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斧优李
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1 第 30 卷第 1 期辐射研究与辐射工艺学报 Vol.30, No 年 2 月 J. Radiat. Res. Radiat. Process. February 2012 四环素衍生物 CMT-8 对人类宫颈癌细胞 HeLa 的生长及其放射敏感性的影响申琳棱赵琳马亮杨江涛焦旸徐加英樊赛军 ( 苏州大学医学部放射医学与防护学院苏州市肿瘤放射生物学重点实验室苏州 ) 摘要探讨四环素衍生物 CMT-8 对人宫颈癌细胞 HeLa 的生长以及放射增敏性的影响分别采用 MTT 法伤口愈合实验细胞粘附实验流式细胞术和 Western blot 法测定 CMT-8 对 HeLa 细胞生长迁移粘附周期的影响及其相关蛋白表达水平的改变实验结果表明,CMT-8 可有效抑制 HeLa 细胞的生长, 降低其迁移粘附能力, 引起细胞 G 0 /G 1 期阻滞下调周期蛋白 Cyclin D 和 Cyclin E 的表达水平 CMT-8 联合 X 射线能明显抑制细胞的生长, 下调 DNA 损伤修复蛋白 Ku70 和 DNA-PKcs 的表达水平这些发现提示,CMT-8 作为人宫颈癌抗肿瘤新药可能是与其抑制细胞生长细胞周期调控和抗迁移有关另外,CMT-8 在低剂量下可以提高人宫颈癌细胞的放射敏感性, 与其调节 DNA 损伤修复蛋白的表达水平有关关键词 CMT-8,HeLa 细胞,X 射线, 放射敏感性中图分类号 R Chemically modified tetracycline-8(cmt-8) 是四环素结构上脱去 A 环 C4 位置上的二甲氨基而形成的一种新四环素衍生物 ( 图 1) 由此,CMT-8 表现为无抗菌活性, 但仍保留了四环素的抗胶原酶活性, 同时具有了良好的亲脂性和组织吸收性目前, 已有文献报道 CMT-8 能抑制包括乳腺癌细胞 MDA-MB-468 肺癌细胞 A549 白血病细胞 HUT-78 和 HL-60 等在内的多种肿瘤细胞的生长, 而对人的正常细胞的生长没有明显的抑制作用 [1-4] 目前, 国外缺乏对 CMT-8 在抗宫颈癌作用的系统研究, 国内尚未见任何报道另外, 国内外未见关于 CMT-8 对肿瘤放射增敏性影响的报道本研究采用人宫颈癌 HeLa 细胞以了解 CMT-8 作为一种新的抗肿瘤药物的作用以及对肿瘤细胞放射敏感性影响及其机制 1 实验材料与方法 1.1 药物与相关试剂人宫颈癌细胞 HeLa 购自美国细胞收藏中心 (ATCC);CMT-8 由美国 CollaGenex Pharmaceuticals 公司提供, 并采用 50% 酒精溶解, 制备成为 20 mmol/l 的储存液,4 避光保存, 实验前用完全培养液稀释成相应的浓度 ; 小牛血清 DMEM 细胞培养液和胰酶粉末购自 Gibco 公司 ; 二甲基亚砜 (DMSO) 购自国药集团化学试剂有限公司 ; 四氮唑蓝 (MTT) 购自 Sigma 公司 ; 实验所需抗体购自美国 Santa Cruze 生物技术公司, 其它试剂均购自上海生工 1.2 方法 Fig.1 Chemical structure of CMT 细胞培养细胞采用含 10% 新生小牛血清的 DMEM 培养液, 于 37 5% CO 2 饱和湿度的培养箱中培养 2 d 换一次液,3 4 d 传代一次, 取对数生长期的细胞进行实验研究药物处理和 X 线照射取对数生长期的 HeLa 细胞接种 24 h 后, 不同浓度 CMT-8 直接加至国家科学自然研究基金面上项目 ( 和 ) 教育部长江学者和创新团队发展计划资助项目 (IRT0848) 苏州市肿瘤放射生物学重点实验室 (SZS0802) 资助第一作者 : 申琳棱, 女,1986 年 3 月出生,2009 年毕业于湖北医药学院, 现为苏州大学医学部放射医学与防护学院研究生, 放射医学专业通讯作者 : 樊赛军, sjfan@suda.edu.cn 收稿日期 : 初稿 , 修回

2 第 1 期申琳棱等 : 四环素衍生物 CMT-8 对人类宫颈癌细胞 HeLa 的生长及其放射敏感性的影响 43 细胞培养液中细胞照射为 P-M 型西门子直线加速器 6 MV 的 X 射线, 剂量率为 200 cgy/min, 源皮距为 1.5 cm MTT 比色法测细胞存活率将 HeLa 细胞用 0.25% 的胰酶消化, 制备成单细胞悬液, 以个 / ml 密度接种到 96 孔培养板, 每孔 100 L, 培养 24 h 后, 更换培养液, 加入 0 70 mol/l 的 CMT-8 细胞培养液 200 μl 每一浓度设 6 个复孔, 加药后的细胞继续培养 24 h 48 h 或 72 h 于实验终止前 4 h, 每孔加入 5 mg/ml 的 MTT 溶液 20 L, 继续培养 4 h 然后吸去上清, 加入 DMSO, 混匀后测值各组细胞存活率 = ( 各浓度组吸光值 / 对照组吸光值 ) 100 % 测定放射敏感性, 取无毒副作用浓度 (0 5 mol/l)cmt-8 处理 HeLa 细胞 24 h 后, 细胞接受照射, 照射后继续培养另外 24 h, 完成 MTT 法倒置显微镜观察细胞形态将各处理组的细胞按实验条件培养 24 h 后, 终止培养, 观察细胞形态变化并拍照记录伤口愈合实验测细胞迁移能力将 HeLa 细胞用胰酶消化, 以个 / ml 接种于 6 孔板中, 待细胞长满板底时用无菌 200 L 的枪头垂直划出一无细胞的细痕, 用 1 PBS 小心清洗去除悬浮细胞 ( 此时作为划痕后 0 h), 各孔再加入不同浓度的 CMT-8 继续培养 24 h 或 48 h, 在显微镜下观察相同部位划痕宽度细胞粘附实验测细胞粘附能力将 HeLa 细胞接种于 24 孔板内, 加入 CMT-8 处理, 置于培养箱中培养, 取不同时间段 ( 如 0.5 h 1 h 3 h 5 h) 进行观察, 弃掉上层漂浮的细胞, 再用 PBS 清洗三次后进行细胞计数细胞粘壁率 =( 粘壁细胞数 / 每格总细胞数 ) 100% 流式细胞技术测细胞周期将贴壁好的 HeLa 细胞换用无血清的培养液同步化处理 12 h 后, 给予不同浓度的 CMT-8 或 X 射线处理细胞,24 h 后收集细胞并用 75% 的酒精 (4 预冷 ) 固定将细胞离心洗涤, 再加 PI 染液 (100 g/l) 避光染色,30 min 后, 上机检测 Western blot 法测细胞蛋白表达将收集的细胞用 IP 裂解液 4 充分裂解,SDS-PAGE 电泳, 转膜,5% 脱脂牛奶封闭过夜, 加入一抗, 室温孵育 1 h, 用 Tween PBS 洗三次, 特异性二抗孵育 1 h, 洗膜三次后用 ECL 法显色于暗室中曝光显影定影成像统计学处理以上实验均重复三次以上, 所得的数据结果以均数 ± 标准差 ( x ±s) 表示, 用 SPSS16.0 统计软件进行 t 检验以及方差分析, P< 0.05 视为有统计学意义 2 结果 2.1 CMT-8 的抗肿瘤作用 CMT-8 对 HeLa 细胞的生长的影响图 2 显示不同浓度 CMT-8 对 HeLa 细胞的生长抑制显现浓度 - 依赖和时间 - 依赖关系由此图也可以看出当 10 mol/l CMT-8 处理细胞 24 h 48 h 72 h 后的存活率分别 77% 28% 10%, 组间相比均有统计学差异 (P<0.05) 形态学观察结果发现 CMT-8 明显改变了 HeLa 细胞形态未处理过的细胞数量多, 贴壁生长, 细胞完整, 而 CMT-8 处理过的细胞数量减少, 间隙增大, 部分细胞皱缩漂浮这些结果表明 CMT-8 可以明显抑制 HeLa 细胞的生长, 并呈时间和浓度效应关系 Fig.2 Effect of CMT-8 on HeLa cell growth CMT-8 对 HeLa 细胞粘附能力的影响 3 或 5 mol/l CMT-8 直接加到胰酶消化后的悬浮 HeLa 细胞培养液中, 并转移至培养皿中不同时间 (0.5 h 1 h 3 h 5 h) 观察细胞贴壁情况如图 3 所示, 与对照组相比, 培养基中含有 CMT-8 的细胞在 1 h 3 h 5 h 时在培养皿的贴壁能力明显低于未处理组, P<0.05, 有统计学差异并随着 CMT-8 浓度增加, 细胞贴壁能力更加减弱 Fig.3 Effect of CMT-8 on the adhesion of HeLa cells

4 CMT-8 对 HeLa 细胞周期分布的影响如表 1 所示与无 CMT-8 药物处理的对照组细胞相比不同浓度 CMT-8 处理 HeLa 细胞 24 h 后的 G0/G1 期细胞数量有不同程度的增多而 S 期和 G2/M 期细胞数量有所减少并呈浓度依赖关系这些结果表明 CMT-8 诱导 HeLa 细胞 G0/G1 期阻滞 Fig.

3 44 第 30 卷辐射研究与辐射工艺学报 CMT-8 对 HeLa 细胞迁移能力的影响如图 4 所示为无毒副作用浓度 CMT-8 5 mol/l 处理 HeLa 细胞 24 h 48 h 后的伤口愈合实验结果从中可以看出随着处理时间的延长细胞向划痕区域迁移 5 mol/l CMT-8 处理过的细胞迁移速度慢在实验结束时其划痕间隙明显大于无 CMT-8 处理组的细胞 CMT-8 对 HeLa 细胞周期分布的影响如表 1 所示与无 CMT-8 药物处理的对照组细胞相比不同浓度 CMT-8 处理 HeLa 细胞 24 h 后的 G0/G1 期细胞数量有不同程度的增多而 S 期和 G2/M 期细胞数量有所减少并呈浓度依赖关系这些结果表明 CMT-8 诱导 HeLa 细胞 G0/G1 期阻滞 Fig.4 Effect of CMT-8 on the migration of HeLa cells Table 1 CMT-8 / mol L Effect of CMT-8 on cell cycle distribution of HeLa cells Percentage of cell cycle ( x ±s) / % G0/G1 S 45.38± ± ± ± ±1.28* 18.45±1.93* 76.78±1.91* 15.96±0.51* G2/M 15.84± ± ±3.21* 7.25±1.40* Note: * p< CMT-8 对蛋白表达的影响如图 5 所示采用 Western blot 法检测发现经 40 mol/l CMT-8 处理后的 HeLa 细胞周期相关蛋白 Cyclin D 和 Cyclin E 表达水平下降而采用 70 mol/l CMT-8 处理后 Cyclin D 和 Cyclin E 表达水平则进一步下降这些结果说明 CMT-8 对 Cyclin D 和 Cyclin E 蛋白表达的影响有一定的剂量依赖性 Fig.5 Effect of CMT-8 on protein expression of HeLa cells 2.2 CMT-8 的放射增敏作用 CMT-8 联合 X 射线对 HeLa 细胞生长的影响图 6-A 显示 5 mol/l 的 CMT-8 处理 HeLa 细胞 24h 后存活率均在 85%以上 P<0.05 有统计学意义因此可以说 5 mol/l 的 CMT-8 对 HeLa 细胞的生长和增殖并不产生明显的抑制作用而将 0 5 mol/l CMT-8 处理 HeLa 细胞 24 h 后再给予细胞 6 Gy X 射线照射继续培养 24 h 后观察细胞生长和增殖从图 6-B 中我们可以看出在同一剂量照射下用 CMT-8 处理后的 HeLa 细胞较未处理的细胞存活率均明显降低 P<0.05 均有统计学差异并呈浓度依赖关系例如与单纯接受 6 Gy X 射线照射的细胞相比 5 mol/l CMT-8 联合 6Gy X 射线照射后的 HeLa 细胞存活率降低至 38% 表明无毒副作用浓度的 CMT-8 5 mol/l 处理可以提高 HeLa 细胞的放射治疗敏感性图 6-B 相对于 6 Gy X 射线单纯处理组联合组的细胞数量减少间隙增宽漂浮细胞明显增多图 7 这

第1期申琳棱等四环素衍生物 CMT-8 对人类宫颈癌细胞 HeLa 的生长及其放射敏感性的影响些结果说明在我们实验条件下 5 mol/l CMT-8 可以提高 HeLa 细胞的放射敏感性 45 CMT-8 处理组与对照组相比 DNA 损伤修复相关蛋白 Ku70 和 DNA-PKcs 表达水平变化不明显但

8 Alteration of protein levels in HeLa cells treated with CMT-8 and/or X-rays: 1, un-treated control; 2, 5 mol/l CMT-8; 3, 6 Gy X-rays; 4, CMT-8+X-rays 3 Fig.

2.2 CMT-8 联合 X 射线对 HeLa 细胞周期分布的影响流式细胞仪检测结果显示与无 CMT-8 处理的对照组相比经 5 mol/l CMT-8 处理后的 HeLa 细胞其周期改变并不明显(P>0.

05 但 CMT-8 联合 X 射线处理的细胞周期与单独 X 射线照射组的细胞周期相比 G2/

2.3 CMT-8 联合 X 射线对 HeLa 细胞蛋白表达的影响如图 8 所示在 HeLa 细胞中 5 mol/l 讨论宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一占女性生殖系统恶性肿瘤的 50%以上化学治疗是治疗宫颈癌的重要手段之一目前的化疗药物毒副作用和耐药性都很强因此研究新的抗肿瘤药物是当前的

4 第1期申琳棱等四环素衍生物 CMT-8 对人类宫颈癌细胞 HeLa 的生长及其放射敏感性的影响些结果说明在我们实验条件下 5 mol/l CMT-8 可以提高 HeLa 细胞的放射敏感性 45 CMT-8 处理组与对照组相比 DNA 损伤修复相关蛋白 Ku70 和 DNA-PKcs 表达水平变化不明显但 5 mol/l CMT-8 联合 X 射线处理组相对于单纯 X 射线照射组 Ku70 和 DNA-PKcs 蛋白表达均明显降低 Fig.6-A Effects of CMT-8 at low doses on HeLa cell growth Fig.8 Alteration of protein levels in HeLa cells treated with CMT-8 and/or X-rays: 1, un-treated control; 2, 5 mol/l CMT-8; 3, 6 Gy X-rays; 4, CMT-8+X-rays 3 Fig.6-B Combinational effects of CMT-8 and X-rays on HeLa cell growth Fig.7 Morphological alteration of cells treated with CMT-8 and X-rays CMT-8 联合 X 射线对 HeLa 细胞周期分布的影响流式细胞仪检测结果显示与无 CMT-8 处理的对照组相比经 5 mol/l CMT-8 处理后的 HeLa 细胞其周期改变并不明显(P>0.05) 而与无 CMT-8 处理和照射的对照组细胞(16%)相比 6 Gy X 射线照射和 CMT-8 联合 X 射线处理的细胞 G2/M 期比例分别为 51%和 60% P<0.05 但 CMT-8 联合 X 射线处理的细胞周期与单独 X 射线照射组的细胞周期相比 G2/M 期比例有所增加但无统计学差异 P> CMT-8 联合 X 射线对 HeLa 细胞蛋白表达的影响如图 8 所示在 HeLa 细胞中 5 mol/l 讨论宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一占女性生殖系统恶性肿瘤的 50%以上化学治疗是治疗宫颈癌的重要手段之一目前的化疗药物毒副作用和耐药性都很强因此研究新的抗肿瘤药物是当前的热点由于 CMT-8 保留了它四环素抗胶原酶活性且胶原酶与蛋白酶和肿瘤的产生机制是相关的因此 CMT-8 可作为一种新的化疗药物应用于肿瘤治疗中研究者在前期研究中采用巨噬细胞 J774 筛选不同类型的 CMT 抑制细胞生长的能力发现不同类型的 CMT 均可导致细胞的生长抑制其中 CMT-8 是非常有效抑制剂之一且呈剂量-依赖关系[2] 另外 Manlio 等研究人员的研究结果也发现 CMT-8 在导致白血病细胞凋亡优于其它类型的 CMT 这可能是由于其 C5 位置上的羟基所致[3] 本实验结果发现将一定浓度的 CMT-8 处理 HeLa 细胞细胞生长受到了明显的抑制抑制程度显现出时间效应和浓度-效应关系另外 CMT-8 也明显地抑制 HeLa 细胞的迁移能力这和我们早期报道的乳腺癌细胞实验结果是一致的可能是通过增加 E-钙粘蛋白/连环蛋白复合体的表达所致[4] 总结已报道的现有研究结果 CMT-8 的抗肿瘤作用可能是通过影响 Bcl-2 C-myc BRCA1 的表达并参加 Caspase 家族调节从而诱导了细胞凋亡以及抑制肿瘤细胞的转移和迁移能力而发挥作用的[1-6] 另外本实验研究也揭示 CMT-8 能引起 HeLa 细胞 G0/G1

5 46 辐射研究与辐射工艺学报第 30 卷期阻滞, 这也说明 CMT 家族可以通过对肿瘤细胞周期干预或导致细胞周期停滞, 也是 CMT 抑制细胞增殖的作用机制之一 [5] 周期相关蛋白 Cyclin D 与 G 1 期密切相关, 其在细胞周期中起正性调控作用, 是细胞周期 G 1 /S 期转换的限速因子 Cyclin E 是另一种 G 1 期细胞周期蛋白, 其含量减少或活性降低都能抑制细胞从 G 1 期向 S 期转换 [7] 因此 CMT-8 对 HeLa 细胞周期的调节可能是通过下调 Cyclin D 和 Cyclin E 的表达水平实现的, 正如图 5 的实验结果所证实放射治疗也是宫颈癌的重要治疗手段之一但由于高分化鳞癌腺癌粘液腺癌等宫颈腺癌对放射治疗不敏感, 因此, 提高宫颈癌细胞放射治疗敏感性的增敏药研究是当今宫颈癌放射治疗的研究方向之一本实验中 MTT 结果提示,CMT-8 在无毒副作用的剂量预处理可明显提高 HeLa 细胞的放射敏感性目前已知道影响肿瘤细胞辐射效应的因素主要有 6 个方面 : 氧效应谷胱甘肽含量放射损伤修复能力细胞周期不同时相再氧合以及照射剂量 [8] 从细胞周期实验结果可以看出, 经过 5 mol/l CMT-8 预处理 24 h 后再接受 X 线照射的 HeLa 细胞, 细胞周期相对于单纯照射细胞相比并没出现明显的差异, 显然细胞周期的调节可能不是 CMT-8 放射增敏的主要机制电离辐射引起细胞死亡的主要原因是 DNA 双链断裂 (DNA double-strand break,dsb), 对 DSB 的强修复是一些肿瘤细胞辐射敏感性低的重要原因非同源末端连接 (Non-homology end joining,nhej) 是 DSB 最重要的修复方式 DNA- PKcs 是 DNA-PK 重要组成部分, 在 NHEJ 过程中起着重要作用 Ku 蛋白对 DNA 末端具有高度的亲和性, 能保护游离的 DNA 末端, 避免被核酸酶分解, 同时 ku 蛋白与 DNA- PKCs 结合形成 DNA- PK 全酶, 进而完成 NHEJ 修复过程因此 Ku 70 和 DNA- PKcs 表达水平与肿瘤细胞对放射线敏感性之间存在显著的负相关关系 [9-11] 本实验的 Western blot 结果 ( 图 8) 显示, 与单纯照射组相比,CMT-8 明显下调 Ku70 和 DNA-PKCs 的表达水平, 因此 CMT-8 的放射增敏作用是可能是通过下调细胞的 Ku70 和 DNA-PKCs 的表达水平有关, 也就是说 CMT-8 调节 DNA 损伤修复可能是 CMT-8 影响肿瘤细胞放射敏感性的重要机制之一综上所述, 虽然明确的作用机制还需进一步深入研究,CMT-8 对人宫颈癌 HeLa 细胞生长有明显的抑制作用, 可能是通过下调 Cyclin D 和 Cyclin E 的表达水平诱导 G 0 /G 1 期阻滞和抑制细胞转移而实现的同时,CMT-8 预处理可以提高人宫颈癌细胞 HeLa 的放射敏感性, 可能与下调 Ku70 和 DNA-PKCs 的表达水平, 抑制辐射引起的细胞 DNA 损伤修复有关参考文献 1 Liu Y, Ramamurthy N, Marecek J, et al. The lipophilicity, pharmacokinetics, and cellular uptake of different chemically-modified tetracyclines (CMTs). Current Medicinal Chemistry, 2001, 3(8): Pietro D' A, Viviana F, Salvatore M, et al. Chemically modified tetracyclines induce cytotoxic effects against J774 tumour cell line by activating the apoptotic pathway. Inyernational Immunopharmacology, 2003, 1(3): Manlio T, Stefania G, Salvatore M, et al. Effects of chemically modified tetracyclines (CMTs) in sensitive, multidrug resistant and apoptosis resistant leukaemia cell lines. British Journal of Pharmacology, 2001, 133: MENG Qinghui, XU Jingwen, Itzhak D, et al. Influence of chemically modified tetracyclines on proliferation, invasion and migration properties of MDA-MB-468 human breast cancer cells. Clinical and Experimental Metastasis, 2000, 2(18): Bal L. Lokeshwar. Chemically modified non- antimicrobial tetracyclines are multifunctional drugs against advanced cancers. Pharmacological Research, 2011, 63(2): Charlotta S, Katariina N, Ken A, et al. Chemically modified tetracyclines induce apoptosis in cultured mast cells. LindstedtInternational Immunopharmacology, 2005, 5: 张玉霞, 喻伦银, 刘铭球. 细胞周期调控研究进展. 国外医学遗传学分册, 2001, 5(24): ZHANG Yuxia, YU Lunyin, LIU Mingqiu. Cell cycle regulation research progress. Foreign Medical Genetics Volume, 2001, 5(24): 周厚清. 肿瘤放射增敏剂及增敏机制研究进展. 国外医学肿瘤学分册, 2001, 28(6): ZHOU Houqing. Cancer radiotherapy sensitization agent and sensitization mechanism research progress. Foreign Medical Oncology Volume, 2001, 28(6): 郭传玲, 王菊芳, 李文建. Ku 蛋白与肿瘤细胞辐射敏感性. 中华实用医药杂志, 1995, 16(5): 1-5 GUO Chuanling, WANG Jufang, LI Wenjian. Ku protein and tumor cells sensitivity radiation. Practical Medical Journal, 1995, 16(5): 1-5

6 第 1 期申琳棱等 : 四环素衍生物 CMT-8 对人类宫颈癌细胞 HeLa 的生长及其放射敏感性的影响 Fattah F, Lee E H, Weisensel N, et al. Ku regulates the non-homologous end joining pathway choice of DNA double-strand break repair in human somatic cells. PLoS Genet, 2010, 6(2): Katheryn M, Van D, Susan P, et al. Chapter 2 DNA-PK: The Means to Justify the Ends. Advances in Immunology, 2008, 99: Anticancer activity and radiosensitization of CMT-8 in human cervical cancer HeLa cells SHEN Linling ZHAO Lin MA Liang YANG Jiangtao JIAO Yang XU Jiaying FAN Saijun (School of Radiation Medicine and protection, Medical College of Soochow University, Suzhou , China) ABSTRACT To investigate the effects of chemically modified tetracycline 8 (CMT-8) on cell growth, migration and radio-senstivity in human cervical cancer HeLa cells, MTT assay was used to determine cell viability and radiosensitivity; wound healing and adhesive assays were used to measure cell migration and adhesion; flow cytometry and Western blot assay were performed to analyze cell cycle alteration and protein expression. The results showed that CMT-8 inhibited HeLa cell growth, migration and adhesion in a dose-and time dependent fashion. Furthermore, CMT-8 caused a G 0 /G 1 arrest, in accompany with a dose-dependent down-regulation of Cyclin D and Cyclin E protein expression. Finally, HeLa cells pre-treated with CMT-8 at non-cytotoxic concentrations became more sensitive to subsequent irradiation of X-rays, which was related to a decreased expression of Ku70 and DNA-PKcs protein. Taken together, these findings indicate that CMT-8 is a new anti-cervical cancer compound via inhibiting cell growth and migration as well as mediating radio-sensitivity. KEYWORDS CMT-8, HeLa cell, X-rays, Radiosensitivity CLC R737.33

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot