如杀虫剂 POPs, 或多环芳烃本方法检测迅速, 能够支持高样品通量, 并且提供的结果具有非常高的灵敏度和精确度本方法使用常规的电子轰击源进行离子化并实现低浓度的亚硝胺定量, 我们推荐将本方法作为前述使用液态 CI 试剂的化学离子化的离子阱方法的高产出的替代方案 TSQ 8 GC-MS/MS 也显示出非常好的离子比稳定性, 适用于阳性样品的确认所有化合物的离子比, 哪怕是在 LOQ 浓度下,RSD% 都低于 4% 表 3. 从 1 ppb 5 ppb 的确认离子比的精确度 Concentration(ppb) AVG RSD(%) NDMA NDEA NDBA NPIP NPYR 表 4. 空白样品检测结果 Compound Area ISTD Area Area Ratio Ion Ratio Confirmation Calculated Amount (ppb) NDMA Pass(65.1%).74* NDEA Fail(%) N/A NDBA Fail(81.1%) N/A NPIP N/A N/A N/A N/A NPYR N/A N/A N/A N/A NMOR Fail(%) N/A 表 5. 添加标准品的啤酒样品检测结果 Compound Area ISTD Area Area Ratio Ion Ratio Confirmation Calculated Amount (ppb) NDMA Pass(68.3%) 12. NDEA Pass(22.%) 9.4 NDBA Pass(96.8%) 13.2 NPIP Pass(5.9%) 1.1 NPYR Pass(68.9%) 13.3 NMOR Pass(67.9%)

20 参考文献 [1] Robert K. Boyd, Cecilia Basic, Robert A. Bethem, Trace Quantitative Analysis by Mass Spectrometry, 28 John Wiley & Sons, Ltd. [2] Material Safety Data Sheet NDMA. [3] Agency for Toxic Substances & Disease Registry, Public Health Statement for n-nitrosodimethylamine, 1989, cdc.gov/toxprofiles/phs141. html. [4] Richard A. Scanlan, Nitrosamines and Cancer, Linus Pauling institute, [5] Mario M. Mangino and Richard A. Scanlan, N-Nitrosamines in Beer, N-Nitroso Compounds, ACS Symposium Series, Vol. 174, 1981, Chapter 17, [6] Munch, J.W., Bassett, M.V. Method 521: Determination of nitrosamines in drinking water by solid phase extraction and capillary column gas chromatography with large volume injection and chemical ionization tandem mass spectrometry (MS/MS) (Version 1.) U.S. Environmental Protection Agency. [7] Raymond E. March, Richard J. Hughes, Quadrupole Storage Mass Spectrometry, 2nd Ed., John Wiley & Sons [8] AOAC Official Method , 2. [9] Introducing AutoSRM, Thermo Fisher Scientific, Technical Brief No. AB52298, 212. [1] Thermo Scientific TSQ 8 Triple Quadrupole GC-MS/ MS Instrument Method, Thermo Fisher Scientific, Technical Brief No. AB52299,

21 TSQ 8 Evo 检测橡胶及弹性体材料中 11 种亚硝胺李春丽彭兴赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司 Application Note 1315 前言 N- 亚硝基化合物是一类很强的化学致癌物质, 包括亚硝胺和亚硝酰胺两大类物质, 通常泛称为亚硝胺超过 3 多种 N- 亚 [1] 硝基化合物在一种或多种动物身上显示出具有致癌作用, 并且 4 多种动物包括灵长类都是易于感染 N- 亚硝基化合物而引起癌症, 而且这类强致癌物质在实验动物体上诱导出的肿瘤在形态学特点与生化特点上都与相应的人体器官上发现的 [2] 肿瘤相似美国环境保护局(USEPA) 认为 N- 亚硝基二甲胺 (NDMA) 在极低的浓度 (.7 ng/l) 下就会致癌, 已将其 [3] 列为优先控制污染物许多国家及国际组织都对相应制品中 [4][5][6] N- 亚硝基胺的检测制定了严格的标准, 如中国出台了 GB 婴幼儿安抚奶嘴安全要求 ; 欧盟玩具安全新指令 (29/48/EC) 中, 对其中的 N- 亚硝基胺含量及迁移量有着极为严格的规定同时, 与该指令配套的欧盟协调标准 EN 要求至少检测 13 种 N- 亚硝基胺, 包括脂肪族亚硝胺脂环族亚硝胺及芳香族亚硝胺等因此开发出快速灵敏和准确的 N- 亚硝胺化合物的测定方法, 对卫生检测削减和控制亚硝胺含量的研究是迫切需要的使 [7][8] 用 GC-MS/MS 检测 N- 亚硝胺, 已有一定程度的应用赛默飞世尔科技的串接气质联用 TSQ 8 Evo 具有高灵敏度背景干扰小稳定性高等特点本文以 TSQ 8 Evo 为平台建立了橡胶及弹性体材料中 11 种 N- 亚硝基胺 GC-MS/MS 检测方法, 结合赛默飞世尔科技特有的 TraceFinder 软件系统进行数据采集数据分析和报告输出, 实现了数据的快速采集及数据结果的智能处理为 N- 亚硝基胺的痕量检测提供了强而有力的技术支持 1. 实验部分 1.1 仪器和试剂质谱仪 :TSQ 8 Evo 质谱仪 ( 赛默飞世尔科技, 美国 ); 气相色谱仪 :Trace 131 气相色谱配 AI 131 自动进样器 ( 赛默飞世尔科技, 美国 ); 色谱柱 :TR-5 MS(3 m.25 mm.25 µm) 毛细管色谱柱 ; 试剂 : 正己烷, 丙酮, 甲醇 ; 均为色谱级 1.2 实验方法气相方法程序升温 :35 ( 维持 3 min),1 /min 到 1 ( 维持 1 min),25 /min 到 25 ( 维持 3 min) 进样口温度 :SSL 分流不分流 (22 )with Splitless 不分流模式 21

22 载气流速 :1. ml/min( 恒流 ) 传输线温度 : 25 进样体积 :1. µl 质谱方法质谱运行时间 :19 min 扫描方式 :Timed-SRM 碰撞气压力 :1. mtorr 氩气 SRM 条件见下表 : 11 种 N- 亚硝基胺化合物及 1 种内标物质质谱信息 Name RT(min) Ion Polarity Window Mass Product Mass Collision Energy NDMA 4.4 Positive NDMA 4.4 Positive NDEA 7.2 Positive NDEA 7.2 Positive NDEA 7.2 Positive NDIPA(ISTD) 9.4 Positive NDIPA(ISTD) 9.4 Positive NDIPA(ISTD) 9.4 Positive NPYR 1.3 Positive NPYR 1.3 Positive NMPHA 1.3 Positive NMPHA 1.3 Positive NMOR 1.3 Positive NMOR 1.3 Positive NMOR 1.3 Positive NDPA 1.4 Positive NDPA 1.4 Positive NDPA 1.4 Positive NPIP 11.1 Positive NPIP 11.1 Positive NPIP 11.1 Positive NEPHA 11.4 Positive NEPHA 11.4 Positive NEPHA 11.4 Positive NDBA 13. Positive NDBA 13. Positive NDBA 13. Positive NDBZA 16.8 Positive NDBZA 16.8 Positive NDBZA 16.8 Positive NDINA 17. Positive NDINA 17. Positive NDINA 17. Positive NDINA 17. Positive 样品制备样品制备成 2 mm 2 mm 2 mm 大小 ( 均匀取样 ) 1.4 样品前处理样品提取准确称取 5. g( 精确到.1 g) 样品于 4 ml 棕色玻璃瓶中, 加入 3 ml 甲醇, 于室温超声萃取 3 min, 过滤转移溶重复超声和转移步骤, 并用少量甲醇洗涤棕色瓶 2-3 次, 合并两次超声和洗涤溶液 ; 将溶液旋转蒸发 (35,15 mbar) 至 4 ml 左右, 于涡旋混匀器上充分旋转振荡 1 min, 样品溶液转移至 1 ml 具塞离心管中另取 1mL 甲醇分 2-3 次洗涤平底烧瓶壁, 并于涡旋混匀器上充分旋转振荡 1 min, 合并洗涤液于 1 ml 具塞离心管中液至 25 ml 平底烧瓶中 ; 再向样品中加入 2 ml 甲醇溶剂, 22

23 1.4.2 净化将 C18 固相萃取小柱置于固相萃取装置上, 用 5 ml 甲醇预淋洗 C18 小柱将样液注入小柱, 流出液收集于离心管中, 待样液液面下降至小柱填料的上层面时, 再加入 5 ml 甲醇进行洗脱, 收集合并全部流出液于离心管中浓缩样液于 25 ml 的平底烧瓶中, 并用少量甲醇淋洗离心管壁 2-3 次, 合并洗涤液于平底烧瓶中, 将溶液旋转蒸发 (35,15 mbar) 至 4 ml 左右, 取下平底烧瓶, 于涡旋混匀器上充分旋转振荡 1 min, 然后将平底烧瓶中的样液转移溶液至 5 ml 棕色容量瓶中用少量甲醇淋洗平底烧瓶 2-3 次, 并于涡旋混匀器上充分旋转振荡 1 min, 合并洗涤液于棕色容量瓶中, 用甲醇定容至刻度经.45 µm 滤膜过滤后进行分析 2. 实验结果 2.1 使用 TraceFinder 软件简化分析步骤使用 TSQ 8 系列产品特有的软件平台 TraceFinder, 不仅可以实现数据快速批量自动化采集及处理, 还可完成实验室常用数据报告的自动生成, 将 Database 数据库,Master method 主方法,Instrument method 仪器方法以及 AutoSRM 质谱条件自动优化软件之间有机结合工作流程如图 1 所示图 1. TraceFinder 工作流程对于大部分常见化合物方法信息, 已包含在 TraceFinder 内置数据库中检测所涉及的化合物的质谱方法信息可使用 TraceFinder 通过 Database 进行查询编辑提取并可直接导入仪器方法中使用这些化合物包括农药多环芳烃多氯联苯多溴联苯和多溴联苯醚邻苯二甲酸酯等常见关注化合物 2.2 使用 AutoSRM 软件自动优化化合物信息对于 11 种 N- 亚硝基化合物及 1 种内标物质, 在方法建立初期, 其色谱质谱条件未知, 需要对其相应的色谱质谱方法优化同样可以利用 TSQ 8 系列产品所特有的 AutoSRM 软件进行自动优化, 可实现优化后自动生成仪器方法的功能 AutoSRM 程序自动进行以下三个步骤 :1. 全扫描分析通常最强的离子将被作为母离子 2. 对母离子进行子离子全扫信 23

24 号最强的子离子 3. 对选定的母离子 / 子离子对进行碰撞能的优化其工作流程如图 2 所示 2.3 定性结果实验采用的 TR-5MS 色谱柱对 N- 亚硝胺化合物有良好的分离效果,12 种化合物 ( 含 1 种内标物质 ) 在 19 min 的分离时间内得到了良好的色谱图, 结果如图 3 所示图 2. AutoSRM 工作流程 C:\Users\...\HK-Nitrosamine\221\5ppb 2/21/13 16:14:18 RT: SM: 11G RT: 4.42 AA: 1959 SN: NL: 4.3E4 TIC F: + c EI SRM ms2 74.1@cid5. [ ] MS ICIS 5ppb RT: SM: 11G RT: 7.25 AA: SN: NL: 1.E6 TIC F: + c EI SRM ms2 12.1@cid5. [ ] MS ICIS 5ppb RT: SM: 11G RT: 9.4 AA: SN: NL: 9.3E5 TIC F: + c EI SRM ms2 13.1@cid5. [ ] MS ICIS 5ppb Time (min) RT: SM: 11G RT: 1.28 AA: SN: Time (min) Time (min) NDMA NDEA NDIPA(ISTD) NL: 2.8E5 TIC F: + c EI SRM ms2 1.@cid5. [ ] MS ICIS 5ppb RT: SM: 7G RT: 1.3 AA: SN: NL: 3.23E6 TIC F: + c EI SRM ms2 17.1@cid1. [ ] MS ICIS 5ppb RT: SM: 11G RT: 1.36 AA: SN: NL: 7.37E5 TIC F: + c EI SRM ms2 86.@cid5. [ ] MS ICIS 5ppb Time (min) NPYR NMPHA Time (min) Time (min) NMOR C:\Users\...\221\221\5ppb 2/21/13 17:55:43 RT: SM: 11G RT: 1.43 AA: SN: NL: 7.4E5 TIC F: + c EI SRM ms2 13.1@cid5. [ ] MS ICIS 5ppb RT: SM: 11G RT: 11.1 AA: SN: NL: 4.83E5 TIC F: + c EI SRM ms2 114.@cid5. [ ] MS ICIS 5ppb RT: SM: 11G RT: AA: SN: NL: 3.19E6 TIC F: + c EI SRM ms2 16.@cid15. [ ] MS ICIS 5ppb Time (min) RT: SM: 11G RT: AA: SN: Time (min) Time (min) NDPA NPIP NEPHA NL: 3.11E5 TIC F: + c EI SRM ms @cid5. [ ] MS ICIS 5ppb RT: SM: 7G RT: AA: SN: NL: 3.44E5 TIC F: + c EI SRM ms @cid1. [ ] MS ICIS 5ppb RT: SM: 9G RT: AA: SN: 8717 NL: 1.99E6 TIC F: + c EI SRM ms @cid1. [ ] MS ICIS 5ppb Time (min) NDBA NDBZA NDINA Time (min) Time (min) 图种化合物色谱图

25 2.3 方法回收率及仪器稳定性选取 4 种物质 (NDPA,NDEA,NDBA,NMphA) 配置成混合标准品, 考察前处理方法的准确性及回收率根据欧盟农残方法准则要求, 回收率需在 7-12% 之间实验以 1 µg/kg 浓度水平进行添加回收实验, 测定两组平行样品, 结果如表 1 所示结果表明, 回收率均处于 7-12% 之间, 方法准确性良好同时对仪器的稳定性进行了考察, 将 4 种化合物配置成 5. µg/kg 标样, 连续进样 6 次, 得到相对应的每个目标化合物的相对标准偏差 (RSD), 测试仪器的稳定性, 如表 1 所示 4 种化合物的 RSD 均小于 5.% 结果表明: 仪器在低浓度水平 ( 5 µg/kg) 连续进样时, 仪器稳定性良好, 满足痕量检测需求表 1. 回收率实验结果 NDPA NDEA NDBA NMphA 回收率 % 117.6% 12.8% 118.3% 回收率 % 114.9% 116.7% 1.% RSD 2.88% 2.49% 2.66% 1.86% 2.4 方法灵敏度检出限及实际样品测定按照上述前处理方法对实验样品进行处理, 以空白样品基质制备浓度为 µg/kg 的基质标准曲线, 在确定的色谱和质谱条件下进行测定, 对测定结果进行分析, 研究方法的灵敏度及检出限同时选取了两种市售产品 ( 婴儿奶嘴及玩具气球 ), 对其中 11 种 N- 亚硝胺化合物进行了测定 TSQ 8 Evo 具有灵敏度高和抗干扰能力强的特点, 所检测 11 种化合物在较低的浓度水平得到了良好的检出效果, 完全满足法规要求, 如表 2 所示同时, 在两种实际样品中均检出了少量的 NDBA 残留结果如表 3 所示 2.4 结论实验结果表明 TSQ 8 Evo 在检测含有痕量亚硝胺样品时, 具有高选择性高灵敏度高稳定性和高通量, 在有害化合物检出方面具有优异的表现同时, 强大的 TraceFinder 软件集数据采集处理, 方法开发于一体在简化实验操作步骤的同时, 实现了对数据处理的自动化 TraceFinder 自带的 AutoSRM 软件, 对于未知信息化合物的质谱条件的优化开发, 提供了可靠的支撑 TraceFinder 软件可同时实现数据采集及数据处理, 根据预先设定的定性离子及定量离子, 对化合物的检出结果进行快速自动化处理, 同时实现定性及定量功能图 4 为 NDPA 质谱图信息图 4. NDPA 质谱图信息 (2 µg/kg) 25

26 表 2. EN 71-12:213 中设定的安全要求商品类型亚硝胺亚硝胺化合物由弹性材料制造, 适用于 36 个月以下儿童使用的玩具和玩具部件.5 mg/kg 1 mg/kg 由弹性材料制造, 意图放入口中的玩具和玩具部件.5 mg/kg 1 mg/kg 适用于 36 个月以下儿童使用的手指画颜料.2 mg/kg 1 mg/kg 2.66% 1.86% 表 3. 灵敏度检出限及实际样品测定结果化合物名称保留时间 (min) 信噪比 (S/N) 检出限 (µg/kg) 样品 -1(µg/kg) 样品 -2(µg/kg) NDMA NA N.A NDEA N.A N.A NDIPA(ISTD) N.A N.A NPYR N.A N.A NMPHA N.A N.A NMOR N.A N.A NDPA N.A N.A NPIP N.A N.A NEPHA N.A N.A NDBA NDBZA N.A N.A NDINA N.A N.A 注 : N.A 为未检出 3. 参考文献 [1] R. Preussmann. Carcinogenic N-nitroso compounds and their environmental significance. [M] [2] Bogovski P.Bogovski S.Animal species in which N-nitroso compounds induce cancer[j]. International Journal of Cancer, 1981,24: [3] U.S. Environmental Protection Agency. N-Nitrosodimethylamine (CASRN ). [4] GB 婴幼儿安抚奶嘴安全要求 [5] 欧盟玩具安全新指令 (29/48/EC) [6] EN 71-12:213 亚硝胺与亚硝胺化合物 [7] 童玉贵, 林伟, 林中等气质联用法测定鞋类橡胶材料中的 N- 亚硝基胺含量 [J]. 皮革科学与工程. 211,5(21):56-6. [8] 李丕, 白桦, 李海玉等固相萃取 - 气相色谱 - 串联质谱法测定乳胶儿童用品中 15 种 N- 亚硝胺及其前体物的迁移量 [J]. 色谱. 214,1(32):

27 关于赛默飞世尔科技赛默飞世尔科技 ( 纽约证交所代码 :TMO) 是科学服务领域的世界领导者公司年销售额 17 亿美元, 在 5 个国家拥有约 5, 名员工我们的使命是帮助客户使世界更健康更清洁更安全我们的产品和服务帮助客户加速生命科学领域的研究解决在分析领域所遇到的复杂问题与挑战, 促进医疗诊断发展提高实验室生产力借助于首要品牌 Thermo Scientific Applied Biosystems Invitrogen Fisher Scientific 和 Unity Lab Services, 我们将创新技术便捷采购方案和实验室运营管理的整体解决方案相结合, 为客户股东和员工创造价值欲了解更多信息, 请浏览公司网站 : 赛默飞世尔科技中国赛默飞世尔科技进入中国发展已有 3 多年, 在中国的总部设于上海, 并在北京广州香港台湾成都沈阳西安南京武汉等地设立了分公司, 员工人数约 37 名我们的产品主要包括分析仪器实验室设备试剂耗材和软件等, 提供实验室综合解决方案, 为各行各业的客户服务为了满足中国市场的需求, 现有 8 家工厂分别在上海北京和苏州运营我们在全国共设立了 6 个应用开发中心, 将世界级的前沿技术和产品带给国内客户, 并提供应用开发与培训等多项服务 ; 位于上海的中国创新中心结合国内市场的需求和国外先进技术, 研发适合中国的技术和产品 ; 我们拥有遍布全国的维修服务网点和特别成立的中国技术培训团队, 在全国有超过 2 名专业人员直接为客户提供服务我们致力于帮助客户使世界更健康更清洁更安全欲了解更多信息, 请登录网站 Orbitrap 组学俱乐部赛默飞小分子质谱应用技术群赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司全国服务热线 : ( 支持手机用户 )

2 实验条件 GC-MS/MS 仪器 TRACE 1310 GC ic 进样模块分流 / 不分流进样口进样器温度 250 进样模式不分流加压模式 300 KPa 不分流时间 1.0 分钟分析柱 TG-WAX MS, 30m 0.25mm 0.5μm 载气 He(99.999% purity

2 实验条件 GC-MS/MS 仪器 TRACE 1310 GC ic 进样模块分流 / 不分流进样口进样器温度 250 进样模式不分流加压模式 300 KPa 不分流时间 1.0 分钟分析柱 TG-WAX MS, 30m 0.25mm 0.5μm 载气 He(99.999% purity 利用气相色谱 - 质谱 / 质谱联用仪进行高灵敏度的亚硝胺分析 Application Note 10315 Alex Chen 1, Hans-Joachim Huebschmann 2, Li Fangyan 3, Chew Yai Foong 3 and Chan Sheot Harn 3 1 Alpha Analytical Pte. Ltd., Singapore; 2 Thermo Fisher