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3 The project is concerning in setup porcine cdna library from high productive sows. We succeeded construction a mature unfertilized oocyte cdna library from 50 oocytes. Mouse oocyte specific expression genes are used to verify the quality of the library. At last, we picked and stored the library. Some clones are sequenced and the result is analyzed with BLAST program in NCBI WWW site. We will screen out the high repetitively expressed genes and perform whole library sequence in the further years.

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6 営 2

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8 , (oogonia),,,,, 1700,,,,,, (primay oocyte),,,, (secondary oocyte), (ovum) in vivo ( )36 hr metaphase; Met 4042 hr Hunter and Polge, 1966 (cumulus cells)gap junction (Heifz, 1987, Martin et al., 2002) Martin et al.(2002) 滤 (folliculogenesis) : Oocyte factors granulosa cells (oocyte granulosa cumulus cells, follicule mural granulose cells) (postnatal)oocyte FIGa (factors in the germline a) primordial follicles 2. KLactivin, AMH (somatic cell derived anti-mullerian hormone) primary follicle ( cumulus cell) 3. primary follicle oocyte cumulus cell 4. cumulus cells preovulatory follicle (antral)gonadotropin hormones and require follicle-stimulating hormone (FSH) oocyte zona proteins, ZP-3, ZP-2 (oocyte-derived zona pellucida proteins)knockout mice zona proteins granulosa cells i. GDF-9(growth differentiation factor-9)oocyte cumulus cells. ii. Oocyte KIT receptor, iii. KITL(KIT ligand)granulosa cells 2nd follicle (prenatral) stage. 5. GDF-9 : 4

9 (i) induce hyaluronan synthase 2, pentraxin 3, and tumor necrosis factor induced factor 6, and suppressing urokinase plasminogen activator (Elvin et al., 2000; Varani et al., 2002) (ii) stimulates prostaglandin and progesterone synthesis and/or signaling pathways in preovulatory cumulus granulosa cells (Elvin et al., 2000);and (iii) suppresses the luteinization of cumulus granulosa cells by inhibiting LH receptorexpression (Elvin et al., 2000). oocyte-secreted TGF-β superfamily protein, bone morphogenetic protein 15 (BMP-15), GDF-9 ovulation (Yan et al., 2001). 6. LH response factors periovulatory period knockout mouse models : prostaglandin and progesterone pathways (e.g., CCAAT/enhancer binding protein b, cyclooxygenase 2, and progesterone receptor)(richards, et al., 2002). 7. oocytes maternal effect factors: (i) MATER ( maternal antigen that embryos require ): two-cell stage (Tong, et al., 2000), and (ii) DNMT1o, oocyte-specificdna methyltransferase: maintains genomic imprinting crucial for viability of the developing fetus (Howell et al., 2001). Ko et al.(2000) 2 cell embyro4 cell embryo 8 cell embryo Morula (16 cells)blastocyst (32-64 cells) plasmid library (0-16 cells) 3000 ESTs Blastocysts 5000 ESTs stage specific gene groups :291 oocyte specific genes241 genes (fertilize cell specific)282 genes(2 cells specific)248 genes (4 cells specific)347 genes (8 cells specific) ESTs PCR random microarray Stanton et at. (2001)NIH databases 15 mouse early embryo expressed EST libraries (unfertilized, fertilized, 2,4,8,16 cell stages) ESTs unique genes ESTs unique genes 1585 unique libraries 109 stage-specific.stanton 4 unique genes oocyte and fertilized oocyte Punsuksilli et al.(2002) substrative libraries genomic project microarry substraction library (see prilimary 5

10 data) 2-cells 4cells, 8cells? Bilodeau-Goeseels S. : 2 transcripts for housekeeping proteins (beta-actin and ribosomal protein L30) and 3 transcripts for growth factor ligand or receptors (platelet derived growth factor receptor alpha (PDGFRalpha), basic fibroblast growth factor (bfgf)), 6

11 EST Sanger ( ) ( ) ( / / ) ABI3100 ( ) ABI3100 ( ) ABI3100 ABI ABI3100 ABI ABI BigDye Terminator 2-4 cdna EST 2 cdna cdna libraries ( ) library (clones) cdna ( ) ( ) (ABI ABI =19,600 ABI ABI3100 ) cdna/est (Expression Sequence Tag), cdna/est, EST 35 (unique)est ( ) cdna microarray ( ) () cdna (SNP ) mrna cdna EST cdna EST cdna 10 cdna RNA Clontech SMART Lambda ( ) RNA DNA 7

12 : 1. cdna Total RNA (oocyte2-cell8-cell blastocyst stage). Total RNA cdna Clontech SMART cdna library construction kittotal RNA mrna absolutely RNA Nanoprep kit. (Strategene) mrna Super Smart PCR cdna synthesis kit (Clontech) cdna embryogenesis marker genes PCR cdna PCR2.1 (C.TA cloning Kit; Invitrogen) electro-poration E.coli (3 ) 2ml, overnight -80 C 2.cDNA QPix-II ,000 3 (ATIT) PCR 3.EST DNA SMART PCR primer sets Viogene plasmid purification kits ABI big dye sequencing kit. 96 wells ABI 377 automated sequencing machine( ) ABI 3700( ) 8

13 50 mature oocytes Nano RNA extraction TA cloning 5 5 GGG Oligonucleotides Poly A + 3 CDS III Primer Transform (E. coli : TOPO 10) First-strand synthesis coupled 5 GGG 5 CCC Poly A + Template switching & Pickup colonies and insert characterization GGG 9 Poly A + CCC DNA sequencer LD PCR

14 Date cell x 57 ( ) cell x cell x cell x cell x 12 (5+7) 4 cell x 12 2 cell x 2 Total: Oocyte: 89 2 cellx4, 4 cellx37, 8 cellx30, 16 cellx5 oocytes (50 ) () 1.mRNA extraction: absolutely RNA Nanoprep kit. (Strategene) 2.Library construction: Super Smart PCR cdna synthesis kit. (Clontech); 3.TA cloning Kit. (Invitrogen) : A. :50 mature oocytes: 10

15 B. : 50 oocytes absolutely RNA Nanoprep kit 25ng total RNA RT-PCR kit LD-PCR PCR cycle size cycle 30 TA-cloning LD-PCR 1kb fraction size column(spin column-1000) PCR2.1 TA cloning transform E. coli TOP10 11

16 ( ) oocyte ( primers :oocyte-407, oocyte-603, :oocyte-618, oocyte Primer name Sequence5 to 3 Product Oocyte-407 Oocyte-603 Oocyte-618 Oocyte-3973 FTGXTTCTTCACGATXTCCTTT RGCCAGTTTXGTGTTGGTTTT FCCATTGACAACTCGCATCAT RTGGAAGTTCAAACACCCTTTG FTCCTTCTTAAGGCCCCTCTC RGGAAAGGGAGGGAACAGAAAA FCCTTAATTACTTCCATGCACA R GGAATXTGTATTTTGGAGGTGCT size (bp) : ( ) oocyte-603 oocyte-3973 oocyte407 oocyte-618 : 1. mature oocyte 2. oocyte-407, oocyte618 PCR oocyte

17 ( ) 12 : 1. Sus Scrota 18s rrna Sus Scrota Mitochondria25 3. Sus Scrota 16s ribosome RNA gene Bos taurus S-adenosylmethionine decarboxylase 18.3 Table 2. Sequence analysis of randomly chosen cdna clones Library Clone no. Most homologous sequence Oocytes 1 Sus scrofa 18s rrna 2 Sus scrofa breed Swedish wild boar mitochondrion 3 Sus scrofa breed Swedish wild boar mitochondrion 4 Sus scrofa 16s ribosomal RNA gene 5 Sus scrofa complete mitochondrial DNA 6 Sus scrofa 18s rrna 7 Sus scrofa 18s rrna 8 Sus scrofa 18s rrna 9 Sus scrofa 18s rrna 10 Bos taurus S- Adenosylmethionine decarboxylase 1 11 Sus scrofa 18s rrna 12 Sus scrofa 18s rrna Accession no. AF AY AJ Percent identity 134/137 (97) 304/04 (100%) 515/515 (100%) 495/505 (98%) 240/240 (100%) 593/598 (99%) 245/245 (100%) 225/231 (97%) 150/178 (84%) 145/179 (81%) 119/120 (99%) 239/245 (97%) 237/243 (97%) 239/245 (97%) 237/243 (97%)- normalize 18s rrna 18s probe, 13

18 : s rrna 14

19 ,, P39~47,, P63~72, Pig News and Information 2000 Vol.21 No.3 89N-98N,, 1996,28 (96),1, 9~20. Bilodeau-Goeseels S., (2003) Effect of oocyte quality on the relative abundance of specific gene transcripts in bovine mature oocytes and 16-cell embryos. Can J Vet Res. 67: Elvin, J. A., Yan, C., Matzuk, M.M., (2000), Oocyte-expressed TGF-beta superfamily members in female fertility., Mol. Cell. Endocrinol., 159:1-5. Heikinheimo, O and Gibbons, WE, (1998), The molecular mechanisms of oocyte maturation and early embryonic development are unveiling new insights into reproductive medicine, Mol Hum Reprod 4: Hafez, E.S.E., (1987), Folliculogenesis, egg maturation and ovulation., Reproduction in farm animals. 5th, edition. Lea & Febiger, Philadelphia. pp Howell, C.Y.. et al. (2001), Genomic imprinting disrupted by a maternal effect mutation in the Dnmt1 gene, Cell, 104: Ko, M.S. et al., (2000) Large-scale cdna analysis reveals phased gene expression patterns during preimplantation mouse development. Development 127: Martin M. Matzuk, Kathleen H. Burns, Maria M. Viveiros, and John J. Eppig, (2002), Intercellular Communication in the Mammalian Ovary: Oocytes Carry the Conversation, Science 296: Richards, J.S., et al. (2002), Ovulation: new dimensions and new regulators of the inflammatory-like response, Annu. Rev. Physiol., 64: Stanton, J.L., and Green D.P.L., (2001) Meta-analysis of gene expression in mouse preimplantation embryo development, Mol. Human Reprod. 7:545. Stanton JL, Green DPL., (2001) A set of 840 mouse oocyte genes with well-matched human homologues., Mol. Human Reprod. 7:521. Tong, Z.B., et al. (2000), Mater, a maternal effect gene required for early embryonic development in mice, Nature Genet., 26: Varani, S. et al. (2002), Knockout of pentraxin 3, a downstream target of growth differentiation factor-9, causes female subfertility., Mol Endocrinol., 16: Yan, C. et al., (2001) Synergistic roles of bone morphogenetic protein 15 and growth differentiation factor 9 in ovarian function., Mol Endocrinol. 15:

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