国 际 药 学 研 究 杂 志 2014 年 2 月 第 41 卷 第 1 期 JIntPharmRes,Vol.41,No.1,February, prop5 是 靶 向 促 凋 亡 蛋 白 PDCD5 的 P ASODN 本 实 验 室 研 究 表 明,PDCD5 在 流 感 病

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1 102 国 际 药 学 研 究 杂 志 2014 年 2 月 第 41 卷 第 1 期 JIntPharmRes,Vol.41,No.1,February,2014 论 著 硫 代 磷 酸 反 义 寡 核 苷 酸 prop5 对 流 感 病 毒 进 入 细 胞 的 抑 制 作 用 李 康 1,2, 齐 向 云 2, 李 庆 平 2, 夏 燕 平 2, 杨 静 2 2, 王 升 启 [ 摘 要 ] 目 的 研 究 硫 代 磷 酸 反 义 寡 核 苷 酸 prop5 对 流 感 病 毒 感 染 进 入 细 胞 的 影 响 方 法 采 用 流 感 病 毒 感 染 A549 细 胞 模 型, 设 立 随 机 序 列 (prop5r) 和 正 义 序 列 (prop5s) 作 为 阴 性 对 照, 收 集 细 胞 培 养 液, 采 用 实 时 荧 光 定 量 PCR 检 测 病 毒 RNA 拷 贝 数, 评 价 反 义 寡 核 苷 酸 对 病 毒 吸 附 和 进 入 的 影 响 ; 进 一 步 通 过 血 凝 抑 制 实 验 检 测 prop5 对 流 感 病 毒 吸 附 细 胞 的 影 响, 溶 血 抑 制 实 验 检 测 prop5 对 流 感 病 毒 进 入 细 胞 的 影 响 结 果 prop5 能 够 抑 制 流 感 病 毒 A/Jingfang/1/86(H1N1) 感 染 A549 细 胞, 对 流 感 病 毒 吸 附 细 胞 过 程 没 有 影 响,prop5 能 够 抑 制 A/Jingfang/1/86(H1N1) A/Lufang/9/93(H3N2) A/FM/1/47(H1N1) 和 A/PR/8/34(H1N1) 介 导 的 膜 融 合 结 论 prop5 能 抑 制 流 感 病 毒 进 入 细 胞, 这 种 额 外 的 活 性 增 强 了 prop5 的 抗 病 毒 能 力 [ 关 键 词 ] 硫 代 磷 酸 反 义 寡 核 苷 酸 ;prop5; 流 感 病 毒 ; 感 染 [ 中 图 分 类 号 ] R978 7 [ 文 献 标 志 码 ] A [ 文 章 编 号 ] (2014) DOI: /j cnki jipr Inhibitedefectofphosphorothioateantisenseoligonucleotidesprop5 onentryofinfluenzavirusintocels LIKang 1,2,QIXiang yun 2,LIQing ping 2,XAYan ping 2,YANGJing 2,WANGSheng qi 2 (1.ColegeofLifeScienceandBio enginering,beijinguniversityoftechnology,beijing100124,china; 2.InstituteofRadiationMedicine,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100850,China) [Abstract] Objective Tostudytheinhibitoryacitvityofphosphorothioateantisenseoligonucleotide(P ASODN)prop5a gainstinfluenzavirusentryintocels.methods A549celsinfectedbyinfluenzaviruswereusedinthisstudy.Arandomsequence (prop5r)andasensesequence(prop5s)servedasnegativecontrols.culturemediasupernatantswerecolectedtodetectcopiesof viralrnabyreal timequantitativert PCR.Further,theefectofprop5onvirusatachmentwasvalidatedbyhemagglutinationinhibi tionasayanditsefectonvirusentrywasdeterminedbyhemolysisinhibitionasay.rusults Prop5couldinhibitinfectionofA549by influenzaa/jingfang/1/86(h1n1).prop5didnotinterferewithinfluenzavirusatachmentoncels.prop5couldinhibitmembranefu sionmediatedbyinfluenzaa/jingfang/1/86(h1n1),a/lufang/9/93(h3n2),a/fm/1/47(h1n1)anda/pr/8/34(h1n1). Conclusion Prop5blocksinfluenzavirusentryinsequence independentmanner.thisextraactivityenhancestheanti influenzavirus capabilityofprop5. [Keywords] phosphorothioateantisenseoligonucleotides;prop5;influenzavirus;infections 反 义 寡 核 苷 酸 技 术 是 转 运 RNA 发 现 者 美 国 著 名 生 物 学 家 Zamecnik 在 20 世 纪 70 年 代 提 出 的 [1] 反 义 寡 核 苷 酸 能 够 通 过 Watson Crick 氢 键 特 异 性 地 结 合 靶 标 mrna, 导 致 mrna 降 解 或 者 功 能 丧 失 这 个 特 点 使 得 反 义 寡 核 苷 酸 药 物 相 对 于 传 统 药 物 副 作 用 更 小 [2] 目 前 治 疗 病 毒 感 染 性 疾 病 [3 6] 癌 [7] [8] 症 和 糖 尿 病 等 反 义 寡 核 苷 酸 药 物 都 在 研 发 中 硫 代 磷 酸 反 义 寡 核 苷 酸 (phosphorothioateanti senseoligonucleotide,p ASODN) 是 将 反 义 寡 核 苷 酸 中 的 磷 酸 二 酯 键 骨 架 进 行 硫 代 磷 酸 化 修 饰 硫 代 修 饰 能 够 提 高 核 酸 酶 耐 受 性, 而 且 可 以 诱 导 RNaseH 降 解 其 靶 向 的 RNA 序 列 [9] 这 种 修 饰 同 时 也 增 加 了 核 苷 酸 序 列 骨 架 的 疏 水 性, 使 得 P ASODN 成 为 既 有 疏 水 性 也 有 亲 水 性 的 两 亲 性 寡 核 苷 酸 研 究 表 明, 两 亲 性 的 硫 代 寡 核 苷 酸 能 够 以 序 列 非 依 赖 性 方 式 抑 制 1 型 人 类 免 疫 缺 陷 病 毒 (HIV 1) [4,10] 小 鼠 和 人 巨 细 胞 病 毒 (MCMV 和 HCMV) [11] 丙 肝 病 毒 (HCV) [5] 等 多 种 病 毒 的 进 入 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 面 上 项 目 ( ; ) 作 者 简 介 : 李 康, 男, 在 读 博 士 研 究 生, 研 究 方 向 : 病 毒 性 疾 病 防 治 研 究,Tel: ,E mail:caaslk@163.com 作 者 单 位 : 北 京, 北 京 工 业 大 学 生 命 科 学 与 生 物 工 程 学 院 ( 李 康 ); 北 京, 军 事 医 学 科 学 院 放 射 与 辐 射 医 学 研 究 所 ( 李 康, 齐 向 云, 李 庆 平, 夏 燕 平, 杨 静, 王 升 启 ) 通 讯 作 者 : 王 升 启, 男, 研 究 员, 博 士 生 导 师, 研 究 方 向 : 传 染 病 分 子 诊 断 与 治 疗 药 物 研 究,Tel: ,E mail:sqwang@bmi.ac.cn; 杨 静, 女, 副 研 究 员, 硕 士 生 导 师, 研 究 方 向 : 分 子 病 毒 学,Tel: ,E mail:jingyang0511@sina.com

2 国 际 药 学 研 究 杂 志 2014 年 2 月 第 41 卷 第 1 期 JIntPharmRes,Vol.41,No.1,February, prop5 是 靶 向 促 凋 亡 蛋 白 PDCD5 的 P ASODN 本 实 验 室 研 究 表 明,PDCD5 在 流 感 病 毒 感 染 A549 细 胞 后 会 过 量 表 达,prop5 在 体 内 外 实 验 中 都 能 有 效 抑 制 PDCD5 的 过 量 表 达 在 抗 流 感 活 性 实 验 中, prop5 能 抑 制 流 感 病 毒 复 制 感 染 所 致 的 细 胞 病 变, 也 能 提 高 感 染 小 鼠 存 活 率, 减 少 小 鼠 肺 部 病 毒 滴 度 体 内 外 抗 病 毒 活 性 实 验 研 究 均 发 现, 提 前 给 药 时 prop5 都 表 现 出 较 好 的 预 防 活 性 本 文 旨 在 进 一 步 探 讨 prop5 是 否 影 响 病 毒 吸 附 和 进 入 细 胞 的 过 程 1 材 料 与 方 法 1 1 细 胞 与 病 毒 株 肺 腺 癌 细 胞 (A549) 为 本 实 验 室 保 存, 分 别 用 含 有 10% 胎 牛 血 清, 青 霉 素 100U/ml, 链 霉 素 100mg/ L 的 F12K 和 DMEM 的 培 养 基 置 于 37 5% CO 2 孵 箱 培 养 流 感 病 毒 A/Jingfang/1/86(H1N1) A/Lu fang/9/93(h3n2) A/FM/1/47(H1N1) 和 A/PR/8/ 34(H1N1) 为 本 实 验 室 保 存, 用 无 特 定 病 原 体 级 鸡 胚 扩 增, 经 空 斑 滴 定 后 用 于 本 实 验 1 2 试 剂 与 仪 器 P ASODN prop5(5 CCCTGTGCTTTGCTTCCT GT 3 ) 随 机 序 列 prop5r (5 CTCTCTTTGTTCT TCGGCCG 3 ) 正 义 序 列 prop5s(5 ACAGGAAG CAAAGCACAGGG 3 ) 和 4 条 硫 代 寡 核 苷 酸 随 机 序 列 ( 和 40 mer 随 机 序 列 ) 均 为 本 实 验 室 合 成 ; 病 毒 检 测 引 物 和 探 针 由 本 实 验 合 成 ;6% 鸡 血 红 细 胞, 广 州 蕊 特 生 物 技 术 有 限 公 司 ; 病 毒 RNA 提 取 试 剂 盒 和 一 步 法 实 时 荧 光 定 量 检 测 试 剂 盒 (Taq man), 北 京 天 根 生 物 技 术 有 限 公 司 ; 高 糖 DMEM 培 养 基 胎 牛 血 清, 美 国 Gibco 公 司 ;F12k 培 养 基, 北 京 迈 晨 生 物 技 术 有 限 公 司 ; 其 他 试 剂 均 为 进 口 或 国 产 分 析 纯 ; 细 胞 培 养 箱 (3111 型 ) 全 波 长 酶 标 仪 ( 型 ), 美 国 Thermo 公 司 ; 实 时 荧 光 定 量 PCR 仪 (Prism7500 型 ), 美 国 ABI 公 司 ; 紫 外 凝 胶 成 像 仪 (GelDoc1000 型 ), 美 国 Bio Rad 公 司 ; 电 泳 仪 (DYY 6B 型 ), 北 京 六 一 仪 器 厂 1 3 实 时 荧 光 定 量 PCR 检 测 流 感 病 毒 感 染 细 胞 后 培 养 液 中 病 毒 RNA 的 表 达 水 平 A549 细 胞 接 种 96 孔 板 ( / 孔 ) 培 养 12~ 18h, 分 4 组 prop5 预 处 理 病 毒 组 : 流 感 病 毒 A/ Jingfang/1/86(H1N1) 感 染 复 数 (moi) 值 为 1 同 prop5 在 冰 上 放 置 1h 后, 加 入 A549 细 胞 在 37 中 感 染 1h,PBS 清 洗 2 次 更 换 新 鲜 培 养 基, 培 养 12h prop5 预 处 理 细 胞 组 : 细 胞 于 含 prop5 的 培 养 液 中 37 放 置 2h 后,PBS 清 洗 2 次 更 换 新 鲜 培 养 基, 培 养 12h 感 染 时 加 prop5 组 :prop5 与 病 毒 混 匀 后 加 入 细 胞,37 放 置 1h,PBS 清 洗 2 次 更 换 新 鲜 培 养 基, 培 养 12h 病 毒 感 染 组 :PBS 代 替 核 酸 药 物 作 为 对 照, 培 养 12h 收 集 上 述 处 理 的 上 清 培 养 液, 采 用 天 根 病 毒 RNA 试 剂 盒 提 取 细 胞 培 养 液 中 的 流 感 病 毒 RNA RNA 拷 贝 数 检 测 采 用 天 根 一 步 法 实 时 荧 光 定 量 试 剂 盒 (Taqman 法 ) 采 用 世 界 卫 生 组 织 推 荐 流 感 病 毒 检 测 引 物 和 探 针 引 物 为 M1 上 游 引 物,5 GACCRATCCTGTCACCTCTGAC 3 ;M1 下 游 引 物 :5 AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA 3 ; 探 针 :5 FAM TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG BHQ1 3 反 应 条 件 :50,30min;92,2min;92, 15s,55,20s,68,30s(40 个 循 环 ) 用 流 感 病 毒 M1 基 因 片 段 RNA 做 为 标 准 品, 以 标 准 品 RNA 拷 贝 数 的 对 数 值 为 横 坐 标, 以 相 对 应 的 CT 值 为 纵 坐 标, 绘 制 标 准 曲 线 根 据 未 知 样 品 的 CT 值, 按 标 准 曲 线 得 到 样 品 RNA 的 拷 贝 数 1 4 实 时 荧 光 定 量 PCR 检 测 流 感 病 毒 吸 附 后 细 胞 培 养 液 中 病 毒 RNA 的 表 达 水 平 参 考 文 献 [13], 将 A549 细 胞 接 种 96 孔 板 ( / 孔 ) 后 培 养 12~18h, 在 4 冷 却 至 少 2h, 分 4 组 prop5 组 : 流 感 病 毒 A/Jingfang/1/86(H1N1) (moi 值 为 1) 与 prop5(2μmol/l) 混 合,4 冷 却 1h 后 加 入 A549 细 胞 吸 附 1h 后 用 冰 冷 的 PBS 洗 去 未 结 合 的 病 毒 及 prop5, 更 换 新 鲜 培 养 基 培 养 12h prop5s prop5r( 各 2μmol/L) 两 组 : 作 为 两 个 阴 性 对 照 组, 处 理 方 法 同 prop5 组 病 毒 对 照 组 :PBS 代 替 核 酸 药 物, 处 理 方 法 同 上 收 集 各 组 上 清 培 养 液 通 过 实 时 荧 光 定 量 PCR 检 测 病 毒 RNA 拷 贝 数, 方 法 同 1 3 项 1 5 血 凝 抑 制 实 验 观 察 流 感 病 毒 吸 附 后 鸡 血 红 细 胞 形 态 变 化 参 考 文 献 [14], 实 验 分 3 组 阳 性 对 照 组 :25 μl 流 感 病 毒 (4 个 血 凝 单 位 ) 与 25μlPBS 混 匀 后 加 入 50μl1% 鸡 血 红 细 胞 悬 浮 液 阴 性 对 照 组 :50μl PBS 加 入 50μl1% 鸡 血 红 细 胞 悬 浮 液 prop5 处 理 组 :25μl 流 感 病 毒 与 25μl 不 同 浓 度 的 prop5 混 匀 后 在 室 温 放 置 1h, 再 加 入 50μl1% 鸡 血 红 细 胞 悬 浮 液 混 匀, 室 温 中 放 置 45min~1h 后, 观 察 血 凝 抑 制 情 况 单 层 红 细 胞 均 匀 铺 底 表 明 无 血 凝 抑 制 作 用, 红 细 胞 在 孔 底 聚 集 成 一 个 小 团 表 明 有 血 凝 抑 制 作 用 1 6 实 时 荧 光 定 量 PCR 检 测 流 感 病 毒 进 入 细 胞 后 培 养 液 中 病 毒 RNA 的 表 达 水 平 参 考 文 献 [15],A549 细 胞 在 4 冷 却 至 少 2h

3 104 国 际 药 学 研 究 杂 志 2014 年 2 月 第 41 卷 第 1 期 JIntPharmRes,Vol.41,No.1,February,2014 后, 感 染 流 感 病 毒 A/Jingfang/1/86(H1N1)(moi 值 为 1) 依 据 prop5 浓 度 分 5 组 在 4 放 置 1h 后, A549 细 胞 用 冰 冷 的 PBS 洗 去 未 结 合 的 病 毒, 分 别 加 入 不 同 浓 度 ( 和 12 5μmol/L) 的 prop5, 置 于 37 培 养 在 预 定 的 时 间 ( 和 120min), 除 去 含 prop5 培 养 液, 用 PBS 清 洗, 未 穿 入 的 病 毒 用 甘 氨 酸 缓 冲 液 ( 甘 氨 酸 0 1μmol/L NaCl0 1μmol/L ph=3 0) 灭 活 1min PBS 清 洗 后 加 入 新 鲜 培 养 基,37 培 养 9h, 收 集 培 养 液 实 时 荧 光 定 量 检 测 流 感 病 毒 RNA 拷 贝 数 1 7 溶 血 抑 制 实 验 检 测 流 感 病 毒 介 导 膜 融 合 的 溶 血 抑 制 率 参 考 文 献 [14], 用 PBS 配 制 2% 鸡 血 红 细 胞 悬 浮 液,4 存 放, 实 验 前 37 预 热 实 验 分 6 组 : prop5 组,100μl 的 prop5(10μmol/l)pbs 溶 液 与 同 体 积 的 病 毒 液 ( PFU) 混 合, 室 温 放 置 30min prop5r(10μmol/l) 组 prop5s(10μmol/l) 组 和 IV AS(10μmol/L) 组 作 为 对 照 组, 处 理 方 法 同 prop5 组 病 毒 对 照 组 : 用 PBS 代 替 药 物 ph 对 照 组 : 用 PBS 代 替 病 毒 和 药 物 各 组 都 加 入 200μl2% 鸡 血 红 细 胞 悬 浮 液,37 放 置 30min 以 上 各 组 都 加 入 100μl 不 同 ph 值 ( 和 6 0) 的 乙 酸 钠 缓 冲 液 (0 5μmol/L), 混 合 均 匀, 37 放 置 30min 混 合 物 g 离 心 6min, 除 去 沉 淀 从 中 取 300μl 转 移 到 平 底 96 孔 板 中, 测 量 540nm 的 吸 光 度 (A 540 ) 值 和 40 mer 随 机 序 列 抑 制 流 感 病 毒 介 导 膜 融 合 活 性 方 法 同 上 计 算 溶 血 抑 制 的 IC 50 值 参 考 文 献 [14],prop5 分 别 设 立 5 个 浓 度 梯 度 ( 和 12μmol/L), 按 照 上 述 方 法 测 得 ph 值 为 5 时 的 A 540 值, 根 据 如 下 公 式 计 算 溶 血 抑 制 率 (R) 用 GraphPadPrism5 软 件 计 算 prop5 的 IC 50 值 R=[1-(A prop5 -A PBS )/(A 病 毒 对 照 -A PBS )] 100% P ASODN 在 低 ph 中 稳 定 性 检 测 参 考 Bernstein [16] 等 报 道, 将 其 与 不 同 ph 值 (4 5 6 和 7) 的 乙 酸 钠 缓 冲 液 混 匀,37 中 放 置 24h 用 含 7mol/L 尿 素 20% 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 进 行 电 泳, 溴 化 乙 啶 (EB) 染 色, 紫 外 凝 胶 成 像 仪 中 观 察 其 条 带 是 否 清 晰 有 无 发 生 降 解 1 8 统 计 学 处 理 所 有 实 验 数 据 以 x±s 珋 表 示, 用 SPSS11 5 统 计 学 软 件 进 行 统 计 分 析 多 组 间 差 异 采 用 单 因 素 方 差 分 析 (one wayanova), 以 P<0 05 表 示 具 有 统 计 学 差 异,P<0 01 表 示 具 有 显 著 统 计 学 差 异 2 结 果 2 1 prop5 对 流 感 病 毒 感 染 A549 细 胞 的 影 响 结 果 显 示 ( 图 1), 与 PBS 处 理 对 照 组 相 比, prop5 预 处 理 病 毒 组 prop5 预 处 理 细 胞 组 和 感 染 时 加 prop5 组 感 染 A549 细 胞 的 病 毒 拷 贝 数 均 显 著 减 少 (P<0 01) 不 过 prop5 预 处 理 病 毒 或 细 胞 与 感 染 同 时 加 prop5 组 相 比, 病 毒 考 贝 数 无 明 显 差 异 图 1 prop5 对 流 感 病 毒 A/Jingfang/1/86(H1N1) 感 染 A549 细 胞 的 影 响 注 : P<0 01, 与 病 毒 对 照 组 相 比 ; x±s,n=3 珋 Fig.1 Efectofprop5oninfectionofA549celsbyinflu enzaa/jingfang/1/86(h1n1) P<0 01,comparedwith viruscontrolgroup; x±s,n=3 珋 2 2 prop5 对 流 感 病 毒 吸 附 A549 细 胞 的 影 响 为 进 一 步 研 究 prop5 抑 制 病 毒 感 染 细 胞 的 作 用 方 式, 首 先 检 测 其 对 病 毒 吸 附 细 胞 的 影 响 如 图 2A 所 示, 与 病 毒 对 照 组 相 比,prop5 prop5r 和 prop5s 组 病 毒 拷 贝 数 均 无 统 计 学 差 异, 表 明 prop5 不 影 响 流 感 病 毒 吸 附 A549 细 胞 为 进 一 步 验 证 prop5 对 病 毒 吸 附 的 影 响, 进 行 血 凝 抑 制 实 验 结 果 显 示, 流 感 病 毒 A/Jingfang/1/86(H1N1) 和 A/Lufang/9/93 (H3N2) 经 过 prop50 5μmol/L~1mmol/L 处 理 后, 鸡 红 细 胞 都 均 匀 凝 聚 孔 底, 发 生 血 凝 现 象 ( 图 2B, 2C) 此 结 果 同 病 毒 对 照 组 引 起 的 血 凝 相 同, 表 明 prop5 不 能 抑 制 流 感 病 毒 A/Jingfang/1/86(H1N1) 和 A/Lufang/9/93(H3N2) 吸 附 到 鸡 血 红 细 胞 上 同 样,prop5R 和 prop5s 也 不 能 抑 制 流 感 病 毒 A/ Jingfang/1/86(H1N1) 引 起 鸡 红 细 胞 血 凝 的 出 现 2 3 prop5 对 流 感 病 毒 进 入 细 胞 的 影 响 实 时 荧 光 定 量 PCR 结 果 显 示 ( 图 3), 在 进 入 时 间 为 和 120min 时, 加 入 prop5 处 理 都 能 减 少 病 毒 进 入 细 胞, 并 有 剂 量 依 赖 性 为 进 一 步 验 证 prop5 对 流 感 病 毒 介 导 的 膜 融 合 的 抑 制 作 用, 采 用 了 溶 血 抑 制 实 验 图 4 所 示, 当 ph<4 8 时, 无 论 有 无 病 毒 的 存 在, 都 引 起 溶 血 (A 540 值 都 较 大 ); 当

4 年 2月 第 卷 第 期 I Ph mr V N F b y 2 国际药学研究杂志 2 5 图 2 5对流感病毒吸附过程的影响 注 A 5对 流 感 病 毒 吸 附 A59细 胞 的 影 响 B 5对 6 HN 介 导 血 凝 的 影 响 C 5对 L 9 HN2 介导血凝的影响 F 2 E 5 hm z v AE 5 h m z v BE 5 d dh m CE 5 z L 9 HN2 d dh m z 6 HN 图 实时荧光 定 量 PCR检 测 5对 流 感 病 毒 进 入 A5 9细胞的影响 F E 5 y A5 9 z v by mpcr 图 5对流感病毒 6 HN 介导膜 融合的影响 H 5 6时 无论有无病毒的存在 都不会引起溶血 注 P 与病毒对照组相比 x F E 5 m mb m d dby A5值都较小 当 H 5 6时 H本身引起 6 HN P m dw hv 的溶血较小 PBS对照组的 A5值都较小 而在此 x H值条件下的流感病毒会引起溶血 病毒对照 A5 值都较大 5 μm L 能显著地减少溶血 5 72± 62± 7 和 7 92± 6 其 A5值与病毒对照组值相比均具有显著统计学差 异 P 另外 5S 2 m 也表现出较好 L 以上结果表明 5能够抑制流感病毒介 μm 导的膜融合过程 的 抑 制 活 性 而 具 有 抗 流 感 活 性 的 I V AS 2 5与 2 和 m 随机序列抑制流 6 m 无 抑 制 溶 血 活 性 其 A5值 同 病 毒 接 近 聚丙烯 为了证明溶血实验的可靠性 我们通过尿素 感病毒介导膜融合活性的比较 从图 结果中推测抑制溶血的活性同序列长度 酰胺凝 胶 电 泳 进 一 步 证 实 了 低 H 值 条 件 下 的 5与 有关系但没有序列特异性 我们比较 5稳定性 如图 5和图 6所示 5能够抑制 2 m 和 m 随机序列对流感病毒 6 HN L 9 HN2 6 HN 介导膜融合的抑制活性 如图 7 7 HN 和 HN 引 起 的 所示 m 随机序列由于疏水能力太小没有表现 膜融 合 相 对 应 的 I C5值 分 别 为 5 ± 5 2m m 和 出任何抑制溶血的活性

5 6 年 2月 第 卷 第 期 I Ph mr V N F b y 2 国际药学研究杂志 2 图 5 5对流感病毒 L 9 HN2 7 HN HN Ⅰ Ⅱ 和 Ⅲ 介导膜融合的影响 注 P 5 P 与病毒对照组相比 x F 5 E 5 m mb m d dby z L 9 HN2 Ⅰ 7 HN Ⅱ d HN Ⅲ P 5 P m dw hv x m 随机序列都表现出抑制溶血的活性 在 H为 5 时 5 2和 m 随机序列与病毒对照相 5 在 H为 5 2时 比 A5值都明显降低 P 5和 m 随机序列与病毒对照组相比 A5值 在 H 也明显降低 有统计学显著差异 P 为5 时 5 2 和 m 随机序列与病毒 对照组相比 其 A5值都具有统计学显著差异 P 所采用的 种随机序列经尿素变性 PAGE 电泳检测条带较为清晰 确定其在酸性环境中都比 较稳定 以上结果表明 5抑制 HA介导的病毒 图 6 5抑制 种流感病毒株介导膜融合的半数抑制 细胞膜融合是序列非依赖性的 浓度 I C5 H 5 x 珔± F 6 I C5 5 m mb m d d 讨论 在流感病毒感染宿主细胞过程中有两个关键步 by z v H 5 x 珔± 骤 即流感病毒血凝素 HA 与受体的特异结合以 及 HA介导的病毒 细胞膜融合 流感病毒 HA可以 结合到血红细胞表面的唾液酸糖蛋白受体上 使得 红细胞发生血凝现象 采用血凝抑制实验检测药物 是否具有抑制病毒吸附的活性已有文献报道 7 5在 mm L浓 本文通过血凝抑制实验表明 度下对流感病毒吸附无抑制作用 流感病毒与相应 受体吸附后 在细胞膜通过胞吞作用包裹形成内吞 体 低 H值会诱导吸附在红细胞膜上的流感病毒 HA发生构型变化 从而使细胞膜破裂 溶血抑制 H值下的构 实验能够检测药物能否抑制 HA在低 图 7 5与 2 和 m 随机序列抑制流感病 毒介导膜融合活性的比较 注 P 5 P 与病毒对照组相比 x F 6Th m h b y v y 5 d 2 d m d m q z v m d dm mb P 5 P m dw hv x 型变化 已被运用于抗流感病毒药物抑制流感病毒 进入的研究中 本文通过溶血抑制实验表明 5能 够 抑 制 6 HN L 9 HN2 7 HN 和 HN 等流感病毒 HA介导的膜融合 我们进一步探讨了在低 H值下 5抑制流

6 国 际 药 学 研 究 杂 志 2014 年 2 月 第 41 卷 第 1 期 JIntPharmRes,Vol.41,No.1,February, 感 病 毒 HA 介 导 膜 融 合 的 机 制 流 感 病 毒 HA2 亚 基 N 端 的 α 螺 旋 三 聚 体 结 构 的 融 合 蛋 白 在 介 导 病 毒 细 胞 膜 融 合 中 起 到 关 键 作 用 当 ph 值 为 5 0~ 6 0 时,HA 构 象 发 生 变 化 使 得 融 合 蛋 白 暴 露 出 来, 并 插 入 到 细 胞 膜 中, 介 导 病 毒 细 胞 膜 融 合 这 种 卷 曲 螺 旋 的 结 构 是 Ⅰ 型 融 合 蛋 白 典 型 特 征 最 为 典 型 的 Ⅰ 型 融 合 蛋 白 包 括 流 感 病 毒 HA2 亚 基 HIV 1 的 gp41 等 [19] [4] Vailant 等 研 究 证 明 硫 代 修 饰 寡 核 苷 酸 REP9(40mer 随 机 序 列 ) 能 够 结 合 到 gp41 核 心 的 疏 水 区 域, 从 而 抑 制 了 gp41 介 导 的 膜 融 合 这 种 抑 制 活 性 无 序 列 依 赖 性, 同 疏 水 性 正 相 关 硫 代 修 饰 骨 架 赋 予 寡 聚 核 苷 酸 疏 水 性, 序 列 越 长 其 疏 水 能 力 越 大 [4 16] 源 于 这 种 抑 制 机 制,Vailant 等 推 测 并 证 实 了 REP9 同 样 能 够 抑 制 其 他 的 Ⅰ 型 融 合 蛋 白 病 毒 介 导 的 膜 融 合, 阻 断 病 毒 进 入 [12,20 21], 而 非 硫 代 修 饰 的 40 mer 随 机 序 列 均 不 能 抑 制 上 述 这 些 病 毒 进 入 流 感 病 毒 HA 是 典 型 的 Ⅰ 型 融 合 蛋 白, 按 照 Vailant 的 理 论 具 有 一 定 疏 水 能 力 的 P ASODN 也 能 够 抑 制 流 感 病 毒 HA 介 导 的 膜 融 合 本 文 中 硫 代 修 饰 的 和 40 mer 随 机 序 列 和 prop5 疏 水 能 力 较 强, 能 够 抑 制 流 感 病 毒 HA 介 导 的 膜 融 合, 而 IV AS 和 10 mer 随 机 序 列 疏 水 能 力 较 弱 没 有 抑 制 活 性 另 一 方 面, 在 REP9 抑 制 HIV 1 进 入 活 性 研 究 中, 不 同 40 mer 随 机 序 列 抑 制 活 性 不 同, 如 poly(g) 的 抑 制 活 性 最 小,poly(C) 则 最 大 REP9 也 没 有 严 格 遵 循 Vailant 的 理 论, 除 抑 制 Ⅰ 型 融 合 蛋 白 病 毒 进 入 外, 同 样 对 Ⅱ 型 融 合 蛋 白 ( 典 型 结 构 β 折 叠 组 成 的 三 聚 体 ) 病 毒 进 入 也 有 抑 制 活 性 [5] 由 此 推 测 除 疏 水 力 外, 还 有 其 他 因 素 ( 如 空 间 结 构 等 ) 影 响 膜 融 合 过 程 本 研 究 中 prop5 表 现 出 比 相 同 疏 水 能 力 的 P ASODN(prop5R prop5s 和 20mer 随 机 序 列 ) 和 较 大 疏 水 能 力 P ASODN(30mer 和 40mer 随 机 序 列 ) 更 大 的 抑 制 HA 介 导 膜 融 合 活 性 也 可 能 源 于 此 总 之,prop5 在 其 进 入 细 胞 发 挥 抑 制 作 用 前, 由 于 自 身 的 双 亲 性 阻 断 流 感 病 毒 HA 介 导 的 膜 融 合, 这 种 额 外 的 新 活 性 更 增 强 了 prop5 的 抗 病 毒 能 力 参 考 文 献 [1] ZamecnikPC,StephensonML.InhibitionofRoussarcomavirus replicationandceltransformationbyaspecificoligodeoxynucle otide[j].procnatlacadsciusa,1978,75(1): [2] CrookeST.Progresinantisensetechnology[J].AnnuRevMed, 2004,55: [3] TseMT.Regulatorywatch:antisenseapprovalprovidesboostto thefield[j].natrevdrugdiscov,2013,12(3): [4] VailantA,JuteauJM,LuH,etal.Phosphorothioateoligonu cleotidesinhibithumanimmunodeficiencyvirustype1fusionby blockinggp41coreformation[j].antimicrobagentschemother, 2006,50(4): [5] MatsumuraT,HuZ,KatoT,etal.AmphipathicDNApolymers inhibithepatitiscvirusinfectionbyblockingviralentry[j]. Gastroenterology,2009,137(2): [6] DuanM, ZhouZ, LinR, etal. Invitroandinvivoprotection againstthehighlypathogenich5n1influenzavirusbyananti sensephosphorothioateoligonucleotide[j].antivirther,2008, 13(1): [7] ZhangZ,LiM,WangH,etal.Antisensetherapytargeting MDM2oncogeneinprostatecancer:efectsonproliferation,ap optosis,multiplegeneexpresion,andchemotherapy[j].proc NatlAcadSciUSA,2003,100(20): [8] GearyRS,BradleyJD,WatanabeT,etal.Lackofpharmacoki neticinteractionforisis113715,a2 O methoxyethylmodified antisenseoligonucleotidetargetingproteintyrosinephosphatase 1BmesengerRNA,withoralantidiabeticcompoundsmetformin, glipizideorrosiglitazone[j].clinpharmacokinet,2006,45 (8): [9] MishraM,BennetJR,ChaudhuriG.Increasedeficacyofantil eishmanialantisensephosphorothioateoligonucleotidesinleish maniaamazonensisoverexpresingribonucleaseh[j].biochem Pharmacol,2001,61(4): [10] SuzukiJ,Miyano KurosakiN,KuwasakiT,etal.Inhibitionof humanimmunodeficiencyvirustype1activityinvitrobyanew self stabilizedoligonucleotidewithguanosine thymidinequadru plexmotifs[j].jvirol,2002,76(6): [11] CardinRD,BravoFJ,SewelAP,etal.AmphipathicDNApol ymersexhibitantiviralactivityagainstsystemicmurinecytomega lovirusinfection[j].virolj,2009,(6):214. [12] LuganiniA, CaposioP, LandolfoS, etal.phosphorothioate modified oligodeoxynucleotides inhibithuman cytomegalovirus replicationbyblockingvirusentry[j].antimicrobagentsche mother,2008,52(3): [13] KumarN,LiangY,ParslowTG,etal.Receptortyrosinekinase inhibitorsblockmultiplestepsofinfluenzaa virusreplication [J].JVirol,2011,85(6): [14] ZhuL,LiY,LiS,etal.InhibitionofinfluenzaAvirus(H1N1) fusionbybenzenesulfonamidederivativestargetingviralhemag glutinin[j].plosone,2011,6(12):e [15] RootCN,WilsEG,McNairLL,etal.Entryofinfluenzaviruses intocelsisinhibitedbyahighlyspecificproteinkinasecinhibi tor[j].jgenvirol,2000,81(11): [16] BernsteinDI,GoyeteN,CardinR,etal.AmphipathicDNA polymersexhibitantiherpeticactivityinvitroandinvivo[j].an timicrobagentschemother,2008,52(8): [17] LiuS,LiR,ZhangR,etal.CL inhibitsH5N1avian influenzaa virusinfectionbyblockingviralentry[j].eurj Pharmacol,2011,660(2/3): [18] PlotchSJ,O HaraB,MorinJ,etal.InhibitionofinfluenzaA virusreplicationbycompoundsinterferingwiththefusogenic ( 下 转 第 117 页 )

7 国 际 药 学 研 究 杂 志 2014 年 2 月 第 41 卷 第 1 期 JIntPharmRes,Vol.41,No.1,February, 讨 论 3 1 提 取 方 法 考 察 根 据 盐 酸 可 乐 定 的 溶 解 性 质, 选 用 0 1mol/L 盐 酸 作 为 提 取 溶 剂, 采 用 超 声 法 进 行 提 取 对 min 等 不 同 超 声 时 间 的 结 果 表 明, 超 声 5 min 基 本 已 提 取 完 全, 为 保 证 提 取 效 果, 确 定 超 声 时 间 为 15min 在 超 声 时 加 入 一 定 量 玻 璃 珠 可 有 效 避 免 提 取 过 程 中 样 品 团 聚 现 象 的 发 生 3 2 SPE 小 柱 选 择 不 同 品 牌 和 基 质 的 固 相 萃 取 小 柱 对 样 品 处 理 能 力 差 异 较 大, 研 究 中 对 比 了 CleanertSCX SPE(200 mg/6ml) CleanertPCX SPE(60mg/3ml) CNW BONDSCX(500mg/3ml) CNW Poly SeryMCX(60 mg/3ml) 和 PlexaPCX(200mg/6ml) 等 5 种 小 柱, 结 果 表 明 CleanertSCX SPE(200mg/6ml) 吸 附 解 析 性 能 最 好, 故 选 其 作 为 前 处 理 小 柱 3 3 SPE 方 案 优 化 研 究 中 对 SPE 小 柱 平 衡 以 及 上 样 淋 洗 洗 脱 等 多 个 操 作 步 骤 及 相 应 溶 剂 进 行 筛 选 优 化, 最 终 优 选 的 萃 取 方 案 有 以 下 特 点 : 上 样 前 采 用 0 1mol/L 盐 酸 平 衡 小 柱, 可 确 保 目 标 成 分 的 完 全 电 离 和 充 分 交 换 ; 采 用 水 50% 甲 醇 作 为 淋 洗 液, 在 保 证 除 杂 效 果 的 前 提 下 减 少 了 有 机 溶 剂 的 用 量 ; 采 用 含 2% 氨 水 的 50% 甲 醇 为 洗 脱 液, 在 保 证 目 标 成 分 脱 附 效 果 的 前 提 下 减 少 了 其 他 低 极 性 杂 质 的 脱 附 ; 洗 脱 液 中 加 入 酸 液 定 容 可 使 游 离 的 可 乐 定 完 全 成 盐, 避 免 测 定 时 出 现 峰 拖 尾 ;5ml 的 溶 剂 用 量 是 根 据 小 柱 规 格 优 选 的 最 佳 用 量 综 上 所 述, 在 珍 菊 降 压 片 处 方 中, 可 乐 定 为 有 机 弱 碱, 而 野 菊 花 中 的 干 扰 成 分 大 多 为 酚 酸 类 和 黄 酮 类 成 分, 两 者 在 反 相 色 谱 中 表 现 出 的 极 性 非 常 相 似, 但 在 电 荷 性 质 方 面 则 存 在 明 显 差 异 本 文 采 用 SPE HPLC 联 用 技 术, 以 阳 离 子 SPE 技 术 消 除 阴 性 干 扰 并 富 集 样 品, 显 著 改 善 了 传 统 HPLC 方 法 的 专 属 性 灵 敏 度 重 现 性 和 准 确 度, 为 珍 菊 降 压 片 中 盐 酸 可 乐 定 的 质 量 控 制 提 供 了 可 靠 的 技 术 手 段, 也 为 今 后 类 似 产 品 的 质 量 控 制 方 法 开 发 提 供 了 新 的 思 路 参 考 文 献 [1] 张 新 学, 刘 圣 梅, 李 亚 芳.HPLC 法 测 定 珍 菊 降 压 片 中 盐 酸 可 乐 定 的 含 量 [J]. 齐 鲁 药 事,2008,27(10): [2] 黄 东 慧. 反 相 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 珍 菊 降 压 片 中 盐 酸 可 乐 定 的 含 量 [J]. 临 床 和 实 验 医 学 杂 志,2009,8(4):68. [3] 张 建 国, 李 志 浩, 孙 新 建, 等. 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 珍 菊 降 压 片 中 盐 酸 可 乐 定 含 量 [J]. 医 药 导 报,2008,27(5): [4] 郭 静, 向 飞 军, 李 凤 银.RP HPLC 测 定 珍 菊 降 压 胶 囊 中 盐 酸 可 乐 定 的 含 量 [J]. 现 代 食 品 与 药 品 杂 志,2007,17(5): [5] 张 志 勇, 林 锋, 于 敬 海. 中 西 药 复 方 制 剂 珍 菊 降 压 片 的 质 量 标 准 研 究 [J]. 哈 尔 滨 医 科 大 学 学 报,2009,43(1): [6] 于 文 静, 王 焕 群. 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 珍 菊 降 压 片 中 盐 酸 可 乐 定 的 含 量 [J]. 中 国 药 品 标 准,2009,10(2): [7] 刘 春 丽, 刘 朋 欣, 李 婷. 珍 菊 降 压 片 含 量 及 均 匀 度 测 定 方 法 研 究 [J]. 黑 龙 江 医 药,2012,25(1):5 7. [8] 鲍 立 曾, 刘 法 千, 金 芳.HPLC 测 定 珍 菊 降 压 片 中 盐 酸 可 乐 定 的 含 量 及 均 匀 度 [J]. 中 国 药 品 标 准,2007,8(5): [9] 高 苏 亚, 李 华, 曹 晓 芹. 区 带 毛 细 管 电 泳 法 测 定 珍 菊 降 压 片 有 效 成 分 的 含 量 [J]. 时 珍 国 医 国 药,2008,19(11): [10] SuSM,YuYQ.Simultaneousdeterminationofclonidinehydro chloride,hyrochlorothiazide,andrutininzhenjujiangyatablet bycapilaryelectrophoresis[j].jchinpharm Sci,2005,14 (3): [11] 丁 飞, 陈 黎 明. 毛 细 管 电 泳 安 培 检 测 法 同 时 测 定 中 成 药 珍 菊 降 压 片 中 有 效 成 分 [J]. 理 化 检 验 化 学 分 册,2008,44 (5): [12] 陈 雯, 方 宝 霞, 李 鹏, 等. 固 相 萃 取 技 术 在 中 成 药 质 量 控 制 中 的 应 用 [J]. 医 药 导 报,2009,28(6): [13] 许 谙, 姚 琴 红. 固 相 萃 取 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 珍 菊 降 压 片 中 盐 酸 可 乐 定 的 含 量 [J]. 中 国 医 院 药 学 杂 志,2010,30 (11): ( 收 稿 日 期 : 修 回 日 期 : ) ( 上 接 第 107 页 ) functionoftheviralhemagglutinin[j].jvirol,1999,73(1): [19] KielianM,ReyFA.Virusmembrane fusionproteins:morethan onewaytomakeahairpin[j].natrevmicrobiol,2006,4(1): [20] GuzmanEM,CheshenkoN,ShendeV,etal.AmphipathicDNA polymersarecandidatevaginalmicrobicidesandblockherpes simplexvirusbinding,entryandviralgeneexpresion[j].anti virther,2007,12(8): [21] LeeAM,RojekJM,GundersenA,etal.Inhibitionofcelular entryoflymphocyticchoriomeningitisvirusbyamphipathicdna polymers[j].virology,2008,372(1): ( 收 稿 日 期 : 修 回 日 期 : )

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